CN112162043A - 生物体液中糖皮质激素的液相色谱串联质谱检测方法 - Google Patents
生物体液中糖皮质激素的液相色谱串联质谱检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种生物体液中糖皮质激素的液相色谱质谱联用的检测方法，包括：(1)样本进行蛋白沉淀和固液萃取板前处理，得供试品溶液和对照品溶液；(2)液相色谱质谱联用检测：色谱柱采用反相C12色谱柱；流动相A为有机酸盐水溶液：乙腈＝9:1；流动相B为有机酸盐水溶液：乙腈＝1:9；采用梯度洗脱。本发明的方法能够有效检出人尿液和血清中糖皮质激素，具有分离效果好，基线平稳，检测时间短，线性好，准确度高，重现性好，灵敏度高，精密度高的特点。
Description
技术领域
本发明涉及医学检测技术领域，具体涉及一种生物体液中糖皮质激素的液相色谱串联质谱检测方法。
背景技术
糖皮质激素属于类固醇家族，它具有重要的糖、蛋白质和钙代谢功能。合成糖皮质激素应用也广泛，其作为消炎药和免疫抑制剂具有重要的临床应用价值。但这些药物的应用也可能有一些其他非预期的临床表现。暴露于这些类固醇的患者可能出现库欣综合征的临床特征，但其皮质醇水平下降，且下丘脑-垂体-肾上腺轴呈现抑制情况。糖皮质激素的活性在很大程度上依赖于核素上的取代基，取代基已被发现可显著增加糖皮质激素和矿物质皮质激素的活性。因此对人体液(如血清和尿液)中多种合成糖皮质激素药物浓度进行同时监测具有重要的意义。
目前用于生物体液中多种合成糖皮质激素检测的方法主要有高效液相色谱(HPLC)、气相色谱(GC)、液相色谱质谱联用(LC-MS)和电化学发光(EC)，其中LC-MS由于具有低检出限、宽线性范围等特点而成为检测糖皮质激素强有力的手段。合成糖皮质激素主要包括地塞米松、倍他米松、布地奈德、皮质醇、可的松、氟氢可的松、丙酸氟替卡松、醋酸甲地孕酮、醋酸甲地孕酮、泼尼松龙、泼尼松、和曲安奈德十二种。在LC-MS检测之前通常需要采用适当的样品前处理方法对样本进行基质去除，现有的LC-MS检测方法存在分析方法耗时长、或准确性及可靠性较差、或精密度较、不易于批量处理等缺点。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，提供一种液质联用检测生物体液中糖皮质激素的方法，该方法具有简单快速、前处理耗时短、精密度和灵敏度高、重现性好的特点。
为解决上述技术问题，本发明提供一种生物体液中糖皮质激素的液相色谱质谱联用的检测方法，包括：
(1)溶液配置和样本前处理：
配制一系列浓度梯度的糖皮质激素标准溶液及一定浓度的糖皮质激素内标溶液；
对添加了糖皮质激素内标溶液的生物体液样本进行蛋白沉淀和固液萃取板(SLE)前处理，得供试品溶液；
对添加了糖皮质激素内标溶液的一系列浓度梯度的糖皮质激素标准溶液进行蛋白沉淀和固液萃取板(SLE)前处理，得对照品溶液；
所述蛋白沉淀和固液萃取板(SLE)前处理的过程为：取一定体积的溶液分别用适量水稀释，然后进行振荡混匀、离心沉淀蛋白；将离心后的溶液分别转移至填充硅藻土吸附剂的固相萃取板(SLE)中，用二氯甲烷洗脱，收集洗脱液并吹干，然后用一定体积的雌三醇溶液复溶；
所述糖皮质激素包括地塞米松、倍他米松、布地奈德、皮质醇、可的松、氟氢可的松、丙酸氟替卡松、醋酸甲地孕酮、醋酸甲地孕酮、泼尼松龙、泼尼松、和曲安奈德十二种；
(2)液相色谱质谱联用检测：
其中，液相色谱条件为：色谱柱采用反相C12色谱柱；流动相包括流动相A和流动相B；流动相A为含0.05～0.15mM mM有机酸盐的水：乙腈＝9:1的混合溶液；流动相B为含0.05～0.15mM mM有机酸盐的水：乙腈＝1:9的混合溶液：乙腈＝1:9的混合溶液；采用梯度洗脱，梯度洗脱程序为：0～6.50min，流动相B体积百分比维持在20～30％；6.50～6.60min，流动相B体积百分比由20～30％增至55～65％；6.60～8.68min，流动相B体积百分比由55～65％递增至85～95％；8.68～9.18min，流动相B体积百分比保持为85～95％；9.18～9.20min，流动相B体积百分比由85～95％递减至20～30％；9.20～10.00，流动相B保持体积百分比为20～30％；
质谱条件为：离子源为电喷雾离子源；离子模式为正离子模式；监测模式为多反应监测模式；
(3)定量测定方法：
将所述对照品溶液以及供试品溶液按所述(2)色谱条件依次进样，记录色谱图；将对照品溶液中各糖皮质激素对其内标物的峰面积的比值与各糖皮质激素浓度分别进行线性回归产生标准曲线和/或拟合方程；将供试品溶液中各糖皮质激素对其内标物的峰面积的比值代入至所述标准曲线和/或拟合方程，得出生物体液中各糖皮质激素浓度。
具体的，所述生物体液为尿液样本和血液样本。优选的，所述血液样本为血清。优选的，所述生物体液来源于人体。
在一个优选的实施例中，所述步骤(1)中，所述固相萃取板的类型为96孔深孔板。
在一个优选的实施例中，所述步骤(1)中，洗脱操作中，使用二氯甲烷洗脱三次。
在一个优选的实施例中，所述步骤(1)中，吹干方式为使用氮气吹干。吹干的温度为40±2℃。
在一个优选的实施例中，所述步骤(1)中，所述雌三醇溶液为体积百分浓度0.05～0.5％雌三醇的70％甲醇水溶液；更优选的，所述甲酸水溶液的体积百分浓度0.1～0.3％雌三醇的70％甲醇水溶液；更优选的，所述甲酸水溶液的体积百分浓度0.1％雌三醇的70％甲醇水溶液。
在一个优选的实施例中，所述步骤(2)中，流动相A中的有机酸盐选自乙酸铵或甲酸胺。
在一个优选的实施例中，所述步骤(2)中，流动相A中有机酸盐浓度为0.1mM。
在一个优选的实施例中，所述步骤(2)中，流动相B中的有机酸盐选自乙酸铵或甲酸胺。
在一个优选的实施例中，所述步骤(2)中，流动相B中有机酸浓度为0.1mM。
在一个优选的实施例中，所述步骤(2)中，采用梯度洗脱，梯度洗脱程序为：0～6.50min，流动相B体积百分比维持在23～27％；6.50～6.60min，流动相B体积百分比由23～27％增至58～62％；6.60～8.68min，流动相B体积百分比由58～62％递增至88～92％；8.68～9.18min，流动相B体积百分比保持为88～92％；9.18～9.20min，流动相B体积百分比由88～92％递减至23～27％；9.20～10.00，流动相B保持体积百分比为23～27％。
在一个优选的实施例中，所述步骤(2)中，采用梯度洗脱，梯度洗脱程序为：0～6.50min，流动相B体积百分比维持在25％；6.50～6.60min，流动相B体积百分比由25％增至60％；6.60～8.68min，流动相B体积百分比由60％递增至90％；8.68～9.18min，流动相B体积百分比保持为90％；9.18～9.20min，流动相B体积百分比由90％递减至25％；9.20～10.00，流动相B保持体积百分比为25％。
在一个优选的实施例中，所述步骤(2)中，色谱柱为Phenomenex SynergiTM4μmMax-RP
50x4.6mm，4μm。
在一个具体的实施例中，所述步骤(2)中，液相色谱的柱温为25.0～55.0℃。在一个优选的实施例中，柱温为48.0～55.0℃。在一个优选的实施例中，柱温为50.0℃。
在一个具体的实施例中，所述步骤(2)中，液相色谱的进样量为0.5～20.0μL。在一个优选的实施例中，进样量为5.0～15.0μL。在一个优选的实施例中，进样量为10.0μL。
在一个具体的实施例中，所述步骤(2)中，液相色谱的流动相的流速为0.1～2.0mL/min。在一个优选的实施例中，流速为0.3～1.0mL/min。在一个优选的实施例中，流速为0.7mL/min。
在一些具体实施例中，所述步骤(2)中，质谱条件设置，驻留时间：0.050s，气帘气为20L/h，碰撞气为10L/h。
在一个具体的实施例中，所述步骤(2)中，质谱条件中12种糖皮质激素的检测离子对为：
393.5→147.1、393.5→355.2和393.5→237.1(地塞米松，Dexa；倍他米松，Beta)；431.0→413.0、431.0→323.0和431.0→305.0(布地奈德，Bude)；363.2→121.0、363.2→309.1和363.2→327.0(皮质醇，Cortisol)；361.2→163.1和361.2→121.1(可的松，Cortisone)；381.4→239.2和381.4→267.0(氟氢可的松，Flid)；501.5→313.1和501.5→292.3(丙酸氟替卡松，Flut-pro)；385.1→223.8、385.1→267.1和385.1→325.2(醋酸甲地孕酮，Mege)；375.2→161.0、375.2→321.3(甲基强的松龙，Meth)；361.4→147.1、361.4→289.0和361.4→223.1(泼尼松龙，Predl)；359.3→147.2、359.3→171.0和359.3→265.1(泼尼松，Pred)；435.4→397.0和435.4→321.0(曲安奈德，Tria)。
内标采用的离子对为：368.4→169.1和368.4→124.9(可的松-d7)；397.4→149.1和397.4→172.8(地塞米松-d4)；388.5→270.1和388.5→226.8(醋酸甲地孕酮-d3)；367.4→149.1和367.4→270.2(泼尼松-d8)；442.4→404.4(曲安奈德-d7)；366.2→121.1和366.2→97.0(皮质醇-d3)；439.1→341.2和439.1→421.0(布地奈德-d8)。
在一个优选的实施例中，一系列浓度梯度的糖皮质激素标准溶液中，12种合成糖皮质激素标准品的浓度范围均为0.0～10.0μg/dL。更优选的，一系列浓度梯度的糖皮质激素标准溶液中，12种合成糖皮质激素标准品的浓度梯度由低到高分别为：0.0μg/dL、0.1μg/dL、0.5μg/dL、2.5μg/dL、5.0μg/dL、10.0μg/dL。
在一个优选的实施例中，糖皮质激素内标溶液中各内标浓度为0.5～50.0μg/dL。
具体的，所述一系列浓度梯度的糖皮质激素标准溶液、糖皮质激素内标溶液在配制时是以甲醇作为稀释和定容溶剂。
具体的，各内标包括同位素标记的可的松、同位素标记的地塞米松、同位素标记的醋酸甲地孕酮、同位素标记的泼尼松、同位素标记的曲安奈德、同位素标记的皮质醇、和同位素标记的布地奈德。其中，同位素标记的可的松是作为可的松的内标、同位素标记的地塞米松作为地塞米松、倍他米松和甲基强的松龙的内标、同位素标记的醋酸甲地孕酮作为醋酸甲地孕酮和丙酸氟替卡松的内标、同位素标记的泼尼松作为泼尼松、泼尼松龙和氟氢可的松的内标、同位素标记的曲安奈德作为曲安奈德的内标、同位素标记的皮质醇作为皮质醇的内标、和同位素标记的布地奈德作为布地奈德的内标。
优选的，同位素标记的可的松为可的松-d7、同位素标记的地塞米松为地塞米松-d4、同位素标记的醋酸甲地孕酮为醋酸甲地孕酮-d3、同位素标记的泼尼松为泼尼松-d8、同位素标记的曲安奈德为曲安奈德-d7、同位素标记的皮质醇为皮质醇-d3、和同位素标记的布地奈德为布地奈德-d8。
本发明提供一种生物体液中糖皮质激素的液相色谱质谱联用的检测方法，先对样本采用采用蛋白沉淀和固液萃取板(SLE)进行前处理，经色谱柱采用梯度洗脱分离，引入质谱进行分析，采用内标法定量。
本发明的有益效果在于：
1)本发明提供的检测方法，对样本前处理方法及仪器方法进行了创新，具有检测方法时间短，单次进样检测仅需10min，提高了检测效率，适合样本的高通量筛选。
2)本发明的方法对生物体液样本的取样量少，只需100-500μL样本体积即可完成检测。
3)本发明的方法使用蛋白沉淀和硅藻土的固液萃取板吸附剂对尿液和血清样本进行前处理净化，其中蛋白沉淀剂为添加至样本中的糖皮质激素内标溶液(内标工作液的甲醇溶液)，可有效的消除基质干扰。而未经净化的尿液、血液样品存在极强的干扰成分使目标成分无法检出。
4)本发明的方法可以同时对12种合成糖皮质激素进行高效率分析，具有良好的线性关系，12种合成糖皮质激素的相关参数R2均≥0.9973，定量检测的准确度高，重现性好。
5)本发明的方法用于血浆样本中糖皮质激素的定量检测具有灵敏度高的优点。
6)本发明的方法用于血浆样本中糖皮质激素的定量检测，经批内和批间精密度的检测，平变异系数(％CV)在15.0％以内，表明本方法具有良好的精密度。
附图说明
图1为12种糖皮质激素标准品的色谱图。
图2为固相萃取后尿液样本和血清样本中12种糖皮质激素的色谱图。
图3为12种糖皮质激素的标准曲线图。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1.色谱条件与质谱参数的设定
色谱柱：Phenomenex SynergiTM4μm Max-RP
50x4.6mm，4μm；
柱温：50℃；
进样量：10μL；
流动相A：含0.1mM乙酸铵的水：乙腈(9:1)溶液；
流动相B：含0.1mM乙酸铵的水：乙腈(1:9)溶液；
梯度洗脱程序：流动相A+流动相B＝100％；0～6.50min，流动相B体积百分比维持在25％；6.50～6.60min，流动相B体积百分比由25％增至60％；6.60～8.68min，流动相B体积百分比由60％递增至90％；8.68～9.18min，流动相B体积百分比保持为90％；9.18～9.20min，流动相B体积百分比由90％递减至25％；9.20～10.00，流动相B保持体积百分比为25％；流动相流速为0.7mL/min。
质谱参数设定为：离子源：电喷雾离子源，离子模式：正离子模式，监测模式：多反应监测，驻留时间：0.050s，气帘气为20L/h，碰撞气为10L/h。12种糖皮质激素的离子对为：393.5→147.1、393.5→355.2和393.5→237.1(地塞米松，Dexa；倍他米松，Beta)；431.0→413.0、431.0→323.0和431.0→305.0(布地奈德，Bude)；363.2→121.0、363.2→309.1和363.2→327.0(皮质醇，Cortisol)；361.2→163.1和361.2→121.1(可的松，Cortisone)；381.4→239.2和381.4→267.0(氟氢可的松，Flid)；501.5→313.1和501.5→292.3(丙酸氟替卡松，Flut-pro)；385.1→223.8、385.1→267.1和385.1→325.2(醋酸甲地孕酮，Mege)；375.2→161.0、375.2→321.3(甲基强的松龙，Meth)；361.4→147.1、361.4→289.0和361.4→223.1(泼尼松龙，Predl)；359.3→147.2、359.3→171.0和359.3→265.1(泼尼松，Pred)；435.4→397.0和435.4→321.0(曲安奈德，Tria)。内标采用的离子对为：368.4→169.1和368.4→124.9(Cortisone-d7)；397.4→149.1和397.4→172.8(Dexa-d4)；388.5→270.1和388.5→226.8(Mege-d3)；367.4→149.1和367.4→270.2(Pred-d8)；442.4→404.4(Tria-d7)；366.2→121.1和366.2→97.0(Cortisol-d3)；439.1→341.2和439.1→421.0(Bude-d8)。
按此方法对10μg/dL的12种糖皮质激素标准品测定，测定结果如图1所示，测定时间为10min。
实施例2.样品前处理程序
1)蛋白沉淀：向1.5mL离心管中加入300μL样本,35μLBude-d8内标(3.13μg/dL)和另外6种混合内标溶液25μL(25μg/dL)，再加入60μL水，振荡混匀(1000r/min，3min)，将样品管转至离心机，14000rpm离心2min；
2)SLE：将上述液体转移至96孔深孔板上的SLE板中，待液体全部进入填料后，每孔加入700μL二氯甲烷洗脱3次，并用另一96孔板收集洗脱液；
3)氮吹：将96孔板收集到的全部有机液体转移至板式氮吹仪上，40±2℃氮吹至干；
4)复溶：向上述含有洗脱液的96孔板相应位置加入150μL 0.1％雌三醇70％甲醇水溶液进行复溶，涡旋，3500rpm离心2min。
按此方法对尿液和血清样本进行测定，经本方法净化处理后的样本(图2)基线平稳，无基质干扰，与标准溶液进样的色谱图的峰形及保留时间相符。
实施例3.线性范围的测定
配制一系列浓度梯度的12种合成糖皮质激素标准溶液：0、0.1、0.5、2.5、5和10μg/dL。样品处理方法同实施例2，色谱条件和质谱参数同实施例1，每天测定一次，连续测定5天。按技术方案中所述内标法定量，以理论浓度为横坐标，以测定浓度为纵坐标进行线性回归，结果如图3所示，12种合成糖皮质激素的线性斜率和相关系数分别为：Slope＝1.0037，R2＝0.9989(Dexa)；Slope＝1.0091，R2＝0.9988(Beta)；Slope＝1.0385，R2＝0.9989(Bude)；Slope＝1.0024，R2＝0.9999(Cortisol)；Slope＝1.0275，R2＝0.9998(Cortisone)；Slope＝0.9852，R2＝0.9989(Flid)；Slope＝1.0363，R2＝0.9996(Flut-pro)；Slope＝1.0159，R2＝0.9992(Mege)；Slope＝1.0025，R2＝0.9997(Meth)；Slope＝0.9897，R2＝0.9990(Predl)；Slope＝1.0203，R2＝0.9996(Pred)；Slope＝0.9572，R2＝0.9973(Tria)。
实施例5.分析灵敏度的考察
1)LOB
每天测定重复4个空白水溶液和重复4个标准品溶液C1(0.1μg/dL)，持续5天，计算按表1所示计算LOB值。
表1-1 Dexa的LOB值
表1-2 Beta的LOB值
表1-3 Bude的LOB值
表1-4 Cortisol的LOB值
表1-5 Cortisone的LOB值
表1-6 Flid的LOB值
表1-7 Flut-pro的LOB值
表1-8 Mege的LOB值
表1-9 Meth的LOB值
表1-10 Predl的LOB值
表1-11 Pred的LOB值
表1-12 Tria的LOB值
1)小结：12种合成糖皮质激素LOB的浓度分别为：地塞米松：0.000μg/dL；倍他米松：0.000μg/dL；布地奈德：0.015μg/dL；皮质醇：0.006μg/dL；可的松：0.012μg/dL；氟氢可的松：0.000μg/dL；丙酸氟替卡松：0.000μg/dL；醋酸甲地孕酮：0.000μg/dL；甲基强的松龙：0.000μg/dL；泼尼松龙：0.000μg/dL；泼尼松：0.005μg/dL；曲安奈德：0.001μg/dL。
2)LOD
配制4个接近LOB浓度的样本：样本1(0.02μg/dL)、样本2(0.03μg/dL)、样本3(0.05μg/dL)、样本4(0.08μg/dL)，每天测定4个重复，同时每天4个测定C1(0.1μg/dL)重复，持续5天，按表2所示计算LOD值。
表2-1 Dexa的LOD值
表2-2 Beta的LOD值
表2-3 Bude的LOD值
表2-4 Cortisol的LOD值
表2-5 Cortisone的LOD值
表2-6 Flid的LOD值
表2-7 Flut-pro的LOD值
表2-8 Mege的LOD值
表2-9 Meth的LOD值
表2-10 Predl的LOD值
表2-11 Pred的LOD值
表2-12 Tria的LOD值
小结：12种合成糖皮质激素LOD-3SD≥LOB且离散值满足合理范围的最低样本浓度值分别为:地塞米松：0.05μg/dL；倍他米松：0.05μg/dL；布地奈德：0.05μg/dL；皮质醇：0.05μg/dL；可的松：0.09μg/dL；氟氢可的松：0.09μg/dL；丙酸氟替卡松：0.05μg/dL；醋酸甲地孕酮：0.05μg/dL；甲基强的松龙：0.09μg/dL；泼尼松龙：0.05μg/dL；泼尼松：0.09μg/dL；曲安奈德：0.05μg/dL。
实施例5.批内和批间精密度
在尿液样本中加入相应量的标准品配制一定浓度的质控样本：LQC和HQC，每个浓度水平测定3个重复，每天2个浓度，连续测定5天，如表4-1到表4-12所示，每个浓度水平变异系数(％CV)在15.0％以内，表明本方法具有良好的精密度，精密度在2.44-8.67％。
表4-1 Dexa批内和批间精密度
表4-2 Beta批内和批间精密度
表4-3 Bude批内和批间精密度
表4-4 Cortisol批内和批间精密度
表4-5 Cortisone批内和批间精密度
表4-6 Flid批内和批间精密度
表4-7 Flut-pro批内和批间精密度
表4-8 Mege批内和批间精密度
表4-9 Meth批内和批间精密度
表4-10 Predl批内和批间精密度
表4-11 Pred批内和批间精密度
表4-12 Tria批内和批间精密度
小结：上述12种糖皮质激素各自的批内和批间各水平的变异系数(％CV)均在15％以内，满足接受标准。
综上所述，上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。
Claims (16)
1.一种生物体液中糖皮质激素的液相色谱质谱联用的检测方法，其特征在于，包括：
(1)溶液配置和样本前处理：
配制一系列浓度梯度的糖皮质激素标准溶液及一定浓度的糖皮质激素内标溶液；
对添加了糖皮质激素内标溶液的生物体液样本进行蛋白沉淀和固液萃取板前处理，得供试品溶液；对添加了糖皮质激素内标溶液的一系列浓度梯度的糖皮质激素标准溶液进行蛋白沉淀和固液萃取板前处理，得对照品溶液；
所述蛋白沉淀和固液萃取板前处理的方法为：取一定体积的溶液用适量水稀释，然后进行振荡混匀、离心沉淀蛋白；将离心后的溶液分别转移至填充硅藻土吸附剂的固相萃取板中，用二氯甲烷洗脱，收集洗脱液并吹干，然后用一定体积的雌三醇溶液复溶；
所述糖皮质激素包括：地塞米松、倍他米松、布地奈德、皮质醇、可的松、氟氢可的松、丙酸氟替卡松、醋酸甲地孕酮、醋酸甲地孕酮、泼尼松龙、泼尼松、和曲安奈德十二种；
(2)液相色谱质谱联用检测：
其中，液相色谱条件为：色谱柱采用反相C12色谱柱；流动相包括流动相A和流动相B；流动相A为含0.05～0.15mM有机酸盐水溶液：乙腈＝9:1的混合溶液；流动相B为含0.05～0.15mM有机酸盐水溶液：乙腈＝1:9的混合溶液；采用梯度洗脱，梯度洗脱程序为：0～6.50min，流动相B体积百分比维持在20～30％；6.50～6.60min，流动相B体积百分比由20～30％增至55～65％；6.60～8.68min，流动相B体积百分比由55～65％递增至85～95％；8.68～9.18min，流动相B体积百分比保持为85～95％；9.18～9.20min，流动相B体积百分比由85～95％递减至20～30％；9.20～10.00，流动相B保持体积百分比为20～30％；
质谱条件为：离子源为电喷雾离子源；离子模式为正离子模式；监测模式为多反应监测模式；
(3)定量测定方法：
将所述对照品溶液以及供试品溶液按所述(2)色谱条件依次进样，记录色谱图；将对照品溶液中各糖皮质激素对其内标物的峰面积的比值与各糖皮质激素浓度分别进行线性回归产生标准曲线和/或拟合方程；将供试品溶液中各糖皮质激素对其内标物的峰面积的比值代入至所述标准曲线和/或拟合方程，得出生物体液中各糖皮质激素浓度。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述生物体液为尿液样本和血液样本。
3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述固相萃取板的类型为96孔深孔板。
4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述雌三醇溶液为体积百分浓度0.05～0.5％雌三醇的70％甲醇水溶液；更优选的，所述甲酸水溶液的体积百分浓度0.1～0.3％雌三醇的70％甲醇水溶液；更优选的，所述甲酸水溶液的体积百分浓度0.1％雌三醇的70％甲醇水溶液。
5.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中，流动相A中的有机酸盐选自乙酸铵或甲酸胺；流动相A中有机酸盐浓度为0.1mM。
6.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中，流动相B中的有机酸盐选自乙酸铵或甲酸胺；流动相B中有机酸盐浓度为0.1mM。
7.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中，采用梯度洗脱，梯度洗脱程序为：0～6.50min，流动相B体积百分比维持在23～27％；6.50～6.60min，流动相B体积百分比由23～27％增至58～62％；6.60～8.68min，流动相B体积百分比由58～62％递增至88～92％；8.68～9.18min，流动相B体积百分比保持为88～92％；9.18～9.20min，流动相B体积百分比由88～92％递减至23～27％；9.20～10.00，流动相B保持体积百分比为23～27％。
8.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中，色谱柱为PhenomenexSynergiTM4μm Max-RP
50x4.6mm，4μm。
9.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中，液相色谱的柱温为25.0～55.0℃；优选的，柱温为48.0～55.0℃；更优选的，柱温为50.0℃。
10.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，液相色谱的进样量为0.5～20.0μL；优选的，进样量为5.0～15.0μL；更优选的，进样量为10.0μL。
11.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中，液相色谱的流动相的流速为0.1～2.0mL/min；优选的，流速为0.3～1.0mL/min；更优选的，流速为0.7mL/min。
12.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中，质谱条件设置，驻留时间：0.050s，气帘气为20L/h，碰撞气为10L/h。
13.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中，质谱条件中12种糖皮质激素的检测离子对为：地塞米松和倍他米松：393.5→147.1、393.5→355.2和393.5→237.1；布地奈德：431.0→413.0、431.0→323.0和431.0→305.0；皮质醇：363.2→121.0、363.2→309.1和363.2→327.0；可的松：361.2→163.1和361.2→121.1；氟氢可的松：381.4→239.2和381.4→267.0；丙酸氟替卡松：501.5→313.1和501.5→292.3；醋酸甲地孕酮：385.1→223.8、385.1→267.1和385.1→325.2；甲基强的松龙：375.2→161.0、375.2→321.3；泼尼松龙：361.4→147.1、361.4→289.0和361.4→223.1；泼尼松：359.3→147.2、359.3→171.0和359.3→265.1；曲安奈德：435.4→397.0和435.4→321.0；
内标采用的离子对为：可的松-d7：368.4→169.1和368.4→124.9；地塞米松-d4：397.4→149.1和397.4→172.8；醋酸甲地孕酮-d3：388.5→270.1和388.5→226.8；泼尼松-d8：367.4→149.1和367.4→270.2；曲安奈德-d7：442.4→404.4；皮质醇-d3：366.2→121.1和366.2→97.0；布地奈德-d8：439.1→341.2和439.1→421.0。
14.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，一系列浓度梯度的糖皮质激素标准溶液中，12种合成糖皮质激素标准品的浓度范围均为0.0～10.0μg/dL。
15.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，一系列浓度梯度的糖皮质激素标准溶液中，12种合成糖皮质激素标准品的浓度梯度由低到高分别为：0.0μg/dL、0.1μg/dL、0.5μg/dL、2.5μg/dL、5.0μg/dL、10.0μg/dL。
16.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，糖皮质激素内标溶液中各内标浓度为0.5～50.0μg/dL。
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