CN115420812B - 一种检测尿液中Calcitroic acid的方法及其应用 - Google Patents
一种检测尿液中Calcitroic acid的方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及体外诊断技术领域，具体涉及一种检测尿液中Calcitroic acid的方法及其应用。所述的检测方法包括：待测样本预处理；样本处理；绘制校准曲线：结果分析。本发明提供的优点：填补了Calcitroic acid定量方法的空白。检测时间短，具有特异性高、高通量、灵敏度高、抗干扰能力强、重现性好。试剂廉价易得；方法简单，利于推广。为Calcitroic acid在尿液中产生的机理研究奠定了方法学上的基础，并且为不同疾病模型当中生物标志物的研究提供了可靠的技术支撑。
Description
技术领域
本发明涉及体外诊断技术领域，具体涉及一种检测尿液中Calcitroic acid的方法及其应用。
背景技术
维生素D是一种非常古老、高度保守的分子，出现在7.5亿年前。最初由简单生物的质膜组分开始逐渐演化至今，其功能已经发生巨大变化。维生素D主要与维生素D受体(VDR)结合发挥一系列生理作用。VDR广泛存在于机体各组织中，其多效性作用也被逐渐发现，在骨骼、肌肉、肿瘤、免疫、心血管、代谢、认知、衰老等各领域均发挥重要作用。
维生素D的研究始于上世纪初，当时斯汀伯克(Steenbock)观察到，经过辐射的食物具有抗佝偻病的特性，这在佝偻病困扰的工业时代是一个革命性的发现，尽管维生素D分子很快被分离出来，但科学家们花了40年时间才明白，在维生素D的代谢过程中产生的具有生物活性的维生素D类似物才是至关重要的。来自膳食或皮肤合成的维生素D不具有生物活性，需要由酶催化成有活性的代谢产物。维生素D在肝脏中被酶催化成25-羟基维生素D(25(OH)D)，然后在肾脏中被催化成1,25-二羟维生素D(1,25D)，被发现是所有类似物中最具有生物活性的，在维持机体各器官功能中起重要作用。
精确评估体内的1,25D水平对准确评估机体维生素D状态、机体各脏器功能、指导维生素D系统相关药物治疗、评估预后等具有重要作用。但临床上1,25D的检测存在较大困难：其水平极低(pg/ml级别)，检测难度大；本身为中间代谢产物，半衰期短，性质不稳定，对样本的收集要求严格，且容易造成检测误差；传统检测方法(如放射免疫法)误差大等，因此临床上无法常规进行1,25D的检测。更多的医疗机构退而求其次，仅检测25(OH)D用以代替1,25D的检测。但25(OH)D的检测仍存在系列弊端：25(OH)D需要在肾脏中被1α羟化酶羟化成具有生物活性的1,25-二羟维生素D，仅检测25(OH)D不能代表衰老、肾功能减退等生理、病理状态下的1,25D水平，且传统的25(OH)D检测方法亦存在较大误差。
Calcitroic acid化学名：1a-hydroxy-23-carboxy-24,25,26,27-tetranorvitaminD3，中文名：1a-羟基-23-羧基-24,25,26,27-四脱维生素D3。其结构式如下：
Calcitroic acid是三十余年前发现的1,25D的终末代谢产物，这个失活过程涉及到C(24)和C(23)原子上的一系列的氧化反应导致了侧链裂解，最终形成了Calcitroicacid。Calcitroic acid能够反映机体1,25D的真实水平，且其本身亦具有一定生物学功能；且该物质性质稳定，对样本的送检要求低。
到目前为止，还未有针对Calcitroic acid物质的定量方法，它在人体液中的浓度也并未见报道。与同传统的免疫学相比，液相色谱-质谱联用技术(LC-MS/MS)具有线性动态范围宽、通用性强、准确度高、多组分分析等优点，并且随着更多尖端技术的出现，使得LC-MS/MS灵敏度得到了显著提高，LC-MS/MS已逐渐成为内源性化合物研究必不可少的手段之一。但目前尚无利用LC-MS/MS对于Calcitroic acid定量方法。它在人体液中的浓度也未见报道。Calcitroic acid在尿液中产生的机理亦尚未见报道。
目前并未有针对Calcitroic acid的检测方法。其原因可能有：
A.Calcitroic acid在人体中的生理浓度可能非常低。
B.虽然Calcitroic acid与1α,25-二羟基维生素D3的结构十分类似，但所有适用于1α,25-二羟基维生素D3的检测方法，均提升不了Calcitroic acid物质的灵敏度。
C.该物质在真实样本中检测波动较大，无法保证检测结果的稳定性。
D.市场上缺乏Calcitroic acid的同位素内标，无法对检测结果进行更好的校正。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种检测时间短，具有特异性高、高通量、灵敏度高、抗干扰能力强、重现性好的一种检测尿液中Calcitroic acid的方法及其应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种检测尿液中Calcitroic acid的方法，其特征在于，所述的检测方法包括：
S101待测样本：
新鲜采集的人尿液样本；
S102样本处理：
S201，室温条件下，分别移取相同体积的系列浓度的标准品溶液、S101所述的待测样本，分别加入内标溶液和方法稳定剂，充分混匀；
S202，往步骤S201处理后的所有样品中分别加入乙腈或甲醇溶液进行蛋白沉淀；
S203，往步骤S202处理后的所有样品中分别加入0.5％～5％的甲酸-水溶液进行稀释后离心；
S204，将步骤S203处理后的所有样品上清液通过活化的固相萃取板进行萃取分离并洗脱，氮吹至干；
S205，往所有氮吹干后的样品加入甲醇-水溶液复溶；
S206，取复溶的样品上清液进行液相色谱-串联质谱分析；
S103绘制校准曲线：
通过各标准品标示浓度X，系列标准品与内标的峰面积比值Y，绘制校准曲线并拟合校准曲线方程；
S104结果分析：
分别将待检测人尿液样本中Calcitroic acid与内标峰面积比值代入校准曲线方程，计算待检测样本人尿液样本中Calcitroic acid的浓度。
进一步的，所述的标准品溶液为一组含有不同浓度Calcitroic acid标准品的人尿液溶液，按浓度大小依次设置，数量为至少6个，浓度为5～1000pg/mL；
所述的质控品为一组含有不同浓度Calcitroic acid标准品的人尿液溶液，按浓度大小依次设置，数量为至少3个，分别为低浓度质控品、中浓度质控品和高浓度质控品。
进一步的，所述的内标溶液为稳定同位素标记的雌酮-13C3甲醇溶液，浓度为1～10ng/mL；
进一步的，所述的方法稳定剂为50％甲醇-水溶液配制的1,2-二甲基-3-羟基-4-吡啶酮，浓度为50～150mM；
进一步的，所述的96孔固相萃取板萃取分离步骤包括：
(1)固相萃取板活化：取Oasis HLB Elution 96孔固相萃取板，先后使用乙腈溶液和甲酸-水溶液进行活化；
(2)上样：离心后上清液加载至活化后的固相萃取板中，使上清液缓慢全部通过固相萃取板；
(3)淋洗：往所有上样后的固相萃取板对应孔中加入甲醇溶液进行充分淋洗，使淋洗液缓慢的全部通过固相萃取板，弃掉所有淋洗液；
(4)洗脱及氮吹：往所有全部淋洗后的固相萃取板对应孔中加入乙腈溶液进行充分洗脱，使洗脱液缓慢的全部通过固相萃取板，并利用96孔板收集所有洗脱液，置于37℃条件下氮吹至干。
进一步的，所述的固相萃取板活化步骤中，乙腈溶液的使用量为500μL，所述的甲酸-水溶液的甲酸浓度为0.3％，使用量为500μL；
所述的淋洗步骤中，甲醇-水溶液的甲醇浓度为20％，使用量为500μL；
所述的洗脱及氮吹步骤中，乙腈溶液的使用量为500μL。
进一步的，所述的液相色谱条件为：
色谱柱型号：ZORBAX Eclipse Plus C18(2.1×50mm,1.8-Micron)；
柱温：40℃；
流动相A：含0.3mM氟化铵的水溶液；
流动相B：含0.5mM乙酸铵的甲醇溶液；
采用梯度洗脱程序：流动相A+流动相B＝100％，流速0.4mL/min；0～0.5min，流动相A体积保持50％；0.5～3.0min，流动相A体积由50％递减至2％；3.0～4.0min，流动相A体积保持2％；4.0～4.1min，流动相A体积由2％升高至50％；4.1～5.0min，流动相A体积保持50％；
所述的质谱条件为：
离子源：ESI-；喷雾毛细管电压(IonSpray Voltage)：-4500V；
离子源温度(Temperature)：500℃；
离子源雾化气(Ion Source Gas1)：50psi；
离子源加热辅助气(Ion Source Gas2)：50psi；
碰撞气(Collision Gas)：8psi；
气帘气(Curtain Gas)：35psi；
所述的液相色谱-质谱联用仪的质谱参数如下表：
表中Dwell Time表征扫描时间，CE表征碰撞电压，DP表征去簇电压。
进一步的，所述的步骤S201中，内标溶液添加量为10μL，方法稳定剂添加量为10μL；
所述的步骤S202中，加入乙腈或甲醇后涡旋震荡10min；
所述的步骤S203中，采用1％甲酸-水溶液稀释后离心，离心条件为12000rpm，10℃，10min；
所述的步骤S205中，用50％甲醇-水溶液复溶，涡旋震荡10min。
进一步的，所述的标准品工作溶液和质控品工作溶液的配制方法为：
标准品储备液的配制：
取标准品Calcitroic acid 100μg充分溶解，溶剂为甲醇溶液，得到Calcitroicacid浓度为100μg/mL的标准品储备液；
标准品次级储备液的配制：
准确移取适量的上述标准品储备液，用甲醇作为稀释液，进行100倍稀释，得到Calcitroic acid浓度为1μg/mL的标准品次级储备液；
内标储备液的配制：
准确移取适量商品化的雌酮-13C3内标溶液，用甲醇作为稀释液，得到雌酮-13C3浓度为1μg/mL的内标储备液；
标准品工作储备液C6-SSC的配制：
准确移取适量的上述标准品次级储备液，用甲醇作为稀释液，进行100倍稀释，得到Calcitroic acid浓度为10ng/mL的标准品工作储备液C6-SSC；
标准品工作储备液C1-SSC～C6-SSC及质控品工作储备液LQC-SSC～HQC-SSC配制：
标准品工作液C1～C6及质控品工作液LQC～HQC配制：
进一步的，所述的内标溶液的配制方法为：
准确移取适量的上述内标储备液，置于容量瓶，用甲醇溶液作为稀释液，定容，得到含2ng/mL雌酮-13C3的内标溶液；
所述的方法稳定剂的配制方法为：
精确称量139.2mg 1,2-二甲基-3-羟基-4-吡啶酮，置于10mL容量瓶，利用50％甲醇-水溶液充分溶解，并定容至10mL，得到含100mM 1,2-二甲基-3-羟基-4-吡啶酮的方法稳定剂。
本发明还提供一种尿液中Calcitroic acid的检测方法的应用。
一种尿液中Calcitroic acid的检测方法的应用，所述的尿液中Calcitroic acid检测方法用于研究和诊断。
本发明提供的检测尿液中Calcitroic acid的方法，所采用检测方法为液相色谱-串联质谱法，填补了目前Calcitroic acid定量方法的空白。本发明提供的检测尿液中Calcitroic acid的方法，采用液相色谱-质谱联用技术(LC-MS/MS)，具有线性动态范围宽、通用性强、检测灵敏度高、准确度高、多组分分析等优点。
本发明提供的检测尿液中Calcitroic acid的方法，利用商品化的稳定同位素标记的雌酮-13C3作为替代内标，并采用1,2-二甲基-3-羟基-4-吡啶酮作为方法稳定剂，大大提高方法的重现性；本发明采用Oasis HLB Elution 96孔固相萃取板实现人尿液样品中Calcitroic acid的富集，检测时间仅为5.0min，具有特异性高、高通量、灵敏度高、抗干扰能力强、重现性好的优点。
本发明提供的检测尿液中Calcitroic acid的方法，采用1,2-二甲基-3-羟基-4-吡啶酮作为方法稳定剂，能够对Calcitroic acid的响应起到稳定的效果。能有效解决尿液中Calcitroic acid检测波动大的问题。
本发明提供的检测尿液中Calcitroic acid的方法中，所采用的试剂均为常见/常用试剂，廉价易得；标准品、质控品、内标溶液和方法稳定剂配制方法简单，利于方法推广。
本发明提供的检测尿液中Calcitroic acid的方法，为后续研究Calcitroic acid生理及病理功能提供有利的检测工具，为实现Calcitroic acid的进一步临床转化打下坚实的基础。
与现有技术相比，本发明提供的一种检测尿液中Calcitroic acid的方法及其应用的优点：
(1)针对1α，25-二羟基维生素D3的所有检测方法无法适用于Calcitroic acid检测的难点，本方案成功建立了专门适用于Calcitroic acid检测的前处理方法，即：利用1％甲酸水作为样本稀释液，对样本进行稀释后，进一步采用Waters Oasis HLB固相萃取板对样本中Calcitroic acid进行富集。该前处理过程可显著提升目标分析物的响应。此外，除了与1α,25-二羟基维生素D3前处理流程的显著不同，Calcitroic acid检测的离子模式也不同，采用负离子模式能够显著的降低基质对该化合物的干扰。
(2)针对该物质在基质中检测结果波动较大的难点，本方案创新性的发现了一种稳定剂，1,2-二甲基-3-羟基-4-吡啶酮，稳定剂的添加可显著提高检测方法的重复性。
(3)针对缺乏稳定同位素内标的问题，本方案筛选出雌酮-13C3作为替代内标，该替代内标的使用能够同时实现对检测方法的前处理过程及基质效应的双重校正作用。
(4)本发明提供的检测尿液中Calcitroic acid的方法，为后续研究Calcitroicacid生理及病理功能提供有利的检测工具，为实现Calcitroic acid的进一步临床转化打下坚实的基础。
附图说明
图1是Calcitroic acid各种衍生条件下定量下限的检测结果。
其中，A为Calcitroic acid PTAD衍生条件下的定量下限(500pg/mL)结果，[M+H]+；流动相：水-甲醇体系(各含0.1％FA)。B为Calcitroic acid PTAD衍生条件下的定量下限(500pg/mL)结果，[M+H]+；流动相：水-甲醇体系(各含0.1％FA，水相中含5mM甲胺)，流动相A中添加5mM甲胺，[M+CH3NH3]+。C为Calcitroic acid Amplifex Diene衍生条件下的定量下限(500pg/mL)结果，[M]+；流动相：水-甲醇体系(各含0.1％FA)。
图2是Waters Oasis MAX与Waters Oasis HLB同规格的固相萃取板，在20pg/mL的响应结果。
图3是样品上固相萃取板前，用水稀释后Calcitroic acid的检测结果。
图4是样品上固相萃取板前，用1％甲酸-水溶液稀释后Calcitroic acid的检测结果。
图5是本发明提供的检测尿液中Calcitroic acid的方法中，Calcitroic acid的色谱图。
图6是本发明提供的检测尿液中Calcitroic acid的方法中，雌酮-13C3色谱图。
图7是本发明提供的检测尿液中Calcitroic acid的方法中，检测Calcitroicacid的线性方程。
图8是本发明提供的检测尿液中Calcitroic acid的方法中，Calcitroic acid系列标准品溶液的线性方程。
具体实施方式
为使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，以下实施例对本发明的作进一步详细描述，以下实施例仅用于说明发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1采用文献已报道的1α,25-二羟基维生素D3检测方法的前处理流程对Calcitroic acid进行初步检测参考文献(参考Ding,S.,et al(2010)的方法，血清样本中待测分析物经固相萃取板(含活化，上样，淋洗，洗脱、氮吹至干步骤)进行富集后，加入PTAD溶液进行衍生反应，待反应完全后，进行LC-MS/MS分析，Calcitroic acid的检测灵度，分别如图1中的图A(流动相A为0.1％甲酸水，流动相B为0.1％甲酸甲醇)、图B(流动相A为0.1％甲酸水并含5mM的甲胺，流动相B为0.1％甲酸甲醇)；参考Ziegler,Toni E.,et al(2014)中的方法，血清样本中待测分析物同样经固相萃取板进行富集后，洗脱液经氮气吹干，再加入Amplifex diene试剂进行衍生反应，待反应完全后，进行LC-MS/MS分析，Calcitroic acid的检测灵敏度，如图1中的图C(流动相A为0.1％甲酸水，流动相B为甲醇))中已有的1α,25-二羟基维生素D3的前处理流程，对Calcitroic acid检测灵敏度进行尝试，见图1，结果发现仅能实现最低500pg/mL Calcitroic acid的检出，表明适用于1α,25-二羟基维生素D3检测的前处理流程并不适用于Calcitroic acid的检测。
实施例2尿液样本前处理用固相萃取条件的筛选
本发明中比较了不同固相萃取板(Waters Oasis MAX与Waters Oasis HLB)对Calcitroic acid富集效果差异，结果如图2所示，对于相同浓度的Calcitroic acid的富集作用而言，Waters Oasis HLB固相萃取板显著优于Waters Oasis MAX，可显著提高目标分析物的提取回收率。
实施例3尿液样本前处理过程中稀释条件的筛选
尿液样品的稀释剂通常选择纯水，但本方案发现样本的稀释剂采用添加一定比例的甲酸水溶液(1％甲酸-水溶液)，与纯水相比，能够显著的提升化合物的富集效果，如图3-4所示。
实施例4 1,2-二甲基-3-羟基-4-吡啶酮可显著提升检测方法的重复性
利用随机尿液样本，分别添加低浓度(80pg/mL)和高浓度(400pg/mL)水平的Calcitroic acid标准品，获得低浓度水平及高浓度水平Calcitroic acid的尿液样本；通过同时比较低浓度及高浓度水平Calcitroic acid尿液样本在添加和未添加稳定剂条件下检测结果的重复性，每份样本均平行处理6次(test-1～test-6)，检测结果表明稳定剂1,2-二甲基-3-羟基-4-吡啶酮的添加可显著提升检测方法的重复性，从而保证检测方法的准确性，如下表(1)和表(2)所示。
表1不加稳定剂的检测结果
| 样品 | 低浓度水平 | 高浓度水平 |
| test-1 | 126.306 | 447.593 |
| test-2 | 170.5 | 498.35 |
| test-3 | 121.971 | 448.307 |
| test-4 | 127.845 | 563.321 |
| test-5 | 99.572 | 466.18 |
| test-6 | 131.715 | 490.902 |
| CV | 17.76％ | 8.95％ |
表2加入稳定剂的检测结果
实施例5新鲜尿液采集后离心过程对Calcitroic acid水平的影响
征集6名志愿者，采集尿液样本，并将每个志愿者的尿液等分为2份，其中一等份经12000rpm，4℃，离心10min后取上清，经前处理步骤后，用于Calcitroic acid浓度测定；另一等份直接经前处理步骤，用于Calcitroic acid浓度测定，具体测定结果见表(3)；结果表明，离心与否对检测结果并没有显著的影响。
表3 6例志愿者样本的尿液Calcitroic acid水平
实施例6系列标准品工作液和质控品工作液制备
(1)标准品储备液的配制
将购买的商品化的100μg Calcitroic acid充分溶解，溶剂为纯甲醇溶液，得到Calcitroic acid浓度为100μg/mL的标准品储备液。
(2)标准品次级储备液的配制
准确移取适量的上述标准品储备液，选用甲醇作为稀释液，得到Calcitroic acid浓度为1μg/mL的标准品次级储备液。
(3)内标储备液的配制
准确移取适量商品化的雌酮-13C3内标溶液，优先选用甲醇作为稀释液，得到雌酮-13C3浓度为1μg/mL的内标储备液。
(4)标准品工作储备液C6-SSC的配制
准确移取适量的上述标准品次级储备液，选用甲醇作为稀释液，得到Calcitroicacid浓度为10ng/mL的标准品C6-SSC。
(5)标准品工作储备液C1-SSC～C5-SSC及质控品工作储备液LQC-SSC～HQC-SSC配制
表4标准品工作储备液C1-SSC～C5-SSC及质控品工作储备液LQC-SSC～HQC-SSC配制
(6)标准品工作液C1～C6及质控品工作液LQC～HQC配制
表5标准品工作液C1～C6及质控品工作液LQC～HQC配制
(7)内标溶液配制
准确移取适量的上述内标储备液，置于25mL容量瓶，优先选用甲醇溶液作为稀释液，定容至25mL，得到含2ng/mL雌酮-13C3的内标溶液。
(8)稳定剂配制
精确称量139.2mg1,2-二甲基-3-羟基-4-吡啶酮，置于10mL容量瓶，利用50％甲醇溶液进行充分溶解，并定容至10mL，得到含100mM 1,2-二甲基-3-羟基-4-吡啶酮的方法稳定剂。
实施例7尿液中Calcitroic acid的检测
1.待测样本
新鲜采集的人尿液样本。
2.样本前处理：
1)室温条件下，分别移取600μL系列浓度的标准品溶液、低中高浓度的质控品溶液和经预处理后的待测样本，加入10μL内标溶液和10μL方法稳定剂，充分混匀；
2)往步骤1)所有管中加入500μL乙腈溶液，并涡旋震荡10min进行蛋白沉淀；
3)往步骤2)所有管中加入600μL 1％甲酸-水溶液进行稀释，涡旋震荡1min使其充分混均后离心，离心条件为：12000rpm，10℃，10min。
4)固相萃取板活化：取Oasis HLB Elution 96孔固相萃取板，先后使用500μL乙腈溶液和500μL 0.3％甲酸-水溶液进行活化。
5)上样：取步骤3)所有管中离心后上清液加载至活化后的固相萃取板中，使上清液缓慢全部通过固相萃取板。
6)淋洗：往所有上样后的固相萃取板对应孔中加入500μL 20％甲醇-水溶液进行充分淋洗，使淋洗液缓慢的全部通过固相萃取板，弃掉所有淋洗液。
7)洗脱及氮吹：往所有全部淋洗后的固相萃取板对应孔中加入500μL乙腈溶液进行充分洗脱，使洗脱液缓慢的全部通过固相萃取板，并利用96孔板收集所有洗脱液，置于37℃条件下氮吹至干。
8)复溶：往所有氮吹干后的样品孔中加入100μL 50％甲醇-水溶液，涡旋震荡10min，充分溶解。
9)取25.0μL上清进行LC-MS/MS分析。
3.高效液相色谱串联质谱法进行样本分析检测，检测条件为：
色谱柱型号：ZORBAX Eclipse Plus C18(2.1×50mm,1.8-Micron)；
柱温：40℃；
流动相A：含0.3mM氟化铵的水溶液；
流动相B：含0.5mM乙酸铵的甲醇溶液；
采用梯度洗脱程序：流动相A+流动相B＝100％，流速0.4mL/min；0～0.5min，流动相A体积保持50％；0.5～3.0min，流动相A体积由50％递减至2％；3.0～4.0min，流动相A体积保持2％；4.0～4.1min，流动相A体积由2％升高至50％；4.1～5.0min，流动相A体积保持50％；
所述的质谱条件为：
离子源：ESI-；喷雾毛细管电压(IonSpray Voltage)：-4500V；
离子源温度(Temperature)：500℃；
离子源雾化气(Ion Source Gas1)：50psi；
离子源加热辅助气(Ion Source Gas2)：50psi；
碰撞气(Collision Gas)：8psi；
气帘气(Curtain Gas)：35psi；
所述的液相色谱-质谱联用仪的质谱参数如表(6)所述：
表6液相色谱-质谱联用仪的质谱参数
表6中Dwell Time表示扫描时间，CE表示碰撞电压，DP表示去簇电压。
其中Calcitroic acid的色谱图见图5所示，雌酮-13C3的色谱图见图6所示。
4.绘制校准曲线：
通过各标准品标示浓度X，系列标准品与内标的峰面积比值Y，绘制校准曲线并拟合校准曲线方程，如图7所示。
5.结果分析
通过各标准品标示浓度(X)，系列标准品与内标的峰面积比值(Y)，绘制校准曲线并拟合校准曲线方程；再分别将待测人尿液样本中Calcitroic acid与内标峰面积比值代入校准曲线方程，即可定量计算待测人尿液样本中Calcitroic acid的浓度。
实施例8线性验证
利用系列标准品溶液进行线性范围的验证，进行3个分析批的验证(3天)，结果如表(7)和图8所示。
表7线性验证结果
结果表明本发明检测人尿液中Calcitroic acid的浓度，具有良好的线性。线性均符合技术要求(技术要求：最低浓度平均偏差应为±20％以内，其余浓度点的平均偏差应在±15％以内；且线性回归：相关系数：R2≥0.98)。
实施例9精密度验证
批内精密度：通过检测高中低水平质控品计算得到；每个浓度水平(低浓度(LQC)、中浓度(MQC)、高浓度(HQC))平行制备6份平行样本，测定1批，检测结果如下表所示，Calcitroic acid批内变异系数(CV％)均<15％，符合技术要求(批内变异系数(CV％)≤15％)。
批间精密度：通过检测高中低水平质控品计算得到；每个浓度水平平行制备6份平行样本，连续测定3批，检测结果如表(8)所示，Calcitroic acid批间变异系数(CV％)均<15％，符合技术要求(批间变异系数(CV％)≤15％)。
表8批内及批间精密度验证结果
实施例10准确度验证
本发明利用回收试验进行准确度评估。选择混合人尿液为常规样本；向常规样本(混合人尿液)中加入不同量的待测物标准品，制成3个不同加入浓度的回收样本(低浓度(LQC)、中浓度(MQC)、高浓度(HQC))，用本发明对回收样本进行测定，对样本进行3次重复分析，取其均值进行计算，检测结果如表(9)所示。
表9准确度验证结果
Calcitroic acid的回收率均在85％～115％范围内，符合技术要求(待分析物的回收率应在85％～115％范围内)。
实施例11残留验证
本发明通过在注射标准品C6后，连续注射5针空白样品来评价；连续测定3天，检测结果如表(10)所示。
表10残留验证结果
Calcitroic acid的标准品C6后的空白样品中的残留均小于20％C1，符合技术要求(空白溶液的峰面积<20％C1峰面积)。
实施例12特异性验证
利用混合空白人尿液溶液配制浓度为C1的样本，及五个不同来源的人尿液空白样品，3个分析批(3天)的重复来评价方法特异性，结果如表(11)。
表11特异性验证结果
/>
双空白人尿液样品中Calcitroic acid的峰面积均<15％C1的峰面积；且双空白人尿液样品中内标的峰面积均<5％C1样本中内标峰面积，符合技术要求(空白尿液样品中化合物峰面积均≤20％C1峰面积；且其内标峰面积均≤5％C1样本中内标峰面积)。
实施例13稀释一致性验证
利用人尿液溶液配制浓度为C6的样本，利用空白尿液样本稀释C6至一定浓度，进行6次重复分析，检测结果如表(12)所示。
表12稀释验证结果
检测值与理论值偏差均在±15％以内，符合技术要求(检测值与理论值偏差<±15％)。
实施例14基质效应实验结果
选取六个不同个体来源的人尿液样本，添加低、高浓度点的目标分析物，并选取目标分析物低、高浓度点的纯溶液以及二者的1:1混合液，分别处理后进样分析，检测结果如表(13)所示：A
表13基质效应验证结果
/>
1:1混合液样本的响应值与对应尿液样本和纯溶液样本响应值的均值相比，符合技术要求(偏差<20％)。
实施例15定量限验证
选择3个浓度接近检测限的样本，每个浓度样本分为5份进行处理，连续测定3个批次，实验结果见下表(14)。
表14定量限验证结果
设置5pg/mL、7pg/mL以及10pg/mL三个浓度点，其中满足CV≤20％、准确度<15％的最低浓度样本为10pg/mL，故定量限为10pg/mL。
实施例16 LC-MS/MS方法初步应用
征集30名不同年龄阶段和不同性别的志愿者，并采集尿液样本，应用本发明建立的LC-MS/MS方法进行Calcitroic acid浓度测定，具体结果见表(15)，30例样本中，共有17例含有可检出的Calcitroic acid，其中6例Calcitroic acid含量大于10pg/mL。
表15 30例志愿者样本的尿液Calcitroic acid水平
/>
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种变换，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征和步骤，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (6)
1.一种非诊断目的的检测尿液中 Calcitroic acid 的方法，其特征在于，检测方法包括：
S101 待测样本：新鲜采集的人尿液样本；
S102 样本处理：
S201，室温条件下，分别移取相同体积的系列浓度的标准品溶液、经预处理后的待测样本，分别加入内标溶液和方法稳定剂，充分混匀，所述内标为稳定同位素标记的雌酮；所述方法稳定剂为 50%甲醇-水溶液配制的 1.2-二甲基-3-羟基-4-吡啶酮，浓度为50~150mM；
S202，往步骤 S201处理后的所有样品中分别加入乙腈或甲醇溶液进行蛋白沉淀；
S203，往步骤 S202 处理后的所有样品中分别加入 0.5%~5%的甲酸-水溶液进行稀释后离心；
S204，将步骤 S203 处理后的所有样品上清液通过活化的固相萃取板进行萃取分离并洗脱，氮吹至干；
S205，往所有氮吹干后的样品中加入甲醇-水溶液复溶；
S206，取复溶的样品上清液进行液相色谱-串联质谱分析；
S103 绘制校准曲线：
通过各标准品标示浓度 X，系列标准品与内标的峰面积比值 Y，绘制校准曲线并拟合校准曲线方程；
S104 结果分析：
分别将待检测人尿液样本中 Calcitroic acid 与内标峰面积比值代入校准曲线方程，计算待检测样本人尿液样本中 Calcitroic acid 的浓度。
2.根据权利要求1所述的一种非诊断目的的检测尿液中 Calcitroic acid 的方法 其特征在于，所述的内标溶液为稳定同位素标记的雌酮-13C3 甲醇溶液，浓度为1~10ng/mL。
3.根据权利要求1所述的一种非诊断目的的检测尿液中 Calcitroic acid 的方法，其中所述S203 步骤中的甲酸-水溶液为 0.5-5%的甲酸-水溶液，S205 步骤中采用 40-60%甲醇-水溶液复溶。
4.根据权利要求1所述的一种非诊断目的的检测尿液中 Calcitroic acid 的方法，所述的标准品溶液为含有梯度浓度 Calcitroic acid 标准品的人尿液溶液，按浓度大小依次设置，数量为至少6个，浓度为5~1000pg/mL。
5.根据权利要求1或4所述的一种非诊断目的的检测尿液中 Calcitroic acid 的方法，所述方法中还加入了质控品溶液用于评估检测方法的准确性，所述的质控品溶液为一组含有不同浓度 Calcitroic acid 标准品的人尿液溶液，按浓度大小依次设置数量为至少3个，分别为低浓度质控品、中浓度质控品和高浓度质控品。
6.根据权利要求1所述的一种非诊断目的的检测尿液中 Calcitroic acid 的方法，其特征在于，所述的固相萃取板萃取分离步骤包括：
(1)固相萃取板活化：取固相萃取板，先后使用乙腈溶液和甲酸-水溶液进行活化；
(2)上样：离心后上清液加载至活化后的固相萃取板中，使上清液缓慢全部通过固相萃取板；
(3)淋洗：往所有上样后的固相萃取板对应孔中加入甲醇-水溶液进行充分淋洗，使淋洗液缓慢的全部通过固相萃取板，弃掉所有淋洗液；
(4)洗脱：往所有全部淋洗后的固相萃取板对应孔中加入乙腈溶液进行充分洗脱，使洗脱液缓慢的全部通过固相萃取板，并收集所有洗脱液。
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