CN111721854A - 一种同时检测血清中11项类固醇激素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种同时检测血清中11项类固醇激素的方法，涉及血液分析技术领域，包括以下步骤：（1）静脉血，离心得到待测血清；（2）内标液加入释放剂A，得到内标工作液；（3）母液加入甲醇进行稀释，得到标准曲线溶液；（4）试液配置：配置待测样品、标准曲线样、质控样；（5）将待测样品、标准曲线样、质控样经混合、离心；（6）平衡固相萃取板；（7）将以上溶液放到平衡以后的固相萃取板上；（8）淋洗：取甲醇放置于固相萃取板；（9）洗脱：收集洗脱液，加入的甲醇，进样分析；（10）构建线性回归方程。本发明能够同时检测血清中类固醇激素，可同时进行鉴定和定量分析类固醇激素，检测时间短，通量高，检测灵敏度高，特异性好。

Description

一种同时检测血清中11项类固醇激素的方法
技术领域
本发明涉及血液分析技术领域，具体涉及一种同时检测血清中11项类固醇激素的方法。
背景技术
超高效液相色谱串联质谱法（UPLC-MS/MS）集超高效液相色谱的超强分离能力和质谱的高特异性、高灵敏度的特点，通过超高效液相色谱的分离，使目标化合物与其他干扰物分离，进一步利用串联质谱选择性地检测目标化合物离子信号，排除干扰成分离子信号，使检测结果更加灵敏、准确。
采用超高效液相色谱串联质谱法检测血清中类固醇激素浓度，不仅可以实现目标化合物与血清基质的分离，而且还可以减少目标化合物与杂质间的信号干扰，因此，采用超高效液相色谱串联质谱法检测血清中类固醇激素浓度可有效排除假阳性信号的干扰，使检测结果更加灵敏、准确。
类固醇激素是胆固醇经一系列酶催化产生的脂溶性小分子，具有维持新陈代谢、调节性功能等重要作用，定量检测类固醇激素对许多内分泌疾病的诊断和治疗有重要意义。但由于类固醇激素涉及分子种类多、结构类似、体内含量低，定量检测分析存在一定的难度。
目前，检测类固醇激素的方法主要有免疫分析法、气相色谱-质谱法(GC-MS)和液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)。其中免疫分析包括：放射免疫法、化学发光免疫分析、酶联免疫法和电化学发光法。免疫法可以自动化操作，检测快速、成本低，是目前临床实验室常用的类固醇激素检测方法，其缺点是特异性差，容易出现交叉反应，而且一次只能检测一种类固醇激素。GC-MS法特异性好，可同时检测多种类固醇激素，但样品的提取、纯化和衍生步骤比较繁琐，使其在临床广泛开展难度很大。相比于免疫分析法与GC-MS法，LC-MS/MS主要采用电喷雾离子源-三重四极杆分析器质谱，在类固醇激素检测中具有实验结果的特异性高，高精度的分子量检测确保了实验的特异性和正确性；检测限可以到达pg/mL，检测灵敏度不低于甚至优于其他检测方法。
生物样品基质复杂，易对含量较低的类固醇激素的检测造成干扰，除了仪器的特异性外，净化与富集也会影响检测的数据。
公开号为CN107064400A的中国专利中公开了一种同时检测血清中五种类固醇激素的方法，所述五种类固醇激素分别为：睾酮、雄烯二酮、11-脱氧皮质醇、皮质醇和可的松；检测方法包括如下步骤：样品前处理：在血清样品中加入内标物的乙腈溶液进行蛋白沉淀，再加入叔丁基甲醚进行萃取，上清液吹干，加入复溶液，取上清液得待测样品；富集、分离和检测：对所述待测样品采用二维液相色谱串联四级杆质谱联用仪进行富集、分离和检测。上述检测方法采用一种方法同时检测血清中五种浓度范围不一致的化合物，同时检测五种化合物的时间约为8.5～12.0min。上述检测方法成本低，通量高灵敏度高、精密度高、特异性强。该申请中检测数据准确性容易受到干扰。
现有技术中血样中激素检测的特异性差，容易出现交叉反应，而且一次只能检测一种类固醇激素，准确性差。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种同时检测血清中11项类固醇激素的方法，该检测方法的准确度好、灵敏度高，重现性好，可有限解决临床样本的数量多、基底复杂、目标化合物浓度低等问题。
一种同时检测血清中11项类固醇激素的方法，包括以下步骤：
（1）抽取静脉血2.0ml置于惰性分离胶促凝真空采血管，加入惰性分离胶和促凝剂，混合后离心得到待测血清；
（2）取类固醇激素的内标液复溶以后加入释放剂A，得到内标工作液,所述释放剂A包括乙腈、甲醇，释放剂A的质量浓度为80-85%，内标液、释放剂A的体积比为1:200；
（3）取至少6份已知浓度的类固醇激素的母液加入甲醇进行稀释，得到不同浓度的标准曲线溶液，母液可以是6-12份，所述母液中皮质素、皮质醇、11-脱氧皮质醇、皮质酮、脱氢表雄酮、雄烯二酮、睾酮、17-羟孕烯醇酮、17-羟孕酮、孕酮、脱氢表雄酮硫酸酯的质量比为50：100:10：5:10:2：5:20：10:5:2000。；
（4）试液配置：配置待测样品、标准曲线样、质控样，所述待测样品包括待测血清、内标工作液；所述标准曲线样包括标准曲线溶液、内标工作液；质控样（质控品高中低就是采购去激素的人血清，添加3种浓度级别的11种类固醇激素标准品；高中低质控基质，无差别，主要是类固醇激素的浓度不同）包括质控溶液、内标工作液，所述质控溶液为去激素的人血清中加入已知量的类固醇激素的溶液；
（5）将待测样品、标准曲线样、质控样经混合、离心；
（6）平衡固相萃取板：将释放剂A、蒸馏水依次放到固相萃取板上，在真空度为1-3psi使释放剂A、蒸馏水通过所述固相萃取板；
（7）取步骤（4）所述的待测样品、标准曲线样、质控样分别放到平衡以后的固相萃取板上，调整真空度使得待测样品、标准曲线样、质控样通过固相萃取板；
（8）淋洗：取质量分数为15%的甲醇放置于经步骤（7）所述的固相萃取板，调整真空度使甲醇通过固相萃取板；
（9）洗脱：将经过步骤（8）处理的固相萃取板底部的废液接收板换成上样板，将乙腈放到固相萃取板上，收集洗脱液，加入质量分数为5%的甲醇，进样分析，废液接收板：就是为了用来接收平衡活化流出的液体、上样后的废液、淋洗的废液；与固相萃取板配套；
（10）以标准曲线样中类固醇激素的峰面积与内标工作液中的类固醇激素的峰面积的比值为纵坐标，以标准溶液中类固醇激素相应的浓度为横坐标进行线性回归，获得类固醇激素线性回归方程，将待测样品、质控样中类固醇激素的峰面积与内标工作液中的类固醇激素的峰面积的比值带入标准曲线线性方程计算待测样品中类固醇激素的浓度。
其中，所述11项类固醇激素包括：皮质素、皮质醇、皮质酮、11-脱氧皮质醇、雄烯二酮、睾酮、脱氢表雄酮、17-羟孕酮、17-羟孕烯醇酮、孕酮、脱氢表雄酮硫酸酯。
所述质控样有3个，包括类固醇激素高浓度样、类固醇激素中浓度样、类固醇激素低浓度样。用于排除外在环境的影响，提高检测的可信度。
步骤（2）所述内标液包括皮质素-d7、皮质醇-d4、11-脱氧皮质醇-d5、皮质酮-d4、脱氢表雄酮-d6、雄烯二酮-13C3、睾酮-13C3、17-羟孕烯醇酮-13C22H2、17-羟孕酮-d8、孕酮-d9、（2500ng/mL）脱氢表雄酮硫酸酯-d6。所述的内标液中各物质的比例可以为皮质素-d7、皮质醇-d4、11-脱氧皮质醇-d5、皮质酮-d4、脱氢表雄酮-d6、雄烯二酮-13C3、睾酮-13C3、17-羟孕烯醇酮-13C22H2、17-羟孕酮-d8、孕酮-d9、2500ng/mL脱氢表雄酮硫酸酯-d6质量比为：10：10：5：2.5：50:1：5：5：10：10：250。
所述进样分析过程中液质流动相包含乙酸铵、甲酸。以55%水相-45%有机相作为初始流动相，再以较低的速率（3.3%/min）增加有机相比例。
本方法运用蛋白沉淀对血清样本进行预处理，再借助固相萃取技术对预处理后的样本进行净化和富集，达到提高灵敏度和重现性的效果，可同时对96个血清样本进行处理，处理时长不超过1小时，11种类固醇激素在超高效液相色谱串联质谱上的分离检测可在8min内完成，本方案之所以能够在8min内完成是因为在流动相中加入甲酸有利于增强正离子监测模式下，分析物的离子化效率，增强信号强度，提高检测灵敏度；加入乙酸铵增加了流动相的缓冲能力，改善了峰形，使各目标物分离良好。由于类固醇激素与T3色谱柱固定相作用力较强，以55%水相-45%有机相作为初始流动相，增强流动相的洗脱能力，使目标峰提前出峰；使目标物逐一出峰，保证了良好的分离度。
综上，基于固相萃取结合超高效液相色谱串联质谱法测定血清中11种类固醇激素的方法分析时间短，可同时处理96份样本，且灵敏度高、重现性好，可有限解决临床样本的数量多、基底复杂、目标化合物浓度低等问题。
有益效果：该检测方法的准确度好、灵敏度高，可以为相关疾病的判断治疗以及健康评估提供条件，同时检测11种类固醇也可提高相关疾病诊断的准确性，比如血清睾酮和脱氢表雄酮硫酸酯的同时检测可提高多卵巢综合征的诊断率。
本发明能够同时检测血清中类固醇激素。首先，采用蛋白沉淀进行样本预处理，离心分离取上清液进行固相萃取，进行高效液相色谱结合三重四级杆串联质谱仪进行检测分析。该方法能够有效地去除基质物质的干扰，可同时进行鉴定和定量分析类固醇激素，检测时间短，通量高，检测灵敏度高，特异性好。
具体实施方式
下面根据具体实施方式对本发明进行详细描述。
实施例1
一种同时检测血清中11项类固醇激素的方法，包括以下步骤：
（1）抽取静脉血2.0ml置于惰性分离胶促凝真空采血管，加入惰性分离胶和促凝剂，混合后离心得到待测血清；
（2）取类固醇激素的内标液复溶以后加入释放剂A稀释，得到内标工作液,所述释放剂A包括乙腈、甲醇，释放剂A的质量浓度为80-85%，内标液、释放剂A的体积比为1:200；
（3）取6份已知浓度的类固醇激素的母液加入甲醇进行稀释，得到不同浓度的标准曲线溶液，所述母液中皮质素、皮质醇、11-脱氧皮质醇、皮质酮、脱氢表雄酮、雄烯二酮、睾酮、17-羟孕烯醇酮、17-羟孕酮、孕酮、脱氢表雄酮硫酸酯的质量比为50：100:10：5:10:2：5:20：10:5:2000，可制备6份标准曲线样；
（4）试液配置：配置待测样品、标准曲线样、质控样，所述待测样品包括200μL待测血清、200μL内标工作液、500μL蒸馏水；所述标准曲线样包括200μL标准曲线溶液、200μL内标工作液、500μL蒸馏水；质控样（质控品高中低就是采购去激素的人血清，添加3种浓度级别的11种类固醇激素标准品；高中低质控基质，无差别，主要是类固醇激素的浓度不同）包括200μL质控溶液、200μL内标工作液、500μL蒸馏水，所述质控溶液为去激素的人血清中加入已知量的类固醇激素的溶液；
（5）将待测样品、标准曲线样、质控样中的组分混合，混合涡旋混合3min后，于4℃，15000r离心10min；
（6）平衡固相萃取板：200μL将释放剂A、200μL蒸馏水依次放到固相萃取板上，在真空度为1-3psi使释放剂A、蒸馏水通过所述固相萃取板；
（7）取步骤（4）所述的800μL待测样品、标准曲线样、质控样分别放到平衡以后的固相萃取板上，调整真空度，并在低真空度下（真空度由0逐渐增大至6psi），使得待测样品、标准曲线样、质控样通过固相萃取板；
（8）淋洗：取200μL质量分数为15%的甲醇放置于经步骤（7）所述的固相萃取板，调整真空度使甲醇通过固相萃取板；
（9）洗脱：将经过步骤（8）处理的固相萃取板底部的废液接收板换成上样板，将60μL乙腈分两次放到固相萃取板上，收集洗脱液，加入60μL质量分数为5%的甲醇，震荡2min，进样分析，废液接收板：就是为了用来接收平衡活化流出的液体、上样后的废液、淋洗的废液；与固相萃取板配套；
（10）以标准曲线样中各类固醇激素的峰面积与内标工作液中的类固醇激素的峰面积的比值为纵坐标，以标准溶液中类固醇激素相应的浓度为横坐标进行线性回归，获得类固醇激素线性回归方程，将待测样品或质控样中类固醇激素的峰面积与内标工作液中的类固醇激素的峰面积的比值带入标准曲线线性方程计算待测样品中类固醇激素的浓度。
其中，所述11项类固醇激素包括：皮质素、皮质醇、皮质酮、11-脱氧皮质醇、雄烯二酮、睾酮、脱氢表雄酮、17-羟孕酮、17-羟孕烯醇酮、孕酮、脱氢表雄酮硫酸酯。
所述质控样有3个，包括类固醇激素高浓度样、类固醇激素中浓度样、类固醇激素低浓度样。用于排除外在环境的影响，提高检测的可信度。
步骤（2）所述内标液包括皮质素-d7、皮质醇-d4、11-脱氧皮质醇-d5、皮质酮-d4、脱氢表雄酮-d6、雄烯二酮-13C3、睾酮-13C3、17-羟孕烯醇酮-13C22H2、17-羟孕酮-d8、孕酮-d9、（2500ng/mL）脱氢表雄酮硫酸酯-d6。所述的内标液中各物质的比例可以为皮质素-d7、皮质醇-d4、11-脱氧皮质醇-d5、皮质酮-d4、脱氢表雄酮-d6、雄烯二酮-13C3、睾酮-13C3、17-羟孕烯醇酮-13C22H2、17-羟孕酮-d8、孕酮-d9、2500ng/mL脱氢表雄酮硫酸酯-d6质量比为：10：10：5：2.5：50:1：5：5：10：10：250。
所述进样分析过程中液质流动相包含乙酸铵、甲酸。
实施例2
一种同时检测血清中11项类固醇激素的方法，包括以下步骤：
（1）抽取静脉血2.0ml置于惰性分离胶促凝真空采血管，加入惰性分离胶和促凝剂，混合后离心得到待测血清；
（2）取类固醇激素的内标液复溶以后加入释放剂A稀释，得到内标工作液,所述释放剂A包括乙腈、甲醇，释放剂A的质量浓度为80-85%，内标液、释放剂A的体积比为1:200；
（3）取12份已知浓度的类固醇激素的母液加入甲醇进行稀释，得到不同浓度的标准曲线溶液，所述母液中皮质素、皮质醇、11-脱氧皮质醇、皮质酮、脱氢表雄酮、雄烯二酮、睾酮、17-羟孕烯醇酮、17-羟孕酮、孕酮、脱氢表雄酮硫酸酯的质量比为50：100:10：5:10:2：5:20：10:5:2000，可制备12份标准曲线样；
（4）试液配置：配置待测样品、标准曲线样、质控样，所述待测样品包括100μL待测血清、100μL内标工作液、250μL蒸馏水；所述标准曲线样包括100μL标准曲线溶液、100μL内标工作液、250μL蒸馏水；质控样（质控品高中低就是采购去激素的人血清，添加3种浓度级别的11种类固醇激素标准品；高中低质控基质，无差别，主要是类固醇激素的浓度不同）包括100μL质控溶液、100μL内标工作液、250μL蒸馏水，所述质控溶液为去激素的人血清中加入已知量的类固醇激素的溶液；
（5）将待测样品、标准曲线样、质控样中的组分混合，混合涡旋混合3min后，于4℃，15000r离心10min；
（6）平衡固相萃取板：200μL将释放剂A、200μL蒸馏水依次放到固相萃取板上，在真空度为1-3psi使释放剂A、蒸馏水通过所述固相萃取板；
（7）取步骤（4）所述的800μL待测样品、标准曲线样、质控样分别放到平衡以后的固相萃取板上，调整真空度，并在低真空度下（真空度由0逐渐增大至6psi），使得待测样品、标准曲线样、质控样通过固相萃取板；
（8）淋洗：取200μL质量分数为15%的甲醇放置于经步骤（7）所述的固相萃取板，调整真空度使甲醇通过固相萃取板；
（9）洗脱：将经过步骤（8）处理的固相萃取板底部的废液接收板换成上样板，将60μL乙腈分两次放到固相萃取板上，收集洗脱液，加入60μL质量分数为5%的甲醇，震荡2min，进样分析，废液接收板：就是为了用来接收平衡活化流出的液体、上样后的废液、淋洗的废液；与固相萃取板配套；
（10）以标准曲线样中各类固醇激素的峰面积与内标工作液中的类固醇激素的峰面积的比值为纵坐标，以标准溶液中类固醇激素相应的浓度为横坐标进行线性回归，获得类固醇激素线性回归方程，将待测样品或质控样中类固醇激素的峰面积与内标工作液中的类固醇激素的峰面积的比值带入标准曲线线性方程计算待测样品中类固醇激素的浓度。
其中，所述11项类固醇激素包括：皮质素、皮质醇、皮质酮、11-脱氧皮质醇、雄烯二酮、睾酮、脱氢表雄酮、17-羟孕酮、17-羟孕烯醇酮、孕酮、脱氢表雄酮硫酸酯。
所述进样分析过程中液质流动相包含乙酸铵、甲酸。
实施例3
本实施例中的操作参考实施例2，其区别是母液为10份，可制备10份标准曲线样。
本发明能够同时检测血清中类固醇激素。首先，采用蛋白沉淀进行样本预处理，离心分离取上清液进行固相萃取，进行高效液相色谱结合三重四级杆串联质谱仪进行检测分析。该方法能够有效地去除基质物质的干扰，可同时进行鉴定和定量分析类固醇激素，检测时间短，通量高，检测灵敏度高，特异性好。
本发明不局限于上述具体的实施方式，本发明可以有各种更改和变化。凡是依据本发明的技术实质对以上实施方式所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种同时检测血清中11项类固醇激素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）抽取静脉血置于惰性分离胶促凝真空采血管，加入惰性分离胶和促凝剂，混合后离心得到待测血清；
（2）取类固醇激素的内标液复溶以后加入释放剂A稀释，得到内标工作液, 所述释放剂A包括乙腈、甲醇；
（3）取至少6份已知浓度的类固醇激素的母液加入甲醇进行稀释，得到不同浓度的标准曲线溶液；
（4）试液配置：配置待测样品、标准曲线样、质控样，所述待测样品包括待测血清、内标工作液；所述标准曲线样包括标准曲线溶液、内标工作液；质控样包括质控溶液、内标工作液，所述质控溶液为去激素的人血清中加入已知量的类固醇激素的溶液；
（5）将待测样品、标准曲线样、质控样经混合、离心；
（6）平衡固相萃取板：将释放剂A、蒸馏水依次放到固相萃取板上，调整真空度使释放剂A、蒸馏水通过所述固相萃取板；
（7）取步骤（4）所述的待测样品、标准曲线样、质控样分别放到平衡以后的固相萃取板上，调整真空度使得待测样品、标准曲线样、质控样通过固相萃取板；
（8）淋洗：取甲醇放置于经步骤（7）所述的固相萃取板，调整真空度使甲醇通过固相萃取板；
（9）洗脱：将经过步骤（8）处理的固相萃取板底部的废液接收板换成上样板，将乙腈放到固相萃取板上，收集洗脱液，加入的甲醇，进样分析；
（10）以标准曲线样中类固醇激素的峰面积与内标工作液中的类固醇激素的峰面积的比值为纵坐标，以标准溶液中类固醇激素相应的浓度为横坐标进行线性回归，获得类固醇激素线性回归方程，将待测样品、质控样中类固醇激素的峰面积与内标工作液中的类固醇激素的峰面积的比值带入标准曲线线性方程计算待测样品中类固醇激素的浓度。
2.根据权利1所述的一种同时检测血清中11项类固醇激素的方法，其特征在于，所述11项类固醇激素包括：皮质素、皮质醇、皮质酮、11-脱氧皮质醇、雄烯二酮、睾酮、脱氢表雄酮、17-羟孕酮、17-羟孕烯醇酮、孕酮、脱氢表雄酮硫酸酯。
3.根据权利要求1所述的一种同时检测血清中11项类固醇激素的方法，其特征在于，所述质控样有3个，包括类固醇激素高浓度样、类固醇激素中浓度样、类固醇激素低浓度样。
4.根据权利要求1所述的一种同时检测血清中11项类固醇激素的方法，其特征在于，步骤（2）所述内标液包括皮质素-d7、皮质醇-d4、11-脱氧皮质醇-d5、皮质酮-d4、脱氢表雄酮-d6、雄烯二酮-13C3、睾酮-13C3、17-羟孕烯醇酮-13C22H2、17-羟孕酮-d8、孕酮-d9、脱氢表雄酮硫酸酯-d6。
5.根据权利要求4所述的一种同时检测血清中11项类固醇激素的方法，其特征在于，所述的内标液中皮质素-d7、皮质醇-d4、11-脱氧皮质醇-d5、皮质酮-d4、脱氢表雄酮-d6、雄烯二酮-13C3、睾酮-13C3、17-羟孕烯醇酮-13C22H2、17-羟孕酮-d8、孕酮-d9、2500 ng/mL脱氢表雄酮硫酸酯-d6质量比为：10：10：5：2.5：50:1：5：5：10：10：250。
6.根据权利要求5所述的一种同时检测血清中11项类固醇激素的方法，其特征在于，所述母液为6-12份。
7.根据权利要求6所述的一种同时检测血清中11项类固醇激素的方法，其特征在于，所述母液中皮质素、皮质醇、11-脱氧皮质醇、皮质酮、脱氢表雄酮、雄烯二酮、睾酮、17-羟孕烯醇酮、17-羟孕酮、孕酮、脱氢表雄酮硫酸酯的质量比为50：100:10：5:10:2：5:20：10:5:2000。
8.根据权利要求7所述的一种同时检测血清中11项类固醇激素的方法，其特征在于，步骤（2）所述内标液、释放剂A的体积比为1:200。
9.根据权利要求8所述的一种同时检测血清中11项类固醇激素的方法，其特征在于，所述释放剂A的质量浓度为80-85%。
10.根据权利要求9所述的一种同时检测血清中11项类固醇激素的方法，其特征在于，所述进样分析过程中液质流动相包含乙酸铵、甲酸。
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