CN116124969A - 一种同时提取并测定血清中pcos相关十二种类固醇激素的lc-ms/ms试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种同时提取并测定血清中PCOS相关十二种类固醇激素的LC‑MS/MS试剂盒，包括一种样本前处理用缓冲液，所述的缓冲液成分为：30%‑35%甲醇、18%‑22%乙腈，所述的缓冲液中的成分单独使用；所述的类固醇激素为17α‑羟基孕酮、双氢睾酮、孕酮、睾酮、雌二醇、硫酸脱氢表雄酮、脱氢表雄酮、雄烯二酮、可的松、氢化可的松、雌三醇和雌酮。本发明前处理方法简单，高效，耗时短，并排除了血清基质对检测的影响；首次实现同时检测12项PCOS相关类固醇激素的LC‑MS/MS试剂盒。
Description
技术领域
本发明属于医学检测技术领域，具体涉及一种同时提取并测定血清中PCOS相关十二种类固醇激素的LC-MS/MS试剂盒。
背景技术
类固醇激素，又称甾体激素，是一类四环脂肪烃化合物，属于脂溶性激素。脊椎动物的肾上腺激素属于类固醇激素，具体可分为肾上腺皮质激素和性激素两类。肾上腺皮质激素由肾上腺皮质分泌产生，目前从肾上腺皮质提取液中分离的类固醇化合物有30余种，已知生理作用的主要有调节糖代谢、调节水盐代谢；性激素可分为雄性激素和雌性激素，它们与动物的性别及第二性征的发育有关。雄性激素和雌性激素的功能虽然很不相同，但它们在结构上却很相似。两类性激素都可以从胆固醇衍生而来，而且二者在体内可以相互转变，并以不同比例同时存在于动物个体。
类固醇激素在维持生命、调节性功能方面具有极重要的医药价值，同时对机体发展、免疫调节、皮肤疾病治疗方面有明确的作用。类固醇激素的同分异构体非常多，导致生物样本中类固醇浓度精确测定异常困难，高选择性且高灵敏度地测定生物样本中某一种特定的类固醇激素是目前尚难以达到。目前临床上对类固醇激素的检测多集中于化学发光领域，成本较高且操作复杂，所以迫切需要简单易行、经济适用、高通量并精确定量的检测方法。
武汉迈特维尔生物科技有限公司于2022年3月30日申请的中国专利CN202210321735.9，发明名称“一种同时检测5种类固醇激素的方法、试剂盒及其应用”，提供了一种同时检测5种类固醇激素的方法、试剂盒及其应用，属于类固醇激素检测技术领域。所述方法包括：基于LC-MS/MS对经过前处理后的待测样品进行检测，通过优化前处理方法，从而实现对睾酮、雄烯二酮、17α-羟孕酮、双氢睾酮、硫酸脱氢表雄酮5种类固醇激素的准确检测，该方法可以应用于临床雄激素血症中重要类固醇激素的检测项目，有助于给出受试者体内上述5种类固醇激素的真实浓度的真实水平，非常有助于临床或实验室使用，对于高雄激素血症、多囊卵巢综合征的辅助诊断具有重要指导意义，具有较高的实际应用价值。不过，该方法只能一次性检测5种类固醇激素，无法涵盖临床病理所需要检测的项目指标。
天津国科医工科技发展有限公司于2022年03月11日申请的中国专利CN202210241244.3，发明名称“基于磁性固相萃取的类固醇激素的液相色谱串联质谱检测方法”，公开了一种基于磁性固相萃取的类固醇激素的液相色谱串联质谱检测方法，包括以下步骤：S1、磁性固相萃取方法进行样本中类固醇激素的前处理，制备测试样：S2、构建标准曲线；S3、采用液相色谱串联质谱法对测试样进行检测，结合构建的标准曲线得到测试样中的类固醇激素的含量。不过，该方法采用的磁性固相萃取技术尚未在临床检测上普遍应用，且洗脱过程中高浓度的表面活性剂可能会影响检测，磁性分子材料制备繁琐，将会导致单个检测的费用高昂，不适用临床检测。
广西壮族自治区妇幼保健院于2017年07月03日申请的中国专利CN201710534316，发明名称“干血斑中7种类固醇激素的液相色谱串联质谱检测方法”，公开了一种干血斑中7种类固醇激素的液相色谱串联质谱检测方法，所述的7种类固醇激素分别为：17-羟基孕酮、雄烯二酮、双氢睾酮、孕酮、皮质醇、11-脱氧可的松和醛固酮。该方法检测经过预处理的干血斑中上述7种类固醇激素，样品经甲醇沉淀蛋白，并超声提取，提取后过滤净化，以甲醇和水作为流动相，经C18色谱柱进行梯度分离，目标化合物在电喷雾正、负离子模式下电离，采用多反应监测扫描模式，内标定量法分析。虽然其用甲醇萃取干血片后即可进行分析，但指标的离子化效率不高，检测下限无法满足临床需求。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种从血清样本中提取12项PCOS相关类固醇激素的前处理及检测试剂盒。试剂盒配合使用液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）法测定血清样本中类固醇激素。血清样本使用前处理试剂盒处理后取上清进样。在电喷雾电离模式下，采用多反应监测模式（MRM）检测，最后使用内标法进行准确定量分析。
采用固相萃取的前处理方法，处理过程简单、高效；制备7个标准工作溶液浓度点，采用LC-MS/MS的检测方法，建立标准工作曲线，检测灵敏度高、特异性强；可同时提取并检测12种PCOS相关类固醇激素，涵盖PCOS全部检测指标，可适用于临床检测。
本发明涉及的缩写词定义如下：
17-OH-P：17α-Hydroxyprogesterone，17α-羟基孕酮；DHT：Dihydrotestosterone，双氢睾酮；P：Progesterone，孕酮；T：Testosterone，睾酮；E1：Estrone，雌酮；E2：Estradiol，雌二醇；E3：Estriol，雌三醇；E：Cortisone，可的松；DHEA-S：Dehydroepiandrosterone sulfate，硫酸脱氢表雄酮；DHEA：Dehydroepiandrosterone，脱氢表雄酮；A4：Androstenedione，雄烯二酮；F：Hydrocortisone，皮质醇；MRM：Multiplereaction monitoring，多反应监测；PCOS：Polycystic ovarian syndrome，多囊卵巢综合征；PP：Polypropylene，聚丙烯；LOD：Limit of detection，检测限；CV：Variablecoefficient，变异系数；SD：Standard deviation，标准偏差；CE：Collision Energy，碰撞能量；CCL2：Collision Cell Lens 2，碰撞室入口电压；EV：Entrance Voltage，入口电压。
一方面，本发明提供了一种血液样本的前处理方法。
所述的前处理方法为固相萃取，包括使用缓冲液冲洗已上样收集板。
所述的缓冲液的成分为：30%-35%甲醇、18%-22%乙腈，所述的缓冲液中的成分单独依次使用；优选地，所述的缓冲液的成分为：33%-35%甲醇、19%-21%乙腈；进一步优选地，所述的缓冲液的成分为：33%甲醇、20%乙腈；所述的前处理方法中还包括洗脱步骤，所述的洗脱步骤中的洗脱液为乙腈和甲醇的混合液。优选地，所述的乙腈和甲醇的体积比为3：1。
所述的前处理方法中还包括洗脱后吹干再进行复溶的步骤；所述的复溶所用的复溶液为甲醇。优选地，所述的复溶液为体积分数50%的甲醇。
优选地，所述的前处理方法包括以下步骤：
（1）血清中加入混合内标工作液，混匀静置；（2）加入甲醇混匀离心取上清液得样品A；（3）样品A加超纯水混匀得样品B；（4）收集板用甲醇和水进行预处理；（5）样品B加入收集板加压上样；（6）依次使用30%-35%甲醇、18%-22%乙腈冲洗收集板；（7）体积比为3：1的乙腈和甲醇的混合液洗脱；（8）洗脱后吹干使用体积分数为50%的甲醇复溶。
所述的步骤（5）中的加压为正压。
另一方面，本发明提供了一种血液样本前处理试剂盒。
所述的血液样本前处理试剂盒包括一种缓冲液作为上样收集板冲洗液，成分为：30%-35%甲醇、18%-22%乙腈，所述的缓冲液中的成分单独依次使用。
再一方面，本发明提供了前述的缓冲液在制备同时提取并测定血清中PCOS相关十二种类固醇激素的LC-MS/MS试剂盒中的应用。
所述的类固醇激素为17α-羟基孕酮、双氢睾酮、孕酮、睾酮、雌二醇、硫酸脱氢表雄酮、脱氢表雄酮、雄烯二酮、可的松、氢化可的松、雌三醇和雌酮。
再一方面，本发明提供了一种同时提取并测定血清中PCOS相关十二种类固醇激素的LC-MS/MS试剂盒。
所述的LC-MS/MS试剂盒包括前述的缓冲液；所述的缓冲液用于血液样本前处理；所述的类固醇激素为17α-羟基孕酮、双氢睾酮、孕酮、睾酮、雌二醇、硫酸脱氢表雄酮、脱氢表雄酮、雄烯二酮、可的松、氢化可的松、雌三醇和雌酮。
所述的试剂盒中还包括体积比为3：1的乙腈和甲醇的混合液、50%的甲醇。所述的试剂盒中还可以还包括色谱流动相A：0.5 mM氟化铵水溶液和色谱流动相B：甲醇。所述的试剂盒中还包括色谱用洗针液：1：1（V/V）的乙腈/超纯水，和2：8（V/V）的甲醇/超纯水。所述的试剂盒中还包括校准品和质控品。
本发明采用不同溶剂比例的清洗液处理上样孔板，可以排除血清中基质效应影响。
本发明的有益效果：
1、前处理方法简单，高效，耗时短，借助正压萃取装置，用SPE96孔板对血清样本进行前处理，快速实现对目标化合物的富集，并排除血清基质对检测的影响；2、首次实现同时检测12项PCOS相关类固醇激素的LC-MS/MS试剂盒；3、方法特异性和灵敏度高，采用LC-MS/MS平台显著提高灵敏度，具有广泛的线性范围；4、制备7个标准工作溶液浓度点来建立标准工作曲线，检测的结果更可靠；5、采用独特的进样模式，大大减少单次进样量。
附图说明
图1为E3标准工作液标准工作曲线。图2为E3标准工作液EIC（提取离子流图）图。图3为F标准工作液标准工作曲线。图4为F标准工作液EIC（提取离子流图）图。图5为DHEA-S标准工作液标准工作曲线。图6为DHEA-S标准工作液EIC（提取离子流图）图。图7为A4标准工作液标准工作曲线。图8为A4标准工作液EIC（提取离子流图）图。图9为E1标准工作液标准工作曲线。图10为E1标准工作液EIC（提取离子流图）图。图11为E2标准工作液标准工作曲线。图12为E2标准工作液EIC（提取离子流图）图。图13为T标准工作液标准工作曲线。图14为T标准工作液EIC（提取离子流图）图。图15为DHT标准工作液标准工作曲线。图16为DHT标准工作液EIC（提取离子流图）图。图17为E标准工作液标准工作曲线。图18为E标准工作液EIC（提取离子流图）图。图19为17-OH-P标准工作液标准工作曲线。图20为17-OH-P标准工作液EIC（提取离子流图）图。图21为P标准工作液标准工作曲线。图22为P标准工作液EIC（提取离子流图）图。图23为P标准工作液标准工作曲线。图24为P标准工作液EIC（提取离子流图）图。图25为SPE 96孔板清洗液1为70%甲醇，清洗液2为20%乙腈时各激素的检测峰形。图26为SPE 96孔板清洗液1为正己烷，清洗液2为20%乙腈时各激素的检测峰形。图27为SPE 96孔板清洗液为纯乙腈时各激素的峰形。图28为SPE 96孔板清洗液1为70%甲醇，清洗液2为20%乙腈时各激素的检测峰形。图29为实施例1的试剂盒示意图。
其中图25-28为观测检测峰形，具体数值对结果判定无影响，当前图片能够清楚判定峰形结果。所有标准工作曲线图纵坐标均为比值，无单位。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中涉及的仪器包括：QSight420MD三重四极杆质谱检测系统（苏州颐坤生物科技有限公司）；Heraeus FRESCO21高速冷冻离心机（美国）；正压萃取装置（Biotage，瑞典）；PEP 96孔板（艾杰尔，美国）；多管涡旋混合仪（Vortex genie2，美国）；可调移液器（Eppendorf 0.5-10μL，10-100μL，100-1000μL）；玻璃仪器、量筒等。
以下实施例中涉及的试剂包括：MS级超纯水（Fisher，美国）；MS级甲醇（Fisher，美国）；MS级甲酸(Fisher，美国)、乙腈（Fisher，美国）；异丙醇（Fisher，美国）。
以下实施例中涉及的标准品包括：17α-Hydroxyprogesterone（TRC，加拿大）、双氢睾酮（甄准生物，中国）、Progesterone（TRC，加拿大）、Testosterone（CATO，中国）、Estradiol（TRC，加拿大）、Dehydroepiandrosterone sulfate（Avanti，美国）、Dehydroepiandrosterone（CATO，中国）、Androstenedione（CATO，中国）、Cortisone（TRC，加拿大）、Hydrocortisone（TRC，加拿大）、Estriol（TRC，加拿大）、Estrone（TRC，加拿大）。
实施例1一种同时提取并测定血清中PCOS相关十二种类固醇激素的LC-MS/MS试剂盒及其使用方法
试剂盒成分有：校准品S1-S7、质控品LQC和HQC、内标溶液、流动相添加剂1、96孔固相萃取板。
1、试剂配制：
（1）流动相A（0.5mM氟化铵水溶液）：加入1000mL超纯水至试剂瓶中；再加入100μL氟化铵溶液（母液浓度5 M）至试剂瓶中；超声5分钟；标签为PCOS流动相A，室温保存（有效期7天）。
（2）流动相B（甲醇）：加入1000mL甲醇至试剂瓶中；超声5分钟；标签为PCOS流动相B，室温保存（有效期3周）。
（3）PCOS洗针液1（乙腈/超纯水，1/1（V/V））：加入500mL乙腈至试剂瓶中；再加入500mL超纯水至试剂瓶中；混合均匀，超声5分钟；标签为PCOS 清洗液1，室温保存（有效期3周）。
（4）PCOS洗针液2（异丙醇）：加入1000mL异丙醇至试剂瓶中；超声5分钟；标签为PCOS清洗液2，室温保存（有效期3周）。
（5）SPE 96孔板清洗液1：33%甲醇；清洗液2：20%乙腈；
（6）洗脱液：乙腈/甲醇:75/25(V/V)；
（7）复溶液：甲醇/超纯水:50/50(V/V)。
2、样本前处理
（1）吸取0.6 mL血清样品至5 mL PP管中；
（2）加入50µL混合内标工作液；涡旋混匀5s，最高档振荡1 min；静置5 min；混合内标工作液成分如下：17-OH-P-d8（5ng/mL），DHT-13C3（8ng/mL），P-d9（5ng/mL），T-13C3（2ng/mL），E2-d3（8ng/mL），DHEA-S-d6（5000ng/mL），DHEA-d5（25ng/mL），A4-13C3（6.25ng/mL），E-d8（250ng/mL），F-d4（125ng/mL），E3-d3（8ng/mL），E1-13C3（6.25ng/mL）；
（3）加入0.6 mL甲醇，高速涡旋混匀10 s，4200 rpm离心5 min，得到上清液A；
（4）另取5 mL样品管，加入1 mL超纯水，将上清液A缓慢倒入其中，混匀得样品B；
（5）将SPE 96孔板用1 mL甲醇和1 mL水依次进行预处理，将样品B用转入SPE 96孔板，使用正压装置施加压力，弃去溶液；
（6）依次使用1 mL 33%甲醇和1 mL 20%乙腈清洗板孔；
（7）最后加入1 mL洗脱液，施压，用96孔收集板收集洗脱液C；
（8）洗脱液C在氮吹仪上以37℃加热条件吹干，加入100 μL复溶液，高速振荡2min，10000 rpm离心5 min，取80 μL装入含内插管的进样瓶中待检测。
3、色谱检测
色谱条件如下：
液相梯度如下：
4、质谱检测
质谱源参数如下：
目标化合物及内标采集参数如下：
注：时间窗口的两端可根据实际情况微调。
5、质控方法
每批样本分析在标准曲线完成之后分别进样一组低、中、高质控品，每四十个样本进样分析结束之后再加上一组低、中、高质控品，以此类推，质控品的准确性应该在85%-115%之间，每个分析批不得多于1/3的质控品超出此范围。
6、标准曲线计算
使用回归分析（权重因子1/X）来构造方程：y=ax+b；
式中：x=待测物浓度（pg/mL）；y= 待测物对内标的峰面积比；a,b=曲线因子；标准点和未知样本的回算浓度以小数点后2位来表示。
7、标准曲线结果示例
（1）E3：图1为E3标准工作曲线；图2为E3的EIC图。E3标准工作液7个浓度点分别为0.06、0.45、1.66、4.1、9.48、14.78、20.12ng/mL，以E3和E3-IS的响应比值为纵坐标建立标准工作曲线，线性判定系数R2为0.99941；E3保留时间为2.98min，质谱采集时间范围选择2.7-3.4分钟。
（2）F：图3为F标准工作曲线；图4为F的EIC图。F标准工作液7个浓度点分别为1、3.33、10、33.33、100、250、500ng/mL，以F和F-IS的响应比值为纵坐标建立标准工作曲线，线性判定系数R2为0.99984；F保留时间为4.113min，质谱采集时间范围选择3.85-4.55分钟。
（3）DHEA-S：图5为DHEA-S标准工作曲线；图6为DHEA-S的EIC图。DHEA-S标准工作液7个浓度点分别为25、227.3、843.7、2112.1、4977.4、7665.9、10658.7ng/mL，以DHEA-S和DHEA-S-IS的响应比值为纵坐标建立标准工作曲线，线性判定系数R2为0.9964；DHEA-S保留时间为4.14min，质谱采集时间范围选择3.6-4.8分钟。
（4）A4：图7为A4标准工作曲线；图8为A4的EIC图。A4标准工作液7个浓度点分别为0.1、0.35、1.09、2.56、6.07、9.21、12.55ng/mL，以A4和A4-IS的响应比值为纵坐标建立标准工作曲线，线性判定系数R2为0.9994；A4保留时间为6.566min，质谱采集时间范围选择6.25-6.95分钟。
（5）E1：图9为E1的标准工作曲线；图10为E1的EIC图。E1标准工作液7个浓度点分别为0.03、0.1、0.3、1、3、7.5、15ng/mL，以E1和E1-IS的响应比值为纵坐标建立标准工作曲线，线性判定系数R2为0.9959；E1保留时间为6.576min，质谱采集时间范围选择6.35-7.35分钟。
（6）E2：图11为E2的标准工作曲线；图12为E2的EIC图。E2标准工作液7个浓度点分别为0.06、0.45、1.67、4.14、9.78、15.23、20.46ng/mL，以E2和E2-IS的响应比值为纵坐标建立标准工作曲线，线性判定系数R2为0.9985；E2保留时间为6.676min，质谱采集时间范围选择6.3-7.1分钟。
（7）T：图13为T的标准工作曲线；图14为T的EIC图。T标准工作液7个浓度点分别为0.1、0.48、1.57、3.74、8.8、13.46、18.27ng/mL，以T和T-IS的响应比值为纵坐标建立标准工作曲线，线性判定系数R2为0.99942；T保留时间为7.52min，质谱采集时间范围选择7.1-7.9分钟。
（8）DHT：图15为DHT的标准工作曲线，图16为DHT的EIC图。DHT标准工作液7个浓度点分别为0.1、0.22、0.59、1.34、3.06、4.63、6.31ng/mL，以DHT和DHT-IS的响应比值为纵坐标建立标准工作曲线，线性判定系数R2为0.99983；DHT保留时间为9.573min，质谱采集时间范围选择9.3-10分钟。
（9）E：图17为E的标准工作曲线，图18为E的EIC图。E标准工作液7个浓度点分别为0.5、2.39、8.27、19.72、47.21、72.45、98.67ng/mL，以E和E-IS的响应比值为纵坐标建立标准工作曲线，线性判定系数R2为0.9966；E保留时间为3.766min，质谱采集时间范围选择3.3-4.2分钟。
（10）17-OH-P：图19为17-OH-P的标准工作曲线，图20为17-OH-P的EIC图。17-OH-P标准工作液7个浓度点分别为0.1、0.61、2.15、5.28、12.64、19.39、26.13，以17-OH-P和17-OH-P -IS的响应比值为纵坐标建立标准工作曲线，线性判定系数R2为0.99923；17-OH-P保留时间为8.289min，质谱采集时间范围选择7.8-8.7分钟。
（11）P：图21为P的标准工作曲线，图22为P的EIC图。P标准工作液7个浓度点分别为0.1、1.1、3.85、9.82、25.54、27.5、50ng/mL，以P和P -IS的响应比值为纵坐标建立标准工作曲线，线性判定系数R2为0.9945；P保留时间为10.276min，质谱采集时间范围选择9.9-10.7分钟。
（12）DHEA：图23为DHEA的标准工作曲线，图24为DHEA的EIC图。DHEA标准工作液7个浓度点分别为0.3、1、3、7.56、17.61、27.08、37.42ng/mL，以DHEA和DHEA-IS的响应比值为纵坐标建立标准工作曲线，线性判定系数R2为0.9985，DHEA保留时间为8.044min，质谱采集时间范围选择7.7-8.5分钟。
8、SPE 96孔板清洗液的验证与对比
（1）清洗液1为70%甲醇，清洗液2为20%乙腈。结果见图25。结果表明，E2有前沿峰出现，E3峰型不好，E、F峰型不对称。
（2）清洗液1为正己烷，清洗液2为20%乙腈。结果见图26。结果表明，清洁力过强，会导致化合物浓度降低。
（3）清洗液为纯乙腈。结果见图27。
（4）清洗液1为33%甲醇，清洗液2为20%乙腈。结果见图28。
综上所述，当SPE 96孔板清洗液1为33%甲醇，清洗液2为20%乙腈时，能最有效去除血清中的基质影响，得到最好的峰型。
9、线性范围
本申请具有广泛的线性范围，线性范围如下表所示：
本发明是类固醇激素相关专利中首例公开线性范围，且显著高于临床标准。本方法具有高灵敏度、强稳定性的特点，可以准确检测人体内PCOS相关激素指标。
本发明的试剂盒如图29所示。
实验例试剂盒性能验证
（1）检测限LoD
配制多个低浓度点样本，前处理后上机检测，选择平均信噪比≥3时的浓度作为方法检测限。
本实验测得的LoD如下：
（2）定量下限LLMI
样本检测浓度的平均值和理论值偏差≤±20%(回收率80%-120%)且CV≤15%的最小浓度为本试剂盒LLMI。制备LLMI样本应该小于或等于以下浓度：
用试剂盒检测以上LLMI样本，每个样本重复检测10次，结果如下：
（3）批内/批间精密度
批内精密度：在同一个分析批（同一天）内，高、低两个浓度水平的样品分别进行10次独立测试。批间精密度：在三个不同分析批高、低两个浓度水平的样品进行10次独立测试。
结果如下：
对比例
参照实施例1设置对比例：
区别在于样本前处理方法步骤（6）中依次使用1 mL 20%乙腈和1 mL 33%甲醇清洗板孔，检测LLMI样本，每个样本重复检测10次，结果如下：
Claims (10)
1.一种血液样本的前处理方法，其特征在于，为固相萃取，包括使用缓冲液冲洗已上样收集板，所述的缓冲液的成分为：30%-35%甲醇、18%-22%乙腈；所述的缓冲液中的成分单独依次使用。
2.根据权利要求1所述的前处理方法，其特征在于，所述的缓冲液的成分为：33%-35%甲醇、19%-22%乙腈。
3.根据权利要求2所述的前处理方法，其特征在于，还包括洗脱步骤，所述的洗脱步骤中的洗脱液为乙腈和甲醇的混合液。
4.根据权利要求3所述的前处理方法，其特征在于，所述的乙腈和甲醇的体积比为3：1。
5.根据权利要求4所述的前处理方法，其特征在于，还包括洗脱后吹干再进行复溶的步骤；所述的复溶所用的复溶液为甲醇。
6.根据权利要求1所述的前处理方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）血清中加入混合内标工作液，混匀静置；
（2）加入甲醇混匀离心取上清液得样品A；
（3）样品A加超纯水混匀得样品B；
（4）收集板用甲醇和水进行预处理；
（5）样品B加入收集板加压上样；
（6）依次使用30%-35%甲醇、18%-22%乙腈冲洗收集板；
（7）体积比为3：1的乙腈和甲醇的混合液洗脱；
（8）洗脱后吹干使用体积分数为50%的甲醇复溶。
7.一种血液样本前处理试剂盒，其特征在于，包括用于冲洗已上样收集板的缓冲液，所述的缓冲液的成分为：30%-35%甲醇、18%-22%乙腈；所述的缓冲液中的成分单独依次使用。
8.一种同时提取并测定血清中PCOS相关十二种类固醇激素的LC-MS/MS试剂盒，其特征在于，包括一种样本前处理用缓冲液，所述的缓冲液成分为：30%-35%甲醇、18%-22%乙腈，所述的缓冲液中的成分单独依次使用；所述的类固醇激素为17α-羟基孕酮、双氢睾酮、孕酮、睾酮、雌二醇、硫酸脱氢表雄酮、脱氢表雄酮、雄烯二酮、可的松、氢化可的松、雌三醇和雌酮。
9.根据权利要求8所述的LC-MS/MS试剂盒，其特征在于，还包括体积比为3：1的乙腈和甲醇的混合液、50%的甲醇；还包括色谱流动相A：0.5 mM氟化铵水溶液和色谱流动相B：甲醇。
10.根据权利要求9所述的LC-MS/MS试剂盒，其特征在于，还包括色谱用洗针液：1：1V/V的乙腈/超纯水，和2：8V/V的甲醇/超纯水。
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