RU2764363C1 - Способ определения производных стероидных гормонов в моче - Google Patents
Способ определения производных стероидных гормонов в моче Download PDFInfo
- Publication number
- RU2764363C1 RU2764363C1 RU2021111154A RU2021111154A RU2764363C1 RU 2764363 C1 RU2764363 C1 RU 2764363C1 RU 2021111154 A RU2021111154 A RU 2021111154A RU 2021111154 A RU2021111154 A RU 2021111154A RU 2764363 C1 RU2764363 C1 RU 2764363C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- urine
- minutes
- dispersant
- sample
- diluent
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
- A61B5/00—Measuring for diagnostic purposes; Identification of persons
- A61B5/20—Measuring for diagnostic purposes; Identification of persons for measuring urological functions restricted to the evaluation of the urinary system
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/483—Physical analysis of biological material
- G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
- G01N33/493—Physical analysis of biological material of liquid biological material urine
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Physiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Surgery (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Изобретение относится к медицине и касается способа определения стероидных гормонов в моче человека, включающего приготовление анализируемой пробы путем ферментативного гидролиза, экстракции, упаривания экстракта, растворения сухого остатка и последующее хроматографическое разделение, с использованием обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии с квадруполь-времяпролетным масс-спектрометрическим детектированием, при этом пробо-подготовку осуществляют путем введения в образец мочи, содержащей внутренний стандарт метилтестостерон, фосфатный буферный раствор с ферментом β-глюкуронидазы Е. Coli, с последующим инкубированием полученной смеси, и вводят смесь, состоящую из хлороформа и диспергента, перемешивают, центрифугируют, после разделения фаз проводят отбор нижнего органического слоя, упаривают в токе азота и к сухому остатку добавляют разбавитель, при этом в качестве диспергента используют ацетон в количестве 500 мкл, а в качестве разбавителя применяют водный раствор гидроксиламина и метанола 1:1, полученную смесь инкубируют в течение не менее 90 минут при температуре не менее 70 оС. Изобретение обеспечивает повышение чувствительности определения стероидов. 2 ил., 2 табл., 1 пр.
Description
Изобретение относится к области медицины, а точнее клинической химии, в частности, к способам определения эндогенных стероидных гормонов в организме человека.
Известны способы определения стероидных гормонов в моче человека методом газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием [Analysis of steroids in urine by gas chromatography-capillary photoionization-tandem mass spectrometry / , K. Scholz, N. [et al.] // J. Chromatogr. A. 2019. V. 1598, P. 175-182; пат. 2380704, RU, МПК G01N 33/48 (2006.01); пат. 2467331, RU, МПК G01N 33/50 (2006.01); G01N 33/52 (2006.01); G01N 33/74 (2006.01)].
Общим недостатком, присущим данным способам, является негативное влияние воды и других протонных растворителей на получение производных, которые не способны образоваться в их присутствии, вследствие чего используется длительная и трудоемкая подготовка проб к анализу для получения летучих производных стероидных гормонов.
Известен способ определения 17β-эстрадиола в моче человека методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с УФ детектированием [, Е. Dispersive liquid-liquid microextraction as an effective preanalytical step for the determination of estradiol in human urine / E. , K. // J. Sep.Sci. 2017. V. 40. P. 2620-2628].
Образец мочи объемом 2 мл, содержащий 8% хлорид натрия, обрабатывают ультразвуком в течение 2 минут. Затем быстро вводят в образец 600 мкл смеси, состоящей из тетрахлорметана и этанола (1:5), и перемешивают его 1 минуту с последующим центрифугированием в течение 5 минут при 10000 об./мин. Органический слой отбирают шприцем в стеклянную виалу и упаривают досуха в водяной бане. После этого перерастворяют сухой остаток в 50 мкл этанола для анализа.
Анализ проводят с использованием аналитической колонки Nucleosil С-18 (250 × 4 мм, 5 мкм) с применением подвижной фазы, состоящей из метанола и воды в режиме изократического элюирования, и УФ детектированием при длине волны 280 нм.
К недостаткам данного способа относятся невоспроизводимость результатов и невысокая чувствительность определения, что обусловлено необходимостью анализа конъюгатов.
Известен также способ определения стероидных гормонов в моче человека методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемным масс-спектрометрическим детектированием [Hexafluoroisopropanol-alkyl carboxylic acid high-density supramolecular solvent based dispersive liquid-liquid microextraction of steroid sex hormones in human urine / Y. Zong, J. Chen, J. Hou [et al.] // J. Chromatogr. A. 2018. V. 1580. P. 12-21].
Согласно этому способу к образцу мочи объемом 900 мкл добавляют 100 мкл концентрированной соляной кислоты и инкубируют его в водяной бане 2 часа при 80°С. После гидролиза проводят дисперсионную жидкость-жидкостную микроэкстракцию следующим образом: в образец мочи быстро вводят смесь, состоящую из 20 мкл 2% октановой кислоты и 70 мкл 7% гексафторизопропанола, затем образец перемешивают и оставляют на 10 минут. После этого его центрифугируют 10 минут при 10000 об./мин для разделения фаз, отбирают нижнюю фазу в виалу и упаривают ее практически досуха при 80°С в токе азота. В виалу добавляют 60 мкл аммиачного буферного раствора (рН 8), 40 мкл аммиачного буферного раствора (рН 10), 100 мкл раствора дансил хлорида и перемешивают. Далее виалу термостатируют в течение 9 минут при 80°С для получения производных стероидных гормонов.
Анализ проводят с использованием аналитической колонки Sepax BR-C18 column (150 × 2.1 мм, 3 мкм) с применением подвижной фазы, состоящей из муравьиной кислоты в воде и муравьиной кислоты в ацетонитриле в режиме градиентного элюирования, а также тандемным масс-спектрометрическим детектированием.
Недостатком указанного способа является получение невоспроизводимых результатов из-за возможной деградации аналитов по причине использования концентрированной соляной кислоты для гидролиза конъюгатов. Кроме того, данный способ имеет неудовлетворительную селективность хроматографического разделения из-за использования дансил хлорида в качестве дериватизирующего агента.
Наиболее близким к заявленному способу является способ определения стероидных гормонов в моче человека методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием [Quantification of steroid hormones in human urine by DLLME and UHPLC-HRMS detection / E. Dmitrieva, A. Temerdashev, A. Azaryan [et al.] // J. Chromatogr. B. 2020. V. 1159. №122390.].
Пробоподготовку осуществляют путем введения в образец мочи объемом 3 мл, содержащим внутренний стандарт, фосфатного буферного раствора (рН 6.5), содержащего фермент β-глюкуронидазу Е. coli, с последующим инкубированием смеси в течение 30 минут при 50°С. Далее в смесь добавляют 1 мл боратного буфера (рН 9) и 150 мг хлорида натрия, затем в анализируемую пробу при помощи шприца вводят смесь, состоящую из 150 мкл хлороформа и 1100 мкл ацетонитрила, образец перемешивают в течение 15 сек, далее центрифугируют 10 минут при 10000 об./мин. После разделения фаз проводят отбор нижнего органического слоя, упаривают его в токе азота и к сухому остатку добавляют 100 мкл водно-метанольного раствора (1:1).
Анализ проводят с использованием обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием аналитической колонки Phenomenex Kinetex С18 (100 х 2.1 мм, 1.7 мкм) и подвижной фазы, состоящей из 0.1% муравьиной кислоты в воде и 0.1% муравьиной кислоты в метаноле в режиме градиентного элюирования, а также квадруполь-времяпролетным масс-спектрометрическим детектированием.
Недостатком указанного способа является невысокая чувствительность определения большинства стероидов.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является повышение чувствительности определения стероидов.
Технический результат достигается тем, что в способе определения стероидных гормонов в моче человека, включающем приготовление анализируемой пробы путем введения в образец мочи, содержащий внутренний стандарт фиксированной концентрации, фосфатный буферный раствор (pH 6.5) с ферментом Р-глюкуронидазы Е. Coli, с последующим инкубированием полученной смеси в течение 30 минут при 50°С, и вводят смесь, состоящую из 150 мкл хлороформа и диспергента, в качестве которого используют ацетон в количестве 500 мкл, перемешивают в течение 15 сек, центрифугируют 10 минут при 10000 об./мин, после разделения фаз проводят отбор нижнего органического слоя, упаривают в токе азота и к сухому остатку добавляют 100 мкл разбавителя, в качестве которого применяют водный раствор гидроксиламина и метанола (1:1). Полученную смесь инкубируют в течение не менее 90 минут при температуре не менее 70°С. Последующее хроматографическое разделение осуществляют с использованием обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии с квадруполь-времяпролетным масс-спектрометрическим детектированием. Заявляемый способ отличается от прототипа тем, что:
- в качестве диспергента используют ацетон в количестве 500 мкл;
- в качестве разбавителя применяют 100 мкл смеси водного раствора гидроксиламина и метанола (1:1);
- смесь инкубируют в течение не менее 90 минут при температуре не менее 70°С.
На фигуре представлена зависимость степени протекания реакции от: а) температуры при времени термостатирования 90 минут и концентрации гидроксиламина 1.6 М; б) времени термостатирования при температуре термостатирования 70°С и концентрации гидроксиламина 1.6 М.
Для осуществления способа использовали хроматограф Bruker Elute, соединенный с масс-спектрометрическим детектором с источником электрораспылительной ионизации Bruker MaXis Impact, и колонку Phenomenex Kinetex С18 (100 х 2.1 мм, 1.7 мкм). Элюирование проводили с использованием двухкомпонентной системы, а именно, 0.1% муравьиной кислоты в воде (элюент А) и 0.1% муравьиной кислоты в метаноле (элюент Б).
Обсуждение параметров способа, позволяющих достичь положительного результата.
Экспериментально было выявлено, что при добавлении к 1 мл синтетической мочи смеси хлороформа и ацетона, представляющих собой экстрагент и диспергент соответственно, достигают наивысшей степени извлечения стероидов. Объемы хлороформа и ацетона, обеспечивающие количественное извлечение стероидов, устанавливали путем проведения дисперсионной жидкость-жидкостной микроэкстракции с различными объемами хлороформа в диапазоне 50-150 мкл и ацетона в диапазоне 450- 550 мкл. Использование 150 мкл хлороформа 500 мкл ацетона привело к количественному извлечению всех стероидов, поэтому данные объемы хлороформа и ацетона были выбраны для использования в дальнейших экспериментах.
Затем изучали зависимость степени протекания реакции от температуры и времени. Данные по оптимизации условий получения производных стероидов представлены на фиг., где по горизонтали представлены стероиды, а по вертикали - степень протекания реакции. Как видно на фиг.а), температура не менее 70°С является оптимальной для получения производных стероидов, а оптимальным временем протекания реакции - не менее 90 минут, см. фиг..б).
В этих условиях на хроматограммах отсутствуют пики, принадлежащие исходным соединениям, в то время как пики производных стероидных гормонов достигают максимальных значений, что свидетельствует о полноте протекания реакции получения производных стероидов.
Пример конкретного выполнения.
К 1 мл образца мочи добавляют 100 мкл внутреннего стандарта метилтестостерона (конечная концентрация - 100 нг/мл мочи) и 0.3 мл фосфатного буферного раствора (pH 6.5), содержащего фермент 0- глюкуронидазу Е. coli, с ее последующим инкубированием в течение 30 минут при 50°С. Далее в пробу мочи при помощи шприца вводят смесь, состоящую из 150 мкл хлороформа и 500 мкл ацетона, образец перемешивают в течение 15 сек, далее центрифугируют 10 минут при 10000 об./мин. После разделения фаз проводят отбор нижнего органического слоя, упаривают его в токе азота и к сухому остатку добавляют 100 мкл 1.6 М водного раствора гидроксиламина и метанола (1:1). Смесь инкубируют в течение 90 минут при 70°С для получения производных стероидных гормонов.
Анализ проводят с использованием хроматографа Bruker Elute, соединенного с масс-спектрометрическим детектором с источником электрораспылительной ионизации Bruker MaXis Impact, и колонкой Phenomenex Kinetex С18 (100 х 2.1 мм, 1.7 мкм). Элюирование проводят с использованием двухкомпонентной системы, а именно, 0.1% муравьиной кислоты в воде (элюент А) и 0.1% муравьиной кислоты в метаноле (элюент Б), по следующей программе: 1.00 мин - 95% А, 2.70 мин - 40% А, 4.00 мин - 40% А, 5.00 мин - 10% А, 7.50 мин - 10% А, 7.51 мин - 95% А, 9.00 мин - 95% А. Скорость потока составляет 0.4 мл/мин при температуре термостата 40°С. Условия масс-спектрометрического детектирования представлены в табл. 1.
Обсуждение преимуществ заявляемого способа.
Для сравнения чувствительности предлагаемого способа и способа прототипа готовили градуировочные растворы в диапазоне концентраций стероидных гормонов 0.1-100 нг/мл. Подготовку проб к анализу проводили в оптимальных условиях по каждому из способов. Полученные результаты представлены в табл. 2.
Использование заявленного способа позволяет увеличить чувствительность определения стероидных гормонов, а именно: тестостерона, дигидротестостерона, эстрона, прогестерона, 11α-гидроксипрогестерона, что особенно важно, учитывая их крайне низкие концентрации в моче человека. Кроме того, увеличение чувствительности определения позволяет снизить требуемое количество образца мочи, а также объемы используемых токсичных растворителей без ухудшения аналитических характеристик методики.
Из этой таблицы видно, что заявляемый способ позволяет достичь увеличения чувствительности в 2-100 раз для большинства определяемых соединений, а у кортизона и кортизола чувствительность является сопоставимой, но при этом объем пробы в 3 раза меньше.
Claims (1)
- Способ определения стероидных гормонов в моче человека, включающий приготовление анализируемой пробы путем ферментативного гидролиза, экстракции, упаривания экстракта, растворения сухого остатка и последующее хроматографическое разделение, с использованием обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии с квадруполь-времяпролетным масс-спектрометрическим детектированием, при этом пробо-подготовку осуществляют путем введения в образец мочи, содержащий внутренний стандарт, в качестве которого используют метилтестостерон с концентрацией 100 нг/мл мочи, фосфатный буферный раствор с рН 6.5 с ферментом β-глюкуронидазы Е. Coli, с последующим инкубированием полученной смеси в течение 30 мин при 50°С, и вводят смесь, состоящую из 150 мкл хлороформа и диспергента, перемешивают в течение 15 с, центрифугируют 10 мин при 10000 об/мин, после разделения фаз проводят отбор нижнего органического слоя, упаривают в токе азота и к сухому остатку добавляют 100 мкл разбавителя, отличающийся тем, что в качестве диспергента используют ацетон в количестве 500 мкл, а в качестве разбавителя применяют водный раствор гидроксиламина и метанола при их объемном соотношении 1:1, полученную смесь инкубируют в течение не менее 90 мин при температуре не менее 70°С.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2021111154A RU2764363C1 (ru) | 2021-04-19 | 2021-04-19 | Способ определения производных стероидных гормонов в моче |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2021111154A RU2764363C1 (ru) | 2021-04-19 | 2021-04-19 | Способ определения производных стероидных гормонов в моче |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2764363C1 true RU2764363C1 (ru) | 2022-01-17 |
Family
ID=80040421
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2021111154A RU2764363C1 (ru) | 2021-04-19 | 2021-04-19 | Способ определения производных стероидных гормонов в моче |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2764363C1 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN115436556A (zh) * | 2022-09-20 | 2022-12-06 | 常州佳德医药科技有限公司 | 一种利用反相液相色谱法测定硼酸酯类化合物纯度的方法及应用 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2362166C2 (ru) * | 2007-09-26 | 2009-07-20 | Учреждение Российской Академии Наук Ордена Трудового Красного Знамени Институт Нефтехимического Синтеза Им. А.В. Топчиева Ран (Инхс Ран) | Модифицированный способ определения эстриола в биологической жидкости беременных женщин |
RU2467331C1 (ru) * | 2011-03-16 | 2012-11-20 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Антидопинговый центр" | Способ определения стероидного профиля при допинговом контроле спортсменов |
CN106198786A (zh) * | 2016-06-29 | 2016-12-07 | 无锡市第四人民医院 | 一种uplc‑ms/ms技术快速检测尿甾体激素的方法 |
-
2021
- 2021-04-19 RU RU2021111154A patent/RU2764363C1/ru active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2362166C2 (ru) * | 2007-09-26 | 2009-07-20 | Учреждение Российской Академии Наук Ордена Трудового Красного Знамени Институт Нефтехимического Синтеза Им. А.В. Топчиева Ран (Инхс Ран) | Модифицированный способ определения эстриола в биологической жидкости беременных женщин |
RU2467331C1 (ru) * | 2011-03-16 | 2012-11-20 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Антидопинговый центр" | Способ определения стероидного профиля при допинговом контроле спортсменов |
CN106198786A (zh) * | 2016-06-29 | 2016-12-07 | 无锡市第四人民医院 | 一种uplc‑ms/ms技术快速检测尿甾体激素的方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
СОКОЛОВА Л.С, и др., Хромато-масс-спектрометрическое определение некоторых женских половых гормонов стероидного строения и их синтетических аналогов. Журнал Сибирского федерального университета. Химия.4 (2010 3) 408-412. УДК 615.357-07. * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN115436556A (zh) * | 2022-09-20 | 2022-12-06 | 常州佳德医药科技有限公司 | 一种利用反相液相色谱法测定硼酸酯类化合物纯度的方法及应用 |
CN115436556B (zh) * | 2022-09-20 | 2024-04-19 | 常州佳德医药科技有限公司 | 一种利用反相液相色谱法测定硼酸酯类化合物纯度的方法及应用 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Ke et al. | A sensitive, simple and robust LC–MS/MS method for the simultaneous quantification of seven androgen-and estrogen-related steroids in postmenopausal serum | |
Yang et al. | Solid-phase microextraction with on-fiber silylation for simultaneous determinations of endocrine disrupting chemicals and steroid hormones by gas chromatography–mass spectrometry | |
Quanson et al. | High-throughput analysis of 19 endogenous androgenic steroids by ultra-performance convergence chromatography tandem mass spectrometry | |
Nováková et al. | Fast and sensitive supercritical fluid chromatography–tandem mass spectrometry multi-class screening method for the determination of doping agents in urine | |
Keski-Rahkonen et al. | Fast and sensitive liquid chromatography–mass spectrometry assay for seven androgenic and progestagenic steroids in human serum | |
Ye et al. | High-performance liquid chromatography–tandem mass spectrometry for the analysis of bile acid profiles in serum of women with intrahepatic cholestasis of pregnancy | |
Desfontaine et al. | Liquid chromatography and supercritical fluid chromatography as alternative techniques to gas chromatography for the rapid screening of anabolic agents in urine | |
Márta et al. | Simultaneous determination of thirteen different steroid hormones using micro UHPLC-MS/MS with on-line SPE system | |
CN109470791A (zh) | 一种高效液相色谱-串联质谱检测血清雌激素的方法及试剂盒 | |
Stephanson et al. | Method validation and application of a liquid chromatography–tandem mass spectrometry method for drugs of abuse testing in exhaled breath | |
Leinonen et al. | Liquid-phase microextraction for sample preparation in analysis of unconjugated anabolic steroids in urine | |
Wang et al. | Solid phase microextraction combined with thermal-desorption electrospray ionization mass spectrometry for high-throughput pharmacokinetics assays | |
Schofield et al. | Sensitive simultaneous quantitation of testosterone and estradiol in serum by LC–MS/MS without derivatization and comparison with the CDC HoSt program | |
Higashi et al. | Determination of salivary dehydroepiandrosterone using liquid chromatography–tandem mass spectrometry combined with charged derivatization | |
Regal et al. | Quantitative LC–MS/MS method for the sensitive and simultaneous determination of natural hormones in bovine serum | |
Dmitrieva et al. | Quantification of steroid hormones in human urine by DLLME and UHPLC-HRMS detection | |
Strahm et al. | Isolation and quantification by high-performance liquid chromatography–ion-trap mass spectrometry of androgen sulfoconjugates in human urine | |
Moeller et al. | The development and validation of a turbulent flow chromatography–tandem mass spectrometry method for the endogenous steroid profiling of equine serum | |
Zhao et al. | Sensitive determination of cholesterol and its metabolic steroid hormones by UHPLC–MS/MS via derivatization coupled with dual ultrasonic‐assisted dispersive liquid–liquid microextraction | |
Sergi et al. | Analysis of bile acids profile in human serum by ultrafiltration clean-up and LC-MS/MS | |
US11536733B2 (en) | Methods and systems for the detection of 11-oxo androgens by LC-MS/MS | |
CN112986433A (zh) | 检测人血清样本中类固醇含量的方法 | |
RU2764363C1 (ru) | Способ определения производных стероидных гормонов в моче | |
CN115963199A (zh) | 一种人/动物体液中类固醇激素的定量检测方法和应用 | |
Higashi et al. | Procedure for increasing the detection responses of estrogens in LC–MS based on introduction of a nitrobenzene moiety followed by electron capture atmospheric pressure chemical ionization |