CN117571882B - 一种血清中类固醇激素的液相色谱-串联质谱检测方法 - Google Patents
一种血清中类固醇激素的液相色谱-串联质谱检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及分析检测技术领域，尤其涉及一种血清中类固醇激素的液相色谱‑串联质谱检测方法。该方法包括：将待测样本与内标物和甲醇水溶液混合后，分离获得上清液；采用PEP板纯化上清液后，依次采用淋洗液A和淋洗液B淋洗PEP板；淋洗液A为含有氨水的甲醇水溶液；淋洗液B为含有甲酸的甲醇水溶液；采用洗脱液C洗脱PEP板，收集洗脱液；洗脱液C为乙腈甲醇溶液；将洗脱液与水混合后，采用液相色谱‑串联质谱进行检测。该方法的前处理过程能够大幅降低待测样本中的磷脂含量，显著提高样本的测试准确度以及灵敏度；前处理后的样本无需氮吹和复溶即可上机检测，大幅提高检测效率。
Description
技术领域
本发明涉及分析检测技术领域，尤其涉及一种血清中类固醇激素的液相色谱-串联质谱检测方法。
背景技术
荷尔蒙（Hormone）又称激素，是指体内的某一细胞、腺体或器官所产生的可以影响机体内其他细胞活动的化学物质，仅需很小剂量的荷尔蒙便可以改变细胞的新陈代谢。类固醇激素又称甾体激素，由性腺及肾上腺分泌，包括雄性激素、雌性激素和肾上腺皮质素，其分泌极其微量，并且随年龄、性别的不同而异，一般在nmol/L和pmol/L数量级，但其作用极为重要，在维持生命、生长发育、生育、炎症、肿瘤发生和情绪控制等方面具有广泛的调节作用。人体的内分泌系统分泌各种荷尔蒙，和神经系统一起调节人体的代谢和生理功能。正常情况下各种荷尔蒙处于平衡状态，如因某种原因使这种平衡被打破而造成内分泌紊乱，就会对身体和精神造成不良影响，甚至危及生命，因此临床上将测定类固醇激素水平作为很多疾病的诊断参考指标。
对于体内类固醇激素的超微量、高灵敏度、精确定量检测，近年来国际上首选液相色谱-串联质谱法（Liquid Chromatography tandem Mass Spectrometry，LC-MS/MS）。其中，待测样本中的磷脂含量会显著地影响到液相色谱-串联质谱法检测的准确度和灵敏度。
现有技术中，CN 111398446 A提供了一种超高效液相色谱-串联质谱技术检测血清中12种类固醇激素的方法，但是其前处理采用液相萃取的方式，杂质去除不够干净，而且萃取后的上清液体积多，需要花费较长的氮吹时间才能够吹干样品，前处理时间较长不适合临床上对于大批量样本的快速检测。CN 112051348 A公开了一种血清或血浆中类固醇激素的固相萃取方法，该前处理方法对于磷脂的去除效果仍然不佳。
发明内容
为了解决上述现有技术的不足，本发明通过对固相萃取板、淋洗液和洗脱液组合的大量摸索尝试后发现，选择PEP板作为固相萃取基质、同时配合采用含有特定浓度氨水的甲醇水溶液和含有特定浓度甲酸的甲醇水溶液依次作为淋洗液、进一步配合采用特定比例的乙腈甲醇溶液作为洗脱液纯化样本后，能够使得进入液相色谱的待测样本中的磷脂含量大幅降低，同时对于皮质醇（COR）、睾酮（T）、17-α羟孕酮（17-OHP）、双氢睾酮（DHT）、雄烯二酮（A4）、脱氢表雄酮（DHEA）、硫酸脱氢表雄酮（DHEAS）这7种类固醇激素的富集效果好，从而显著提高样本的测试准确度以及灵敏度。
基于此，特提出如下发明内容。
首先，本发明提供了一种类固醇激素的检测方法，包括：
（1）将待测样本与内标物和甲醇水溶液混合后，分离获得上清液；
（2）采用PEP板纯化所述上清液后，依次采用淋洗液A和淋洗液B淋洗PEP板；
所述淋洗液A为含有氨水的甲醇水溶液；其中，氨水占淋洗液A的体积百分比为0.1%~0.15%，甲醇占淋洗液A的体积百分比为30%~40%；
所述淋洗液B为含有甲酸的甲醇水溶液；其中，甲酸占淋洗液B的体积百分比为0.1%~0.15%，甲醇占淋洗液B的体积百分比为30%~40%；
（3）采用洗脱液C洗脱所述PEP板，收集洗脱液；所述洗脱液C为乙腈甲醇溶液；其中，乙腈占洗脱液C的体积百分比为80%~85%；
（4）将所述洗脱液与水混合后，采用液相色谱-串联质谱进行检测。
优选地，所述淋洗液A中，氨水占淋洗液A的体积百分比为0.1%~0.12%，甲醇占淋洗液A的体积百分比为32%~38%。
优选地，所述淋洗液B中，甲酸占淋洗液B的体积百分比为0.1%~0.12%，甲醇占淋洗液B的体积百分比为32%~38%。
采用上述含量的两种淋洗液淋洗PEP板，对于磷脂的去除效果更佳。
优选地，所述洗脱液C中，乙腈占洗脱液C的体积百分比为82%~85%。
采用上述含量的洗脱液C洗脱，对于上述7种类固醇激素的富集效果更佳。
优选地，所述PEP板在使用前，依次采用甲醇和水活化所述PEP板。
优选地，步骤（4）中，所述洗脱液与水按照体积比为1：（0.8~1.5）混合。
优选地，液相色谱的检测条件包括：
色谱柱为C18柱，规格为（2~3）×（80~100）mm，（3~5）μm；
流动相A为含有氟化铵的水溶液，流动相B为含有氟化铵的甲醇溶液。
优选地，液相色谱的洗脱程序为：
洗脱过程中，流动相A和流动相B的体积百分比之和为100%。
本发明进一步针对上述前处理后的样本，对流动相以及洗脱程序进行配套优化，发现在上述液相色谱的组合条件下，能够同时使得多种类固醇激素的峰型和响应值更佳。
优选地，流动相A包括体积比为1L：（0.3~0.7）mL的水和氟化铵水溶液；氟化铵水溶液的浓度为0.03~0.08mM。
更优选地，流动相A包括体积比为1L：（0.4~0.6）mL的水和氟化铵水溶液；氟化铵水溶液的浓度为0.04~0.06mM。
优选地，流动相B包括体积比为1L：（0.3~0.7）mL的甲醇和氟化铵水溶液；氟化铵水溶液的浓度为0.03~0.08mM。
更优选地，流动相B包括体积比为1L：（0.4~0.6）mL的甲醇和氟化铵水溶液；氟化铵水溶液的浓度为0.04~0.06mM。
优选地，洗脱过程中的流速为0.4~0.8 mL/min；和/或，色谱柱的柱温为38~42℃。
优选地，所述类固醇激素为皮质醇（COR）、睾酮（T）、17-α羟孕酮（17-OHP）、双氢睾酮（DHT）、雄烯二酮（A4）、脱氢表雄酮（DHEA）、硫酸脱氢表雄酮（DHEAS）中的至少一种。
优选地，所述内标物为所述类固醇激素的氘代化合物。
采用化合物同位素作为内标物，可以排除内源性干扰，同时与化合物性质相似，在相同的前处理及色谱条件下具有一定的稳定性，在一定程度上消除了操作条件等的变化所引起的误差。
优选地，所述液相色谱-串联质谱为高效液相色谱-串联质谱。
在一些实施方案中，所述检测方法还包括：
将待测样本替换为质控品或校准品进行检测。
在一些实施方案中，所述待测样本为人血清或血浆。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明提供了一种血清中类固醇激素的液相色谱-串联质谱检测方法，该方法的前处理过程能够大幅降低待测样本中的磷脂含量，显著提高样本的测试准确度以及灵敏度；前处理后的样本无需氮吹和复溶即可上机检测，大幅提高检测效率。本发明的检测方法能满足线性范围、重复性、批间差、准确度等多方面的要求。
附图说明
图1是皮质醇（左图）及其内标物（右图）的色谱图。
图2是睾酮（左图）及其内标物（右图）的色谱图。
图3是17-羟孕酮（左图）及其内标物（右图）的色谱图。
图4是双氢睾酮（左图）及其内标物（右图）的色谱图。
图5是雄烯二酮（左图）及其内标物（右图）的色谱图。
图6是脱氢表雄酮（左图）及其内标物（右图）的色谱图。
图7是硫酸脱氢表雄酮（左图）及其内标物（右图）的色谱图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例中未注明具体技术或条件者，均为常规方法或者按照本领域的文献所描述的技术或条件进行，或者按照产品说明书进行。所用试剂和仪器等未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
PEP板的品牌：艾杰尔；货号：PE00501-MW。
液相色谱-串联质谱仪的仪器型号为：AB SCIEX Triple QuadTM 4500MD。
下述实施例中选用0.5%牛血清白蛋白作为人血清样本的替代基质配制标准曲线的各个浓度点及质控，稳定性好又易于获得方便保存。
实施例1
本实施例提供了一种同时检测人血清中皮质醇（COR）、睾酮（T）、17-α羟孕酮（17-OHP）、双氢睾酮（DHT）、雄烯二酮（A4）、脱氢表雄酮（DHEA）、硫酸脱氢表雄酮（DHEAS）共7种类固醇激素的高效液相色谱-串联质谱检测方法，具体步骤如下：
（一）化合物储备液及次级储备液的配制
1、购买的T、DHEAS、17-OHP、DHT、A4、COR、DHEA标准品为液标，浓度都是1mg/mL，分别精密移取上述液标，甲醇作为稀释液，按照下表1所示配制成次级储备液1，其中DHEAS不需要稀释，置于-20℃冰箱中贮存待用，以1mL为例。
表1 化合物次级储备液1的配制
2、精密移取由表1配制得到的次级储备液1，继续用甲醇作为稀释液，按照下表2所示配制成混合次级储备液2，待用，以1mL为例。
表2化合物混合次级储备液2的配制
（二）内标储备液及内标萃取液的配制
1、分别精密称量购买的T-d3、DHEAS-d6、17-OHP-d8、DHT-d4、A4-d7、COR-d4、DHEA-d6标准品，用甲醇作稀释液，容量瓶定容，在实际称量时需要对标准物质的纯度、所带的结晶水或者盐（如有）进行折算，分别得到浓度为1000 μg/mL的T-d3、DHEAS-d6、17-OHP-d8、DHT-d4、A4-d7、COR-d4、DHEA-d6的储备液，置于-20℃冰箱中贮存待用。
2、分别精密移取上述储备液，甲醇作为稀释液，按照下表3所示配制成内标次级储备液，置于-20℃冰箱中贮存待用，以1mL为例。
表3 内标次级储备液的配制
3、精密移取由表3配制得到的内标次级储备液1，继续用甲醇作为稀释液，按照下表4所示配制成内标萃取液，待用，以100mL为例。
表4 内标萃取液的配制
（三）校准品的配制
1、0.5%BSA溶液的配制
以配制100mL为例：
用天平称量0.5g牛血清白蛋白至100mL的1×PBS溶液，充分混合均匀后备用。
2、校准品6的配制
以配制100mL校准品6为例：
精密移取表2中的混合次级储备液2取5mL，再加入0.5%BSA溶液定容至100mL，上下颠倒至少10次，混合均匀，如下表5所示。
表5 校准品6的配制
3、空白液H0配制
以配制100mL空白液H0为例：
精密移取甲醇5mL，再加入0.5%BSA溶液定容至100mL，上下颠倒至少10次，混合均匀。
4、校准品1~ 6的配制
以配制50.00mL校准品1~5为例，校准品1~5的配制是分别将校准品6与空白液H0稀释后得到，稀释比例见表6。
表6校准品1~ 5配制
（四）质控品的配制
以配制50.00mL质控品1~3为例，质控品1~3的配制是分别将校准品6与空白液H0稀释后得到，稀释比例见表7。
表7 质控品1~ 3配制
（五）样本前处理方法
1、试剂准备：
淋洗液A：含体积百分比0.1%氨水和35%甲醇的水溶液；
淋洗液B：含体积百分比0.1%甲酸和35%甲醇的水溶液；
洗脱液C：体积比为85：15的乙腈甲醇溶液；
流动相添加剂：浓度为0.05mM的氟化铵水溶液。
2、前处理步骤：
（1）预处理：所有校准品、质控品及人血清样本各取400μL至2mL离心管中，分别加入400μL内标萃取液，2000rpm涡旋混匀10min，然后加入400μL水，2000rpm涡旋混匀5min，最后在4℃，12000rpm条件下离心5min，上清液待用。
（2）PEP板活化：依次用300μL甲醇和300μL水活化PEP板，废液弃去。
（3）加载样本：取800μL步骤1）预处理后的上清液于活化后的PEP板中，缓慢通过，废液弃去。
（4）淋洗：依次用300μL淋洗液A和300μL淋洗液B淋洗PEP板，废液弃去。
（5）洗脱：在PEP板下放置新的96孔板，使用60μL洗脱液C洗脱，洗脱过后，再加入50μL水，混合均匀，4000rpm离心5min后即可上机检测。
（6）检测：于液相色谱-串联质谱仪上机检测。
（六）液相色谱-串联质谱条件
1、液相色谱条件如表8所示。
表8 液相色谱条件
2、质谱条件如表9和表10所示。
表9 离子源参数
表10离子对参数
皮质醇、睾酮、17-羟孕酮、双氢睾酮、雄烯二酮、脱氢表雄酮、硫酸脱氢表雄酮及其内标物的色谱图分别如图1~图7所示。
实施例2
本实施例对实施例1的检测方法进行方法学验证。
1、线性
（1）验证方法：连续配制3批标准曲线，分别用实施例1的检测方法进行检测，计算各个浓度点的相对偏差及线性相关系数。按下列公式和数据分析软件计算线性回归的相关系数r。
（2）接受标准：COR，T，17-OHP，DHT，A4，DHEA及DHEAS的线性最低浓度点的偏差均在±20.0%以内，其余浓度点的偏差均在±15.0%以内，线性回归的相关系数r均≥0.990。
（3）实验结果如表11~表17所示。
表11 化合物COR的线性结果
表12 化合物T的线性结果
表13 化合物17-OHP的线性结果
表14 化合物DHT的线性结果
表15 化合物A4的线性结果
表16 化合物DHEA的线性结果
表17 化合物DHEAS的线性结果
（4）结论：COR，T，17-OHP，DHT，A4，DHEA及DHEAS的线性最低浓度点的偏差均在±20.0%以内，其余浓度点的偏差均在±15.0%以内，线性回归的相关系数r均≥0.990，满足接受标准。
2、方法准确度（加标回收率）
（1）验证方法：将已知浓度的高水平待测物A液（包含COR，T，17-OHP，DHT，A4，DHEA及DHEAS共7种化合物，A液可以直接选用合适的高浓度参考物质，若无参考物质，也可用与被测量一致的纯品进行配制，配制时应采用重量法，以减小配制过程中的不确定度），加入到人的血清样本B液中，配制成至少3个不同浓度的回收样本，所加待测物A液与人的血清样本B液之间的体积比例为1：9，计算回收率，各样本各化合物的回收率（R）应在85%-115%范围内。
R=（C实测值-C本底值）/ C理论值×100%
R：回收率；
C实测值：根据线性拟合计算出的测量值的平均值；
C本底值：人的血清样本的本底值；
C理论值：配制后的样本的理论浓度。
（2）接受标准：COR，T，17-OHP，DHT，A4，DHEA及DHEAS的回收率（R）应在85%-115%范围内。
（3）实验结果如表18所示。
表18加标回收率结果
（4）结论：准确度高，COR，T，17-OHP，DHT，A4，DHEA及DHEAS的低、高浓度样本回收率均在85~115%以内。
3、重复性
（1）验证方法：在重复性条件下，按照实施例1的检测方法，对于质控品1~3重复测试10次。按照下列公式计算重复性的变异系数（CV）。
；
CV：重复性的变异系数；
：10次测量结果的平均值；
S：10次测量结果的标准差。
（2）接受标准：质控品1的变异系数CV≤20%，质控品2和3的变异系数CV≤15%。
（3）实验结果如表19所示。
表19重复性结果
（4）结论：质控品1的变异系数CV≤20%，质控品2和3的变异系数CV≤15%，满足接受标准。
4、批间差
（1）验证方法：按照实施例1的检测方法测试不同批次配制的质控品1~3，分别测试10次，共30次。按照下列公式计算重复性的变异系数（CV）。
；
CV：重复性的变异系数；
：30次测量结果的平均值；
S：30次测量结果的标准差。
（2）接受标准：质控品1的变异系数CV≤20%，质控品2和3的变异系数CV≤15%。
（3）实验结果如表20所示。
表20批间差结果
（4）结论：低值质控品的变异系数CV≤20%，高值质控品的变异系数CV≤15%，满足接受标准。
综上，实施例1的检测方法专属性好，特异性强，分析灵敏度高，准确度高。线性最低浓度点的偏差均在±20.0%以内，其余浓度点的偏差均在±15.0%以内，线性回归拟合常数r大于0.990；低、高浓度人的血清加标样本的回收率均在85~115%以内；质控品1的重复性的变异系数（CV）≤ 20%，质控品2~3的重复性的变异系数（CV）≤ 15%；质控品1的批间变异系数（CV）≤ 20%，质控品2~3的批间变异系数（CV）≤ 15%，均满足接受标准。
对比例1
本对比例提供了一种类固醇激素的检测方法，其与实施例1的不同之处仅在于：
淋洗液A：含体积百分比0.05%氨水和35%甲醇的水溶液。
对比例2
本对比例提供了一种类固醇激素的检测方法，其与实施例1的不同之处仅在于：
淋洗液B：含体积百分比0.05%甲酸和35%甲醇的水溶液。
对比例3
本对比例提供了一种类固醇激素的检测方法，其与实施例1的不同之处仅在于：
洗脱液C替换为体积比50：50的乙腈甲醇溶液。
效果例
取对比例1~3检测方法前处理后的样本参照实施例1加标回收率测定方法进行加标回收率的测定。
测试结果如表21所示。
表21
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (9)
1.一种类固醇激素的检测方法，其特征在于，包括：
（1）将待测血清样本与内标物和甲醇水溶液混合后，分离获得上清液；
（2）采用PEP板纯化所述上清液后，依次采用淋洗液A和淋洗液B淋洗PEP板；
所述淋洗液A为含有氨水的甲醇水溶液；其中，氨水占淋洗液A的体积百分比为0.1%~0.15%，甲醇占淋洗液A的体积百分比为30%~40%；
所述淋洗液B为含有甲酸的甲醇水溶液；其中，甲酸占淋洗液B的体积百分比为0.1%~0.15%，甲醇占淋洗液B的体积百分比为30%~40%；
（3）采用洗脱液C洗脱所述PEP板，收集洗脱液；所述洗脱液C为乙腈甲醇溶液；其中，乙腈占洗脱液C的体积百分比为80%~85%；
（4）将所述洗脱液与水混合后，采用液相色谱-串联质谱进行检测；
所述类固醇激素为皮质醇、睾酮、17-α羟孕酮、双氢睾酮、雄烯二酮、脱氢表雄酮、硫酸脱氢表雄酮中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述淋洗液A中，氨水占淋洗液A的体积百分比为0.1%~0.12%，甲醇占淋洗液A的体积百分比为32%~38%。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述淋洗液B中，甲酸占淋洗液B的体积百分比为0.1%~0.12%，甲醇占淋洗液B的体积百分比为32%~38%。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述PEP板在使用前，依次采用甲醇和水活化所述PEP板。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（4）中，所述洗脱液与水按照体积比为1：（0.8~1.5）混合。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，液相色谱的检测条件包括：
色谱柱为C18柱，规格为（2~3）×（80~100）mm，（3~5）μm；
流动相A为含有氟化铵的水溶液，流动相B为含有氟化铵的甲醇溶液。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，液相色谱的洗脱程序为：
；
洗脱过程中，流动相A和流动相B的体积百分比之和为100%。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，洗脱过程中的流速为0.4~0.8 mL/min；和/或，色谱柱的柱温为38~42℃。
9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述内标物为所述类固醇激素的氘代化合物。
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