CN114609297B - 一种同时检测5种类固醇激素的方法、试剂盒及其应用 - Google Patents
一种同时检测5种类固醇激素的方法、试剂盒及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种同时检测5种类固醇激素的方法、试剂盒及其应用，属于类固醇激素检测技术领域。所述方法包括：基于LC‑MS/MS对经过前处理后的待测样品进行检测。本发明通过优化前处理方法，从而实现对睾酮、雄烯二酮、17α‑羟孕酮、双氢睾酮、硫酸脱氢表雄酮5种类固醇激素的准确检测，该方法可以应用于临床雄激素血症中重要类固醇激素的检测项目，有助于给出受试者体内上述5种类固醇激素的真实浓度的真实水平，非常有助于临床或实验室使用，对于高雄激素血症、多囊卵巢综合征的辅助诊断具有重要指导意义，具有较高的实际应用价值。
Description
技术领域
本发明属于类固醇激素检测技术领域，具体涉及同时检测5种类固醇激素的方法、试剂盒及其应用。
背景技术
多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是一种常见的生殖内分泌代谢性疾病，起病多见于青春期，临床上多表现为月经不调、不孕、多毛痤疮、肥胖、黑棘皮症等。由于其临床表现呈现高度异质性，不仅严重影响患者的生殖功能，而且雌激素依赖性肿瘤如子宫内膜癌发病率会增加，相关的代谢失调包括高雄激素血症、胰岛素抵抗、糖代谢异常、脂代谢异常、心血管疾病发病率也会增加。现阶段对于PCOS的诊断主要依据2003年欧洲生殖和胚胎学会与美国生殖医学学会的专家会议推荐的标准：①稀发排卵或无排卵；②高雄激素的临床表现和/或高雄激素血症；③卵巢多囊性改变：一侧或双侧卵巢直径2～9mm的卵泡≥12个，和/或卵巢体积≥10mL；④上述3条中符合2条，并排除其他高雄激素病因：先天性肾上腺皮质增生、柯兴氏综合征、分泌雄激素的肿瘤等，以及其他引起排卵障碍的疾病，如高泌乳素血症、卵巢早衰和垂体或下丘脑性闭经，以及甲状腺功能异常，可确诊为PCOS。
高雄性激素血症被普遍认为是PCOS关键的病理生理改变，对雄性激素的检测是临床诊断PCOS的重要依据。在女性体内存在多种雄性激素，其中，睾酮(T)的血清水平高于其他雄性激素，是PCOS中主要的病源性雄性激素。目前，临床大多依靠检测睾酮水平判断患者是否存在高雄性激素血症。此外，硫酸脱氢表雄酮(DHEAS)、雄烯二酮(A4)、17α-羟孕酮(17-OHP)、双氢睾酮(DHT)也是人体内重要的雄性激素，一些研究表明，这些激素的血清水平在PCOS患者与正常人群中存在差别，可为PCOS的诊断提供参考。50％的PCOS病人会出现血清DHEAS水平升高，其中5％的患者有且只有DHEAS这一雄性激素特异性升高，同时检测T和DHEAS可以提高PCOS的诊断率。A4是T的直接前体，雄性激素检测中如果加入A4，大约可以提高9％的PCOS检出率；DHT是T经过5α-还原酶作用转化而来，其雄性激素活力最强，检测DHT能够帮助解释局部目标组织中雄性激素活性过高的现象；17-OHP是类固醇合成通路中的中间物质，同时也是盐皮质激素和雄性激素的前体，其血清水平在非典型肾上腺皮质增生(Non-classic CAH)病人中异常升高，因此17-OHP被许多相关专业学会推荐用于PCOS病患诊断，以排除Non-classic CAH。
鉴于上述5种类固醇激素在人体内的重要地位，对其准确定量有助于辅助诊断相关疾病。临床实验室多采用自动化免疫法检测激素，但其特异性差，易受温度、pH、离子强度、试剂免疫活性、易噬性抗体等因素干扰而造成假阳性或假阴性结果；液相色谱-串联质谱技术(LC-MS/MS)因其所需样本量少、可同时检测多种物质，且精密度和准确度高，是激素“金标准”。因此，采用LC-MS/MS实现对T、A4、DHEAS、17-OHP、DHT的准确检测具有重要意义。
目前能够同时检测睾酮、雄烯二酮、17α-羟孕酮、双氢睾酮、硫酸脱氢表雄酮5种类固醇激素的LC-MS/MS方法少有报道，且其前处理方法采用蛋白沉淀结合固相萃取法，然而，固相萃取操作较为复杂，批间重复性难以保证，且价格昂贵。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种同时检测5种类固醇激素的方法、试剂盒及其应用。本发明通过优化前处理方法，从而实现对睾酮、雄烯二酮、17α-羟孕酮、双氢睾酮、硫酸脱氢表雄酮5种类固醇激素的准确检测，具有较高的实际应用价值。
现有的样品前处理过程中，内标溶液和前处理试剂都是分开配制，分两次加入并混合，给样品前处理过程带来更多的人工操作。
经大量实验研究发现，将硫酸锌溶液直接与内标准品溶液混合成优化的内标溶液体系，加入样品中混匀，既可以发挥内标的作用，还可以实现对样品中目标物质的纯化提取，而且该内标溶液体系对样品中的类固醇激素的选择性和溶解性非常高，完全不需要冷冻干燥或固相萃取后氮吹富集等操作，离心分离沉淀物等杂质后即可直接进样检测，并能显著提升检测灵敏度，极大简化了操作过程，且所用试剂均为成本较低的常规化学试剂，降低了检测成本。
为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明的第一个方面，提供一种同时检测5种类固醇激素的方法，所述5种类固醇激素包括睾酮、雄烯二酮、17α-羟孕酮、双氢睾酮、硫酸脱氢表雄酮，所述方法包括：基于LC-MS/MS对经过前处理后的待测样品进行检测；所述的方法可以用于非诊断的检测；
其中，所述前处理方法种包括向待测样品中加入含硫酸锌的同位素内标溶液。所述硫酸锌浓度控制在25～35mmol/L，优选为30mmol/L。
所述待测样品为受试者血液样品，包括全血、血浆或血清，进一步优选为血清。
进一步的，所述检测方法中还包括以校准品制作标准曲线定量，同时采用质控品进行质控。
具体的，校准品制备方法包括：采用2％～5％BSA(优选3％)的磷酸盐缓冲液为基质进行配制，按体积比49:1的比例向上述基质中添加5种类固醇激素不同浓度梯度的混合工作液，得到校准品。
所述类固醇激素包括睾酮、雄烯二酮、17α-羟孕酮、双氢睾酮、硫酸脱氢表雄酮。
采用高和低两个水平的质控品进行质控；
具体的，使用睾酮、雄烯二酮、17α-羟孕酮、双氢睾酮、硫酸脱氢表雄酮终浓度分别为4ng/mL、12ng/mL、16ng/mL、3ng/mL、1200ng/mL作为高质控，使用睾酮、雄烯二酮、17α-羟孕酮、双氢睾酮、硫酸脱氢表雄酮终浓度分别为0.6ng/mL、1.8ng/mL、2.4ng/mL、0.45ng/mL、180ng/mL作为低质控。
所述前处理方法还包括：将待测样品与含有硫酸锌的同位素内标溶液混合，离心，取上清液进行上机检测。
所述同位素内标溶液制备方法为：将上述5种类固醇激素的同位素内标原料加入萃取液中溶解即得。
其中，5种类固醇激素的同位素内标原料包括2H3-T、A4-13C3、2H8-17-OHP、2H4-DHT、2H6-DHEAS。
所述萃取液为50％甲醇。
所述LC-MS/MS对待测样品进行检测具体方法为：
液相色谱条件包括：
采用梯度洗脱，流动相A相：含0.1％甲酸的水溶液；流动相B相：含0.1％甲酸的甲醇溶液；
流动相流速为0.3～0.6mL/min(优选为0.6mL/min)；柱温为40～50℃(优选为45℃)；进样量5～25μL(优选为20μL)；
梯度洗脱方式具体为：0-0.5min，50％流动相B，0.5-3.5min，升至95％流动相B，3.5-4.5min，维持95％流动相B，4.5-4.6min，降至50％流动相B，4.6-5min，维持50％流动相B，停止。
质谱条件包括：
正-负离子电喷雾离子化的多离子反应监测，正离子源参数喷雾电压5500V，负离子源参数喷雾电压为-4500V；雾化温度为650℃；碰撞气为6L/min；气帘气为40L/min；雾化气为55L/min；辅助加热气为80L/min。
MRM质谱参数如下所示：
本发明的第二个方面，提供同时检测5种类固醇激素的试剂盒，所述试剂盒包括：标准品、同位素内标原料、稀释液、萃取液以及沉淀剂，其中所述标准品包括睾酮、雄烯二酮、17α-羟孕酮、双氢睾酮、硫酸脱氢表雄酮中的任意一种或多种；
所述同位素内标原料包括2H3-T、A4-13C3、2H8-17-OHP、2H4-DHT、2H6-DHEAS中的任意一种或多种；
所述的稀释液包括含2～5％BSA(优选3％)的磷酸盐缓冲液；
所述的萃取液为50％甲醇；所述的沉淀剂为硫酸锌；
本发明的第三个方面，提供上述方法和/或试剂盒在如下任意一种或多种的中的应用：
a)高雄激素血症的辅助诊断；
b)多囊卵巢综合征的辅助诊断。
与现有技术相比，上述一个或多个技术方案存在如下有益技术效果：
上述技术方案通过优化前处理方法并结合LC-MS/MS测定5种类固醇激素，并从线性、灵敏度、精密度、基质效应、回收率和稳定性等多方面对上述5种类固醇激素在血清中的测定方法进行充分验证。该方法可以应用于临床高雄激素血症、多囊卵巢综合征相关类固醇激素的检测项目，有助于给出受试者体内上述类固醇激素的真实浓度的真实水平，有助于临床或实验室使用，对于高雄激素血症、多囊卵巢综合征的辅助诊断具有重要指导意义，具有较高的实际应用价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例1中5种类固醇激素的色谱图(睾酮、雄烯二酮、17α-羟孕酮、双氢睾酮、硫酸脱氢表雄酮)。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细描述，需要指出的是，以下所述实施例旨在便于对本发明的理解，而对其不起任何限定作用。本实施例种使用的试剂均为已知产品，通过购买市售产品获得。
实施例1：样品制备、前处理、检测、分析
一、样品制备
1.标准曲线和质控样品的配制
将睾酮、雄烯二酮、17α-羟孕酮、双氢睾酮、硫酸脱氢表雄酮标准品配制成混合溶液，作为标准工作液和质控工作液，分别与3％BSA的磷酸盐缓冲液和阴性血清按1:49的体积比混合，配制校准品和质控样品。
5种类固醇激素在标准品中具有6个系列浓度(C1～C6)，如表1所示：
表1、5种类固醇激素在标准品中的6个系列浓度(C1～C6)
5种类固醇激素在质控品中具有低(L)、高(H)两个系列浓度，如表2所示：
表2、5种类固醇激素在质控品中的两个系列浓度
2.内标溶液的配制
(1)内标准品工作液的配制
配制混合内标准品工作液，2H3-T、A4-13C3、2H8-17-OHP、2H4-DHT、2H6-DHEAS的浓度分别为100ng/mL、200ng/mL、400ng/mL、2000ng/mL、10000ng/mL。
(2)内标溶液的配制
称取125mg硫酸锌，加入25mL50％甲醇，配制成含有30mM硫酸锌的50％甲醇的混合溶液A。
取200μL内标准品工作液加入20mL混合溶液A内，配制成内标准品工作液与混合溶液A的比例为1:100内标溶液。
本实施例虽然选用硫酸锌作为沉淀剂，但经多次实验证明，沉淀剂也可选用三氟乙酸锌，同样能够发挥提高样本中类固醇激素提取率的效果。
二、样品前处理
样品包括待测人血清、校准品、质控品，都采用如下方法处理：
(1)取100μL校准品/质控品/待测人血清，加入到96孔板中；
(2)加入100μL内标溶液，1000rpm震荡30min；
(3)再4000rpm离心10min，取上清液100μL于干净的96孔板中，样品待测。
三、样品检测
取20μL样品进液相色谱质谱联用系统分析，具体分析条件如下：
液相色谱-串联质谱系统：AB SCIEX Triple Quad 4500MD；色谱柱：
BEHC18(3.0×50mm,2.5μm)；流动相A：0.1％甲酸水溶液；流动相B：0.1％甲酸甲醇；流速：0.6mL/min；柱温：45℃；进样器温度：7℃；进样量：20μL。
洗脱梯度具体为：0-0.5min，50％流动相B，0.5-3.5min，升至95％流动相B，3.5-4.5min，维持95％流动相B，4.5-4.6min，降至50％流动相B，4.6-5min，维持50％流动相B，停止。
5种类固醇激素的保留时间如下：睾酮的保留时间为2.49min，雄烯二酮的保留时间为2.32min，双氢睾酮的保留时间为2.85min；17α-羟孕酮的保留时间为2.59min；硫酸脱氢表雄酮的保留时间为1.86min。
如图1所示，样品通过高效液相色谱分离后，不同的类固醇激素在不同洗脱时间出峰，并且被质谱选择反应监控模式检测到，从而检测其含量。
液相色谱上分离出的5种类固醇激素进入到质谱进行检测，利用电喷雾电离源(ESI))和多反应监测扫描模式(MRM)检测5种类固醇激素的含量，并绘制校准曲线图。
质谱检测条件如下：正离子源参数喷雾电压5500V，负离子源参数喷雾电压为-4500V；雾化温度为650℃；碰撞气为6L/min；气帘气为40L/min；雾化气为55L/min；辅助加热气为80L/min。
每个待测物的母离子/子离子对质荷比、去簇电压、碰撞室射出电压如表3所示：
表3、待测物的母离子/子离子对质荷比等参数
可以通过选择反应监控检测到的离子对，以及对应的保留时间，来确定5种类固醇激素的检测，并通过各种类固醇激素的同位素内标进行定量。
样品通过液相色谱分离后，不同的类固醇激素在不同洗脱时间出峰，并且被质谱多反应监测模式检测到，从而检测其含量。按照校准曲线C1系列浓度，以阴性人血清为基质配制待测样品进行检测，检测图谱如图1所示。由图1可见，按照本实施例提供的方法，可以同时准确检测5种类固醇激素。
四、数据处理及分析
1、绘制校准曲线
校准曲线图以5种类固醇激素校准品浓度为横坐标，以与5种类固醇激素其各自内标峰面积比为纵坐标，进行线性回归，获得校准曲线，校准曲线及相关系数如表4所示。
表4、校准曲线回归方程及相关系数
| 物质 | 线性及线性相关系数 |
| 睾酮 | y＝1.1125x+0.0041(r＝0.9990) |
| 雄烯二酮 | y＝0.4347x+0.0008(r＝0.9997) |
| 双氢睾酮 | y＝0.0704x+0.0058(r＝0.9993) |
| 17α-羟孕酮 | y＝0.2505x+0.0035(r＝0.9984) |
| 硫酸脱氢表雄酮 | y＝0.0146x+0.0065(r＝0.9991) |
2、计算准确度、精密度和基质效应
使用低、高浓度质控样品(L、H)中待测物与其内标峰面积比，代入建立的5种各自的类固醇激素校准曲线种，计算得到质控样品中5种类固醇激素的浓度，再计算出至少3个分析批的每种质控样品的准确度和精密度结果，其接受标准为测定值均值和理论值间的准确度在85.0％～115.0％之间，且精密度(CV)≤10.0％。三次精密度测试，两个浓度(L、H)，准确度在88.8％～111.7％，批间精密度(CV)在2.2％～6.2％之间，符合要求。
(2)基质效应
基质效应通过比较各浓度质控水平的醇溶液与其对应添加入基质空白和血清空白后待测物的响应得到(基质和血清样品需减去本底响应)，基质效应在85～115％之间时表明该基质对待测物测定的影响可忽略。如存在基质效应，各浓度质控水平的基质效应应接近。内标归一化的基质因子在90.02％～107.1％之间，符合要求。
3、计算待测人血清样品种5种类固醇激素的浓度
质谱检测得到类固醇激素与内标的比值，将比值带入到定量校正方程，计算得到血清种5种类固醇激素的含量。
实施例2：含不同浓度硫酸锌的内标溶液体系的检测结果对比
本实施例按照实施例1提供的内标溶液配制方法，配制含有5种类固醇激素内标的内标溶液，采用如表5所示的含不同浓度硫酸锌的内标溶液体系成分，并按照实施例1提供的步骤方法完成样品制备和前处理后，取低质控点(LQC)进液相色谱质谱联用系统分析，测得LQC样品中5种类固醇激素的浓度与理论值的偏差如表5所示：
睾酮的临床检测参考区间为0.08～0.86ng/mL，雄烯二酮的临床检测参考区间为0.32～2.33ng/mL，双氢睾酮的临床决定水平≤0.41ng/mL，17α-羟孕酮的临床决定水平≤2.7ng/mL，硫酸脱氢表雄酮的临床参考区间为273～2500ng/mL。因此对浓度为临床决定水平附近的样品检测灵敏度要求较高，由表5可以看出，采用本实施例提供的内标溶液体系含25～35mmol/L硫酸锌时，检测到的睾酮、雄烯二酮、17α-羟孕酮、双氢睾酮、硫酸脱氢表雄酮的浓度与理论值的偏差均能符合接受标准，其中当硫酸锌浓度为30mmol/L时，5种类固醇激素的实测浓度与理论值的偏差最小。因此，当内标溶液体系中硫酸锌浓度为25～35mmol/L时(30mmol/L最优)，临床上可对5种类固醇激素是否过量进行准确判断。
采用本实施例提供的内标溶液体系，不仅简化了前处理操作，且5种类固醇激素的提取回收率也较高，结合液相色谱-串联质谱的高灵敏度和准确度，使得对血液样品种5种类固醇激素的检测能力能同时满足临床的参考区间的实际需求。采用本实施例提供的内标溶液体系含25～35mmol/L硫酸锌(优选30mmol/L)进行前处理后，并经后续高效液相色谱串联质谱检测验证，对睾酮、雄烯二酮、17α-羟孕酮、双氢睾酮、硫酸脱氢表雄酮的灵敏度最高分别可达0.015ng/mL、0.025ng/mL、0.25ng/mL、0.15ng/mL、2.5ng/mL。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述方法和/或试剂盒在如下任意一种或多种中的应用：
a)高雄激素血症的辅助诊断；
b)多囊卵巢综合征的辅助诊断。
已下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例3：一种同时检测5种类固醇激素的方法，包括如下步骤：
前处理方法：
1)校准品配制：用含3％BSA的磷酸盐缓冲液为基质进行配制，按体积比为49:1的比例向上述基质中添加已配制好的不同浓度的校准品混标工作液，共6个浓度梯度，作为校准品。取配置好的各浓度校准品400μL分装于1.5mL冻干瓶中，放置于冷冻干燥机内，-80℃预冻4h再进行梯度升温，在第一次升温时抽真空，制备成干粉，于2～8℃保存备用。使用时，从冰箱取出并放于室温下平衡15～20min，然后分别加入400μL纯水，混匀备用。
2)质控配制：用阴性血清为基质进行配制，按体积比为49:1的比例向上述基质中添加已配制好的高、低浓度的质控品混标工作液，得到睾酮、雄烯二酮、17α-羟孕酮、双氢睾酮、硫酸脱氢表雄酮终浓度分别为4ng/mL、12ng/mL、16ng/mL、3ng/mL、1200ng/mL的高质控品和睾酮、雄烯二酮、17α-羟孕酮、双氢睾酮、硫酸脱氢表雄酮终浓度分别为0.6ng/mL、1.8ng/mL、2.4ng/mL、0.45ng/mL、180ng/mL的低质控品。取配制好的高、低浓度质控品400μL分装于1.5mL冻干瓶中，放置于冷冻干燥机内，-80℃预冻4h再进行梯度升温，在第一次升温时抽真空，制备成干粉，于2～8℃保存备用。使用时，从冰箱取出并放于室温下平衡15～20min，然后分别加入400μL纯水，混匀备用。
3)内标配制：用甲醇配制混合内标准品工作液，2H3-T、A4-13C3、2H8-17-OHP、2H4-DHT、2H6-DHEAS的浓度分别为100ng/mL、200ng/mL、400ng/mL、2000ng/mL、10000ng/mL。取配制好的内标准品240μL分装于1.5mL样品瓶中，置于浓缩仪内浓缩干燥成干粉，于2～8℃保存备用。使用时，从冰箱取出并放于室温下平衡15～20min，然后加入240μL 50％甲醇，混匀备用。
4)内标溶液配制：取125mg硫酸锌，加入25mL 50％甲醇，配制成含有30mM硫酸锌的50％甲醇的混合溶液A。然后取200μL内标准品工作液加入20mL混合溶液A内，配制成内标准品工作液与混合溶液A的比例为1:100内标溶液，备用。
5)向96孔板中加入100μL血清样本/校准品/质控品，再加入100μL内标溶液，1000rpm震荡30min；
6)4000rpm离心10min；
7)取上清液100μL加入至新的96孔板中；
8)覆上封板膜，供色谱进样分析；
上机检测
LC-MS/MS检测条件为：
色谱条件：色谱柱：
BEH C18(3.0×50mm,2.5μm)；流动相A：0.1％甲酸水溶液；流动相B：0.1％甲酸甲醇；流速：0.6mL/min；柱温：45℃；进样器温度：7℃；进样量：20μL。洗脱梯度程序为：0-0.5min，50％流动相B，0.5-3.5min，升至95％流动相B，3.5-4.5min，维持95％流动相B，4.5-4.6min，降至50％流动相B，4.6-5min，维持50％流动相B，停止。
质谱条件：正离子源参数喷雾电压5500V，负离子源参数喷雾电压为-4500V；雾化温度为650℃；碰撞气为6L/min；气帘气为40L/min；雾化气为55L/min；辅助加热气为80L/min。
表6、MRM质谱参数
性能验证：
1.结果计算：首先以校准品浓度为横坐标，以校准品与内标峰面积的比值为纵坐标，绘制标准曲线，得到线性方程y＝ax+b，将样品与内标的峰面积比代入方程，计算样品中各分析物浓度。
用数据处理软件对数据进行处理，得到标准曲线为：睾酮：y＝1.0600x+0.0057，r＝0.9978；雄烯二酮：y＝0.4310x+0.0012，r＝0.9994；双氢睾酮：；17α-羟孕酮：y＝0.2617x-0.0013，r＝0.9993；硫酸脱氢表雄酮：y＝0.0145x+0.0046，r＝0.9992。r≥0.99，满足线性要求。
2.定量下限
根据重复性CV≤20.0％，准确度偏差≤±15.0％作为定量下限指标的判定标准，当样品种含有的睾酮、雄烯二酮、17α-羟孕酮、双氢睾酮、硫酸脱氢表雄酮的浓度分别为0.015ng/mL、0.025ng/mL、0.25ng/mL、0.15ng/mL、2.5ng/mL时，重复测定5次，经过样品预处理和上机检测，分析后的数据可满足接收标准。
3.精密度
将2个浓度水平质控品，各重复检测3次，连续检测5天，计算重复性CV，批内各分析物CV结果为1.2％～8.0％，批间各分析物CV结果为2.2％～6.2％，所有化合物批内、批间CV均≤10.0％，符合接受标准。
4.回收率
向临床血清样本中添加相同体积不同浓度的各标准品溶液，使得睾酮、雄烯二酮、17α-羟孕酮、双氢睾酮、硫酸脱氢表雄酮终浓度分别为4ng/mL、12ng/mL、16ng/mL、3ng/mL、1200ng/mL作为回收样本一，睾酮、雄烯二酮、17α-羟孕酮、双氢睾酮、硫酸脱氢表雄酮终浓度分别为0.6ng/mL、1.8ng/mL、2.4ng/mL、0.45ng/mL、180ng/mL作为回收样本二，每个浓度重复测试3次，取3次均值与理论值进行比较，计算回收率，结果为88.2％％～109.1％不等，满足85％～115％的判断标准。
5.稳定性试验
校准品、质控品干粉在2～8℃条件下保存6个月，性能仍然良好，通过定期取样观察，计算观察数据的偏差及变异系数CV，在此条件下偏差均≤±15.0％，CV均≤10.0％。由此可见，校准品、质控品在干粉状态下，可提高稳定性，利于运输保存。
Claims (11)
1.一种同时检测5种类固醇激素的方法，所述类固醇激素包括睾酮(T)、雄烯二酮(A4)、17α-羟孕酮(17-OHP)、双氢睾酮(DHT)、硫酸脱氢表雄酮(DHEAS)，其特征在于，所述方法包括：基于LC-MS/MS对经过前处理后的待测样品进行检测；所述的检测为非诊断检测；其中，所述前处理方法包括向待测样品中加入含硫酸锌的同位素内标溶液；
其特征在于，所述前处理方法还包括：将待测样品与加入硫酸锌的同位素内标混合，离心，取上清液进行上机检测；所述同位素内标制备方法为：将上述5种类固醇激素的同位素内标原料加入萃取液中溶解即得；5种类固醇激素的同位素内标原料包括：2H3-T、A4-13C3、2H8-17-OHP、2H4-DHT、2H6-DHEAS，所述萃取液为50％甲醇；
所述LC-MS/MS对待测样品进行检测具体方法为：采用AB SCIEX Triple Quad 4500MD；色谱柱为BEHC18，3.0×50mm,2.5μm，液相色谱条件包括：采用梯度洗脱，流动相A相：含0.1％甲酸水溶液；流动相B相：含0.1％甲酸甲醇溶液；流动相流速为0.3～0.6mL/min；柱温为40～50℃；进样量5～25μL；
所述梯度洗脱方式具体为：0-0.5min，50％流动相B，0.5-3.5min，升至95％流动相B，3.5-4.5min，维持95％流动相B，4.5-4.6min，降至50％流动相B，4.6-5min，维持50％流动相B，停止。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述硫酸锌浓度控制为25～35mmol/L。
3.根据权利要求2所述的方法，其中硫辛酸浓度为30mmol/L。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测样品为受试者血液样品，包括全血、血浆或血清。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的待测样品为血清。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测方法种还包括以校准品制作标准曲线定量，同时采用质控品进行质控。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，校准品制备方法包括：采用1～5％BSA的磷酸盐缓冲液为基质进行配制，按体积比49:1的比例向上述基质中添加上述5种类固醇激素不同浓度梯度的混合工作液，得到校准品。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的质控采用高和低两个水平的质控品进行质控。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述LC-MS/MS对待测样品进行检测具体方法为：
液相色谱条件包括：采用梯度洗脱，流动相A相：含0.1％甲酸水溶液；流动相B相：含0.1％甲酸甲醇溶液；流动相流速为0.6mL/min；柱温为45℃；进样量为20μL。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，质谱条件包括： 正-负离子电喷雾离子化的多离子反应监测，正离子源参数喷雾电压5500V，负离子源参数喷雾电压为-4500V；雾化温度为650℃；碰撞气为6L/min；气帘气为40L/min；雾化气为55L/min；辅助加热气为80L/min。
11.权利要求1-10任一项所述方法在制备如下任意一种或多种中的应用的诊断试剂中的用途：
a)高雄激素血症的辅助诊断；
b)多囊卵巢综合征的辅助诊断。
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