CN107121518A - 一种同时富集检测饮用水中酚类、雌激素类和雄激素类内分泌干扰物的方法 - Google Patents
一种同时富集检测饮用水中酚类、雌激素类和雄激素类内分泌干扰物的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种同时富集检测饮用水中酚类、雌激素类和雄激素类内分泌干扰物的方法，首先采用固相萃取法(SPE)对预处理后的水样浓缩富集，然后利用高效液相色谱串联质谱(LC‑MS/MS)进行分析检测，最后，根据样品的分析色谱图及三类EDCs的标准工作曲线确定水样中三类EDCs的浓度。与现有技术相比，本发明实现了饮用水中痕(微)量典型酚类、雌激素和雄激素三类EDCs的同时富集检测，避免了不同类型EDCs单独分析检测的繁琐，大大节省了测样时间，降低了检测成本，同时，检测结果精度可靠，检出限低，相对标准偏差小等。
Description
技术领域
本发明涉及水环境中痕(微)量有机污染物检测分析技术，尤其是涉及一种同时富集检测饮用水中酚类、雌激素类和雄激素类内分泌干扰物的方法。
背景技术
内分泌干扰物(Endocrine Disrupting Chemicals，即EDCs)，也称为环境激素，是一种外源性干扰内分泌系统的化学物质，其在环境中的存在能干扰人类或动物内分泌系统诸环节并导致异常效应。虽然EDCs并不直接作为有毒物质给生物体带来异常影响，但可通过摄入、积累等各种途径对生物体产生作用，即使数量极少，也能让生物体的内分泌失衡，出现种种异常现象，包括致使动物体和人体生殖器障碍、行为异常、生殖能力下降、幼体死亡，严重者甚至会造成物种灭绝。目前，有关检测环境水体中内分泌干扰物残留的分析方法已经引起了科学家的广泛关注，并对此进行了深入研究。
以下几种EDCs是目前最常见最受关注的EDCs：双酚A(BPA)、双酚S(BPS)、壬基酚(NP)、雌酮(E1)、雌二醇(E2)、雌三醇(E3)、乙炔雌二醇(EE2)、己烯雌酚(DES)、群勃龙(Tren)、睾酮(TES)和甲基睾酮(Me-TES)。其中部分EDCs不仅在水源水中含量和检出频率都很高，而且化学性质稳定，常规水处理工艺难以有效去除，致使其在龙头水中也被普遍检出，如BPA和NP等【Benotti,M.J.,et al.Pharmaceuticals and endocrine disruptingcompounds in U.S.drinking water[J].Environmental Science&Technology,2009,43,597-603】。因此，建立针对这些EDCs的简便精确的检测分析方法是对其开展有效控制的基础和前提。
虽然目前国内外在EDCs检测分析方法上已开展诸多研究，但多数检测方法只能针对某一类分子结构相同的EDCs，如酚类或雌激素类等，难以做到更大范围的多类型EDCs同时检测。如中国专利公开号CN104977382A公开了同时测定水环境中6种痕量酚类环境内分泌干扰物的分析方法。所述方法采用Sep-Pak-C18固相萃取小柱富集酚类EDCs，并以甲醇-水溶液淋洗小柱，用二氯甲烷洗脱富集的酚类EDCs至试剂小瓶中，经氮气浓缩后，加入BSTFA和吡啶进行衍生化反应，最后利用GC-MS测定环境水样中的痕量酚类EDCs。虽然该方法通过衍生化反应，能够改善色谱峰型，降低检测限，提高GC-MS分析的灵敏度和准确度，但只能检测酚类EDCs而不适用于其他类型EDCs，且衍生化反应也增加了前处理的步骤和操作时间。
中国专利公开号CN102175792A公开了一种水环境中雌激素及壬基酚、辛基酚(OP)和双酚A的共检测方法。所述方法涉及一种水环境中EDCs的检测技术，特别是涉及一种采用液相色谱-串联质谱联用技术对水环境样品中E1、E2、E3、EE2、NP、OP和BPA等7种物质的共检测方法。该方法采用固相萃取柱浓缩富集水样品中的雌激素、NP、OP和BPA，采用乙酸乙酯将雌激素、NP、OP和BPA从固相萃取柱上洗脱下来，利用液相色谱-串联质谱联用分析雌激素、NP、OP和BPA的浓度。该方法较上一种方法扩大了检测范围，能够同时分析检测水体样品中酚类和雌激素类的浓度，但就水环境中存在的EDCs种类而言，其检测范围仍有待提高。
中国专利公开号CN102636611A公开了一种复杂基质水体样品中雌激素及壬基酚、辛基酚、双酚A的共检测方法。所述方法涉及一种水环境中EDCs的检测技术，特别是涉及一种采用液相色谱-串联质谱联用技术对复杂基质水体样品中E1、E2、E3、EE2、NP、OP和BPA定量分析的技术。该方法将采集好的水体样品，采用HLB固相萃取小柱富集并用甲醇洗脱，再将洗脱液氮吹干，用Florisil固相萃取柱净化，最后利用液相色谱-串联质谱联用分析。该方法环境友好、易于操作、且回收率较高，能够快速分析复杂基质水体样品中痕量存在的E1、E2、E3、EE2、NP、OP和BPA，较前一种方法抗背景基质干扰能力有所提高。
但是，目前水环境中关注较多的除了酚类和雌激素类EDCs，还有多种雄激素类EDCs，如TREN、TES、Me-TES等，而迄今为止尚未有一种可以同时检测这三大类EDCs的分析检测方法，本发明方法恰好填补了这一空白，可以实现一次性定量分析饮用水中酚类、雌激素和雄激素三大类共11种EDCs的浓度，极大提高了检测效率。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种同时富集检测饮用水中酚类、雌激素类和雄激素类内分泌干扰物的方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种同时富集检测饮用水中酚类、雌激素类和雄激素类内分泌干扰物的方法，包括以下步骤：
(1)样品预处理：
取水样过滤除去悬浮物，调pH并加入络合剂，再加入内标物，完成预处理；
(2)目标物EDCs浓缩富集：
先对SPE小柱进行活化，将步骤(1)预处理后的水样过柱萃取富集，然后取淋洗液淋洗小柱，并真空干燥除去水分，之后继续用洗脱溶剂洗脱目标物，收集洗脱液，在氮气流下吹干，并用有机溶液定容，最后，将其过滤转移至棕色进样瓶中待测；
(3)标准工作曲线制作：
以每种EDCs与相应内标物浓度比值为横坐标，以每种EDCs定量子离子与相应内标物峰面积比值为纵坐标，分别绘制三类EDCs的标准工作曲线；
(4)仪器分析检测：
采用LC-MS/MS分析步骤(2)浓缩富集后的样品，确定样品中各目标物EDCs的定量子离子与相应内标物的峰面积比值，结合步骤(3)绘制的标准工作曲线，得到样品中各EDCs与相应内标物浓度比值，再乘以步骤(1)加入的各内标物的浓度，即可确定样品中各EDCs的含量。
作为优选的实施方案，目标物包括酚类、雌激素和雄激素三类EDCs，其中，酚类EDCs包括双酚A(BPA)、双酚S(BPS)和壬基酚(NP)，雌激素类EDCs包括雌酮(E1)、雌二醇(E2)、雌三醇(E3)、乙炔雌二醇(EE2)和己烯雌酚(DES)，雄激素类EDCs包括群勃龙(Tren)、睾酮(TES)和甲基睾酮(Me-TES)。
作为优选的实施方案，步骤(1)中的预处理过程中：
过滤采用孔径为0.7μm的玻璃纤维膜作为滤膜，pH值调节为5.0，络合剂选用Na2EDTA，酚类EDCs的内标物选用200μg/L的双酚A-D16(BPA-D16)，雌性激素EDCs的内标物选用200μg/L的雌二醇-D2(E2-D2)，雄性激素EDCs的内标物选用100μg/L的睾酮-D3(TES-D3)。
其中，优选pH值可保证前处理中目标EDCs的高回收率，优选络合剂可保证掩蔽水中Ca2+、Mg2+等干扰，内标物的投加用于指示前处理操作过程中的回收率和排除仪器分析误差，其种类和投加量的优选确保了内标物不干扰目标EDCs且出峰效果良好。
作为优选的实施方案，步骤(2)的目标物浓缩富集过程中：
SPE小柱选用Oasis HLB固相萃取小柱，并用5-10mL等体积的甲醇、超纯水和稀盐酸溶液依次通过SPE小柱进行活化，进行富集浓缩的水样体积为500mL，淋洗液选用5％的甲醇/水溶液(v/v)，真空干燥时间定为20min，温度为25℃，洗脱溶剂选用10mL乙酸乙酯/甲醇溶液(85％/15％，v/v)，氮气流吹干时控制洗脱液的水浴温度为35℃，有机溶液采用50％甲醇/水溶液(v/v)，定容后过滤转移时采用0.22μm PTFE针式过滤器过滤。
其中，优选萃取柱类型可保证目标EDCs的良好富集度和回收率，优选活化方式可最大程度提高萃取柱内填料对目标EDCs的吸附和洗脱效果、提高回收率，优选淋洗方式可在最大限度减少目标EDCs流失的同时除去萃取柱填料内的杂志、减少后续检测的干扰，优选洗脱方式可确保将萃取柱上富集的目标EDCs最大限度洗脱下来、提高目标物的回收率，优选氮吹方式可保证洗脱溶剂快速挥发的同时最大限度减少目标EDCs的损失，优选有机溶液可保证氮气吹干后附着于容器壁上的目标EDCs完全溶解混合、便于后续仪器进样分析。
作为优选的实施方案，步骤(3)的标准工作曲线绘制包括以下具体步骤：
(a)配制混合标准储备液：用50％甲醇/水溶液(v/v)将已知浓度的三类EDCs混合配制成单种EDCs浓度分别相同的混合标准储备液，置于棕色试剂瓶中；
(b)用50％甲醇/水溶液(v/v)将步骤(a)中混合标准储备液稀释为不同浓度梯度的样品，同时向各浓度梯度样品中加入200μg/L BPA-D16，200μg/L E2-D2和100μg/L TES-D3三种内标物；
(c)采用LC-MS/MS对各浓度梯度样品进行分析，以每种EDCs与相应内标物浓度比值为横坐标，以每种EDCs的定量子离子与相应内标物峰定量子离子峰面积比值为纵坐标，即可绘制三类EDCs的标准工作曲线。
其中，定量子离子峰面积的确定方法为：1)用全扫描监测模式(SCAN)确定目标物母离子(m/z)；2)用选择离子监测模式(SIM)确保目标物母离子以最佳状态进入碰撞室；3)用子离子扫描模式(Product Scan)模式筛选母离子破裂后响应度最大的特征子离子(m/z)；4)用多反应监测模式(MRM)记录以母离子和特征子离子为离子对的目标物峰面积。
作为上述优选的实施方案的更优选，步骤(b)中，不同浓度梯度的样品包括1μg/L、5μg/L、10μg/L、20μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L、500μg/L和1000μg/L的样品。
作为优选的实施方案，所述LC-MS/MS的运行参数为：
液相色谱运行参数为：
有机流动相为含0-5mM乙酸铵的甲醇和乙腈混合溶液(甲醇/乙腈＝1：1，v/v)，水相为0-5mM的乙酸铵水溶液，梯度洗脱程序：0到6min，70％的水相流动相线性降低到5％并保持6min，在13min时回到70％并保持5min，进样流速为0.25-0.45mL/min，进样体积为5-20μL；
质谱的运行参数为：
采用正电喷雾电离源(ESI+)和负电喷雾电离源(ESI-)，其中，BPA、BPS、NP、E1、E2、E3、EE2、DES、BPA-D16和E2-D2采用ESI-模式，Tren、TES、Me-TES和TES-D3采用ESI+模式；干燥气温度为350℃；气体流为11L/min；正电离模式毛细管电压4000v；负电离模式毛细管电压3000v；雾化器压力为15psi；在多反应监测(MRM)模式下，通过母离子和子离子两个特征离子，对目标EDCs进行定量分析，其中，BPA、BPS、NP、E1、E2、E3、EE2、DES、Tren、TES、Me-TES、BPA-D16、E2-D2和TES-D3的碎裂电压(V)/碰撞能(eV)分别为120/30、153/33、111/30、161/37、192/59、138/62、169/69、134/31、137/25、135/27、135/28、125/30、169/56和152/27。
作为上述优选实施方案的更优选，所述的液相色谱运行时，有机相与水相中乙酸铵浓度为2mM，进样流速为0.35mL/min，进样体积为10μL。所述的质谱检测运行参数中，BPA、BPS、NP、E1、E2、E3、EE2、DES八种EDCs及BPA-D16、E2-D2两种内标物采用ESI-电离模式检测，TREN、TES、Me-TES三种EDCs及TES-D3内标物采用ESI+电离模式检测。
上述LC-MS/MS的检测分析中，液相色谱有机流动相通过对比甲醇、乙腈以及甲醇与乙腈的混合溶液(1：1，v/v)的色谱分离效果而确定，选取出峰分离度佳、峰形好、响应度高的有机溶剂为最佳有机流动相。液相色谱水相流动相的选取，是在最佳有机流动相基础上，通过对比不同浓度乙酸铵溶液的色谱分离效果而确定，选取出峰分离度佳、峰形好、响应度高的乙酸铵浓度为最佳水相。进样流速的选择通过对比0.25、0.35、0.45mL/min三种不同流速的出峰情况而确定，综合考虑11种目标EDCs和3种内标物的出峰分离度、峰形、响应度和保留时间来选取最佳流速。
本发明通过对样品前处理浓缩富集和LC-MS/MS仪器检测条件和参数的探索和优化，实现了饮用水中痕(微)量典型酚类、雌激素和雄激素三类EDCs的同时富集检测，避免了不同类型EDCs单独分析检测的繁琐，大大节省了测样时间，降低了检测成本。在前处理过程中，通过对内标物投加量、固相萃取柱填料、水样pH、萃取体积和洗脱溶剂的选择和优化，综合提高了三类不同EDCs的回收率，并改善了后续检测中不同EDCs和内标物的出峰情况；在仪器分析检测过程中，通过对液相色谱进样条件及质谱检测参数的优化，确保了三类目标EDCs和三种内标物的峰形和分离度，从而获得了较低的检出限和较小的相对标准偏差。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)选择Oasis HLB固相萃取柱对三大类共11种EDCs进行富集纯化，回收率高而稳定，选择性强，吸附容量大，达到了对目标物有效分离富集的目的，实现了多类型EDCs的同时富集检测。
(2)采用LC-MS/MS进行定量分析检测，灵敏度高，三类EDCs的检出限均低于2ng/L，定量限均低于5ng/L，能够满足对饮用水中痕量内EDCs的检测要求。此外，串联三重四级杆质谱仪根据由对应母离子碰撞产生的特征碎片离子进行定量分析，选择性强，排除了样品中其他杂质信号的干扰。
(3)采用内标标准曲线法测定EDCs的浓度，线性关系好，相对偏差小，提高了分析的精密度。
(4)前处理过程操作简单，环境友好。
附图说明
图1为本发明的分析流程示意图；
图2为不同SPE填料对目标物回收率的影响；
图3为不同水样pH值对目标物回收率的影响；
图4为不同萃取体积对目标物回收率的影响；
图5为不同洗脱溶剂对目标物回收率的影响；
图6为三类目标物EDCs的混合标准溶液(100μg/L)的总离子流图
图7为三类目标物EDCs及相应内标物的提取色谱图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
采用如图1所示的分析方法流程，对饮用水中酚类、雌激素类和雄激素类内分泌干扰物同时进行检测，具体包括样品前处理优化、检测方法优化和运行测定效果检验三部分。
样品前处理优化包括SPE填料、最佳pH、萃取体积和洗脱溶剂的确定。
检测方法中各条件优化包括液相色谱条件优化和质谱运行参数优化。
具体步骤如下：
1.样品前处理
1.1 SPE填料的确定
固相萃取柱的选择取决于柱填料与目标物上官能团的相互作用，由于本发明涉及物理化学性质不同的三大类EDCs的分离富集与检测，为实现每种EDCs富集效率最大化，本发明根据经验总结选择了四种不同柱填料(Poly-Sery MCX、Isolute C18、Cleanert PEP和Oasis HLB)的萃取效果，结果见图2。实验结果表明：在四种SPE柱中，经过Oasis HLB固相萃取柱富集时，有更多的目标EDCs的萃取回收率位于或接近80％-120％范围，可实现对三类EDCs的有效富集且满足环境样品加标回收率的控制限要求。因此，可确定更佳的SPE填料为Oasis HLB。
1.2 最佳pH的确定
由于目标EDCs多为含酚羟基的弱酸性化合物，故本发明选择水样pH为3.0、5.0、7.0进行优化，分别代表强酸性条件，弱酸性条件，中性条件，结果见图3。实验结果表明：pH为5.0时，有更多的目标内分泌干扰物的萃取回收率在80％-120％范围内，因此本发明选择pH值为5.0的水样条件完成对目标EDCs的萃取和富集。
1.3 萃取体积的确定
载样量过大或目标物浓度过高均可导致固相萃取过程中穿透现象的发生，萃取体积宜在保证固相萃取小柱不发生穿透的前提下尽量提高富集倍数。本发明选择纯水加标浓度100ng/L(保守估计饮用水中可能存在的最大浓度)，分别采用水样体积为250mL，500mL和1000mL进行对比实验，每个萃取体积条件均设置三个平行样，不同萃取体积下的回收率见图4。实验结果表明：目标物回收率并未随萃取体积的增加而增加，萃取体积为500mL时，更多目标物萃取回收率位于或接近80％-120％范围。此外，考虑到实际采样时用玻璃瓶采样，若是萃取体积大，则更会加大采样难度，因此本发明选择萃取体积为500mL。
1.4 洗脱溶剂的确定
为了保证目标物能最大程度的被洗脱下来，本发明考察了不同洗脱溶剂对目标物回收率的影响。洗脱溶剂分别有甲醇，乙腈，乙酸乙酯：甲醇(85％:15％,v/v)。乙酸乙酯的极性很弱，为了能洗脱下来目标物，需要在乙酸乙酯中加入一定体积的醇，结果见图5。实验结果表明：当洗脱溶剂为乙腈时，洗脱时间最短，但目标物的回收率最低；当洗脱溶剂为乙酸乙酯：甲醇(85％:15％,v/v)混合溶剂时，洗脱时间最长，目标物的回收率最高，并且符合定量要求；当洗脱溶剂为甲醇时，洗脱时间和目标物的回收率位于前两者之间。并且在之后的氮吹过程中，乙酸乙酯与甲醇的混合洗脱溶剂最快被吹干，比另外两种洗脱液的氮吹时间都短，可加快实验进度。因此本发明选择洗脱溶剂为乙酸乙酯：甲醇(85％:15％,v/v)混合溶剂。
2.检测方法优化
2.1 液相色谱条件优化
为了实现色谱峰分离并提高信号强度，本发明对流动相、流速、进样量及梯度洗脱程序等影响液相分离的关键因素分别做了优化。本发明采用的液相色谱检测条件如下：
流动相A：2mM乙酸铵溶液；流动相B：含2mM乙酸铵的甲醇和乙腈混合溶液(甲醇/乙腈＝1：1，v/v)；流速：0.35mL/min；进样量：10μL；柱温：35℃；梯度洗脱程序：0到6min，70％的A流动相线性降低到5％并保持6min，在13min时回到70％并保持5min。
2.2 质谱运行参数优化
液相色谱-串联质谱仪能够利用特征碎片离子准确定量，为此，需要优化碎裂电压和碰撞能，以获得最佳分子离子-碎片离子对，使后续对实际水样的检测分析更加精确。本发明采用的质谱运行参数如下：
电离方式：ESI+和ESI-；干燥气温度：350℃；气体流速：11L/min；毛细管电压：4000v(ESI+)、3000v(ESI-)；雾化器压力：15psi。
本发明选用BPA-D16,E2-D2和TES-D3分别作为酚类、雌激素类和雄激素类EDCs的内标物，采用内标法定量。内标物与目标物在相同的色谱时间段被洗脱，且在电喷雾电离源模式下响应良好无明显基质干扰。因此，上述内标物是本发明中十分理想的内标物质。三类EDCs混合标准溶液及内标溶液的总离子流图和提取色谱图分别见图6和图7。此外，除了采用内标标准曲线外，串联质谱仪利用信号响应强度最大的特征碎片离子作为定量离子，各物质的定量离子见表1。
表1
实施例1
一种同时富集检测饮用水中酚类、雌激素类和雄激素类内分泌干扰物的方法，其标准工作曲线制作具体步骤如下：
(a)配制混合标准储备液：用50％甲醇/水溶液(v/v)将已知浓度的三类EDCs混合配制成单种EDCs浓度分别相同的混合标准储备液，置于棕色试剂瓶中；
(b)用50％甲醇/水溶液(v/v)将步骤(a)中混合标准储备液稀释为不同浓度梯度：1μg/L、5μg/L、10μg/L、20μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L、500μg/L和1000μg/L，同时向各浓度梯度样品中加入200μg/L BPA-D16，200μg/L E2-D2和100μg/L TES-D3三种内标物；
(c)采用LC-MS/MS对各浓度梯度样品进行分析，采用上述优化后的液相色谱运行参数和质谱运行参数运行LC-MS/MS，以每种EDCs与相应内标物浓度比值为横坐标，以分析得出的每种EDCs定量子离子与内标物峰面积比值为纵坐标，分别绘制三类EDCs的标准工作曲线。
方法检出限与方法定量限通过信噪比(Signal-to-noise，S/N)来计算，以3倍信噪比为方法检出限(Limit of detection，LOD)，10倍信噪比为方法定量限(Limit ofquantitation，LOQ)。本方法的线性范围、相关系数、检出限和定量限结果列于表2。
表2
结果表明目标物质在优化的仪器条件下线性相关性良好，线性相关系数R2>0.98。目标物质的方法检出限范围为0.01-1.36ng/L，方法定量限范围为0.03-4.53ng/L，低浓度水平的检出限与定量限保证了该分析方法检测水环境中痕量EDCs的可能性。
实施例2
一种同时富集检测饮用水中酚类、雌激素类和雄激素类内分泌干扰物的方法，包括以下步骤：
(1)样品预处理：
选取华东地区某水源地水样，采用0.7μm的玻璃纤维膜作为滤膜过滤除去悬浮物，调pH为5.0并加入络合剂Na2EDTA，再加入已知量的三类内标物：200μg/L的BPA-D16、200μg/L的E2-D2和100μg/L的TES-D3，完成预处理；
(2)目标物EDCs浓缩富集：
先用5-10mL等体积的甲醇、超纯水和稀盐酸溶液依次通过SPE小柱(Oasis HLB固相萃取小柱)进行活化，再取500mL步骤(1)预处理后的水样过柱萃取富集，然后取5％的甲醇/水溶液(v/v)作为淋洗液淋洗小柱，并真空干燥20min除去水分，之后继续用10mL乙酸乙酯/甲醇溶液(85％/15％，v/v)作为洗脱溶剂洗脱目标物，收集洗脱液，控制其水浴温度为35℃，在氮气流下吹干，并用50％甲醇/水溶液(v/v)溶解残留物并定容，最后，将其采用0.22μm PTFE针式过滤器过滤后转移至棕色进样瓶中待测；
(3)仪器分析检测：
采用LC-MS/MS分析步骤(2)浓缩富集后的样品，设置液相色谱运行参数为：有机流动相为含2mM乙酸铵的甲醇和乙腈混合溶液(甲醇/乙腈＝1：1，v/v)，水相为2mM的乙酸铵水溶液，梯度洗脱程序：0到6min，70％的水相流动相线性降低到5％并保持6min，在13min时回到70％并保持5min，进样流速为0.35mL/min，进样体积为10μL；质谱的运行参数为：采用正电喷雾电离源(ESI+)和负电喷雾电离源(ESI-)，干燥气温度为350℃；气体流为11L/min；正电离模式毛细管电压4000v；负电离模式毛细管电压3000v；雾化器压力为15psi；同时采用全扫描SCAN、选择离子监测(SIM)模式、子离子扫描Product Ion和多反应监测MRM模式记录。
根据LC-MS/MS分析结果确定样品中各目标物EDCs的定量子离子与相应内标物的峰面积比值，结合实施例1所绘制的标准工作曲线，得到样品中各EDCs与相应内标物浓度比值，再结合步骤(1)加入的已知的各内标物的浓度，即可确定样品中各EDCs的含量。
最后，所得饮用水样品在本实施例检测操作条件下的分析检测结果见表3。
表3
实验结果表明：所建方法已成功应用于华东地区某水源水中EDCs残留的分析检测，在所有三类EDCs中，除了BPS、DES和TREN，其他EDCs均被检出(E1浓度低于定量限)，其中NP在该水源地的浓度高达μg/L数量级。BPA、E2和EE2也是该水源地主要EDCs残留种类。
实施例3
一种同时富集检测饮用水中酚类、雌激素类和雄激素类内分泌干扰物的方法，包括以下步骤：
(1)样品预处理：
选取华东地区某水源地水样，采用0.7μm的玻璃纤维膜作为滤膜过滤除去悬浮物，调pH为5.0并加入络合剂Na2EDTA，再加入已知量的三类内标物：200μg/L的BPA-D16、200μg/L的E2-D2和100μg/L的TES-D3，完成预处理；
(2)目标物EDCs浓缩富集：
先用5-10mL等体积的甲醇、超纯水和稀盐酸溶液依次通过SPE小柱(Oasis HLB固相萃取小柱)进行活化，再取500mL步骤(1)预处理后的水样过柱萃取富集，然后取5％的甲醇/水溶液(v/v)作为淋洗液淋洗小柱，并真空干燥20min除去水分，之后继续用10mL乙酸乙酯/甲醇溶液(85％/15％，v/v)作为洗脱溶剂洗脱目标物，收集洗脱液，控制其水浴温度为35℃，在氮气流下吹干，并用50％甲醇/水溶液(v/v)溶解残留物并定容，最后，将其采用0.22μm PTFE针式过滤器过滤后转移至棕色进样瓶中待测；
(3)仪器分析检测：
采用LC-MS/MS分析步骤(2)浓缩富集后的样品，设置液相色谱运行参数为：有机流动相为含5mM乙酸铵的甲醇和乙腈混合溶液(甲醇/乙腈＝1：1，v/v)，水相为5mM的乙酸铵水溶液，梯度洗脱程序：0到6min，70％的水相流动相线性降低到5％并保持6min，在13min时回到70％并保持5min，进样流速为0.25mL/min，进样体积为20μL；质谱的运行参数为：采用正电喷雾电离源(ESI+)和负电喷雾电离源(ESI-)，干燥气温度为350℃；气体流为11L/min；正电离模式毛细管电压4000v；负电离模式毛细管电压3000v；雾化器压力为15psi；同时采用全扫描SCAN、选择离子监测(SIM)模式、子离子扫描Product Ion和多反应监测MRM模式记录。
根据LC-MS/MS分析结果确定样品中各目标物EDCs的定量子离子与相应内标物的峰面积比值，结合实施例1所绘制的标准工作曲线，得到样品中各EDCs与相应内标物浓度比值，再结合步骤(1)加入的已知的各内标物的浓度，即可确定样品中各EDCs的含量。
实施例4
一种同时富集检测饮用水中酚类、雌激素类和雄激素类内分泌干扰物的方法，包括以下步骤：
(1)样品预处理：
选取华东地区某水源地水样，采用0.7μm的玻璃纤维膜作为滤膜过滤除去悬浮物，调pH为5.0并加入络合剂Na2EDTA，再加入已知量的三类内标物：200μg/L的BPA-D16、200μg/L的E2-D2和100μg/L的TES-D3，完成预处理；
(2)目标物EDCs浓缩富集：
先用5-10mL等体积的甲醇、超纯水和稀盐酸溶液依次通过SPE小柱(OasisHLB固相萃取小柱)进行活化，再取500mL步骤(1)预处理后的水样过柱萃取富集，然后取5％的甲醇/水溶液(v/v)作为淋洗液淋洗小柱，并真空干燥20min除去水分，之后继续用10mL乙酸乙酯/甲醇溶液(85％/15％，v/v)作为洗脱溶剂洗脱目标物，收集洗脱液，控制其水浴温度为35℃，在氮气流下吹干，并用50％甲醇/水溶液(v/v)溶解残留物并定容，最后，将其采用0.22μm PTFE针式过滤器过滤后转移至棕色进样瓶中待测；
(3)仪器分析检测：
采用LC-MS/MS分析步骤(2)浓缩富集后的样品，设置液相色谱运行参数为：有机流动相为含1mM乙酸铵的甲醇和乙腈混合溶液(甲醇/乙腈＝1：1，v/v)，水相为1mM的乙酸铵水溶液，梯度洗脱程序：0到6min，70％的水相流动相线性降低到5％并保持6min，在13min时回到70％并保持5min，进样流速为0.45mL/min，进样体积为5μL；质谱的运行参数为：采用正电喷雾电离源(ESI+)和负电喷雾电离源(ESI-)，干燥气温度为350℃；气体流为11L/min；正电离模式毛细管电压4000v；负电离模式毛细管电压3000v；雾化器压力为15psi；同时采用全扫描SCAN、选择离子监测(SIM)模式、子离子扫描Product Ion和多反应监测MRM模式记录。
根据LC-MS/MS分析结果确定样品中各目标物EDCs的定量子离子与相应内标物的峰面积比值，结合实施例1所绘制的标准工作曲线，得到样品中各EDCs与相应内标物浓度比值，再结合步骤(1)加入的已知的各内标物的浓度，即可确定样品中各EDCs的含量。
实施例5
一种同时富集检测饮用水中酚类、雌激素类和雄激素类内分泌干扰物的方法，包括以下步骤：
(1)样品预处理：
选取华东地区某水源地水样，采用0.7μm的玻璃纤维膜作为滤膜过滤除去悬浮物，调pH为5.0并加入络合剂Na2EDTA，再加入已知量的三类内标物：200μg/L的BPA-D16、200μg/L的E2-D2和100μg/L的TES-D3，完成预处理；
(2)目标物EDCs浓缩富集：
先用5-10mL等体积的甲醇、超纯水和稀盐酸溶液依次通过SPE小柱(Oasis HLB固相萃取小柱)进行活化，再取500mL步骤(1)预处理后的水样过柱萃取富集，然后取5％的甲醇/水溶液(v/v)作为淋洗液淋洗小柱，并真空干燥20min除去水分，之后继续用10mL乙酸乙酯/甲醇溶液(85％/15％，v/v)作为洗脱溶剂洗脱目标物，收集洗脱液，控制其水浴温度为35℃，在氮气流下吹干，并用50％甲醇/水溶液(v/v)溶解残留物并定容，最后，将其采用0.22μm PTFE针式过滤器过滤后转移至棕色进样瓶中待测；
(3)仪器分析检测：
采用LC-MS/MS分析步骤(2)浓缩富集后的样品，设置液相色谱运行参数为：有机流动相为甲醇和乙腈混合溶液(甲醇/乙腈＝1：1，v/v)，水相为水，梯度洗脱程序：0到6min，70％的水相流动相线性降低到5％并保持6min，在13min时回到70％并保持5min，进样流速为0.3mL/min，进样体积为8μL；质谱的运行参数为：采用正电喷雾电离源(ESI+)和负电喷雾电离源(ESI-)，干燥气温度为350℃；气体流为11L/min；正电离模式毛细管电压4000v；负电离模式毛细管电压3000v；雾化器压力为15psi；同时采用全扫描SCAN、选择离子监测(SIM)模式、子离子扫描Product Ion和多反应监测MRM模式记录。
根据LC-MS/MS分析结果确定样品中各目标物EDCs的定量子离子与相应内标物的峰面积比值，结合实施例1所绘制的标准工作曲线，得到样品中各EDCs与相应内标物浓度比值，再结合步骤(1)加入的已知的各内标物的浓度，即可确定样品中各EDCs的含量。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种同时富集检测饮用水中酚类、雌激素类和雄激素类内分泌干扰物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)样品预处理：
取水样过滤除去悬浮物，调pH并加入络合剂，再加入内标物，完成预处理；
(2)目标物EDCs浓缩富集：
先对SPE小柱进行活化，将步骤(1)预处理后的水样过柱萃取富集，然后取淋洗液淋洗小柱，并真空干燥除去水分，之后继续用洗脱溶剂洗脱目标物，收集洗脱液，在氮气流下吹近干，并用有机溶液定容，最后，将其过滤转移至棕色进样瓶中待测；
(3)标准工作曲线制作：
以每种EDCs与相应内标物浓度比值为横坐标，以每种EDCs定量子离子与相应内标物峰面积比值为纵坐标，分别绘制三类EDCs的标准工作曲线；
(4)仪器分析检测：
采用LC-MS/MS分析步骤(2)浓缩富集后的样品，确定样品中各目标物EDCs的定量子离子与相应内标物的峰面积比值，结合步骤(3)绘制的标准工作曲线，得到样品中各EDCs与相应内标物浓度比值，再乘以步骤(1)加入的各内标物的浓度，即可确定样品中各EDCs的含量。
2.根据权利要求1所述的一种同时富集检测饮用水中酚类、雌激素类和雄激素类内分泌干扰物的方法，其特征在于，目标物包括酚类、雌激素和雄激素三类EDCs。
3.根据权利要求2所述的一种同时富集检测饮用水中酚类、雌激素类和雄激素类内分泌干扰物的方法，其特征在于，所述酚类EDCs包括双酚A(BPA)、双酚S(BPS)和壬基酚(NP)。
4.根据权利要求2所述的一种同时富集检测饮用水中酚类、雌激素类和雄激素类内分泌干扰物的方法，其特征在于，所述雌激素类EDCs包括雌酮(E1)、雌二醇(E2)、雌三醇(E3)、乙炔雌二醇(EE2)和己烯雌酚(DES)；
所述雄激素类EDCs包括群勃龙(Tren)、睾酮(TES)和甲基睾酮(Me-TES)。
5.根据权利要求1所述的一种同时富集检测饮用水中酚类、雌激素类和雄激素类内分泌干扰物的方法，其特征在于，步骤(1)中的预处理过程中：
过滤采用0.7μm孔径的玻璃纤维膜作为滤膜，pH值调节为5.0，络合剂选用Na2EDTA，酚类DCs的内标物选用200μg/L的双酚A-D16(BPA-D16)，雌性激素EDCs的内标物选用200μg/L的雌二醇-D2(E2-D2)，雄性激素EDCs的内标物选用100μg/L的睾酮-D3(TES-D3)。
6.根据权利要求1所述的一种同时富集检测饮用水中酚类、雌激素类和雄激素类内分泌干扰物的方法，其特征在于，步骤(2)的目标物浓缩富集过程中：
SPE小柱选用Oasis HLB固相萃取小柱，并用5-10mL等体积的甲醇、超纯水和稀盐酸溶液依次通过SPE小柱进行活化，进行富集浓缩的水样体积为500mL，淋洗液选用5％的甲醇/水溶液(v/v)，真空干燥时间定为20min，温度为室温25℃，洗脱溶剂选用10mL乙酸乙酯/甲醇溶液(85％/15％，v/v)，氮气流吹近干时控制洗脱液的水浴温度为35℃，有机溶液采用50％甲醇/水溶液(v/v)，定容后过滤转移时采用0.22μm PTFE针式过滤器过滤。
7.根据权利要求1所述的一种同时富集检测饮用水中酚类、雌激素类和雄激素类内分泌干扰物的方法，其特征在于，步骤(3)的标准工作曲线绘制包括以下具体步骤：
(a)配制混合标准储备液：用50％甲醇/水溶液(v/v)将已知浓度的三类EDCs混合配制成单种EDCs浓度分别相同的混合标准储备液，置于棕色试剂瓶中；
(b)用50％甲醇/水溶液(v/v)将步骤(a)中混合标准储备液稀释为不同浓度梯度的样品，同时向各浓度梯度样品中加入200μg/L BPA-D16，200μg/L E2-D2和100μg/L TES-D3三种内标物；
(c)采用LC-MS/MS对各浓度梯度样品进行分析，以每种EDCs与相应内标物浓度比值为横坐标，以每种EDCs的定量子离子与相应内标物峰面积比值为纵坐标，即可绘制三类EDCs的标准工作曲线。
8.根据权利要求7所述的一种同时富集检测饮用水中酚类、雌激素类和雄激素类内分泌干扰物的方法，其特征在于，步骤(b)中，不同浓度梯度的样品包括1μg/L、5μg/L、10μg/L、20μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L、500μg/L和1000μg/L的样品。
9.根据权利要求1或7或8所述的一种同时富集检测饮用水中酚类、雌激素类和雄激素类内分泌干扰物的方法，其特征在于，所述LC-MS/MS的运行参数为：
(a)液相色谱运行参数为：
有机流动相为含0-5mM乙酸铵的甲醇和乙腈混合溶液(甲醇/乙腈＝1：1，v/v)，水相为0-5mM的乙酸铵水溶液，梯度洗脱程序：0到6min，70％的水相流动相线性降低到5％并保持6min，在13min时回到70％并保持5min，进样流速为0.25-0.45mL/min，进样体积为5-20μL；
(b)质谱的运行参数为：
采用正电喷雾电离源(ESI+)和负电喷雾电离源(ESI-)，其中，BPA、BPS、NP、E1、E2、E3、EE2、DES、BPA-D16和E2-D2采用ESI-模式，Tren、TES、Me-TES和TES-D3采用ESI+模式；干燥气温度为350℃；气体流为11L/min；正电离模式毛细管电压4000v；负电离模式毛细管电压3000v；雾化器压力为15psi；在多反应监测(MRM)模式下，通过母离子和子离子两个特征离子，对目标EDCs进行定量分析，其中，BPA、BPS、NP、E1、E2、E3、EE2、DES、Tren、TES、Me-TES、BPA-D16、E2-D2和TES-D3的碎裂电压(V)/碰撞能(eV)分别为120/30、153/33、111/30、161/37、192/59、138/62、169/69、134/31、137/25、135/27、135/28、125/30、169/56和152/27。
10.根据权利要求9所述的一种同时富集检测饮用水中酚类、雌激素类和雄激素类内分泌干扰物的方法，其特征在于，所述的液相色谱运行时，有机相与水相中乙酸铵浓度为2mM，进样流速为0.35mL/min，进样体积为10μL。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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