CN115876933A - 一种血清中类固醇激素的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种血清中类固醇激素的检测方法，包括以下步骤：(1)每毫升待测样品中加入磁性固相萃取剂0.1～20mg，混匀，磁性分离，移除液体；加入淋洗液，混匀，磁性分离，移除液体；加入洗脱液进行洗脱，混匀，磁性分离，收集洗脱液，即为待测液；(2)采用液相色谱和串联质谱法检测待测液中的激素含量；其中，所述激素选自睾酮、雄烯二酮、双氢睾酮、硫酸脱氢表雄酮、17α‑羟基孕酮中的任一种或其组合；所述磁性固相萃取剂包含磁核四氧化三铁、包裹磁核的中层结构二氧化硅和外层介孔结构，所述外层介孔结构选自聚苯乙烯、聚苯乙烯二乙烯基苯中的任一种或其组合。本发明具有稳定性好、准确度和灵敏度高，专属性强，回收率高，操作简便可控，分析速度快等特点，可用于临床中多种激素的同时定量检测。

Description

一种血清中类固醇激素的检测方法

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种血清中类固醇激素的检测方法。

背景技术

多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是一种常见妇科内分泌疾病，多发病于青春期。临床上以月经不调为主要症状，兼有体毛多、痤疮多发、肥胖、不孕等。临床诊断中，除了超声波提示卵巢多囊性改变外，血清高雄性激素也是重要的诊断依据。研究表明，以血清中睾酮(T)为主，以及血清中雄烯二酮(A4)、双氢睾酮(DHT)、硫酸脱氢表雄酮(DHEAS)、17α-羟孕酮(17-OHP)五种激素的浓度水平，在PCOS患者和正常人群之间有明显差别。准确检测机体内激素水平，对于临床诊断PCOS具有重要意义。

目前临床上主要采用免疫法对激素进行测定，该方法存在特异性差的缺点，由于异噬性抗体等因素干扰常导致结果的不准确性，且无法在一次检测中获得多种激素的结果。已有较多文献报道了液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)用于检测血清中性激素睾酮(T)水平，但由于人体中激素含量较低，基质干扰严重，因此，在对待测样品进行分析前，都要对样品进行前处理，富集待测物，排除基质干扰，从而提高分析精度和检测灵敏度，但现有的前处理方法步骤复杂、处理时间长、通量低、试剂成本高、对操作人员要求高，且在线萃取的耗材成本高。因此，亟需开发一种能够同时测定血清中五种类固醇激素的检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种血清中类固醇激素的检测方法，包括以下步骤：

(1)每毫升待测样品中加入磁性固相萃取剂0.1～20mg，混匀，磁性分离，移除液体；加入淋洗液，混匀，磁性分离，移除液体；加入洗脱液进行洗脱，混匀，磁性分离，收集洗脱液，即为待测液；

(2)采用液相色谱和串联质谱法检测待测液中的激素含量；

其中，所述激素选自睾酮、雄烯二酮、双氢睾酮、硫酸脱氢表雄酮、17α-羟基孕酮中的任一种或其组合；

所述磁性固相萃取剂包含磁核四氧化三铁、包裹磁核的中层结构二氧化硅和外层介孔结构，所述外层介孔结构选自聚苯乙烯、聚苯乙烯二乙烯基苯中的任一种或其组合。

本发明优选的技术方案，所述磁性固相萃取剂选自水油平衡磁性固相萃取剂(HLB)、强阳离子交换磁性固相萃取剂(MCX)、强阴离子交换磁性固相萃取剂(MAX)、弱阳离子交换磁性固相萃取剂(WCX)、弱阴离子交换磁性固相萃取剂(WAX)中的任一种或其组合。

本发明优选的技术方案，所述磁性固相萃取剂还包括键合于介孔结构内的具选择性吸附性能的官能团。

本发明优选的技术方案，所述官能团选自亲水性基团、强阳离子交换基团(MCX)、强阴离子交换基团(MAX)、弱阳离子交换基团(WCX)、弱阴离子交换基团(WAX)中的任一种。

本发明优选的技术方案，所述官能团选自N-乙烯吡咯烷酮、磺酸基团、季胺基团、羧酸根基团、仲胺基团中的任一种。

本发明优选的技术方案，每毫升待测样品中加入磁性固相萃取剂为1～15mg，更优选为5-10mg。

本发明优选的技术方案，所述淋洗液为甲醇、正己烷中的任一种或其组合。

本发明优选的技术方案，所述磁性固相萃取剂与淋洗液质量体积比为1:0.1～0.5mg/mL，优选为1:0.2-0.3mg/mL。

本发明优选的技术方案，所述洗脱液为乙腈甲醇混合溶液，所述混合溶液中乙腈与甲醇的体积比为9:1。

本发明优选的技术方案，所述磁性固相萃取剂与洗脱液质量体积比为1:0.01～0.1mg/mL，优选为1:0.025-0.05mg/mL。

本发明优选的技术方案，所述磁性固相萃取剂先进行活化制成磁性萃取剂悬浊液，再加入待测样品溶液中。

本发明优选的技术方案，所述磁性萃取剂悬浊液的制备方法为：

a、取磁性固相萃取剂按质量体积比1:1～10g/mL加入甲醇或乙醇中，震荡均匀；

b、按质量体积比1:0.01～0.1mg/mL加入甲醇，混匀，磁性分离，移除溶液；

c、按质量体积比1:0.01～0.1mg/mL加入5％甲醇水溶液，混匀，磁性分离，移除溶液；制得磁性萃取剂悬浊液。

本发明优选的技术方案，步骤a中，所述磁性固相萃取剂与甲醇或乙醇的质量体积比为1:5-8g/mL。

本发明优选的技术方案，步骤b中，所述磁性固相萃取剂与甲醇质量体积比为1:0.05-0.008mg/mL。

本发明优选的技术方案，步骤c中，所述磁性固相萃取剂与5％甲醇水溶液质量体积比为1:0.05～0.08mg/mL。

本发明优选的技术方案，所述混匀方式为超声混匀，超声频率40-60HZ、超声功率60-240w、超声温度20-30度、超声混匀时间为30～60s。

本发明优选的技术方案，所述磁性分离方式为采用铷磁铁吸附磁性固相萃取剂进行分离。

本发明优选的技术方案，所待测样品溶液的制备方法为，向待测样品中加入混合内标溶液，用水稀释，涡旋混合均匀，得待测样品溶液。

本发明优选的技术方案，所述混合内标溶液中包含睾酮内标物(T-d3)、雄烯二酮内标物(A4-13C3)、双氢睾酮内标物(DHT-d3)、硫酸脱氢表雄酮内标物(DHEAS-d5)、17α-羟基孕酮内标物(17-OHP-d8)；优选的，所述混合内标溶液中睾酮内标物(T-d3)、雄烯二酮内标物(A4-13C3)、双氢睾酮内标物(DHT-d3)、17α-羟基孕酮内标物(17-OHP-d8)的浓度均为10ng/mL，硫酸脱氢表雄酮内标物(DHEAS-d5)的浓度为1200ng/mL。

本发明优选的技术方案，所述待测样品为受试者的静脉血经凝血处理后所得血清或与之相关的提取液。

本发明优选的技术方案，所述液相色谱和串联质谱法的检测方法为，将提取的激素采用液相色谱分离，三重四极杆串联质谱检测。

本发明的优选技术方案中，所述的色谱柱选自反相C18色谱柱，亲电基团修饰的反相C18色谱柱，苯基修饰的反相C18色谱柱，全氟代苯基修饰的反相C18色谱柱。

本发明的优选技术方案中，所述色谱柱的直径为3-5mm，色谱柱的长度20-300mm，色谱柱中的填料粒径为2-5μm。

本发明优选的技术方案，所述液相色谱的色谱柱型号为Phenomenex Kinetex C18(2.6um，2.1x50mm)。

本发明优选的技术方案，所述液相色谱的流动相为流动相A和流动相B，其中，流动相A为含1-5mmol/L氟化铵的水溶液；流动相B为含1-5mmol/L氟化铵的甲醇水溶液。

本发明优选的技术方案，所述液相色谱的流速为0.1-1mL/min，优选为0.4-0.8mL/min。

本发明优选的技术方案，所述液相色谱的柱温为30-40℃，优选为35-37℃。

本发明优选的技术方案，所述液相色谱的进样体积为1-10μL，优选为2-5μL。

本发明优选的技术方案，所述流动相洗脱程序为：

时间(min)	A％	B％
			0	70	30
0.5	50	50
			2	50	50
3.5	10	90
			4.5	10	90
5	70	30
			6	70	30

本发明优选的技术方案，所述串联质谱条件为：离子源部分：雾化气50psi；加热辅助气55psi；气帘气25psi；电离电压5500V/-4500V。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、本发明方法通过分散固相萃取技术富集血清中五种激素，并结合液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)分析血清中痕量激素，解决了现有技术中难准确测定人血清中醇激素含量，且大多分析时间长，样品前处理复杂，测定激素种类少，不能同时测定多种激素含量的问题。

2、本发明方法具有稳定性好、准确度和灵敏度高，专属性强，回收率高，操作简便可控，分析速度快等特点，可用于临床中多种雄性激素的同时定量检测。

除非另有说明，本文中，

T是指睾酮；

A4是指雄烯二酮；

DHT是指双氢睾酮；

DHEAS是指硫酸脱氢表雄酮；

17-OHP是指17α-羟孕酮。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

附图说明

图1为实施例1血清中激素的MRM色谱图；

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

实施例1血清中激素的检测

1、标准样品准备

五种激素原始标准品浓度均为1000μg/mL的甲醇溶液。以甲醇为溶剂，分别稀释五种性激素的单标溶液，浓度均为10μg/mL。以甲醇为溶剂，将上述单标溶液混合制得混标溶液，其中T、A4、DHT、17-OHP浓度为10ng/mL，DHEAS浓度为1200ng/mL。以不含上述五种性激素的空白血清(或者浓度为4～5％牛血清白蛋白水溶液)为溶剂，将上述混标溶液逐级稀释制得T、A4、DHT、17-OHP浓度为0.05、0.1、0.5、1、2、5、10ng/mL，DHEAS浓度为6、12、60、120、240、600、1200的标准曲线系列工作溶液，分别进行磁性萃取处理。

五种性激素原始同位素标记标准品浓度均为1000μg/mL的甲醇溶液。逐级稀释，添加至各点标准曲线工作溶液至T-d3、A4-13C3、DHT-d3、17-OHP-d8浓度为0.5ng/mL，DHEAS-d5浓度为60ng/mL。

2、待测样品前处理

S1、精密称取0.5g Bonnacats-MA HLB磁性萃取剂于5mL玻璃瓶中，加入5mL乙醇。取用前振荡均匀，直至所有固体全部悬浮于乙醇中，瓶底没有沉降，得磁性萃取剂悬浊液。

S2、活化，移取200μL甲醇，加入上述试管内，超声波混匀30秒。将一枚铷磁铁置于试管近底部的外侧，静置30秒。尽可能将甲醇移取完全并丢弃。

S3、平衡，移取400μL 5％甲醇水溶液，加入上述试管内，超声波混匀30秒。将一枚铷磁铁置于试管近底部的外侧，静置30秒。尽可能将5％甲醇水溶液移取完全并丢弃。

S4、取400μL血清，加入20μLT-d3、A4-13C3、DHT-d3、17-OHP-d8浓度为10ng/mL，DHEAS-d5浓度为1200ng/mL的混合内标溶液，加入400μL水，涡旋混合均匀得待净化样品溶液。

S5、上样，移取上述800μL待净化样品溶液，加入上述试管内，超声波混匀60秒。将一枚铷磁铁置于试管近底部的外侧，静置30秒。尽可能将样品溶液移取完全并丢弃。

S6、淋洗1，移取800μL 5％甲醇水溶液，加入上述试管内，超声波混匀30秒。将一枚铷磁铁置于试管近底部的外侧，静置30秒。尽可能将5％甲醇水溶液移取完全并丢弃。

S7、淋洗2，移取400μL正己烷，加入上述试管内，超声波混匀30秒。将一枚铷磁铁置于试管近底部的外侧，静置30秒。尽可能将正己烷移取完全并丢弃。

S8、洗脱，移取100μL体积比为9:1的乙腈甲醇混合液(简称洗脱液)，加入上述试管内，超声波混匀60秒。将一枚铷磁铁置于试管近底部的外侧，静置30秒。尽可能将洗脱液移取完全并转移至1.5mL玻璃样品瓶或96孔样品板的某一孔内。

S9、稀释，在洗脱液中加入200μL水，涡旋混合均匀，得洗脱液稀释液。

3、待测样品分析检测

将步骤S9所得洗脱液稀释液分析检测，采用液相色谱进行分离，三重四极杆串联质谱检测，得到样品谱图。

液相色谱条件如下：

色谱柱：Phenomenex Kinetex C18 2.6um，2.1x50mm

流速：0.4mL/min

柱温：35℃

进样体积：5μL

流动相：A，含5mmol/L氟化铵的水溶液；B，含5mmol/L氟化铵的甲醇水溶液

流动相洗脱程序：

时间(min)	A％	B％
			0	70	30
0.5	50	50
			2	50	50
3.5	10	90
			4.5	10	90
5	70	30
			6	70	30

串联质谱条件如下：

离子源部分：雾化气50psi；加热辅助气55psi；气帘气25psi；电离电压5500V/-4500V。

质量分析器部分：

表1激素MRM质谱参数

4、定量计算结果分析：检测结果见图1。

实施例1方法学验证结果：

1、线性和范围

激素DHEAS在20～5000ng/mL范围内，激素17-OHP、A4、DHT、T在0.02～10ng/mL范围内，线性关系良好，相关系数均大于0.998。

2、定量限

激素DHEAS的定量限为20ng/mL，激素17-OHP、A4、DHT、T的定量限为0.02ng/mL。

3、基质效应

分别测得五种激素的实际响应值A和标准响应值B。五种激素的基质影响因子，即响应值比值A/B，均在82.4～108％之间，满足验证要求。

4、准确度

用本发明所述方法重复测试三次，五种激素的回收率均在88.7～106％之间，且RSD(n＝3)≤8.1％，满足验证要求。

5、精密度

取空白血浆，加入适量五种激素标准物质，制得低中高三个浓度(DHEAS浓度分别为20、50、1000ng/mL；17-OHP、A4、DHT、T浓度分别为0.02、0.05、1.0ng/mL)的精密度测试样品。用本发明所述方法，将以上样品分两个批次测定。五种激素的批内和批间的相对标准偏差均≤8.7％，回收率值均在88.7～107％之间，满足验证要求。

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明权利要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种血清中类固醇激素的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)每毫升待测样品中加入磁性固相萃取剂0.1～20mg，混匀，磁性分离，移除液体；加入淋洗液，混匀，磁性分离，移除液体；加入洗脱液进行洗脱，混匀，磁性分离，收集洗脱液，即为待测液；

(2)采用液相色谱和串联质谱法检测待测液中的激素含量；其中所述激素选自睾酮、雄烯二酮、双氢睾酮、硫酸脱氢表雄酮、17α-羟基孕酮中的任一种或其组合；

所述磁性固相萃取剂包含磁核四氧化三铁、包裹磁核的中层结构二氧化硅和外层介孔结构，所述外层介孔结构选自聚苯乙烯、聚苯乙烯二乙烯基苯中的任一种或其组合。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述磁性固相萃取剂选自水油平衡磁性固相萃取剂(HLB)、强阳离子交换磁性固相萃取剂(MCX)、强阴离子交换磁性固相萃取剂(MAX)、弱阳离子交换磁性固相萃取剂(WCX)、弱阴离子交换磁性固相萃取剂(WAX)中的任一种或其组合。

3.如权利要求1-2任一项所述的方法，其特征在于，所述磁性固相萃取剂还包括键合于介孔结构内的具选择性吸附性能的官能团，优选所述官能团选自亲水性基团、强阳离子交换基团(MCX)、强阴离子交换基团(MAX)、弱阳离子交换基团(WCX)、弱阴离子交换基团(WAX)中的任一种，更优选所述官能团选自N-乙烯吡咯烷酮、磺酸基团、季胺基团、羧酸根基团、仲胺基团中的任一种。

4.如权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述淋洗液为甲醇、正己烷中的任一种或其组合，优选所述磁性固相萃取剂与淋洗液质量体积比为1:0.1～0.5mg/mL，优选为1:0.2-0.3mg/mL。

5.如权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述洗脱液为乙腈甲醇混合溶液，所述混合溶液中乙腈与甲醇的体积比为9:1，所述磁性固相萃取剂与洗脱液质量体积比为1:0.01～0.1mg/mL，优选为1:0.025-0.05mg/mL。

6.如权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述磁性固相萃取剂先进行活化制成磁性萃取剂悬浊液，再加入待测样品溶液中，所述磁性萃取剂悬浊液的制备方法为：a、取磁性固相萃取剂按质量体积比1:1～10g/mL加入甲醇或乙醇中，震荡均匀；b、按质量体积比1:0.01～0.1mg/mL加入甲醇，混匀，磁性分离，移除溶液；c、按质量体积比1:0.01～0.1mg/mL加入5％甲醇水溶液，混匀，磁性分离，移除溶液；制得磁性萃取剂悬浊液。

7.如权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，所述混匀方式为超声混匀，超声频率40-60HZ、超声功率60-240w、超声温度20-30度、超声混匀时间为30～60s。

8.如权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，所述液相色谱和串联质谱法的检测方法为，将提取的激素采用液相色谱分离，三重四极杆串联质谱检测，所述的色谱柱选自反相C18色谱柱，亲电基团修饰的反相C18色谱柱，苯基修饰的反相C18色谱柱，全氟代苯基修饰的反相C18色谱柱，优选为所述液相色谱的色谱柱型号为Phenomenex Kinetex C18(2.6um，2.1x50mm)。

9.如权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于，所述液相色谱的流动相为流动相A和流动相B，其中，流动相A为含1-5mmol/L氟化铵的水溶液；流动相B为含1-5mmol/L氟化铵的甲醇水溶液，优选所述流动相洗脱程序为：

时间(min) A％ B％ 0 70 30 0.5 50 50 2 50 50 3.5 10 90 4.5 10 90 5 70 30 6 70 30

10.如权利要求1-9任一项所述的方法，其特征在于，所述串联质谱条件为：离子源部分：雾化气50psi；加热辅助气55psi；气帘气25psi；电离电压5500V/-4500V。

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