CN104807920A - 高效液相色谱串联质谱技术检测血清中10种类固醇激素的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高效液相色谱串联质谱技术检测血清中10种类固醇激素的试剂盒，包括洗脱液、标准品母液、混合内标液、稀释液、萃取液和质控品，所述的10种类固醇激素分别为：脱氢表雄酮、睾酮、双氢睾酮、雄烯二酮、雌酮、皮质酮、孕酮、孕烯醇酮、17α-羟孕酮和17-羟孕烯醇酮。采用本发明试剂盒进行检测，灵敏度高、特异性强、准确且前处理过程较简单，10min之内可完成多种激素的分离和检测，精密度与加标回收率基本满足要求。
Description
技术领域
本发明属于血液检测技术领域，具体涉及高效液相色谱串联质谱技术检测血清中10种类固醇激素的试剂盒。
背景技术
类固醇激素是一类脂溶性小分子激素，是由胆固醇经一系列酶催化而来。本发明主要针对其中对人体生长发育、性成熟及新陈代谢所必须的10种类固醇激素进行分析，包括脱氢表雄酮(dehydroepiandrosterone,DHEA)、睾酮(testosterone，T)、双氢睾酮(dihydrotestosterone,DHT)、雄烯二酮(androstenedione,AD)、雌酮(estrone,E1)、皮质酮(corticosterone,CORT)、孕酮(progesterone,P4)、孕烯醇酮(pregnenolone,P5)、17α-羟孕酮(17α-Hydroxyprogesterone,17α-OHP4)和17-羟孕烯醇酮(17-hydroxyl pregnenolone,17-OHP5)。
其中，DHEA是一种非常重要的荷尔蒙，可使人改善记忆力，恢复性能力，降低血液中的胆固醇，并能抵抗肥胖、心脏疾病与压力，还能强化免疫系统。脱氢表雄酮过低可能引起糖尿病、免疫力不足、癌症、高血压及心脏病等重大疾病。17α-OHP4和CORT增高可能引起先天性肾上腺皮质增生，肾上腺腺瘤或卵巢肿瘤。T可增进记忆力、增加肌肉强度、减少脂肪、增加骨头硬度。DHT的作用主要是维持产生精子作用，刺激生殖器官的发育，维持正常的性欲，同时还能促进骨骼生长与钙磷的沉积和红细胞的生成。AD升高可引起痤疮，先天性肾上腺皮质增生，肾上腺皮质肿瘤等；AD降低可使得男性发育延迟，侏儒症，肾上腺皮质功能减退症，镰状红细胞性贫血。
总之，人体类固醇激素的升高或者降低与一些临床疾病如先天性肾上腺增生、多囊卵巢综合症、肾上腺皮质功能不全等疾病息息相关，其在血清中含量的高低对于评估人体健康是至关重要的。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种高效液相色谱串联质谱技术检测血清中10种类固醇激素的试剂盒。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
高效液相色谱串联质谱技术检测血清中10种类固醇激素的试剂盒，
所述的10种类固醇激素分别为：脱氢表雄酮、睾酮、双氢睾酮、雄烯二酮、雌酮、皮质酮、孕酮、孕烯醇酮、17α-羟孕酮和17-羟孕烯醇酮；
所述试剂盒包括如下试剂：
(1)洗脱液：
洗脱液A：0.1％v/v甲酸水溶液；
洗脱液B：0.1％v/v甲酸甲醇溶液；
(2)标准品母液：含雄烯二酮、17α-羟孕酮、孕烯醇酮、雌酮、双氢睾酮、脱氢表雄酮、孕酮、睾酮、皮质酮和17-羟孕烯醇酮的甲醇溶液；
(3)混合内标液：含有d6-脱氢表雄酮、d3-睾酮、d8-17α-羟孕酮、d2-雌酮和d9-孕酮的甲基叔丁基醚溶液；
(4)稀释液：
稀释液1：空白血清基质溶液；
稀释液2：甲醇；
(5)萃取液：甲基叔丁基醚；
(6)质控品：含有雄烯二酮、17α-羟孕酮、孕烯醇酮、雌酮、双氢睾酮、脱氢表雄酮、孕酮、睾酮、皮质酮和17-羟孕烯醇酮的空白血清基质溶液，分高中低三个浓度分别为QC(L)、QC(M)、QC(H)；
其中，QC(L)，QC(M)，QC(H)中10种类固醇激素质控品对应浓度见表1；
表1 10种类固醇激素质控品对应浓度(单位ng/mL)
其中，所述的标准品母液为含浓度为20ng/mL的雄烯二酮、20ng/mL 17α-羟孕酮、20ng/mL孕烯醇酮、20ng/mL雌酮、20ng/mL双氢睾酮、80ng/mL的脱氢表雄酮、100ng/mL孕酮、100ng/mL睾酮、100ng/mL皮质酮、50ng/mL17-羟孕烯醇酮的甲醇溶液。
其中，所述的混合内标液为含有1.0mg/mL d6-脱氢表雄酮、1.0mg/mL d3-睾酮、1.0mg/mL d8-17α-羟孕酮、1.0mg/mL d2-雌酮和1.0mg/mL d9-孕酮的甲基叔丁基醚溶液。
其中，所述的空白血清基质溶液为40mg/mL牛血清蛋白的水溶液。
其中，所述的血清为人或动物的血清。
上述高效液相色谱串联质谱技术检测血清中10种类固醇激素的试剂盒的制备方法，
(1)洗脱液：
洗脱液A：配制0.1％v/v甲酸水溶液；
洗脱液B：配制0.1％v/v甲酸甲醇溶液；
(2)标准品母液：
分别准确称取脱氢表雄酮10.0mg、睾酮25.0mg、双氢睾酮5.2mg、雄烯二酮1.5mg、雌酮2.5mg、皮质酮2.0mg、孕酮10mg、孕烯醇酮5.1mg、17α-羟孕酮10mg和17-羟孕烯醇酮25mg，分别加入1mL、2.5mL、5.2mL、1.5mL、2.5mL、2mL、1mL、5.1mL、10mL和2.5mL的甲基叔丁基醚，配制成浓度分别为10.0mg/mL的脱氢表雄酮、10.0mg/mL的睾酮、1.0mg/mL的双氢睾酮、1.0mg/mL的雄烯二酮、1.0mg/mL的雌酮、1.0mg/mL的皮质酮、10.0mg/mL的孕酮、1.0mg/mL的孕烯醇酮、1.0mg/mL的17-羟孕酮和10.0mg/mL的17-羟孕烯醇酮的标准品母液；
分别从以上脱氢表雄酮、睾酮、孕酮和17-羟孕烯醇酮标准品母液中移取100μL用甲基叔丁基醚定容至1mL，得到这10种类固醇激素的浓度都是1.0mg/mL，然后用甲醇将这10种类固醇激素的浓度由1.0mg/mL逐级稀释至1.0μg/mL；
分别取200μL浓度为1.0μg/mL的雄烯二酮、17α-羟孕酮、孕烯醇酮、雌酮和双氢 睾酮，800μL浓度为1.0μg/mL的脱氢表雄酮，各1.0mL浓度为1.0μg/mL的睾酮、孕酮和皮质酮，500μL浓度为1.0μg/mL的17-羟孕烯醇酮均加入到15mL离心管中，再加去离子水定容到10mL，配制成混合标准液A；混合标准液A中，雄烯二酮、17α-羟孕酮、孕烯醇酮、雌酮和双氢睾酮的浓度为20ng/mL，脱氢表雄酮的浓度为80ng/mL，孕酮、睾酮和皮质酮的浓度为100ng/mL，17-羟孕烯醇酮的浓度为50ng/mL；
(3)混合内标液：配制含有1.0mg/mL d6-脱氢表雄酮、1.0mg/mL d3-睾酮、1.0mg/mL d8-17α-羟孕酮、1.0mg/mL d2-雌酮和1.0mg/mL d9-孕酮的甲基叔丁基醚溶液；
(4)稀释液：
稀释液1：将4g牛血清蛋白用水定容至100mL制得；
稀释液2：甲醇；
(5)萃取液：甲基叔丁基醚；
(6)质控品：取步骤(2)得到的10种类固醇激素标混合标准液A各20μL、100μL、500μL分别用空白血清基质溶液定容至1000μL得到。
上述试剂盒在利用高效液相色谱串联质谱技术检测血清中10种类固醇激素中的应用也在本发明的保护范围之内。
具体检测方法如下：
高效液相色谱串联质谱技术检测血清中10种类固醇激素的方法，
所述的10种类固醇激素分别为：脱氢表雄酮、睾酮、双氢睾酮、雄烯二酮、雌酮、皮质酮、孕酮、孕烯醇酮、17α-羟孕酮和17-羟孕烯醇酮；
采用高效液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的血清中的上述10种类固醇激素，先利用高效液相色谱将10种类固醇激素分离，再利用质谱同位素内标定量法，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物的峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算上述10种类固醇激素的含量，具体色谱条件为：
(1)高效液相色谱条件：
流动相A：0.1％v/v甲酸水溶液；
流动相B：0.1％v/v甲酸的甲醇溶液；
色谱柱型号：Phenomenex C18100mm×2.1mm，2.6μm；
采用梯度洗脱的方式，见表2；
流速为0.5mL/min，柱温为35℃，进样体积为20μL；
表2 流动相梯度洗脱参数
(2)质谱条件：
在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式；喷雾电压为5500V；碰撞气为Medium；气帘气为40kPa；离子源雾化气和加热辅助气均为60kPa；去溶剂温度为550℃；同时监测了目标物孕酮(m/z 345.093→124.1)、孕烯醇酮(m/z332.0→86.2)、17α-羟孕酮(m/z 361.0→112.2)、17-羟孕烯醇酮(m/z 348.0→330.3)、雄烯二酮(m/z 317.0→112.2)、脱氢表雄酮(m/z 304.2→253.2)、睾酮(m/z 304.1/112.2)、双氢睾酮(m/z 306.2→81.1)、皮质酮(m/z 410.0→377.2)和雌酮(m/z 286.0→253.0)以及同位素内标d2-雌酮(m/z 288.0→255.1)、d6-脱氢表雄酮(m/z 310.3→219.2)、d8-17α-羟孕酮(m/z 269.2→115.1)和d3-睾酮(m/z 307.0→112.2)；各个目标物的去簇电压、碰撞电压和碰撞池出口电压参数见表3；
表3 10种类固醇激素质谱参数
其中，所述的血清为人或动物的血清。
其中，所述的经过预处理的血清按照如下方法制备得到：取200μL血清于1.5mL离心管中，向其中加入20μL 100ng/mL混合内标液B，再加入600μL MTBE，然后涡旋数秒后振荡15min，14000r/min离心5min后取400μL上清液用氮吹仪吹干，再加入80μL 1.5mol/L羟胺，涡旋5秒后振荡15min，放入恒温箱60℃衍生化反应1h。
其中，所述的混合内标液B按如下方法制备得到：分别准确称取10.0mg氘代同位素内标品，包括d6-脱氢表雄酮、d3-睾酮、d8-17α-羟孕酮、d2-雌酮和d9-孕酮，分别加入10mL甲基叔丁基醚完全溶解，得到浓度均为1.0mg/mL的5种同位素内标溶液，然后用甲醇将这5种同位素内标溶液的浓度均由1.0mg/mL稀释至1.0μg/mL，接着各取1mL浓度为1.0μg/mL的5种同位素内标溶液加水定容至10mL，配制得到浓度均为100ng/mL的混合内标液B。
其中，所述的标准品按照如下步骤制备得到：
分别准确称取脱氢表雄酮10.0mg、睾酮25.0mg、双氢睾酮5.2mg、雄烯二酮1.5mg、雌酮2.5mg、皮质酮2.0mg、孕酮10mg、孕烯醇酮5.1mg、17α-羟孕酮10mg和17-羟孕烯醇酮25mg，分别加入1mL、2.5mL、5.2mL、1.5mL、2.5mL、2mL、1mL、5.1mL、10mL和2.5mL的甲基叔丁基醚，配制成浓度分别为10.0mg/mL的脱氢表雄酮、10.0mg/mL的睾酮、1.0mg/mL的双氢睾酮、1.0mg/mL的雄烯二酮、1.0mg/mL的雌酮、1.0mg/mL的皮质酮、10.0mg/mL的孕酮、1.0mg/mL的孕烯醇酮、1.0mg/mL的17-羟孕酮和10.0mg/mL的17-羟孕烯醇酮的标准品母液；
分别从以上脱氢表雄酮、睾酮、孕酮和17-羟孕烯醇酮标准品母液中移取100μL用甲基叔丁基醚定容至1mL，得到这10种类固醇激素的浓度都是1.0mg/mL，然后用甲醇将这10种类固醇激素的浓度由1.0mg/mL逐级稀释至1.0μg/mL；
分别取200μL浓度为1.0μg/mL的雄烯二酮、17α-羟孕酮、孕烯醇酮、雌酮和双氢 睾酮，800μL浓度为1.0μg/mL的脱氢表雄酮，各1.0mL浓度为1.0μg/mL的睾酮、孕酮和皮质酮，500μL浓度为1.0μg/mL的17-羟孕烯醇酮均加入到15mL离心管中，再加去离子水定容到10mL，配制成混合标准液A；混合标准液A中，雄烯二酮、17α-羟孕酮、孕烯醇酮、雌酮和双氢睾酮的浓度为20ng/mL，脱氢表雄酮的浓度为80ng/mL，孕酮、睾酮和皮质酮的浓度为100ng/mL，17-羟孕烯醇酮的浓度为50ng/mL；
移取100μL混合标准液A于1.5mL离心管中，向其中加入100μL空白血清基质(40mg/mL牛血清蛋白水溶液)作为第一个高值浓度点；移取40μL混合标准液A用血清基质类似物定容至400μL得到标准混合液B；分别取5、25、50、100、200μL标准混合液B定容至200μL，得到其它五个校准浓度点，这六个浓度点体积均为200μL；接着向其中各加入20μL 100ng/mL混合内标液B，再加入600μL甲基叔丁基醚，然后涡旋5秒后振荡15min，14000r/min离心5min后取400μL上清液用氮吹仪吹干，再加入80μL 1.5mol/L羟胺，涡旋5秒后振荡15min，再放入恒温箱60℃衍生化反应1h。
有益效果：采用本发明试剂盒检测血清中的类固醇激素，灵敏度高、特异性强、准确且前处理过程较简单，10min之内可完成多种激素的分离和检测，精密度与加标回收率基本满足要求，可用于临床上血清类固醇激素的定量分析，为临床上男女激素水平的健康评估提供一种可靠的检测方法。
附图说明
图1为10种类固醇激素及其5种内标标准品的总离子流色谱图
图2为血清中10种类固醇激素及其5种内标的总离子流色谱图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：
1.材料
方法学研究实验的样本来自于上海迪安医学检验所2014年9月和10月份大学生体 检的血清样本。
(1)仪器：API 4000+三重四级杆质谱仪(Applied Biosystem公司)；kspert’ultra LC100液相色谱系统(配自动进样器)；医用高速冷冻离心机(北京白洋医疗器械有限公司)；超纯水仪(成都优普超纯科技有限公司)；电热恒温干燥箱(上海森信实验有限公司)；多管涡旋混合仪(杭州奥盛仪器有限公司)；快速混匀器(姜堰市康泰医疗器材厂)；氮吹仪(MD200，杭州奥盛仪器有限公司)；可调移液器(Thermo Scientific 0.5～10μL，10～100μL，100～1000μL)；玻璃仪器、烧杯、量筒等。
(2)试剂耗材：色谱纯甲醇(Tedia High Purity Solvent Company.Inc)；Phenomenex C18反相色谱柱(100mm×2.1mm，2.6μm)和Phenomenex C18预保护柱(美国菲罗门公司)；甲基叔丁基醚(methyl tert-butyl ether,MTBE)(纯度99.9％，Sigma-Aldrich公司)；羟胺(Sigma-Aldrich公司)。
(3)标准品：E1、P4、P5、CORT、17α-OHP4、17-OHP5、AD、DHEA、DHT和T购自于Sigma-Aldrich，稳定同位素内标d2-E1、d9-P4、d6-DHEA、d8-17OHP4和d3-T购自于Toronto Research Chemical Inc.公司，纯度均≥98％。
(4)质控品：含有T、DHEA、DHT、AD、E1、CORT、P4、P5、17-OHP4和17-OHP5的空白血清基质溶液，分高中低三个浓度分别为QC(L)、QC(M)、QC(H)，见表1所示。
2.方法
(1)色谱条件：流动相A：0.1％v/v甲酸水溶液；流动相B：0.1％v/v甲酸的甲醇溶液。色谱柱型号：Phenomenex C18100mm×2.1mm，2.6μm，采用梯度洗脱的方式，详见表2。流速为0.5mL/min，柱温为35℃，进样体积为20μL。
(2)质谱条件：在电喷雾电离(electrospray ionization,ESI)正离子检测模式下，采用多反应监测(multiple reaction monitoring,MRM)的质谱扫描模式。喷雾电压(ionspray,IS)为5500V；碰撞气(collision gas,CAD)为Medium；气帘气(curtain gas,CUR)为40kPa；离子源雾化气(ion source GS1,GS1)和加热辅助气(GS2)均为60kPa；去溶剂温度为550℃。同时监测了目标物P4(m/z 345.093→124.1)、P5(m/z 332.0→86.2)、17-OHP4(m/z 361.0→112.2)、17-OHP5(m/z 348.0→330.3)、AD(m/z 317.0→112.2)、DHEA(m/z 304.2→253.2)、T(m/z 304.1/112.2)、DHT(m/z 306.2→81.1)、CORT(m/z410.0→377.2)和E1(m/z 286.0→253.0)以及同位素内标d2-E1(m/z 288.0→255.1)、d6-DHEA(m/z 310.3→219.2)、d8-17OHP4(m/z 269.2→115.1)和d3-T(m/z 307.0→112.2)。 再分别对各个目标物的去簇电压(declustering potential,DP)、碰撞电压(collision energy,CE)和碰撞池出口电压(collision cell exit potential,CXP)等条件进行了系统优化(见表3)，以便达到更高的稳定性和灵敏度。
(3)标准品配制：
分别准确称取脱氢表雄酮10.0mg、睾酮25.0mg、双氢睾酮5.2mg、雄烯二酮1.5mg、雌酮2.5mg、皮质酮2.0mg、孕酮10mg、孕烯醇酮5.1mg、17α-羟孕酮10mg和17-羟孕烯醇酮25mg，分别加入1mL、2.5mL、5.2mL、1.5mL、2.5mL、2mL、1mL、5.1mL、10mL和2.5mL的甲基叔丁基醚溶液，配制成浓度分别为10.0mg/mL的脱氢表雄酮、10.0mg/mL的睾酮、1.0mg/mL的双氢睾酮、1.0mg/mL的雄烯二酮、1.0mg/mL的雌酮、1.0mg/mL的皮质酮、10.0mg/mL的孕酮、1.0mg/mL的孕烯醇酮、1.0mg/mL的17-羟孕酮和10.0mg/mL的17-羟孕烯醇酮的标准品母液；分别从以上脱氢表雄酮、睾酮、孕酮和17-羟孕烯醇酮标准品母液中移取100μL用甲基叔丁基醚定容至1mL，得到这10种类固醇激素的浓度都是1.0mg/mL，然后用甲醇将这10种类固醇激素的浓度由1.0mg/mL逐级稀释至1.0μg/mL；接着分别取200μL浓度为1.0μg/mL的雄烯二酮、17α-羟孕酮、孕烯醇酮、雌酮和双氢睾酮，800μL浓度为1.0μg/mL的脱氢表雄酮，各1.0mL浓度为1.0μg/mL的睾酮、孕酮和皮质酮，500μL浓度为1.0μg/mL的17-羟孕烯醇酮均加入到15mL离心管中，再加去离子水定容到10mL，配制成混合标准液A，得到雄烯二酮、17α-羟孕酮、孕烯醇酮、雌酮和双氢睾酮的浓度为20ng/mL，脱氢表雄酮的浓度为80ng/mL，孕酮、睾酮和皮质酮的浓度为100ng/mL，17-羟孕烯醇酮的浓度为50ng/mL。
分别准确称取10.0mg氘代同位素内标品，包括脱氢表雄酮-d6、睾酮-d3、17α-羟孕酮-d8、雌酮-d2和孕酮-d9，分别加入10mL甲基叔丁基醚完全溶解，得到浓度均为1.0mg/mL的5种同位素内标溶液。然后用甲醇将这5种同位素内标溶液的浓度均由1.0mg/mL稀释至1.0μg/mL，接着各取1mL浓度为1.0μg/mL的5种同位素内标溶液加水定容至10mL，配制得到浓度均为100ng/mL的混合内标液B。
(4)质控品的配制：取标准品母液20μL、100μL、500μL分别用空白血清基质溶液定容至1000μL得到。
试剂盒上下四周加膜，防震保温，左上方放置洗脱液A和B，左下方分别放置4*1mL安瓿瓶，分别为标准液和质控品；右边分别放置10mL稀释液1、20mL稀释液2 和100mL萃取液。
(5)样品处理
1)标准品处理：移取100μL混合标准液A于1.5mL离心管中，向其中加入100μL血清基质类似物作为第一个高值浓度点；移取40μL混合标准液A用血清基质类似物定容至400μL得到标准混合液B；分别取5、25、50、100、200μL标准混合液B定容至200μL，得到其它五个校准浓度点，这六个浓度点体积均为200μL。接着向其中各加入20μL 100ng/mL混合内标液B，再加入600μL MTBE，然后涡旋数秒后振荡15min，14000r/min离心5min后取400μL上清液用氮吹仪吹干，再加入80μL 1.5mol/L羟胺，涡旋数秒后振荡15min，再放入恒温箱60℃衍生化反应1h，再移入色谱瓶中上样进行LC-MS/MS分析。
2)血清样品前处理：取200μL血清于1.5mL离心管中，向其中加入20μL 100ng/mL混合内标液B，再加入600μL MTBE，然后涡旋数秒后振荡15min，14000r/min离心5min后取400μL上清液用氮吹仪吹干，再加入80μL 1.5mol/L羟胺，涡旋数秒后振荡15min，放入恒温箱60℃衍生化反应1h，最后移入色谱瓶中上样进行LC-MS/MS分析。
(3)质控品前处理：分别取质控品溶液QC(L)，QC(M)，QC(H)各200μL于1.5mL离心管中，然后跟血清样品前处理方法一致，此处不再赘述。
分析试剂盒中各组分见表4。
表4 10种类固醇激素分析试剂盒组分的制备
3、方法的建立与优化
实验为了得到更加稳定且灵敏度高的目标物信号，使用羟胺将类固醇激素中的羰基经过肟化反应，采用MRM模式监测其衍生化产物的离子对(Q1/Q3)，使用“Ramp”选择不同离子对的DP、CE和CXP进行优化，从优化色谱图中即可看到离子最高信号强度所对应的最佳结果，记录优化结果见表2。此外，其它一些参数如IS、CAD、CUR、GS1和GS2等根据仪器提供的参考值范围选择合适的数值，以保证较强的信号强度。
四、方法验证
1.总离子流色谱图：10种类固醇激素的标准品和血清样品的峰型比较对称，在浓度不大于50ng/mL时基本没有杂峰干扰，说明在此条件下能够得到良好的检测，图1为10种类固醇激素及其5种内标的总离子流色谱图，图2为血清中10种类固醇激素的总离子流色谱图，这10种物质虽然没有完全分离开，但对于LC-MS/MS的检测足以满足定量要求，无需完全分离。
2.校准曲线：采用同位素内标定量法，利用Analyst软件以标准物与内标物的浓度比为X轴，标准物与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，并计算出血清中待测物的浓度。10种类固醇激素在各自浓度范围内的线性拟合方程，线性良好，相关系数在0.999以上，满足定量要求，见表5。
表5 10种类固醇激素线性回归方程及线性相关系数
3.精密度试验：取正常人血清样品一天内重复处理8批，以同位素内标法定量测定10种类固醇激素的浓度，批内精密度范围为1.61％～15.42％，结果见表6；三日内分8批处理，计算批间精密度范围为4.27％～17.02％，结果见表7。
表6 批内精密度试验结果(单位ng/mL)
表7 批间精密度试验结果(单位ng/mL)
3.回收率试验：实验随机选取一例病人血清样品，其中1个不加标准品，其它3个分别加入低、中、高3个浓度的标准品，以相同步骤重复处理并测定3次，结果经计算如表8所示。结果显示，10种激素的加标回收率在80％-130.6％之间，3次重复试验的RSD在0.6％-12.7％范围。
表8 10种类固醇激素的加标回收率结果(单位ng/mL)
五、讨论
本研究采用ID-HPLC-MS/MS方法同时测定了人体血清中10种类固醇激素。目前，操作简单和成本低是免疫法的优势，但因其存在交叉反应和基质干扰而导致缺乏特异性，而且灵敏度较低。LC-MS/MS是同时针对目标物的出峰时间和离子对进行检测，灵敏度高，可极大的避免交叉反应的干扰。与此同时，采用同位素内标法定量可以极大的 消除基体的干扰，而且不受预处理过程、上样体积和流动相等条件的影响，能够达到准确定量。
为了提高分析物的离子化效率，利用柱前衍生化法，采用羟胺与类固醇激素中的羰基发生衍生化反应，极大地提高了分析物的灵敏度和稳定性，最低定量限LLOQ(以S/N≥10为标准)可低至几十个pg/mL，基本满足血清中一些痕量激素的检测要求。
考察了这10种激素的检测方法的重现性和回收率，日内精密度为1.61％～15.42％，日间精密度为4.27％～17.02％，除E1的批间精密度较大外，其它9种类固醇激素的精密度均小于15％(可接受标准为CV≤15％)，但也与待测物的浓度有关，若浓度过低(ppb级以下)可放宽至CV≤20％，因此该方法稳定性良好。此外，实验获得加标回收率在80％-130.6％范围，可接受标准为80％-120％，同样也跟浓度有关，若浓度较低可接受范围可放宽至70％-130％，而E1的回收率为130.6％，因此，除E1较大以外，其它激素基本满足要求。与其它几种激素相比，E1的精密度和回收率较大，可能由于其在人血清内的含量较低，相对而言仪器对它的噪音较大，从而检测结果的误差会变大；较大的精密度也可能跟样品的保存、预处理过程和基体中其它物质对它的干扰有关。因而，可以通过定期清洗仪器或者ESI喷雾针来尽量降低背景干扰，或者还可以选择更高性能的质谱仪器来检测含量过低的物质，如E1等。
总之，该方法灵敏度高、特异性强、准确且前处理过程较简单，10min之内可完成多种激素的分离和检测，精密度与加标回收率基本满足要求，可用于临床上血清类固醇激素的定量分析，为临床上男女激素水平的健康评估提供一种可靠的检测方法。
Claims (7)
1.高效液相色谱串联质谱技术检测血清中10种类固醇激素的试剂盒，其特征在于，
所述的10种类固醇激素分别为：脱氢表雄酮、睾酮、双氢睾酮、雄烯二酮、雌酮、皮质酮、孕酮、孕烯醇酮、17α-羟孕酮和17-羟孕烯醇酮；
所述试剂盒包括如下试剂：
(1)洗脱液：
洗脱液A：0.1％v/v甲酸水溶液；
洗脱液B：0.1％v/v甲酸甲醇溶液；
(2)标准品母液：含雄烯二酮、17α-羟孕酮、孕烯醇酮、雌酮、双氢睾酮、脱氢表雄酮、孕酮、睾酮、皮质酮和17-羟孕烯醇酮的甲醇溶液；
(3)混合内标液：含有d6-脱氢表雄酮、d3-睾酮、d8-17α-羟孕酮、d2-雌酮和d9-孕酮的甲基叔丁基醚溶液；
(4)稀释液：
稀释液1：空白血清基质溶液；
稀释液2：甲醇；
(5)萃取液：甲基叔丁基醚；
(6)质控品：含有雄烯二酮、17α-羟孕酮、孕烯醇酮、雌酮、双氢睾酮、脱氢表雄酮、孕酮、睾酮、皮质酮和17-羟孕烯醇酮的空白血清基质溶液，分高中低三个浓度分别为QC(L)、QC(M)、QC(H)；
其中，QC(L)，QC(M)，QC(H)中10种类固醇激素质控品对应浓度见表1；
表1 10种类固醇激素质控品对应浓度(单位ng/mL)
2.根据权利要求1所述的高效液相色谱串联质谱技术检测血清中10种类固醇激素的试剂盒，其特征在于，所述的标准品母液为含浓度为20ng/mL的雄烯二酮、20ng/mL17α-羟孕酮、20ng/mL孕烯醇酮、20ng/mL雌酮、20ng/mL双氢睾酮、80ng/mL的脱氢表雄酮、100ng/mL孕酮、100ng/mL睾酮、100ng/mL皮质酮、50ng/mL17-羟孕烯醇酮的甲醇溶液。
3.根据权利要求1所述的高效液相色谱串联质谱技术检测血清中10种类固醇激素的试剂盒，其特征在于，所述的混合内标液为含有1.0mg/mL d6-脱氢表雄酮、1.0mg/mLd3-睾酮、1.0mg/mL d8-17α-羟孕酮、1.0mg/mL d2-雌酮和1.0mg/mL d9-孕酮的甲基叔丁基醚溶液。
4.根据权利要求1所述的高效液相色谱串联质谱技术检测血清中10种类固醇激素的试剂盒，其特征在于，所述的空白血清基质溶液为40mg/mL牛血清蛋白的水溶液。
5.根据权利要求1所述的高效液相色谱串联质谱技术检测血清中10种类固醇激素的试剂盒，其特征在于，所述的血清为人或动物的血清。
6.权利要求1所述的高效液相色谱串联质谱技术检测血清中10种类固醇激素的试剂盒的制备方法，其特征在于，
(1)洗脱液：
洗脱液A：配制0.1％v/v甲酸水溶液；
洗脱液B：配制0.1％v/v甲酸甲醇溶液；
(2)标准品母液：
分别准确称取脱氢表雄酮10.0mg、睾酮25.0mg、双氢睾酮5.2mg、雄烯二酮1.5mg、雌酮2.5mg、皮质酮2.0mg、孕酮10mg、孕烯醇酮5.1mg、17α-羟孕酮10mg和17-羟孕烯醇酮25mg，分别加入1mL、2.5mL、5.2mL、1.5mL、2.5mL、2mL、1mL、5.1mL、10mL和2.5mL的甲基叔丁基醚，配制成浓度分别为10.0mg/mL的脱氢表雄酮、10.0mg/mL的睾酮、1.0mg/mL的双氢睾酮、1.0mg/mL的雄烯二酮、1.0mg/mL的雌酮、1.0mg/mL的皮质酮、10.0mg/mL的孕酮、1.0mg/mL的孕烯醇酮、1.0mg/mL 的17-羟孕酮和10.0mg/mL的17-羟孕烯醇酮的标准品母液；
分别从以上脱氢表雄酮、睾酮、孕酮和17-羟孕烯醇酮标准品母液中移取100μL用甲基叔丁基醚定容至1mL，得到这10种类固醇激素的浓度都是1.0mg/mL，然后用甲醇将这10种类固醇激素的浓度由1.0mg/mL逐级稀释至1.0μg/mL；
分别取200μL浓度为1.0μg/mL的雄烯二酮、17α-羟孕酮、孕烯醇酮、雌酮和双氢睾酮，800μL浓度为1.0μg/mL的脱氢表雄酮，各1.0mL浓度为1.0μg/mL的睾酮、孕酮和皮质酮，500μL浓度为1.0μg/mL的17-羟孕烯醇酮均加入到15mL离心管中，再加去离子水定容到10mL，配制成混合标准液A；混合标准液A中，雄烯二酮、17α-羟孕酮、孕烯醇酮、雌酮和双氢睾酮的浓度为20ng/mL，脱氢表雄酮的浓度为80ng/mL，孕酮、睾酮和皮质酮的浓度为100ng/mL，17-羟孕烯醇酮的浓度为50ng/mL；
(3)混合内标液：配制含有1.0mg/mL d6-脱氢表雄酮、1.0mg/mL d3-睾酮、1.0mg/mL d8-17α-羟孕酮、1.0mg/mL d2-雌酮和1.0mg/mL d9-孕酮的甲基叔丁基醚溶液；
(4)稀释液：
稀释液1：将4g牛血清蛋白用水定容至100mL制得；
稀释液2：甲醇；
(5)萃取液：甲基叔丁基醚；
(6)质控品：取步骤(2)得到的10种类固醇激素标混合标准液A各20μL、100μL、500μL分别用空白血清基质溶液定容至1000μL得到。
7.权利要求1～5中任意一项所述的试剂盒在利用高效液相色谱串联质谱技术检测血清中10种类固醇激素中的应用。
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| Sun et al. | Quantitative determination and confirmation of five synthetic glucocorticoid residues in milk powder by gel permeation chromatography–liquid chromatography–tandem mass spectrometry |
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| EXSB | Decision made by sipo to initiate substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |