CN112730710A - 通过引入系列不同同位素标签用于快速实时定量样品中目标分析物的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种通过引入系列不同同位素标签用于快速实时定量样品中目标分析物的检测方法,以已知系列浓度的目标分析物分别连接不同的同位素衍生试剂a作为内标物,待测样品中的待测目标分析物连接同位素衍生试剂b,将所述内标物加入待测样品后进行质谱法分析,得到内标物的信号和待测目标分析物的信号,然后通过内标物的信号来计算得到待测目标分析物的浓度。本发明无需配制外标回归标准曲线,待测样品实时随行2个及以上内标参照或者内标标准标准曲线,实现了对基质的实时校正;通过采用系列不同同位素衍生试剂,在衍生试剂上加不同同位素来将不同同位素引入目标分析物中,解决了多个目标分析物测定时各目标分析物均需重标同位素内标的问题。
Description
技术领域
本发明涉及检测分析技术领域,具体涉及一种用于快速实时定量样品中目标分析物的检测方法,尤其涉及一种通过引入系列不同同位素标签用于快速实时定量样品中目标分析物的检测方法。
背景技术
色谱质谱联用技术越来越多的应用于生物样品、环境样品、食品样品、合成样品、药物样品、化工样品、临床化学样品、法医样品、药理样品、农业样品等等。在目前的分析过程中里,通常使用外标标准曲线法,也有使用内标一点法的,外标标准曲线法最主要的缺点是只能在外部做校正,不能在样品内部做校正。内标一点法的主要缺点是只能用一点法做校正,不能用二点或者多点或者用内标标准曲线校正。
虽然以目前的分析方法和操作流程,也可以对待测样品进行比较准确的定量,但是一直存在以下这些问题,这些不足很大程度上限制了色谱质谱联用技术的快速分析、准确定量和更加广泛的应用。
以下列出了目前的分析流程和方法、存在的不足和限制。
1、样品在前处理过程中的提取效率、提取误差和进样误差,需要进行校正,这个目的可以通过随行内标校正化合物来实现,但是需要内标校正化合物和待测物性质尽可能一模一样的化合物,但是又不能对待测物在测定的时候造成干扰。这种随行内标校正化合物的方法,用于校正提取效率、提取误差和进样误差,在生物样品的测定中很常用,因为生物样品中的基质更加复杂,而且待测化合物的含量很低,在样品处理过程中带来的误差或者不同基质带来的误差会对待测化合物的准确测定产生很显著的影响;在生物样品的测定过程中,选择待测化合物的同位素作为随行的内标校正物是最常见的和行业推荐的方法。随行内标校正物的方法,提高了对检测的准确性控制,减少了因为操作带来的差异和结果的不稳定性,但是需要寻找合适的内标物,一般会选择待测化合物的类似物,但是在实践中我们发现,哪怕是类似物,其性质和待测化合物也有区别,目前最适合的是待测化合物的同位素内标,行业基本上默认待测化合物的同位素和待测化合物本身性质基本完全一致,但是同位素内标的合成困难,因为合成成本高所以购买价格很高,在对多个化合物同时测定时,就还需要每个化合物相应的同位素内标,这样成本就更高,而且即使购买了大量的同位素内标,也只能解决样品提取效率、提取误差和进样误差校正的问题,还是解决不了含量测定标物必须外标校正的问题。
2、色谱质谱联用技术因为检测原理决定了,虽然其专属性和灵敏度很高,但是质谱检测器对待测化合物的响应不稳定,有一定的上下波动,待测样品含量测定必须用已知浓度的待测化合物的响应做参照来做校正和计算。用已知浓度的样品做参照物,采用外标一点法、外标二点法、外标标准曲线等等方法来计算待测样品中的待测化合物浓度;需要先测定已知浓度的一个或多个样品中待测化合物的响应,以便形成参照或者浓度响应的回归曲线,再来计算待测样品的浓度,其中绘制回归曲线是最常见的通用的方法,该回归曲线也称为标准曲线或者工作曲线。外标标准曲线法:在检测待测样品之前,需要提前准备系列已知浓度的样品来绘制标准曲线,1) 这个过程非常耗时,要处理和准备这些样品,2) 而且最麻烦的是,哪怕只有一个待测样品需要检测,也需要准备和测定该标准曲线,非常不经济,3)如果每天收到的样品各异,需要测定的化合物不同,那么每个都需要准备各自的标准曲线,所有的时间都浪费在准备标准曲线上,是以检测速度非常慢,所以目前行业内通常都是一天内一台仪器上只检测一个项目,但是实际市场上需求各异,这种情况就造成样品数量少的项目往往得不到开展,或者有攒样品的情况,数量少的样品攒到一起再来进行检测,这样检测的周期就变得很长;4)即便是每天只检测一个项目,因为是外标的方法,设备和环境都在变化中,早上准备的标准曲线,到了下午和晚上也很难能够准确的作为含量测定的参照来测定待测样品样品了。
3、同上,色谱质谱联用技术因为检测原理决定了,虽然其专属性和灵敏度很高,但是质谱检测器对待测化合物的响应不稳定,有一定的上下波动,待测样品含量测定必须用已知浓度的待测化合物的响应做参照来做校正和计算。通常用已知浓度的重标同位素作为内标,用内标一点法来进行参照。内标一点法:内标一点法通常可以使用已知浓度的重标同位素来做为参照,但是待测样品中待测化合物的浓度差别很大,仅使用一个浓度的内标来进行参照和校正待测样品中不同浓度的待测化合物是很困难的,特别是内标浓度和待测化合物浓度相差较大时,很难实现准确校正,需要多个浓度的内标或者内标标准曲线来做校正,但是以目前的方法无法实现。
4、不同的待测样品之间的基质效应不同,基质效应会影响质谱的电离效率,产生离子抑制或者离子增强,进而对检测结果产生影响。为了解决这个问题,用已知浓度的样品做参照物,采用一点法、二点法、标准曲线等等方法来计算待测样品中的待测化合物浓度;需要先测定已知浓度的一个或多个样品中待测化合物的响应,以便形成参照或者浓度响应的回归曲线,再来计算待测样品的浓度,其中绘制回归曲线是最常见的通用的方法,该回归曲线也称为标准曲线或者工作曲线。但这种方法配置的外标或者外标回归标准曲线,只能采用某一特定的基质,以生物样品分析举例,通常会用某个人或者某个动物的血浆或者空白生物样品样品,或者采用6-10个人或者动物的混合血浆,或者采用模拟血浆,但是无论哪种方法,都不可能完全代表未知含量的诸多待测样品样品,因为每个人的血浆里基质都是差别很大的,外标法没办法解决这个问题。
以目前的行业方法,要做到对待测样品的实时和更加快速的而且还要准确的测定是有限制的,必须有全新的方法来解决这个问题,但是同时又不能增加分析成本,需要保证有很强的可执行性。
申请号为201280036810.1的专利文献中记载了一种用于定量样品中目标分析物的组合物、方法和试剂盒,该专利采取的方法是购买或者合成待测化合物的一系列校准物,包括待测化合物的不同类似物、衍生物、代谢产物或者同位素,通过在样品中加入这些校准物,来对待测化合物进行定量。该专利虽然公开多年,但是一直不能执行,主要缺点在于每个待测化合物都需要购买或者合成一系列的校正物,这个是个巨大的挑战:1)该专利计划用待测化合物的不同类似物作为校准物,但是所有这些类似物的购买和合成都很困难且成本巨大,而且通常的应用场景下仅合成一个内标是不够的,需要合成3个甚至多个类似物,这就使得合成工作更加困难,很容易找不到合适的类似物,或者勉强找到一个类似物,有可能和待测化合物的性质还是相差很大;2)通常稳定重标同位素才是不同样品测定内标的首选,因为同位素重标同位素和待测化合物的结构几乎完全相同,其他的类似化合物即使花很多时间和经费进行合成,哪怕只有一个化学基团发生了变化,仍然会造成其性质和待测化合物相差较大,这种差异使校准物对待测化合物难以起到准确校准的目的。所以整个行业内,无论生物样品、环境样品、食品样品、合成样品或其他分析等等,还是全部要求使用稳定重标同位素作为校准物;3)稳定重标同位素的合成,因为需要用C13或者D取代原来结构上的C12或者H,但是因为每个待测化合物的结构都不相同而且合成路线各异,且结构通常比较复杂,需要针对每个特定的化合物,再来合成该化合物相应的稳定重同位素校准物,针对不同的各个待测化合物,不仅重标同位素原料的获得困难(很可能没有商业化的原料)、整个合成路线需要重新设计确定引入重标同位素的时间和位置、另外合成路线较长造成合成的成本更高昂(通常不可能在2-3步内完成合成)、合成路线复杂还要非常注意不能在合成过程中带入轻标同位素杂质(否则后期难以分离,将对含量测定带来最直接的干扰)等等困难,因此仅合成一个同位素内标本身已经是很大的挑战,但是按照该专利要合成至少3个不同的稳定重同位素校准物,因为3个不同的同位素校准物必须要在待测化合物的不同位置进行重标替换,为这对于合成的挑战非常大; 4)检测不同样品中的待测化合物,极少数情况下仅检测1-2个化合物,绝大多数情况下需要同时检测很多的待测化合物,例如,检测类固醇激素,通常需要检测至少20个类固醇激素,每个类固醇激素结构相差较大,校准物是不能互相分享的,只能各自使用各自的校准物,按照该专利的方法,就需要相应的合成至少60个重同位素的类固醇激素或者其他的类似物,这么大的各种重同位素类固醇激素和类似物的合成,成本是非常巨大和昂贵的,仅一个项目就需要至少数百万的投入,这对于分析工作来讲是非常不经济和非理性的。
发明内容
针对现有技术中的不足,本发明的目的是提供一种通过引入系列不同同位素标签用于快速实时定量样品中目标分析物的检测方法,可以实现内标2点校正、内标多点校正或者内标标准曲线。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的:
本发明提供了一种通过引入系列不同同位素标签用于快速实时定量样品中目标分析物的检测方法,包括以下步骤:
以已知系列浓度的目标分析物连接不同的同位素衍生试剂a作为内标物,待测样品中的待测目标分析物连接同位素衍生试剂b,将所述内标物加入待测样品后进行质谱法分析,得到内标物的信号和待测目标分析物的信号,然后通过内标物的信号来计算得到待测目标分析物的浓度;
所述已知系列浓度的目标分析物包括2个以上不同浓度的目标分析物,每一个浓度的目标分析物连接一种同位素衍生试剂a。
本发明通过对不同浓度的目标分析物连接不同的同位素衍生试剂a作为内标物,例如采用两个已知浓度的目标分析物时,第一浓度目标分析物连接一种同位素衍生试剂a1,第二浓度目标分析物连接另一种同位素衍生试剂a2(若为2个以上已知浓度的目标分析物时,以此类推),由此形成的两个内标物作为随行内标与待测样品(其中的待测目标分析物连接另一种同位素衍生试剂b)混合后一同进行质谱分析,以所得第一浓度目标分析物和第二浓度目标分析物的信号绘制标准曲线(浓度为横坐标、峰面积为纵坐标),然后根据待测目标分析物的信号计算的得到其浓度值。
所述检测方法还包括采用常规的校正方法进行校正。
优选地,所述已知系列浓度的目标分析物为已知系列浓度的目标分析物纯品溶液,或为包含有已知系列浓度的目标分析物的混合样品溶液。
优选地,所述已知系列浓度的目标分析物的浓度范围应覆盖待测目标分析物的浓度。
优选地,所述不同同位素衍生试剂a、同位素衍生试剂b各选自轻标同位素衍生试剂、重标同位素衍生试剂、不同荧光标记试剂、不同发光标记试剂、不同化学基团反应试剂中的一种,且同位素衍生试剂a、同位素衍生试剂b采用的具体化合物各不相同。本发明采用不同同位素衍生试剂的目的是为了区分不同浓度的目标分析物和待测目标分析物,因此原则上只要各不相同即可,不需要做特别的限定。
优选地,所述目标分析物包括带有羰基的化合物,带有羧基的化合物,带有胺基的化合物,带有羟基或醇基或酚类的化合物,肽类和蛋白类化合物、维生素类化合物、脂质类化合物如脂肪类化合物、胆固醇和其衍生物,甾体和衍生物、工业聚合物中的任一种或多种类型。
优选地,所述目标分析物包括类固醇激素类化合物、脂肪酸类化合物、有机酸类化合物、氨基酸及氨基酸代谢产物、磷脂酰乙醇胺类化合物、糖类化合物、硫醇、氧化硫醇、肽类和蛋白类化合物、维生素类化合物、脂肪类化合物、胆固醇和其衍生物、甾体和其衍生物中的任一种或多种类型;
所述目标分析物为多种类型时,每类目标分析物相应连接不同同位素衍生试剂a和b。
例如当目标分析物为多个同类型化合物时,由于同位素衍生试剂a和b是可以和一系列目标分析物发生反应的,因此在同时测定多个同类型目标分析物时,只需采用一套同位素衍生试剂a和b,分别引入到不同目标分析物中即可实现一次性同时检测多个同类型目标分析物。
当目标分析物为多个不同类型化合物时,每一类型化合物采用一套同位素衍生试剂a和b,分别引入到不同类型目标分析物中即可实现一次性同时检测多个不同类型的目标分析物。
优选地,所述质谱法采用的质谱选自四级杆质谱仪、高分辨质谱;所述质谱的检测模式选自全扫描模式、子离子检测模式、母离子检测模式、多反应检测模式、中性丢失扫描、数据依赖性扫描模式、非数据依赖性扫描模式中的任一种。
优选地,所述质谱法分析之前还包括采用色谱法进行分离的步骤;所述色谱法选自液相色谱法,气相色谱法,毛细管电泳法,亲和色谱法,超临界流体色谱法,离子淌度法中的任一种。
优选地,所述质谱法分析之前还包括对待测样品进行前处理的步骤;所述前处理的方法选自固相萃取法、固液萃取法、液液萃取法、沉淀蛋白法、直接稀释法、溶剂提取法、免疫亲和富集法、盐析法、浓缩法、掩蔽法中的任一种。
优选地,当所述方法还包括采用色谱法进行分离的步骤时,所述前处理步骤在色谱法进行分离的步骤之前。
优选地,所述待测样品包括生物样品、环境样品、食品样品、合成样品、药物样品、化工样品中的任一种;所述生物样品包括血浆、血清、全血、尿液、组织、脑脊液、汗液、唾液、毛发、皮肤中的任一种。
本发明还提供了一种用于前述的快速实时定量样品中目标分析物检测方法的产品。
本发明还提供了一种用于前述的通过引入系列不同同位素标签用于快速实时定量样品中目标分析物的检测方法的装置,包括样品在线或者离线的引入系列不同重标同位素的装置,样品的前处理装置,样品储藏装置和运送装置。
本发明还提供了一种基于前述的检测方法的用于快速实时定量样品中目标分析物的检测试剂盒,所述试剂盒包括不同同位素衍生试剂a、同位素衍生试剂b、空白基质、系列已知浓度的目标分析物纯品或系列含有已知浓度的目标分析物的混合样品、质控品。
本发明通过设计一系列(通常为2-3个即可,但不限于此)同位素衍生试剂,设计目标分析物(底物)的系列已知浓度,通过已知浓度的目标分析物连接不同同位素衍生试剂,实现有目标的在不同已知浓度的目标分析物上引入了特定的不同同位素标签,形成系列不同的同位素标记的内标;在实验过程中,以系列已知性质和结构极其类似,但结构又均不完全相同的同位素衍生试剂与不同已知浓度的目标分析物连接形成内标作为参照物或者形成标准曲线,对未知待测样品中的目标分析物进行定量,实现了在同一个样品中随行已知浓度的内标参照物或者内标标准曲线的目的,不再需要外标标准曲线,大大提高了分析速度,实现了实时检测的目的;且在同一个样品中随行已知浓度的内标参照物或者内标标准曲线,同时最大程度的校正了仪器响应波动、不同样品基质效应、进样误差等系统误差,大大提高了测定的准确性。
与现有技术相比,本发明具有如下的有益效果:
1、本发明实现了待测样品实时随行2个以及2个以上内标参照或者内标标准标准曲线,1)不再需要每次检测待测样品之前配制外标回归标准曲线,节省了大量的时间,2)解决了每天各种不同项目交叉,都需要配置自己的外标标准曲线的问题,做到了可以实时检测,3) 因为在待测样品中内标随行标准曲线,解决了外标标准曲线不能准确校正相隔时间较长的待测样品的问题;4)因为在待测样品中随行2个以及2个以上内标参照或者标准曲线,实现了对基质的实时校正,不再因为不同样品之间基质的差异而对测定结果带来影响;
2、本发明通过采用系列不同同位素衍生试剂,在衍生试剂上加系列不同同位素来将不同同位素引入目标分析物中,操作简单方便,解决了多个目标分析物测定的时候,各个目标分析物均需要购买或者合成重标同位素内标的问题,大大减少了分析的成本,而且同位素衍生试剂可以和一系列的目标分析物发生反应,可以使很多化合物一次性快速接上同位素,效率非常高,成本很低,解决了多个化合物获得同位素内标困难和成本高的问题。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述,本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显:
图1为本发明实施例1采用的三种重标同位素衍生试剂;其中,*: C13或者N15;D:H2;
图2为本发明实施例1中醛固酮结构式;
图3为本发明实施例1中醛固酮自身重标同位素醛固酮D-8的结构式;
图4为本发明实施例1采用的三种重标同位素衍生试剂的具体合成路线;其中,*:C13或者N15;D: H2;
图5为本发明实施例1中醛固酮与三种重标同位素衍生试剂的衍生化反应路线;
图6为本发明实施例1中醛固酮自身重标同位素与三种重标同位素衍生试剂的衍生化反应路线;
图7 本发明实施例1中轻标衍生试剂与醛固酮的衍生化反应路线;
图8为本发明实施例1中轻标衍生试剂与醛固酮自身的重标同位素化合物的衍生化反应路线;
图9-1为其中的步骤一的操作步骤示意图;
图9-2为其中步骤二的操作和提取校正原理示意图;
图10-1为本发明实施例的内标标准曲线法和传统外标标准曲线法的对比示意图;
图10-2为同样的样品,分别采用本发明实施例内标标准曲线法和传统外标标准曲线法测定结果比较的相关性分析结果;
图11为本发明实施例1中以醛固酮轻标产物A+P为例展示质谱检测的母离子和子离子结构式和质荷比;
图12为引入系列重标同位素内标的简要示意图(待测化合物自身重标同位素仅用于校正提取效率、提取误差等,在简要示意图中未标注);
图13 为待测样品测试过程简要示意图;
图 14为采用引入的系列不同同位素标签,可以实现内标2点或者内标多点或者内标标准曲线,采用内标标准曲线计算待测样品中的待测化合物浓度示意图;
图15 为实施例2所示含有羰基的化合物引入不同同位素标签的反应式示意图;
图16 常见的类固醇激素和糖皮质激素的结构式举例(仅用于举例不仅限于该图中的类固醇激素和糖皮质激素);
图17 为睾酮引入不同同位素标签的反应过程。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明,但不以任何形式限制本发明。应当指出的是,对本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
下面以测定含有羰基基团的化合物中的一种化合物醛固酮作为具体实施例1,对本发明进行进一步阐述,本发明以醛固酮为例并不仅限于该实施例,实施例中提到的重标同位素衍生试剂为适用于含有羰基化合物的衍生试剂,本发明以适用于含有羰基化合物的衍生试剂为例但不仅限于该衍生试剂。
本发明重点在于说明快速方便的引入系列不同重标同位素标签,且依据底物(在实施例1中为醛固酮)的不同浓度,制备成可以用于内标校准的2点或者多点或者标准曲线,实现对待测样品的实时快速内标校正,重点并不在于待测样品的具体处理方法和操作步骤,因此不必局限于本发明列举的操作步骤,在实际使用中,可以灵活使用这个方法,可以在不同的操作步骤中加入系列重标同位素内标,只需要相应的合理调整校正计算方式即可。
所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径而得。
实施例1
本发明重点在于说明快速方便的引入系列不同重标同位素标签,且依据底物(在实施例1中未醛固酮)的不同浓度,制备成可以用于内标校准的2点或者多点或者标准曲线,实现对待侧样品的实时快速内标校正,重点并不在于待测样品的具体处理方法和操作步骤,因此不必局限于本发明列举的操作步骤,在实际使用中,可以灵活使用这个方法,可以在不同的操作步骤中加入系列重标同位素内标,只需要相应的合理调整校正计算方式即可。
本实施例以引入3个不同重标同位素衍生标签为例但不仅限于3个,可以为1,2,3,4,5,6,7,8,9,10个等。本实施例以加入3种不同的重标同位素衍生试剂举例,但不限于仅加入3种不同的重标同位素衍生试剂,可以加入1,2,3,4,5,6,7,8,9,10等或更多的重标同位素衍生剂,以生成1,2,3,4,5,6,7,8,9,10等更多的系列重标同位素衍生产物。
步骤一、使用系列不同重标同位素衍生试剂引入重标同位素,制备重标同位素内标溶液:
1)在3个已知浓度(3个已知浓度要覆盖待测样品中醛固酮的浓度,命名为A1,A2,A3,浓度分别为5、20、100pg/ml)的醛固酮标准品溶液(醛固酮在接下来的图和计算公式中,命名为A,醛固酮结构式见图2)中,先分别加入固定浓度的醛固酮自身的重标同位素溶液(该醛固酮自身的重标同位素化合物是在醛固酮化合物本身结构上进行了重标取代,目的是用于校正样品前处理过程的醛固酮的提取效率,提取误差和进样误差,不同于本发明中的重标同位素内标用于醛固酮的内标准确定量,该醛固酮自身的重标同位素化合物命名为A',本实施例采用的醛固酮化合物自身的重标同位素化合物醛固酮-D8,其结构式见图3)。
2)在步骤1)处理后的A1,A2,A3溶液中分别加入3个不同的重标同位素衍生试剂10微升(重标同位素衍生试剂1、重标同位素衍生试剂2、重标同位素衍生试剂3,3种重标衍生试剂的结构见图1,分别命名为P',P'', P'''),静置10分钟完成衍生化反应,通过系列的重标同位素衍生试剂引入了不同的重标同位素基团标签,生成了3个不同的醛固酮重同位素标签化产物,命名为A1+P',A2+P'', A3+P''',以及3个醛固酮本身的重标同位素的重标同位素标签化产物,命名为A'+P',A'+P'', A'+P'''。将这3个反应后的溶液涡旋混合,制备成系列重标同位素化合物的混合物(以下简称重标同位素内标溶液),备用。图9-1给出了步骤一操作步骤示意图。
本发明合成系列重标同位素衍生试剂很容易实现,这也是本发明实施的关键点,合成需要的原料简单,容易购得,合成方法简单,路线短,采用很简单的方法(仅需2步反应),采用商业化的原料就可以实现系列重标同位素衍生试剂的快速制备合成。图4中展示了1-3重标同位素衍生试剂的合成原料、合成途径和产物,产物分别命名为P',P'', P'''。
图5展示了通过引入3种不同的重标同位素衍生试剂,生成3种不同的重标同位素产物,发生反应的反应式,反应产物结构式,反应产物分别命名为A1+P',A2+P'', A3+P'''(1,2,3表示不同浓度,A1,A2,A3,3个已知浓度要覆盖待测样品中醛固酮的浓度)。
图6展示了通过引入3种不同的重标同位素衍生试剂,生成3种不同的醛固酮自身重标同位素的系列重标同位素产物,发生反应的反应式,反应产物结构式,反应产物分别命名为A'+P',A'+P'', A'+P'''(醛固酮自身重标同位素溶液为固定浓度,本实施例中该浓度为1ng/ml)。
注意:该步骤中制备的重标同位素内标溶液,不需要每次检测都制备,可以冻干或者分装后超低温保存,每次测定时使用即可,大大减少了工作量。
步骤二、真实待测样品的测定,如生物样品、环境样品、食品样品、合成样品、药物样品、化工样品、临床化学样品、法医样品、药理样品、农业样品等等,所述生物样品包括但不仅限于血浆、血清、全血、尿液、组织、脑脊液、汗液、唾液、毛发、皮肤样品。以下以血浆为例,但本发明不仅限于血浆。
1)血浆中醛固酮的提取和纯化:采用常规的固相萃取法进行醛固酮的提取。取血浆200微升,置于2毫升的Eppendorf试管中,加入醛固酮化合物自身的重标同位素化合物A’20微升,200微升甲醇,0.2M的硫酸锌溶液,450微升0.05%的磷酸溶液,混合涡旋2分钟,离心(离心力1000g, 5分钟,4摄氏度)。收集上清液至固相萃取小柱,用含有5%甲酸的20%甲醇溶液洗去基质并弃去,再用50微升甲醇洗脱,收集洗脱液。
2)血浆中醛固酮的轻标衍生化:在步骤1)收集的洗脱液中加入5微升醋酸和10微升衍生化试剂(普通的轻标衍生试剂,命名为P,浓度为1毫克/毫升,反应式见图7),静置10分钟即完成衍生化反应,产物命名为A+P。醛固酮化合物自身的重标同位素化合物A’也在一起同时完成衍生化,反应式见图8,产物命名为A'+P。
3)在步骤2)得到的产物A+P和A'+P中加入步骤一中制备的系列重标同位素内标溶液(A1+P',A2+P'', A3+P''',A'+P',A'+P'', A'+P'''的混合溶液),涡旋混合均匀。
步骤三、氮气吹干并用50微升50%甲醇复溶,取20微升样品进行液相色谱串联质谱分析。
步骤四、计算待测样品中醛固酮的含量:
采用已知浓度的A1+P',A2+P'', A3+P'''的浓度作为横坐标x,A1+P'/A'+P',A2+P''/A'+P'', A3+P'''/A'+P'''峰面积比值作为纵坐标y,通常标准曲线是线性标准曲线(特殊情况下也有非线性标准曲线),回归方程为y=ax+b。
待测样品醛固酮浓度=((待测样品中A+P的峰面积/ A'+P 的峰面积)-b)/a
图9-2给出了步骤二操作步骤和提取校正原理示意图。
上述前处理方法后所得样品进行液相色谱串联质谱分析时(即前述操作方法中的步骤三),液相色谱参数、分析条件如下:
流动相 A: 水
流动相 B: 甲醇
色谱柱: BEH C8, 100mm x 2.1mm, 1.7µm
柱温箱温度: 35°C
进样体积: 20微升
流动相流速: 0.40mL/min
流动相梯度如表1所示。
表1
以A+P的母离子和子离子结构为例,说明A+P,A'+P,A+P',A+P'',A+P''',A'+P',A'+P'',A'+P'''在质谱中母离子和子离子的结构和质荷比,见图11。A+P,A'+P,A1+P',A2+P'',A3+P''',A'+P',A'+P'',A'+P'''在质谱检测中的母离子和子离子信息列表见表2。
质谱检测参数、分析条件如下:
离子化模式 ES+
毛细管电压 (kV) 2.40
锥孔电压 (V) 参见下表2
离子源温度 (°C) 150
脱溶剂温度 (°C) 600
锥孔气流速(L/Hr) 200
脱溶剂气流速 (L/Hr) 1000
MSMS碰撞电压 参见下表2
表2 醛固酮液相色谱质谱分析质谱参数和分析条件
Interscan Scan Delay (secs):0.02
Interscan Channel Delay (secs):0.01
其他需要用到的响应因子:
1) 质谱对A+P,A'+P,A1+P',A2+P'',A3+P''',A'+P',A'+P'',A'+P'''的响应因子计算公式为(相同浓度的化合物,不经提取,采用标准品溶液进行测定,采用峰面积进行计算):
质谱响应因子=等浓度的化合物1的质谱响应(通常用峰面积)/等浓度的化合物2的质谱响应
质谱响应简称MRf(MS Response Factor),峰面积(Area)
即:
MRf (A+P')=Area(A+P') /Area(A+P)
MRf (A+P'')=Area(A+P'') /Area(A+P)
MRf (A+P''')=Area(A+P''') /Area(A+P)
MRf (A'+P)=Area(A'+P) /Area(A+P)
MRf (A'+P')=Area(A'+P') /Area(A+P)
MRf (A'+P'')=Area(A'+P'') /Area(A+P)
MRf (A'+P''')=Area(A'+P''') /Area(A+P)
以A+P的质谱响应为100%, A'+P,A1+P',A2+P'',A3+P''',A'+P',A'+P'',A'+P'''的峰面积分别除以A+P的峰面积,计算A'+P,A1+P',A2+P'',A3+P''',A'+P',A'+P'',A'+P'''的相对质谱响应因子;本实施例中以上化合物的质谱响应因子均为1。
2) 衍生化效率考察:该实施例1衍生化效率为100%,其他实施例如果需要计算衍生化效率,可以检测衍生化反应之后未反应的化合物浓度,公式如下:
a.衍生化效率= 100%-(衍生化反应之后未反应的化合物浓度/衍生化之前化合物的总浓度)
b.或者用标准加入法考察衍生化效率。
3) 提取效率的校正因子Extraction Efficiency Correction Factor(缩写为EECF),峰面积(Area)
各个校正因子的计算(相同浓度相同提取方法提取后,测定峰面积):
EECF(A+P')=Area(A+P') /Area(A+P)
EECF(A+P'')=Area(A+P'') /Area(A+P)
EECF (A+P''')=Area(A+P''') /Area(A+P)
EECF(A'+P)=Area(A'+P) /Area(A+P)
EECF(A'+P')=Area(A'+P') /Area(A+P)
EECF(A'+P'')=Area(A'+P'') /Area(A+P)
本实施例中以上化合物的提取效率校正因子均为1。
本实施例测定了3个血浆样品中的醛固酮的含量,同样的样品采用现有的传统外标标准曲线法同时计算含量,测定结果见表3。图10-1 给出了本发明实施例的内标标准曲线法和传统外标标准曲线法的对比示意图。同样的样品,分别采用本发明实施例内标标准曲线法和传统外标标准曲线法测定结果比较的相关性分析结果见图10-2,结果表明,两种方法的结果一致,相关系数为0.998。
表3 实施例和传统外标法测定结果
以上实施例采用醛固酮标准品做了标准曲线作为举例,也可以采用系列已知醛固酮浓度的样品准备混合内标溶液。取和待测样品一致的基质(例如生物样品基质,血浆、血清、组织等,食品样品基质、猪肉、水果、蔬菜等,及其他基质),和待测样品一致进行前处理,如实施例1操作,制备重标同位素混合内标溶液。
总结:本实施例提供了一种通过引入系列不同重标同位素标签用于快速实时定量样品中目标分析物的检测方法,系列重标同位素标签用作互相区分,基于待测化合物(底物)的系列浓度,制备成含有系列浓度的不同的重标同位素内标,加入待测样品作为内标,可以实现内标2点校正、内标多点校正或者内标标准曲线;
通过该方法,在待测样品中,包含了2个以及2个以上的重标同位素内标校正物,采用色谱质谱法进行待测样品的分析,可以同时获得待测样品中待测化合物轻标同位素的信号、2个以及2个以上已知浓度的不同重标同位素的信号,使用系列已知浓度的重标同位素信号来内标计算待测化合物的浓度;
为了呈现的更加清楚,给出了个关键步骤的简要示意图。
图12为引入系列重标同位素内标的简要示意图(待测化合物自身重标同位素仅用于校正提取效率、提取误差等,在简要示意图中未标注);
图13 为待测样品测试过程简要示意图;
图 14为采用引入的系列重标同位素,可以实现内标2点或者内标多点或者内标标准曲线,采用内标标准曲线计算待测样品中的待测化合物浓度示意图。
由此可见,实施例1虽然仅针对醛固酮含量进行了测定,但本领域技术人员由本发明的测定方法和原理可推知该方法也同样适用于其他待测目标分析物。
实施例2
采用实施例1同样的方法可以用于多个化合物的同时检测,因为衍生化反应是发生在特定的化学基团上,只要带有特定化学基团的化合物,都会发生反应。下面结合系列类固醇激素类和糖皮质激素化合物,对本发明作进一步阐述。
类固醇激素类和糖皮质激素化合物中很多都含有羰基基团,都可以发生和实施例1中一样的反应,含有羰基的类固醇激素和糖皮质激素都可以快速连接上系列同位素标签,可以使用以上方法进行分析。含有羰基的化合物通用反应式见图15,含羰基化合物分别与重标同位素衍生试剂P'、P''、P'''、P进行衍生化反应生成相应的衍生产物。 类固醇激素和糖皮质激素是非常常见的化合物,通常需要同时测定,一般需要同时测定5个至数百个类固醇激素和糖皮质激素不等。
常见的类固醇激素和糖皮质激素的结构式举例见图16(仅用于举例不仅限于该图中的类固醇激素和糖皮质激素)。例如本实施例中以同时对待测样品中的睾酮、11-脱氧皮质酮、11-脱氧皮质醇、皮质酮、双氢睾酮、黄体酮、可的松、皮质醇进行快速实时定量。以睾酮为例,如图17所示,将睾酮采用实施例1的方法与不同的重标衍生化试剂P'、P''、P'''、P进行衍生化反应生成相应的衍生产物,形成B+P,B1+P', B2+P'' ,B3+P'''(其中B为待测样本中的睾酮,B1、B2、B3为不同已知浓度的睾酮)。以此类推,形成前述睾酮、11-脱氧皮质酮、11-脱氧皮质醇、皮质酮、双氢睾酮、黄体酮、可的松、皮质醇分别与不同的重标衍生化试剂P'、P''、P'''、P进行衍生化反应所相应得到的衍生产物。
采用与实施例1相同的方法,即可同时得到睾酮、11-脱氧皮质酮、11-脱氧皮质醇、皮质酮、双氢睾酮、黄体酮、可的松、皮质醇的浓度。实现多个目标分析物的同时定量测定。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改,并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此,本发明不限于上述实施例,本领域技术人员根据本发明的揭示,不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (11)
1.一种通过引入系列不同同位素标签用于快速实时定量样品中目标分析物的检测方法,其特征在于,包括以下步骤:
以已知系列浓度的目标分析物分别连接不同的同位素衍生试剂a作为内标物,待测样品中的待测目标分析物连接同位素衍生试剂b,将所述内标物加入待测样品后进行质谱法分析,得到内标物的信号和待测目标分析物的信号,然后通过内标物的信号来计算得到待测目标分析物的浓度;
所述已知系列浓度的目标分析物包括2个以上不同浓度的目标分析物,每一个浓度的目标分析物连接一种同位素衍生试剂a。
2.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,所述已知系列浓度的目标分析物为已知系列浓度的目标分析物纯品溶液,或为包含有已知系列浓度的目标分析物的混合样品溶液。
3.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,所述不同同位素衍生试剂a、同位素衍生试剂b各选自轻标同位素衍生试剂、重标同位素衍生试剂、不同荧光标记试剂、不同发光标记试剂、不同化学基团反应试剂中的一种,且同位素衍生试剂a、同位素衍生试剂b采用的具体化合物各不相同。
4.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,所述目标分析物包括类固醇激素类化合物、脂肪酸类化合物、有机酸类化合物、氨基酸及氨基酸代谢产物、磷脂酰乙醇胺类化合物、糖类化合物、硫醇、氧化硫醇、肽类和蛋白类化合物、维生素类化合物、脂肪类化合物、胆固醇和其衍生物、甾体和其衍生物中的任一种或多种类型;
所述目标分析物为多种类型时,每类目标分析物相应连接不同同位素衍生试剂a和b。
5.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,所述质谱法采用的质谱选自四级杆质谱仪、高分辨质谱;所述质谱的检测模式选自全扫描模式、子离子检测模式、母离子检测模式、多反应检测模式、中性丢失扫描、数据依赖性扫描模式、非数据依赖性扫描模式中的任一种。
6.根据权利要求1或5所述的检测方法,其特征在于,所述质谱法分析之前还包括采用色谱法进行分离的步骤;所述色谱法选自液相色谱法,气相色谱法,毛细管电泳法,亲和色谱法,超临界流体色谱法,离子淌度法中的任一种。
7.根据权利要求1或5所述的检测方法,其特征在于,所述质谱法分析之前还包括对待测样品进行前处理的步骤;所述前处理的方法选自固相萃取法、固液萃取法、液液萃取法、沉淀蛋白法、直接稀释法、溶剂提取法、免疫亲和富集法、盐析法、浓缩法、掩蔽法中的任一种。
8.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,所述待测样品包括生物样品、环境样品、食品样品、合成样品、药物样品、化工样品中的任一种;所述生物样品包括血浆、血清、全血、尿液、组织、脑脊液、汗液、唾液、毛发、皮肤中的任一种。
9.一种用于权利要求1所述的通过引入系列不同同位素标签用于快速实时定量样品中目标分析物的检测方法的产品。
10.一种用于权利要求1所述的通过引入系列不同同位素标签用于快速实时定量样品中目标分析物的检测方法的装置,其特征在于,包括样品在线或者离线的引入系列不同同位素标签的装置,样品的前处理装置,样品储藏装置和运送装置。
11.一种基于权利要求1所述的检测方法的用于快速实时定量样品中目标分析物的检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括不同同位素衍生试剂a、同位素衍生试剂b、空白基质、系列已知浓度的目标分析物纯品或系列含有已知浓度的目标分析物的混合样品、质控品。
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