CN112611827A - 同时检测血清中3种雌激素的化学衍生-超高效液相色谱-串联质谱法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种同时检测血清中3种雌激素的化学衍生‑超高效液相色谱‑串联质谱法，采用一种新型衍生化试剂3‑甲基‑8‑喹啉磺酰氯对目标雌激素分析物进行化学衍生后，用于超高效液相色谱‑串联质谱检测。本发明所提供的方法采用3‑甲基‑8‑喹啉磺酰氯对雌激素的酚羟基特异性衍生化，通过衍生化反应将质子化的带电荷基团引入目标雌激素分析物中，雌激素衍生物的pKa值增加，增强了离子化效率，提高了雌激素质谱检测的灵敏度；通过优化色谱条件，减少同分异构体共流出，降低基质干扰，提高了本方法定量的特异性、准确性和灵敏度；本方法具有操作简单、反应时间短、灵敏度高且无交叉污染、衍生产物稳定且衍生化试剂廉价易得的优势。
Description
技术领域
本发明涉及医疗分析检测技术领域，更具体地，涉及一种同时检测血清中3种雌激素的化学衍生-超高效液相色谱-串联质谱法。
背景技术
雌激素属于类固醇激素，大部分的雌激素是由雄激素受芳香化酶催化而来，其主要以雌酮(E1)、雌二醇(E2)和雌三醇(E3)等形式存在。雌激素是女性重要的性激素，其在促进和维持女性生殖器官和第二性征方面起着至关重要的作用，同时对人体的新陈代谢、骨骼的生长和成熟、内分泌系统、网状内皮系统、心血管系统以及皮肤等方面也有很的大影响。
在现有技术中，提高LC-MS/MS检测灵敏度的手段主要有柱前衍生化，普遍使用丹磺酰氯作为衍生化试剂。2017年，
Siqueira Ferreira等人发表的题为《Highsensitivity method validated to quantify estradiol in human plasma by LC-MS/MS》的论文中，检测血浆中单一化合物雌二醇的线性范围为2-150pg/mL，但是衍生化过程需要两次液-液萃取且存在特异性不足等缺点；此外，采用对氟磺酸2-氟-1-甲基吡啶鎓(FMP)进行衍生化后，会生成很多干扰的副产物。李迎发表的题为《基于衍生化与LC-MSn联用研究生物样品中难测定药物的定量测定及其在药代动力学中的应用》的论文中将化学衍生与亲水作用色谱技术结合，以避免基质干扰物与目标衍生产物的共流出，但是其检测价格昂贵，实际应用前景欠佳。
综上所述，研究开发一种操作简便、反应时间短、灵敏度高、衍生产物稳定且衍生化试剂廉价易得的定量检测血清中雌激素的方法是本领域技术人员亟需解决的关键技术问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种同时检测血清中3种雌激素的化学衍生-超高效液相色谱-串联质谱法，该方法具有前处理简单，灵敏度高，检测速度快，准确度高，成本低的优点。
本发明采用如下技术方案：
一种同时检测血清中3种雌激素的化学衍生-超高效液相色谱-串联质谱法，
所述3种雌激素为雌酮、雌二醇和雌三醇；
具体包括如下步骤：
S1、将待测血清样品与稳定同位素内标溶液混匀后，通过液-液萃取提取目标激素；
S2、采用3-甲基-8-喹啉磺酰氯进行衍生化反应；
S3、采用超高效液相色谱-串联质谱技术对所述衍生化反应后的待测液进行检测。
详细地，在上述技术方案中，采用3-甲基喹啉-8-磺酰氯标记雌激素后，通过改变衍生产物的pKa值，通过衍生化反应将质子化的带电荷基团引入3种目标雌激素分析物中，雌激素衍生化产物的pKa值至4.83，增强了待测物的离子化效率，提高了雌激素质谱检测的灵敏度。
具体地，在上述技术方案中，步骤S2中，通过加入3-甲基喹啉-8-磺酰氯的丙酮溶液进行衍生化反应。
优选地，在上述技术方案中，步骤S2中，所述3-甲基喹啉-8-磺酰氯的丙酮溶液的浓度为1-10mg/mL。
具体而言，由于血清中存在基质干扰，衍生化试剂3-甲基喹啉-8-磺酰氯的浓度低于1mg/mL会导致目标雌激素反应不完全，其浓度高于10mg/mL会造成衍生试剂不必要的浪费，且残留的试剂会对质谱仪器的离子源造成污染。
详细地，在上述技术方案中，步骤S2中，所述衍生化反应具体为，加入3-甲基喹啉-8-磺酰氯的丙酮溶液，随后通过加入碳酸盐缓冲溶液调节pH为8.5-11，混匀后置于恒温振荡器中，在30-70℃下避光震荡反应5-120min。
具体地，经实验对比后发现，通过加入碳酸盐缓冲溶液调节pH为弱碱性，可有利于衍生化反应的进行。
进一步地，在上述技术方案中，所述超高效液相色谱条件为：
流动相A为0.1％(v/v)甲酸/水溶液；
流动相B为0.1％(v/v)甲酸/甲醇溶液；
流动相梯度洗脱参数为：
其中，流动相A和流动相B的比例均为体积比。
本发明在上述流动相梯度洗脱参数下，可以实现三种雌激素衍生物的最优分离，减少同分异构体共流出，降低基质干扰，提高雌激素定量分析的准确性和灵敏度。
在本发明的超高效液相色谱-串联质谱技术中超高效液相色谱可以使用本领域中常用的色谱柱，为了提高分离效果和分离度，优选使用型号为Shim-pack GIST C18(2μm，100*2.1mm)的色谱柱。
再进一步地，在上述技术方案中，所述质谱条件具体为：
电离源为电喷雾电离ESI源，其中雾化气流量为2.5-3.6L/min，干燥气流量为8-13.5L/min，加热气流量为9-15L/min，接口温度280-350℃，DL温度235-280℃，加热块温度380-450℃；
质谱检测参数为：
具体地，在上述技术方案中，所述质谱检测具体采用岛津8050三重四极杆质谱仪，模式为正离子模式，检测过程采用MRM的质谱扫描模式。
又进一步地，在上述技术方案中，步骤S1中，所述液-液萃取采用乙酸乙酯。
在本发明一个优选方案中，为了提高稳定性，准确度和灵敏度以及分离效率，所述液-液萃取具体包括：
向待测血清样品与稳定同位素内标溶液的混合溶液中加入0.8-1.2mL乙酸乙酯，涡旋后在8000-12000r/min下离心2-4min，取上层清液，N2吹干。
又进一步地，在上述技术方案中，步骤S3中，还包括，在检测前，将所述衍生化反应后的检测液置于3-5℃下冷却25-35s，随后离心取上清液进行检测。
具体地，在本发明的一个优选实施方案中，所述流动相梯度洗脱参数为：
其中，所述流动相的流速优选为0.4ml/min，色谱柱的柱温优选为40℃。
在本发明中，可以使用本领域中常用的方法来得到各激素的具体浓度值。具体为：
结合步骤S3得到的检测结果和各雌激素的标准工作曲线，得到各雌激素在血清中的含量值。
详细地，在上述技术方案中，所述雌激素的标准工作曲线采用同位素内标定量法制得，具体步骤包括，
分别取已知且不同浓度的雌酮、雌二醇和雌三醇的甲醇溶液，与内标溶液和空白血清基质混合，经过S1所述步骤得到不同浓度的标准待测液，使用化学衍生-超高效液相色谱-串联质谱技术对所述不同浓度的标准待测液分别进行检测，以标准待测液中各雌激素与内标物峰面积比为Y轴，标准待测液中各类固醇激素浓度为X轴，得到各类固醇激素的标准工作曲线；所述化学衍生-超高效液相色谱-串联质谱技术中的检测条件为步骤S3中的检测条件。
其中，
上述前处理步骤与在制备检测液的前处理步骤相同；
上述超高效液相色谱-串联质谱技术中所有的参数与测定检测液的相应参数相同；
上述标准待测液是将空白血清基质、混合内标溶液以及不同浓度含有3种激素的标准混合液混合制得。
在本发明中，优选使用0.1％牛血清白蛋白溶液为空白血清基质。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明所提供的同时检测血清中3种雌激素的化学衍生-超高效液相色谱-串联质谱法，通过采用3-甲基喹啉-8-磺酰氯对雌激素的酚羟基特异性衍生化，通过衍生化反应将质子化的带电荷基团引入目标雌激素分析物中，由于衍生产物的pKa值增加，提高了衍生化分析物的离子化效率，从而增强了雌激素质谱检测的灵敏度；
(2)本发明所提供的同时检测血清中3种雌激素的化学衍生-超高效液相色谱-串联质谱法，通过优化色谱条件，减小基质中同分异构体共流出的基质干扰，提高了定量的特异性和准确性，能够为临床提供更加准确可靠的检测方法；
(3)本发明所提供的化学衍生-超高效液相色谱-串联质谱法通过液-液萃取，分离富集待测雌激素组分，使得检测结果稳定性大大提高，与其他激素检测提取方法相比，该方法操作简便，耗时少；
(4)本发明所提供的化学衍生-超高效液相色谱-串联质谱法使用超高液相色谱-质谱串联检测技术，具有操作简单、反应时间短、灵敏度高且无交叉污染、衍生产物稳定且衍生化试剂廉价易得的优势，精密度好，可以真实反应人体内激素的水平，适用于临床医疗的生化检测。
附图说明
图1为本发明实施例1的血清样品中3种雌激素的MRM检测色谱图；
图中：
雌三醇1，雌酮2，雌二醇3。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。
以下实施例，仅用于说明本发明，但不止用来限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。
实施例1
本实施例所提供的化学衍生-超高效液相色谱-串联质谱技术同时检测3种雌激素的方法，包括以下步骤：
1、材料
方法学研究的实验样本来自于武汉康圣达医学检验所有限公司的2018年6月体检的血清样本。
2、仪器与试剂耗材
仪器：岛津8050三重四极杆质谱仪，岛津30A超高效液相色谱仪，超纯水仪(Millipore超纯水机)，电子分析天平(FA1004，上海舜宇恒平科学仪器有限公司)，高速冷冻离心机(GL-20M高速冷冻离心机)，涡旋混匀仪(美国SCILOGEX公司)，GM-12水浴氮吹仪(北京成萌伟业科技有限公司)，移液枪(大龙兴创实验仪器有限公司，北京)，容量瓶，EP管。
试剂耗材：色谱柱为岛津Shim-pack GIST C18(2.1*100mm，2μm)，3-甲基-8-喹啉磺酰氯为罗恩试剂公司产品，乙酸乙酯为Aladdin公司产品，丙酮为Merck公司产品，甲醇为Sigma-Aldrich公司产品，碳酸钠，碳酸氢钠和甲酸购自国药集团药业股份有限公司。
3种雌激素的标准品均购自J&K Scientific Ltd公司。
3、方法
(1)标准储备液配制：
将雌酮、雌二醇和雌三醇3种雌激素的固体标准品分别用甲醇溶解后并稀释至1mg/mL，各取1mL，混合加入10mL的棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度线，配制成100ng/mL的标准混合溶液。
(2)系列浓度混合标准溶液的配制：
将标准混合溶液逐级稀释成20ng/mL、10ng/mL、5ng/ml、2ng/mL、1ng/mL、0.5ng/ml、0.2ng/mL和0.1ng/mL。
(3)内标溶液的配制：
将雌二醇-d4的固体标准品分别用甲醇溶解后并稀释至5ng/mL。
(4)衍生化试剂的配制：
将固体3-甲基-8-喹啉磺酰氯溶解于丙酮，用丙酮配制成浓度为2mg/mL的3-甲基-8-喹啉磺酰氯衍生试剂，装入棕色瓶，置于-20℃冰箱储存。
(5)衍生化反应实验
S1、衍生化反应条件1：采用乙酸乙酯液-液萃取后，氮气吹干，加入2mg/mL 3甲基喹啉-8-磺酰氯衍生化试剂60μL后，加入pH为8.5-11的碳酸盐缓冲溶液40μL，在此pH范围内衍生化反应得以进行；更优选的，取pH为10的缓冲溶液，得到的衍生化产物产率最高。
S2、衍生化反应条件2：3-甲基-8-喹啉磺酰氯衍生化反应可以在水相中进行，优选的，取30～70μL的碳酸盐缓冲溶液，更优选的，取40μL的碳酸盐缓冲溶液。
S3、衍生化反应条件3：衍生化反应温度为30-80℃。在较低的温度下，衍生化效率低或者需要更长的反应时间，但是温度过高，会导致衍生化产物分解，因此，更优选的，衍生化反应取60℃为反应温度。
S4、衍生化反应条件4：选择60℃为反应温度，进行5-120min的反应；反应超过20min，衍生化效率未继续增加，为了减少前处理时间不必要的浪费，更优选的，反应时间为20min。
(2)中八个混合标样取10μL，(3)中所述内标10μL加入90μL空白基质中，用1mL有机溶剂提取，10000rmp离心3min，取上清液，氮气吹干，加入3-甲基-8-喹啉磺酰氯衍生化试剂30-70μL，用碳酸盐缓冲溶液调节pH 8.5-11，涡旋混合后，在温度30-70℃的恒温振荡器中避光反应5min-2h。衍生反应完成后放入冰箱4℃冷却30s，离心取上清液直接进超高效液相色谱-串联质谱分析。
(6)色谱条件：
色谱柱为岛津Shim-pack GIST C18(2.1*100mm，2μm)，流动相A为0.1％(v/v)甲酸/水溶液，流动相B为0.1％(v/v)甲酸/甲醇溶液，流速为0.4ml/min，柱温为40℃；
流动相梯度洗脱参数为：
(8)质谱条件：
采用正离子离子化模式，MRM的质谱扫描模式，电离源为电喷雾电离ESI源，其中雾化气流量为3L/min，干燥气流量为10L/min，加热气流量为10L/min，接口温度300℃，DL温度250℃，加热块温度440℃；监测时间3.5～10min。
具体地，质谱检测参数为：
4、检测结果
检测结果如图1所示，3种雌激素均能用该检测方法进行准确定量分析，分离效果好、灵敏度高。
采用同位素内标定量法，以雌激素标准物衍生化产物(E1-di MQSCl，E2-diMQSCl，E3-di MQSCl)与内标物峰面积比为Y轴，标准物浓度为X轴，建立标准工作曲线。
用于建立工作曲线的三种雌激素混合标准溶液的浓度分别为0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00和2.00ng/mL。
结果图下表所示，三种雌激素的最低定量检测限(LOQ)分别为2.7、4.6和5.1pg/mL。
实施例2人血清样本中三种雌激素的测定
(1)人血清样本的提取
将合并后的人血清作为实验样本，对上述3种雌激素同时进行检测；共设置低、中、高三个添加浓度，分别为0.05ng/mL、0.20ng/mL和1.00ng/mL。分别设置一个空白样本，对每个浓度点进行6次重复实验，分别计算精密度和加标回收率。
(2)人血清样本的衍生化反应
取100μL人血清，加入实施例1所制备的浓度为5ng/mL的内标10μL，用1mL乙酸乙酯提取，10000rmp离心3min取上清液，氮气吹干，加入实施例1所制备的3-甲基喹啉-8-磺酰氯衍生化试剂60μL，加入碳酸盐缓冲溶液40μL调节pH 10，涡旋混合后，在温度40℃的恒温振荡器中避光反应20min；衍生反应完成后，放入4℃的冰箱冷却30s，离心取上清液，进行超高效液相色谱-串联质谱分析。
检测结果
日内及日间精密度和回收率值如下表。
如上表所示，三种激素在0.05-2.00ng/mL的添加浓度范围内的日内精密度范围为0.6-10.3％、日间精密度范围为2.7-13.2％，回收率范围为92.5-114.3％，表明本发明方法可以直接应用于临床血清样本中3种雌激素的定量检测，稳定性好，准确度高。
对比例1
对比例1所采用的超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-LC-MS/MS)技术同时检测3种雌激素的方法，其步骤及具体参数与实施例1的步骤及具体参数相同，区别仅在于，未采用3-甲基-8-喹啉磺酰氯对3种雌激素进行衍生化。
结果如下表所示。
对比上表的结果可以发现，本发明实施例所提供的化学衍生-超高效液相色谱-串联质谱方法对3种雌激素检测的灵敏度(依据最低检测定量限)均有明显提高，具体地，灵敏度提高了12.2-163.9倍；因为3-甲基-8-喹啉磺酰氯衍生提高了目标分析物的pka值，从而提高质谱的离子化效率，提高了检测方法的定量灵敏度。
对比例2
丹磺酰氯是一种广泛应用的常规激素衍生试剂，对比例2所采用的超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-LC-MS/MS)技术同时检测3种雌激素的方法，区别仅在于，采用丹磺酰氯对目标分析物进行衍生化反应(在最优衍生化条件下)，其它步骤与实施例1的步骤相同。
结果如下表所示。
对比上表的结果可以发现，本申请实施例1中的3-甲基-8-喹啉磺酰氯化学衍生-超高效液相色谱-串联质谱法检测3种雌激素的检测灵敏度提高了1.7-5.6倍，更有利于人体血清内低含量雌激素的测定。
最后，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.同时检测血清中3种雌激素的化学衍生-超高效液相色谱-串联质谱法，其特征在于，
所述3种雌激素为雌酮、雌二醇和雌三醇；
具体包括如下步骤：
S1、将待测血清样品与稳定同位素内标溶液混匀后，通过液-液萃取提取目标激素；
S2、采用3-甲基-8-喹啉磺酰氯进行衍生化反应；
S3、采用超高效液相色谱-串联质谱技术对所述衍生化反应后的待测液进行检测。
2.根据权利要求1所述的化学衍生-超高效液相色谱-串联质谱法，其特征在于，
步骤S2中，通过加入3-甲基-8-喹啉磺酰氯的丙酮溶液进行衍生化反应；
优选地，步骤S2中，所述3-甲基-8-喹啉磺酰氯的丙酮溶液的浓度为1-10mg/mL。
3.根据权利要求1或2所述的化学衍生-超高效液相色谱-串联质谱法，其特征在于，
步骤S2中，所述衍生化反应具体为，加入3-甲基-8-喹啉磺酰氯的丙酮溶液，随后通过加入碳酸盐缓冲溶液调节pH为8.5-11，混匀后置于恒温振荡器中，在30-70℃下避光震荡反应5-120min。
4.根据权利要求1-3任一项所述的化学衍生-超高效液相色谱-串联质谱法，其特征在于，
所述超高效液相色谱条件为：
流动相A为0.1％(v/v)甲酸/水溶液；
流动相B为0.1％(v/v)甲酸/甲醇溶液；
流动相梯度洗脱参数为：
5.根据权利要求1-3任一项所述的化学衍生-超高效液相色谱-串联质谱法，其特征在于，
所述质谱条件具体为：
电离源为电喷雾电离ESI源，其中雾化气流量为2.5-3.6L/min，干燥气流量为8-13.5L/min，加热气流量为9-15L/min，接口温度280-350℃，DL温度235-280℃，加热块温度380-450℃；
质谱检测参数为：
6.根据权利要求1-5任一项所述的化学衍生-超高效液相色谱-串联质谱法，其特征在于，
步骤S1中，所述液-液萃取采用乙酸乙酯作为萃取剂；优选地，所述液-液萃取具体包括：向待测血清样品与稳定同位素内标溶液的混合溶液中加入0.8-1.2mL乙酸乙酯，涡旋后在8000-12000r/min下离心2-4min，取上层清液，N2吹干；
和/或，步骤S3中，还包括，在检测前，将所述衍生化反应后的检测液置于3-5℃下冷却25-35s，随后离心取上清液进行检测。
7.根据权利要求1-6任一项所述的化学衍生-超高效液相色谱-串联质谱法，其特征在于，
所述流动相梯度洗脱参数为：
8.根据权利要求1-7任一项所述的化学衍生-超高效液相色谱-串联质谱法，其特征在于，
还包括，结合步骤S3得到的检测结果和各雌激素的标准工作曲线，测定各雌激素在血清中的含量值。
9.根据权利要求8所述的化学衍生-超高效液相色谱-串联质谱法，其特征在于，
所述雌激素的标准工作曲线采用同位素内标定量法制得，具体步骤包括，取已知且不同浓度的雌酮、雌二醇和雌三醇的甲醇溶液，分别与内标溶液和空白血清基质混合，经过S1所述步骤得到不同浓度的标准待测液，使用化学衍生-超高效液相色谱-串联质谱技术对所述不同浓度的标准待测液分别进行检测，以标准待测液中各雌激素与内标物峰面积比为Y轴，标准待测液中各类固醇激素浓度为X轴，得到各类固醇激素的标准工作曲线；所述化学衍生-超高效液相色谱-串联质谱技术中的检测条件为步骤S3中的检测条件。
10.根据权利要求9所述的化学衍生-超高效液相色谱-串联质谱法，其特征在于，所述空白血清基质为0.1％牛血清白蛋白溶液。
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