CN115219611A - 一种超高效液相色谱-串联质谱法测定血清中7种抗真菌药物的试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用超高效液相色谱‑串联质谱法检测血清中7种抗真菌药物的试剂盒以及该试剂盒的应用。所述7种抗真菌药物为伏立康唑(VRC)、泊沙康唑(PCZ)、伊曲康唑(ICZ)、羟基伊曲康唑(HICZ)、氟康唑(FCZ)、卡泊芬净(CPF)和伏立康唑氮氧化物(VNO);所述试剂盒包含:稀释液、流动相、校准品溶液和质控品溶液。使用本发明的试剂盒测定抗真菌药物浓度时操作简单、特异性强、灵敏度高,准确度和精密度符合临床要求,为临床提供了一种准确定量血清中7种抗真菌药物浓度的方法。
Description
技术领域
本发明涉及临床血清定量检测技术领域,具体涉及一种用超高效液相色谱-串联质谱法测定血清中7种抗真菌药物含量的试剂盒,还涉及所述试剂盒在测定血清中7种抗真菌药含量的应用。
背景技术
抗菌药物一般是指具有杀菌或抑菌活性的药物,包括各种抗生素、磺胺类、硝基咪唑类、三唑类药物。抗生素和合成抗菌药物的发明和应用是20世纪医药领域最伟大的成就之一,人类应用抗生素和合成抗菌药物有效地治愈了各类严重的细菌感染性疾病。
但随着几十年抗菌药的广泛应用,临床致病菌对一些抗菌药物的耐药率迅速上升,还引发了许多严重的药物不良反应。在抗生素和抗菌药使用的计量和疗程把握上,应遵循“最小有效剂量、最短必需疗程”的原则,因此每个患者在抗菌药的使用上应该遵循“个体化”治疗。
伏立康唑(Voriconazole,VRC)、泊沙康唑(Posaconazole,PCZ)、伊曲康唑(Itraconazole,ICZ)、氟康唑(Fluconazole,FCZ)都属于三唑类抗真菌药物。卡泊芬净(Caspofungin,CPF)是第一个获准用于治疗侵袭性真菌感染的棘白菌素类药物。《伏立康唑个体化用药指南》中提到,伏立康唑是具有广谱抗真菌活性的第二代三唑类抗真菌药物,是侵袭性曲霉感染和克柔念珠菌感染的一线治疗药物。伏立康唑在2005年进入中国,该药在成人体内药代动力学特征为非线性,随着给药剂量增加,血药浓度显著升高;伏立康唑主要经细胞色素P450 2C19代谢,有较多临床意义显著的药物相互作用,且CYP2C19基因多态性使伏立康唑存在较大的个体内和个体间的差异。其对药物代谢基因非常敏感,同样的剂量对于超快代谢型和慢代谢型患者来说,就会出现一者是药物蓄积,另一者则无法起到抗菌作用。伏立康唑及其代谢产物伏立康唑氮氧化物(Voriconazole N-Oxide,VNO)个体化用药的必要性已成为业界共识。泊沙康唑临床主要用于侵袭性霉菌、念珠菌病的预防和难治性口咽念珠菌的治疗,抗菌活性好。泊沙康唑主要通过肝脏代谢,经肝葡萄苷酸转化为无生物活性的代谢产物。但由于其生物利用率在个体间存在较大的个体差异,有必要对其进行血药浓度监测。伊曲康唑为三唑类高效广谱抗真菌药,可结合真菌细胞色素P450同工酶,抑制麦角甾醇合成。伊曲康唑对皮肤癣菌、念珠菌属、新生隐球菌、糠秕孢子菌属、曲霉菌属、组织胞浆菌属、巴西副球孢子菌、申克孢子丝菌、着色真菌属、枝孢霉属、皮炎芽生菌等感染有效。伊曲康唑在人体内主要经肝脏代谢,通过细胞色素P450酶CYP3A4转换为活性代谢产物羟基伊曲康唑(Hydroxyitraconazole,HICZ)和其他非活性代谢产物,与一些其他CYP3A4的底物药物合用时会导致严重的不良反应,因此,监测体内伊曲康唑和羟基伊曲康唑的浓度尤为必要。氟康唑为新型三唑类抗真菌药,主要用于念珠菌、隐球菌等的感染。其作用机理为高度选择性干扰真菌的细胞色素P-450的活性,从而抑制真菌细胞膜上麦角固醇的生物合成。氟康唑主要经肾排泄,80%以原型随尿排泄,肾功能不良的患者应根据自身情况调整剂量,并监测体内药物浓度,避免蓄积中毒。卡泊芬净是一种广谱抗真菌药,能够显著的杀灭白色念珠菌的活性,是第一个获准用于治疗侵袭性真菌感染的棘白菌素类药物。对于肝功能不全的患者,应当酌情减量。因此,测定患者的卡泊芬净的血药浓度对个体化精准用药有重大临床意义。
目前,抗真菌药物血药浓度的检测方法主要有微生物法、高效液相色谱法及超高效液相色谱-串联质谱法,其中高效液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS法)由于其高灵敏度、高特异性和高选择性的优点,更受临床的青睐。
目前,对于LC-MS/MS法测定抗真菌药物浓度的文献、专利研究较少,其中对多种抗真菌药物及其代谢产物的研究就更少。如2021年的几篇最新研究:文献《UPLC-MS/MS法同时测定人血浆中5种抗真菌药物的血药浓度》中,没有对伏立康唑和伊曲康唑的代谢产物伏立康唑氮氧化物和羟基伊曲康唑进行测定;文献《LC-MS/MS同时测定人血浆种6种抗真菌药物浓度》没有对伏立康唑的代谢产物伏立康唑氮氧化物进行研究;CN 111665301A虽然对7种抗真菌药物都进行了研究,但该方法中的混合标准溶液是存储在有机溶液中,且检测操作人员在检测前需要自行将混合标准溶液与基质溶液混合后配制成不同浓度的校准品和质控品溶液,增加了操作的复杂性和不准确性。本发明对于抗真菌药在基质中的稳定性进行研究,发明了一种可以稳定保存的基质校准品和质控品检测试剂盒,从而提供一种利用超高效液相色谱-串联质谱法同时测定7种抗真菌药的方法,为临床精准、个体化测定血清中抗真菌药浓度提供参考依据。
发明内容
本发明的目的是提供一种稳定、高效检测血清中7种抗真菌药浓度的试剂盒。
本发明的另一个目的是提供上述试剂盒在利用超高效液相色谱-串联质谱法测定血清中7种抗真菌药含量中的应用。
为了实现上述目的,本发明一方面提供一种用超高效液相色谱-串联质谱法检测血清中7种抗真菌药物的试剂盒,所述7种抗真菌药物包括伏立康唑(VRC)、泊沙康唑(PCZ)、伊曲康唑(ICZ)、羟基伊曲康唑(HICZ)、氟康唑(FCZ)、卡泊芬净(CPF)和伏立康唑氮氧化物(VNO);
其中,所述试剂盒包括:稀释液、流动相、校准品溶液和质控品溶液,其中:
(1)所述稀释液为甲醇-水混合溶液;
(2)所述流动相包括流动相A和流动相B,其中,流动相A为含有水、甲酸或乙酸、甲酸铵或乙酸铵的混合液;所述流动相B为含有甲酸或乙酸的甲醇或乙腈溶液;
(3)所述校准品溶液是具有6个浓度点C1-C6的含有伏立康唑(VRC)、泊沙康唑(PCZ)、氟康唑(FCZ)、伊曲康唑(ICZ)、羟基伊曲康唑(HICZ)、伏立康唑氮氧化物(VNO)和卡泊芬净(CPF)的血清基质溶液;
(4)所述质控品溶液是包含伏立康唑(VRC)、泊沙康唑(PCZ)、氟康唑(FCZ)、伊曲康唑(ICZ)、羟基伊曲康唑(HICZ)、伏立康唑氮氧化物(VNO)和卡泊芬净(CPF)的血清溶液。
在本发明实施方式中,所述流动相A为含5mM乙酸铵的0.01%~1%甲酸水溶液,所述流动相B为0.01%~1%甲酸乙腈溶液。
在本发明实施方式中,所述流动相A为含5mM乙酸铵的0.1%甲酸水溶液,所述流动相B为0.1%甲酸乙腈溶液。
在本发明实施方式中,所述校准品溶液的6个浓度点C1-C6分别为
C1:VRC/ICZ/HICZ/VNO 0.1μg/mL,PCZ 0.05μg/mL,FCZ 0.5μg/mL,CPF 0.2μg/mL;
C2:VRC/ICZ/HICZ/VNO 0.5μg/mL,PCZ 0.25μg/mL,FCZ 2.5μg/mL,CPF 1.0μg/mL;
C3:VRC/ICZ/HICZ/VNO 2.0μg/mL,PCZ 1.0μg/mL,FCZ 10.0μg/mL,CPF 4.0μg/mL;
C4:VRC/ICZ/HICZ/VNO 5.0μg/mL,PCZ 2.5μg/mL,FCZ 25.0μg/mL,CPF 10.0μg/mL;
C5:VRC/ICZ/HICZ/VNO 7.0μg/mL,PCZ 3.5μg/mL,FCZ 35.0μg/mL,CPF 14.0μg/mL;和
C6:VRC/ICZ/HICZ/VNO 10.0μg/mL,PCZ 5.0μg/mL,FCZ 50.0μg/mL,CPF 20.0μg/mL。
在本发明实施方式中,所述质控品溶液具有3个浓度点LQC、MQC和HQC,分别为:
LQC:VRC/ICZ/HICZ/VNO 0.4μg/mL,PCZ 0.2μg/mL,FCZ 2.0μg/mL,CPF 0.8μg/mL;
MQC:VRC/ICZ/HICZ/VNO 4.0μg/mL,PCZ 2.0μg/mL,FCZ 20.0μg/mL,CPF 8.0μg/mL;
HQC:VRC/ICZ/HICZ/VNO 8.0μg/mL,PCZ 4.0μg/mL,FCZ 40.0μg/mL,CPF 16.0μg/mL。
在本发明实施方式中,所述血清为人血清、牛血清或牛血清白蛋白配制的替代基质。
在本发明实施方式中,所述血清为无干扰的牛血清白蛋白配制的替代基质。
在本发明实施方式中,所述牛血清白蛋白配制的替代基质中添加了抑菌剂和混合稳定剂,所述抑菌剂选自叠氮钠、Proclin 300或Proclin 950,优选Proclin 950,所述混合稳定剂选自BHT、海藻糖、VC、EDTA和柠檬酸,优选VC、EDTA和柠檬酸的混合稳定剂。
在本发明实施方式中,所述抑菌剂为0.02%-0.2%浓度的Proclin950,优选为0.05%-0.1%浓度;所述混合稳定剂为0.5%-5%VC、5-40mM EDTA、1%-5%柠檬酸的混合物,优选为1%-2% VC、15-25mM EDTA、2%-5%柠檬酸的混合物。
另一方面,本发明提供所述试剂盒在利用超高效液相色谱-串联质谱法测定血清中7种抗真菌药物含量中的应用。
本发明中,使用所述试剂盒的方法处理简便、易操作、特异性强,且峰形不拖尾,无残留,在6.0分钟内可以完成所有化合物的检测,为临床提供了一种同时测定7种抗真菌药物的简便可靠的方法。
附图说明
图1是本发明卡泊芬净在不同流动相条件下的峰形的色谱峰。
图2是本发明7种抗真菌药物标准品的提取离子流图。
图3是本发明7种抗真菌药物血清样品加标的提取离子流图。
图4是本发明卡泊芬净在有机溶剂中加速稳定性结果。
图5是本发明低浓度校准品在混合稳定剂下加速回收结果。
图6是本发明高浓度校准品在混合稳定剂下加速回收结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例,进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义,文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外,任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实验方法与材料仅作示范之用。
在本发明的一个实施方式中,提供了一种用超高效液相色谱-串联质谱法检测血清中7种抗真菌药物的试剂盒,所述7种抗真菌药物分别为伏立康唑(VRC)、泊沙康唑(PCZ)、伊曲康唑(ICZ)、羟基伊曲康唑(HICZ)、氟康唑(FCZ)、卡泊芬净(CPF)和伏立康唑氮氧化物(VNO)。所述试剂盒包括以下试剂:
(1)洗脱液
流动相A:含5mM乙酸铵的0.01%~1%甲酸水溶液,流动相B:0.01%~1%甲酸乙腈溶液;
(2)校准品溶液
在校准品溶液中,含有6个浓度点C1-C6,含有伏立康唑(VRC)、泊沙康唑(PCZ)、氟康唑(FCZ)、伊曲康唑(ICZ)、羟基伊曲康唑(HICZ)、伏立康唑氮氧化物(VNO)和卡泊芬净(CPF)7个化合物的牛血清白蛋白替代基质溶液,浓度如下:
C1:VRC/ICZ/HICZ/VNO 0.1μg/mL,PCZ 0.05μg/mL,FCZ 0.5μg/mL,CPF 0.2μg/mL;
C2:VRC/ICZ/HICZ/VNO 0.5μg/mL,PCZ 0.25μg/mL,FCZ 2.5μg/mL,CPF 1.0μg/mL;
C3:VRC/ICZ/HICZ/VNO 2.0μg/mL,PCZ 1.0μg/mL,FCZ 10.0μg/mL,CPF 4.0μg/mL;
C4:VRC/ICZ/HICZ/VNO 5.0μg/mL,PCZ 2.5μg/mL,FCZ 25.0μg/mL,CPF 10.0μg/mL;
C5:VRC/ICZ/HICZ/VNO 7.0μg/mL,PCZ 3.5μg/mL,FCZ 35.0μg/mL,CPF 14.0μg/mL;
C6:VRC/ICZ/HICZ/VNO 10.0μg/mL,PCZ 5.0μg/mL,FCZ 50.0μg/mL,CPF 20.0μg/mL。
(3)质控液
在质控品溶液中,含有伏立康唑(VRC)、泊沙康唑(PCZ)、氟康唑(FCZ)、伊曲康唑(ICZ)、羟基伊曲康唑(HICZ)、伏立康唑氮氧化物(VNO)和卡泊芬净(CPF)的牛血清白蛋白基质溶液,分别为低、中、高三个浓度,浓度如下:
LQC:VRC/ICZ/HICZ/VNO 0.4μg/mL,PCZ 0.2μg/mL,FCZ 2.0μg/mL,CPF 0.8μg/mL;
MQC:VRC/ICZ/HICZ/VNO 4.0μg/mL,PCZ 2.0μg/mL,FCZ 20.0μg/mL,CPF 8.0μg/mL;
HQC:VRC/ICZ/HICZ/VNO 8.0μg/mL,PCZ 4.0μg/mL,FCZ 40.0μg/mL,CPF 16.0μg/mL。
在本发明的一个实施方式中,萃取液为乙腈,含同位素内标。由于已有技术对同位素内标进行研究,所以本发明不再对内标的选择进行特殊的说明。在本发明中,选择使用较为稳定的同位素产品做为内标。内标的浓度为:伏立康唑D3 0.4μg/mL,泊沙康唑D4 0.2μg/mL,伊曲康唑D5 0.5μg/mL,羟基伊曲康唑D8 1.0μg/mL,氟康唑D4 5.0μg/mL和卡泊芬净D45.0μg/mL。
在本发明的一个实施方式中,所述配制校准品及质控品的血清基质为0.1%~10%的牛血清白蛋白基质。牛血清白蛋白中添加的防腐抑菌剂为叠氮钠、Proclin 300、Proclin 950等。牛血清白蛋白用磷酸缓冲液配制。牛血清白蛋白添加的稳定剂为VC、EDTA、柠檬酸等。优选的一种牛血清白蛋白替代基质为,牛血清白蛋白含量为0.1%~8%;缓冲液为1*PBS;抑菌剂Proclin950浓度为0.02%~0.2%;稳定剂为0.5%~5%VC、5mM~40mMEDTA、1%~5%柠檬酸的混合稳定剂。更为优选的一种替代基质为牛血清白蛋白含量为1%~5%;缓冲液为1*PBS;抑菌剂为0.05%~0.1%的Proclin950;稳定剂为1%~2% VC、15mM~25mM EDTA、2%~5%柠檬酸的混合稳定剂。此替代基质相较于人血清或动物血清有较低的病毒和微生物感染风险,且由于稳定剂和抑菌剂的添加,更易于伊曲康唑、羟基伊曲康唑、伏立康唑氮氧化合物、卡泊芬净的稳定保存。
优选的,所述萃取液为含伏立康唑D3 0.4μg/mL,泊沙康唑D4 0.2μg/mL,伊曲康唑D5 0.5μg/mL,羟基伊曲康唑D8 1.0μg/mL,氟康唑D4 5.0μg/mL,卡泊芬净D4 5.0μg/mL的6种同位素内标的乙腈、甲醇、乙腈-水、甲醇-水溶液。在一种更优选的方案中,所述萃取液为乙腈。
优选的,本发明各化合物混合标准溶液的配制方法如下:
(1)分别将浓度为VRC/PCZ/ICZ/HICZ/VNO/CPF 1mg/mL、FCZ 5mg/mL的储备液用50%-100%甲醇-水溶液配制成含VRC 100μg/mL、PCZ 50μg/mL、FCZ 500μg/mL、ICZ 100μg/mL、HICZ 100μg/mL、VNO 100μg/mL、CPF 200μg/mL的混合标准溶液。优选的,配制混合标准溶液的溶剂为80%甲醇-水溶液;分别移取一定体积混合标准溶液,加入不同体积牛血清白蛋白替代基质,配制成C1-C6、LQC、MQC、HQC。
血清样本通过蛋白沉淀后,振荡、离心取上清,稀释后进样,采用超高效液相色谱-串联质谱法检测经过处理的血清中的抗真菌药物。其原理是利用超高效液相色谱将待测物与血清基质中的杂质分离,串联质谱检测器利用内标法定量,标准品与内标的浓度比例为X轴,标准品与内标的峰面积比率为Y轴,建立校准曲线,计算样品中抗真菌药浓度的含量。其中,涉及到的色谱条件为:
流动相A:水溶液或含有甲酸、乙酸、甲酸铵、乙酸铵的水溶液;优选的,选择含有5mM乙酸铵-0.1%甲酸的水溶液为流动相A;流动相B:乙腈、甲醇或含有甲酸、乙酸的乙腈、甲醇溶液;优选的选择含有0.1%的甲酸乙腈溶液为流动相B。添加乙酸铵是为了增加响应较低的伊曲康唑和羟基伊曲康唑的灵敏度;选择添加甲酸,是为了改善卡泊芬净的色谱峰形,在A相和B相中同时添加同浓度的甲酸,是为了保证在A相和B相任意比例混合时,始终保证体系在相同的酸碱度下进行分离,色谱分析更稳定。
在图1中,A部分为流动相中未加酸的卡泊芬净的色谱峰,B部分为流动相中添加甲酸后的卡泊芬净的色谱峰。其中,色谱柱型号为:CNWShell C18,2.1*100mm,2.6μm;液相条件采用双元混合梯度洗脱,流动相A和流动相B的初始比例为95:5,具体洗脱参数见表1。
表1.流动相梯度洗脱参数
优选的,流速为0.2-0.6mL/min,柱温为30-40℃,进样体积为5μL。在更优选的方案中,流速为0.4mL/min,柱温为40℃。
优选的,所述质谱条件为:在电喷雾(ESI)正模式下,采用多反应监测(MRM)模式进行扫描,离子化电压为5000V,源温度为250,干燥气100,辅助加热气温度200℃,质谱接口温度200℃。在流动相中增加缓冲盐是为了增加化合物的离子化效率和改善峰形,提高灵敏度。
根据下述实施例,可以更好地理解本发明。然而,本领域的技术人员容易理解,实施例所描述的内容仅用于说明本发明,而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1
1.实验仪器与材料
(1)本发明用到的血液样本来自于上海市血库。
(2)仪器:LX50-QSight220高效液相色谱-串联质谱仪(PerkinElmer);Milli-Qplus超纯水仪(美国Milipore公司);FC5816R高速冷冻离心机(奥豪斯);电子天平XPE105(瑞士METTLER公司);MB100-4A微孔板恒温振荡器(杭州奥盛仪器有限公司);ASP1000微孔板热封仪(杭州瑞诚仪器有限公司);96孔板(2.0mL、0.36mL);热封铝膜(Waters);12通道可调移液器(BRAND公司)。
(3)试剂:MS级甲醇(CNW)、MS级乙腈(CNW)、MS级乙酸铵(CNW)、MS级甲酸(CNW)、牛血清白蛋白(Sigma)、PBS缓冲盐(Solarbio)、Proclin950(Sigma)、VC(CNW)、EDTA(CNW)、柠檬酸(CNW)。
(4)色谱柱:CNW Shell C18,2.1*100mm,2.6μm
(5)标准品见表2
表2.标准品信息
编号 | 中文名称 | CAS NO. | 品牌 |
1 | 伏立康唑 | 137234-62-9 | 中国食品药品检定研究所 |
2 | 伏立康唑D3 | 1217661-14-7 | 上海安谱璀世 |
3 | 泊沙康唑 | 171228-49-2 | Fluka |
4 | 泊沙康唑D4 | 1133712-26-1 | 上海安谱璀世 |
5 | 伊曲康唑 | 84625-61-6 | 中国食品药品检定研究所 |
6 | 伊曲康唑D5 | 1217510-38-7 | 上海安谱璀世 |
7 | 羟基伊曲康唑 | 112559-91-8 | 上海安谱璀世 |
8 | 羟基伊曲康唑D8 | 1217516-26-1 | 上海安谱璀世 |
9 | 氟康唑 | 86386-73-4 | 中国食品药品检定研究所 |
10 | 氟康唑D4 | 1124197-58-5 | 上海安谱璀世 |
11 | 伏立康唑氮氧化物 | 618109-05-0 | TRC |
12 | 醋酸卡泊芬净 | 179463-17-3 | TRC |
13 | 醋酸卡泊芬净D4 | 1131958-73-0 | 上海安谱璀世 |
2.仪器条件
(1)液相条件
流动相A:5mM醋酸铵-0.1%甲酸水溶液;流动相B:0.1%甲酸乙腈;
色谱柱型号:CNWShell C18,2.1*100mm,2.6μm;液相条件采用双元混合梯度洗脱,流动相A和流动相B的初始比例为95:5,具体洗脱参数见表1。流速为0.4mL/min,柱温为40℃,进样体积为5μL。
(2)质谱条件
源参数见表3:
表3 质谱参数
离子源 | ESI |
扫描方式 | 正模式 |
监测方式 | MRM |
干燥气 | 100 |
质谱接口温度 | 200℃ |
雾化气 | 200 |
ESI喷雾电压 | 5000V |
辅助加热气温度 | 250℃ |
MRM参数见表4:
表4.MRM参数
3.校准品和质控品的配制
精密称量伏立康唑(VRC)、泊沙康唑(PCZ)、伊曲康唑(ICZ)、羟基伊曲康唑(HICZ)、氟康唑(FCZ)、伏立康唑氮氧化物(VNO)和卡泊芬净(CPF),用甲醇溶解并配制成为浓度分别为VRC/PCZ/ICZ/HICZ/VNO/CPF 1mg/mL、FCZ 5mg/mL的储备液。用80%甲醇溶液将储备液稀释为含VRC 100μg/mL、PCZ 50μg/mL、FCZ 500μg/mL、ICZ 100μg/mL、HICZ 100μg/mL、VNO100μg/mL和CPF 200μg/mL的混合标准溶液。
将上述混合标准溶液用替代基质稀释成C1-C6,LQC、MQC和HQC,配制成标准曲线工作液和质控品。
表5.标准曲线工作液浓度
μg/mL | C1 | C2 | C3 | C4 | C5 | C6 | LQC | MQC | HQC |
伏立康唑氮氧化物 | 0.1 | 0.5 | 2 | 5 | 7 | 10 | 0.4 | 4 | 8 |
伏立康唑 | 0.1 | 0.5 | 2 | 5 | 7 | 10 | 0.4 | 4 | 8 |
泊沙康唑 | 0.05 | 0.25 | 1 | 2.5 | 3.5 | 5 | 0.2 | 2 | 4 |
伊曲康唑 | 0.1 | 0.5 | 2 | 5 | 7 | 10 | 0.4 | 4 | 8 |
羟基伊曲康唑 | 0.1 | 0.5 | 2 | 5 | 7 | 10 | 0.4 | 4 | 8 |
氟康唑 | 0.5 | 2.5 | 10 | 25 | 35 | 50 | 2 | 20 | 40 |
卡泊芬净 | 0.2 | 1 | 4 | 10 | 14 | 20 | 0.8 | 8 | 16 |
所述试剂盒的组成如下表6所示:
表6 试剂盒组成
4.方法的建立
为了建立一种能够同时测定7种抗真菌药物浓度的检测方法,需要对各化合物进行参数优化。首先选择合适的离子化模式,对待测化合物进行全扫(Q1 Scan),确定合适的Q1。再优化离子监测参数和合适的离子对Q1<Q3。最后对所有化合物进行源参数的优化,如反吹气、离子源温度、电压等参数。最后建立7种化合物及6种同位素内标的多重反应监测条件。
通过对高效液相流动相缓冲盐种类及梯度的优化,建立高效液相色谱的梯度洗脱程序。
监测结果如图2和图3所示。从结果可以看出:各化合物峰形良好,离子对之间相互没有干扰,响应良好,各化合物分离度完整。各化合物出峰时间如表7所示:
表7.各化合物出峰时间
5.样品处理
(1)分别取校准品、质控品、样品各50μL于1.0mL 96孔板中,加入200μL含内标的萃取液,将96孔板用热封铝箔密封,置于微孔板振荡器中振荡5min。4000r/min离心5min,用排枪移取50μL上清液于0.36mL 96孔板中,加入200μL乙腈-水(1:1)溶液,用封板膜密封,振荡1min,上机检测。
(2)建立校准曲线:以目标物与内标的浓度比为横坐标,目标物与内标的峰面积比为纵坐标,采用同位素内标法定量,建立校准曲线,并计算出血清样本中待测物的浓度。
6.方法性能验证
(1)基质效应考察
将目标物添加在纯溶剂中,制备成纯溶液样本;再用空白人血清配制相同浓度的生物基质样本;将溶剂样本和生物基质样本按照1:1混合得到混合基质样本,将上述3种样本分别处理后进样分析。如果1:1混合基质样本的响应值与生物基质样本和纯溶液样本响应值的均值相比,差异低于一定比例,则证明基质效应是否存在并不影响目标分析物的准确定量。混合基质效应结果见表8。
表8 混合基质效应
由上述结果可知,目标物在纯溶剂中与生物基质样本中差异<20%,说明基质效应是否存在并不影响目标分析物的准确定量。
(2)正确度考察
通过向已知浓度人血清样本中加标,测定加标回收率,来评估方法的正确度性能。加标浓度分别为低、中、高3各浓度的标准溶液,制备出三个浓度的加标样本各5份,每个浓度样本测定3次。理论值为样本中内源物质浓度与加入标准品浓度之和,测定值与理论值的比可用于评价准确性,检测值应该在靶值的±15%以内。加标结果见表9.
表9.正确度验证
(3)精密度考察
选择低、中、高3个不同浓度的样本进行精密度考察,每个浓度至少测定5次,测得批内精密度;上述样本重复测量3天,考察三批的批间精密度,要求精密度<15%。结果见表10。
表10.批内精密度
从上述结果可知,以同位素内标法定量测定7种抗真菌药物的浓度,批内精密度2.05%-8.66%,批间精密度3.10%-6.32%。精密度良好,符合产品要求。
(4)线性考察
向空白人血清中加入一定浓度标准品制成低浓度曲线点S1和高浓度曲线点S7,S1和S7按不同比例混合配制成S2-S6。每个浓度点重复测定3次,分别得出每个浓度测定结果的均值,采用多项式回归方程,r2>0.9900。线性结果见表11.
表11.抗真菌药线性回归方程及相关系数
从上述结果来看,本发明的抗真菌药在各自范围内的线性良好,相关系数符合要求。
(5)稳定性考察
通过研究,发现低浓度的泊沙康唑、伊曲康唑、羟基伊曲康、卡泊芬净和伏立康唑氮氧化物在基质中不能长期稳定。目前,市场中还没有产品能使7种抗真菌药物在基质中能够稳定保存。为了考察校准品和质控品的稳定性,本研究对添加不同稳定剂的产品进行加速稳定性的研究,并发明出一种能够使7种抗真菌药物在基质中稳定保存的稳定剂。
有机溶液中的稳定性考察,通过对7种抗真菌药物保存在不同浓度甲醇、乙腈中的加速稳定性进行研究,发现卡泊芬净在有机溶剂中无法稳定保存。图4显示了卡泊芬净在有机溶剂中加速稳定性结果。
替代基质中添加稳定剂的稳定性考察,通过向替代基质中添加稳定剂VC,可以使泊沙康唑、伊曲康唑和羟基伊曲康唑稳定保存;通过向替代基质中添加EDTA,可以使伏立康唑氮氧化物稳定保存;通过添加VC、EDTA、柠檬酸三种混合稳定剂,可以使7种化合物都能够稳定保存。添加混合稳定剂后低浓度和高浓度产品的加速稳定性结果如图5和6所示。
综合上述测试结果:本发明所述的高效液相色谱-串联质谱法测定7种抗真菌药的试剂盒,各项性能符合相关标准,特异性强、灵敏度高、前处理简单,结果稳定、准确,可长期保存,能够为临床提供一种可靠的技术手段。
虽然本发明已以较佳实施例揭示如上,然其并非用以限定本发明,任何本领域技术人员,在不脱离本发明的精神和范围内,当可作些许的修改和完善,因此本发明的保护范围当以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种超高效液相色谱-串联质谱法检测血清中7种抗真菌药物的试剂盒,所述7种抗真菌药物包括伏立康唑(VRC)、泊沙康唑(PCZ)、伊曲康唑(ICZ)、羟基伊曲康唑(HICZ)、氟康唑(FCZ)、卡泊芬净(CPF)和伏立康唑氮氧化物(VNO);
其特征在于,所述试剂盒包括:稀释液、流动相、校准品溶液和质控品溶液,其中:
(1)所述稀释液为甲醇-水混合溶液;
(2)所述流动相包括流动相A和流动相B,其中,流动相A为含有水、甲酸或乙酸、甲酸铵或乙酸铵的混合液;所述流动相B为含有甲酸或乙酸的甲醇或乙腈溶液;
(3)所述校准品溶液是具有6个浓度点C1-C6的含有伏立康唑(VRC)、泊沙康唑(PCZ)、氟康唑(FCZ)、伊曲康唑(ICZ)、羟基伊曲康唑(HICZ)、伏立康唑氮氧化物(VNO)和卡泊芬净(CPF)的血清基质溶液;
(4)所述质控品溶液是具有3个浓度点的含有伏立康唑(VRC)、泊沙康唑(PCZ)、氟康唑(FCZ)、伊曲康唑(ICZ)、羟基伊曲康唑(HICZ)、伏立康唑氮氧化物(VNO)和卡泊芬净(CPF)的血清溶液。
2.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述流动相A为含5mM乙酸铵的0.01%~1%甲酸水溶液,所述流动相B为0.01%~1%甲酸乙腈溶液。
3.如权利要求2所述的试剂盒,其特征在于,所述流动相A为含5mM乙酸铵的0.1%甲酸水溶液,所述流动相B为0.1%甲酸乙腈溶液。
4.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述校准品溶液的6个浓度点C1-C6分别为
C1:VRC/ICZ/HICZ/VNO 0.1μg/mL,PCZ 0.05μg/mL,FCZ 0.5μg/mL,CPF0.2μg/mL;
C2:VRC/ICZ/HICZ/VNO 0.5μg/mL,PCZ 0.25μg/mL,FCZ 2.5μg/mL,CPF1.0μg/mL;
C3:VRC/ICZ/HICZ/VNO 2.0μg/mL,PCZ 1.0μg/mL,FCZ 10.0μg/mL,CPF4.0μg/mL;
C4:VRC/ICZ/HICZ/VNO 5.0μg/mL,PCZ 2.5μg/mL,FCZ 25.0μg/mL,CPF10.0μg/mL;
C5:VRC/ICZ/HICZ/VNO 7.0μg/mL,PCZ 3.5μg/mL,FCZ 35.0μg/mL,CPF14.0μg/mL;
C6:VRC/ICZ/HICZ/VNO 10.0μg/mL,PCZ 5.0μg/mL,FCZ 50.0μg/mL,CPF20.0μg/mL。
5.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述质控品溶液的3个浓度点LQC、MQC和HQC分别为
LQC:VRC/ICZ/HICZ/VNO 0.4μg/mL,PCZ 0.2μg/mL,FCZ 2.0μg/mL,CPF0.8μg/mL;
MQC:VRC/ICZ/HICZ/VNO 4.0μg/mL,PCZ 2.0μg/mL,FCZ 20.0μg/mL,CPF8.0μg/mL;
HQC:VRC/ICZ/HICZ/VNO 8.0μg/mL,PCZ 4.0μg/mL,FCZ 40.0μg/mL,CPF16.0μg/mL。
6.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述血清为人血清、牛血清或牛血清白蛋白配制的替代基质。
7.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述血清为无干扰的牛血清白蛋白配制的替代基质。
8.如权利要求6所述的试剂盒,其特征在于,所述牛血清白蛋白配制的替代基质中添加了抑菌剂和混合稳定剂,所述抑菌剂选自叠氮钠、Proclin 300或Proclin 950,优选Proclin 950,所述混合稳定剂选自BHT、海藻糖、VC、EDTA和柠檬酸,优选VC、EDTA和柠檬酸的混合稳定剂。
9.如权利要求8所述的试剂盒,其特征在于,所述抑菌剂为0.02%-0.2%浓度的Proclin950,优选为0.05%-0.1%浓度;所述混合稳定剂为0.5%-5%VC、5-40mM EDTA、1%-5%柠檬酸的混合物,优选为1%-2%VC、15-25mM EDTA、2%-5%柠檬酸的混合物。
10.权利要求1-9中任一项所述的试剂盒在利用超高效液相色谱-串联质谱法测定血清中7种抗真菌药含量中的应用。
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