CN113820430A - 一种用于检测抗菌药物的试剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测抗菌药物的试剂及其制备方法，涉及液相色谱串联质谱检测技术领域，本发明通过将3‑(N‑吗啡啉)丙磺酸(MOPS)为稳定剂进行质控品和校准品的制备，能有效提高其稳定性，最大程度地保持了血浆基质成分，简化了校准品和质控品的运输和储存过程。将本发明制备的校准品和质控品用于抗菌药物的液相色谱串联质谱检测，能同时确保至少16种药物的检测，显著提高了检测效率，且响应度高，重复性好。

Description

一种用于检测抗菌药物的试剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及液相色谱串联质谱检测技术领域，具体而言，涉及一种用于检测抗菌药物的试剂及其制备方法。

背景技术

目前，各种抗菌药物在临床中的应用极为广泛。合理应用抗菌药物，对于改善抗感染治疗的临床疗效、缩短患者治疗时间、减少医疗费用至关重要。滥用抗菌药物或在某些中成药、化妆品中非法添加抗菌药物会导致耐药细菌的增加和细菌耐药性的增强，进一步加剧感染性疾病对人类健康的威胁。

目前，大多数抗菌药物还没有系统化的临床检测方法。因此，实验室仍然需要开发自己的方法，为医院提供快速可靠的药物测量。由于需要测量广泛的抗菌药物，包括不同抗菌药物种类的多分析物方法变得更加普遍，因为它们节省时间并且具有成本效益。

文献中抗菌药物内标多采用甲氧苄啶、三唑仑等临床常用的抗生素药物，由于许多临床患者用药复杂，使用这些抗生素做内标，可能对测定产生干扰。

到目前为止，已经公开了几种方法来处理亚胺培南、美罗培南或头孢吡肟的定量。Abdulla等发表了亚胺培南、美罗培南等β-内酰胺类抗生素的HILIC UPLC-MS/MS方法，没有使用任何类型稳定剂，发现样品之间的基质效应和回收率差异很大。Zander等人和Rigo-Bonnin等人提出了头孢吡肟、美罗培南和其他抗生素的两种UPLC-MS/MS方法。两组均提供了经过充分验证的方法，但没有使用任何稳定剂来确保美罗培南在处理和储存期间的稳定性。现有使用反相液相色谱-质谱仅定量血浆中美罗培南的方法如下。徐等人提出了一种使用乙二醇和2-(N-吗啉代)-乙磺酸(MES)测定亚胺培南、西司他丁和一种研究性β-内酰胺酶抑制剂的HILIC-LC-MS方法。这些方法都不能同时测定亚胺培南、头孢吡肟和美罗培南。只有一组在一种UHPLC-质谱/质谱方法中测量了所有三种分析物以及其他β-内酰胺类。然而，cazolla-Rey Cazolla-Rey等人没有使用任何稳定方法检测抗菌药物，研究发现美罗培南在-80℃下保持一周稳定性，但是不能长时间储存质控品和校准品，不适合常规分析。抗菌药物的检测方法有免疫法、色谱法和质谱法。免疫法检测药物种类单一，很难实现同时检测多种药物；HPLC法分析时间较长，操作复杂。随着检测技术提高，LC-MS法液应用于治疗抗真菌药物监测中。目前，只有伏立康唑能够采用免疫法进行检测。

因此，如何建立简便、快速、准确的相关检测方法，对于监管该类药物在临床中的使用情况具有重要意义。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于检测抗菌药物的试剂及其制备方法。

本发明是这样实现的：

第一方面，本发明实施例提供了一种用于检测抗菌药物的试剂，其包括用于抗菌药物液相色谱串联质谱检测的校准品和质控品中的至少一种；所述质控品以及所述校准品中包含有3-(N-吗啡啉)丙磺酸，所述校准品和所述质控品为冻干制品或冻干复溶液。

第二方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的用于检测抗菌药物的试剂的制备方法，其包括：在用于抗菌药物液相色谱串联质谱检测的校准品溶液和质控品溶液中添加3-(N-吗啡啉)丙磺酸，将溶液冻干后，获得校准品和/或质控品。

第三方面，本发明实施例提供了一种用于液相色谱串联质谱检测抗菌药物的试剂盒，其包括如前述实施例所述的用于检测抗菌药物的试剂或如前述实施例所述的制备方法制备的用于检测抗菌药物的试剂。

第四方面，本发明实施例提供了一种用于检测抗菌药物的方法，所述方法包括：采用如前述实施例所述的用于检测抗菌药物的试剂或如前述实施例所述的制备方法制备的用于检测抗菌药物的试剂对待测样本中的抗菌药物进行检测。

本发明具有以下有益效果：

本发明通过将3-(N-吗啡啉)丙磺酸(MOPS)为稳定剂进行质控品和校准品的制备，能有效提高其稳定性，最大程度地保持了血浆基质成分，简化了校准品和质控品的运输和储存过程。将本发明制备的校准品和质控品用于抗菌药物的液相色谱串联质谱检测，能同时确保至少16种药物的检测，显著提高了检测效率，且响应度高，重复性好。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为试验例1种血浆中16种抗菌药物及其内标标准品的总离子流色谱图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

现有的抗菌药物的稳定性较差，难以保存，制备的校准品和质控品不利于实现对样本中抗菌药物的有效检测，尤其是多种抗菌药物的检测。本申请发明人经一系列创造性劳动后提出，采用3-(N-吗啡啉)丙磺酸作为稳定剂，能够有效保持试剂中抗菌药物的稳定性，从而利于实施对抗菌药物的精准检测。

具体地，本发明实施例提供了一种用于检测抗菌药物的试剂，其包括用于抗菌药物液相色谱串联质谱检测的校准品和质控品中的至少一种；所述质控品以及所述校准品中均包含有3-(N-吗啡啉)丙磺酸，所述校准品和所述质控品均为冻干制品或冻干复溶液。

本发明所选用3-(N-吗啡啉)丙磺酸作为稳定剂能够有效解决抗菌药不稳定和易降解等问题。

本文中“冻干复溶液”为采用复溶液对校准品和/或质控品的冻干制品进行复溶后获得的。

在可选的实施方式中，所述试剂还包括内标标准品。优选地，所述内标标准品中包含3-(N-吗啡啉)丙磺酸。在其他的实施方式中，内标标准品的制备也可以不添加3-(N-吗啡啉)丙磺酸。

在优选的实施方式中，所述内标标准品中3-(N-吗啡啉)丙磺酸的质量分数为4％～7％，具体可以为4％、5％、6％或7％，更优选为5％。在该范围内能够实现抗菌药物的精准检测。

本发明实施例还提供了前述实施例所述的用于检测抗菌药物的试剂的制备方法，其包括：在用于抗菌药物液相色谱串联质谱检测的校准品溶液和/或质控品溶液中分别添加3-(N-吗啡啉)丙磺酸，将溶液冻干后，获得校准品和/或质控品对应的冻干制品。

需要说明的是，溶液的冻干技术以及未加入3-(N-吗啡啉)丙磺酸的校准品溶液和质控品溶液的制备均可基于本领域常规技术知识获取，在此不再赘述，只要将加入有3-(N-吗啡啉)丙磺酸的质控品和/或校准品用于抗菌药物检测，则属于本申请的保护范围。

在优选的实施方式中，3-(N-吗啡啉)丙磺酸在校准品溶液和/或质控品溶液中的质量分数为1％～3％，具体可以为1％、2％或3％。

在优选的实施方式中，在校准品溶液和/或质控品溶液中添加3-(N-吗啡啉)丙磺酸的步骤如下：将3-(N-吗啡啉)丙磺酸与血浆基质混合后获得的血浆溶液与抗菌药物储备液混合，获得校准品溶液和/或质控品溶液。其中，所述血浆基质优选为小牛血浆，其成分组成更接近实际临床样本，且来源更好获取(相比于人血浆/人血清)，且不含16种待测物本底(由于抗生素滥用，人血浆/血清中含有不同程度的本底，对线性拟合及实际临床样本检测造成影响)。

在优选的实施方式中，所述血浆溶液与抗菌药物储备液混合的步骤包括：取抗菌药物储备液，配制抗菌药物浓度为校准点n倍浓度的溶液作为混合校准品溶液和/或混合质控品溶液；其中，n≥10，具体可以为10、12、12、13、14或15，只要大于10倍以上的数值即可，10倍以下由于有机溶剂占比较高可能对检查结果造成影响；然后将所述混合校准品溶液和/或所述混合质控品溶液分别与血浆溶液混合，获得校准品和/或质控品。所述血浆浓度与所述混合校准品溶液或混合质控品溶液的体积比为(n-1)：(0.9～1.1)，例如，当n为10时，体积比为9：1。

本文中的“校准点”和“质控点”是指已知真实值的数据点，根据想要设定的校准点和/或质控点的浓度进行储备液浓度的配置，具体可参照表5。

在优选的实施方式中，所述制备方法还包括内标标准品的制备，步骤如下：在内标标准品溶液中添加3-(N-吗啡啉)丙磺酸，获得内标标准品。优选地，内标标准品中3-(N-吗啡啉)丙磺酸的质量分数为4％～7％。

在优选的实施方式中，所述内标标准品采用同位素内标。现有技术中抗菌药物内标多采用甲氧苄啶、三唑仑等临床常用的抗生素药物，由于许多临床患者用药复杂，使用这些抗生素做内标，可能对测定产生干扰，而本发明实施例采用稳定性同位素内标，能最大程度的减轻基质效应，提高方法的准确度。

本发明实施例还提供了一种用于液相色谱串联质谱检测抗菌药物的试剂盒，其包括如前述任意实施例所述的用于检测抗菌药物的试剂或如前述任意实施例所述的制备方法制备的用于检测抗菌药物的试剂。

在可选的实施方式中，所述试剂盒还可以包括：蛋白沉淀剂以及复溶液。

当校准品和/或质控品均为冻干品时，本发明提供的试剂盒于2℃-8℃长期储存稳定性为至少12个月；将校准品和质控品的冻干制品复溶后，冻干复溶液于-20℃下能至少保存1个月，满足临床使用需求。

本发明实施例还提供了一种用于检测抗菌药物的方法，所述方法包括：采用如前述任意实施例所述的用于检测抗菌药物的试剂或如前述任意实施例所述的制备方法制备的用于检测抗菌药物的试剂对待测样本中的抗菌药物进行检测。

在一些实施例中，所述抗菌药物包括：利奈唑胺、美罗培南、氟康唑、伏立康唑、泊沙康唑、伊曲康唑、卡泊芬净、莫西沙星、左氧氟沙星、头孢他啶、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢哌酮、哌拉西林、舒巴坦和他唑巴坦中的至少一种。

在一些实施例中，蛋白沉淀剂为甲醇溶液。现有技术中沉淀剂选自常用沉淀剂包括异丙醇、乙腈等。相同的沉淀效率下，甲醇较其他沉淀剂价格更经济、毒性更低。

当所述质控品和/或校准品为冻干制品时，所述方法包括：采用复溶液对冻干的质控品和/或校准品进行复溶，以获得质控品和校准品的冻干复溶液用于检测。在优选的实施方式中，所述复溶液中含有3-(N-吗啡啉)丙磺酸，3-(N-吗啡啉)丙磺酸的质量分数优选为4％～5％，可以为4％、4.5％或5％。在可选的实施方式中，所述复溶液为含有3-(N-吗啡啉)丙磺酸的水溶液。在其他可选的实施方式中，复溶液中也可以不添加3-(N-吗啡啉)丙磺酸。不同技术方案对应的抗菌药物稳定性或检测有效性的排序为：冻干前和复溶液中均添加＞冻干前或复溶液中添加＞不添加。

具体地，所述检测的方法包括：在待测样本中添加蛋白沉淀剂和内标标准品，经蛋白沉淀后，取上清液用于液相色谱串联质谱检测。

该方法检测灵敏度高、特异性强、准确且血浆样品前处理过程较简单，3.5min之内可完成多种抗菌药物(利奈唑胺、美罗培南、氟康唑、伏立康唑、泊沙康唑、伊曲康唑、卡泊芬净、莫西沙星、左氧氟沙星、头孢他啶、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢哌酮、哌拉西林、舒巴坦和他唑巴坦)的分离和检测，基质效应和精密度均满足要求。

在可选的实施方式中，所述待测样本为血清样本、血浆样本或全血样本种的任意一种。

优选地，所述液相色谱的条件如下：色谱柱为C18反相色谱柱，色谱柱规格为：长度50～100mm，内径2～3mm，颗粒直径为2～5μm，色谱柱的流速为0.4-0.7mL/min，色谱柱的柱温为40℃，色谱柱的进样体积为2～10μL；

优选地，所述液相色谱的流动相和洗脱时间如下：流动相A为含甲酸和乙酸铵的溶液，甲酸的体积分数为0.05％～0.15％，乙酸铵的终浓度为1～3mM/L；流动相B为体积分数为含0.05％～0.15％甲酸的甲醇溶液；洗脱时间0～1.5min，流动相B的体积分数从2％～90％，流动相A的体积分数从98％到10％；洗脱时间1.5～1.9min，流动相B的体积分数保持在90％，流动相A的体积分数保持在10％；洗脱时间1.9～2.0min，流动相B的体积分数从90％到2％，流动相A的体积分数从10％到98％；洗脱时间2.0～3.5min，流动相B的体积分数保持2％，流动相A的体积分数保持98％；

优选地，质谱条件为：离子源为ESI电喷雾离子源，扫描模式为多反应监测，正离子扫描模式，喷雾电压为5450～5600kV，离子源温度为530～570℃，雾化气流速为45～55psi，辅助加热气流速为45～55psi，图谱数据采集的质荷比范围为300～700m/z，采集的扫描频率为0.5～0.7s。

采用上述优选实施例的设置的色谱条件和质谱条件进行检测，能进一步提高检测结果的稳定性和精准度。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实验仪器：包括三重四极杆串联质谱仪(AB sciex Triple quaurd 4500MD，ABsciex)；色谱柱为Thermo Hypersil C18色谱柱(Thermo Fisher Scientific)。试剂耗材包括色谱纯甲醇(Honeywell)；MS级甲酸、乙酸铵(Merck)。

实施例1

一种液相色谱串联质谱检测多种抗菌药物的试剂盒，其制备方法如下。

标准品：16种抗菌药物的标准品及稳定同位素内标均购自北京甄准生物公司，纯度均≥99％。

同时监测了目标物利奈唑胺(m/z 338.0→296.0)、利奈唑胺内标(m/z341.0→297.0)、美罗培南(m/z 384.0→141.1)、美罗培南内标(m/z 390.0→147.0)、氟康唑(m/z307.0→220.0)、氟康唑内标(m/z 311.0→223.2)、伏立康唑(m/z 350.0→280.0)、伏立康唑内标(m/z353.2→127.1)、泊沙康唑(m/z 701.0→127.0/701.0→614.0)、泊沙康唑内标(m/z 705.0→127.0)、伊曲康唑(m/z 705.0→392.0/705.0→432.0)、伊曲康唑内标(m/z714.0→401.0)卡泊芬净(m/z 547.6→131.0)、卡泊芬净内标(m/z 549.5→131.0)、莫西沙星(m/z 402.2→384.1)、莫西沙星内标(m/z 406.0→388.0)、左氧氟沙星(m/z 362.0→318.0)、左氧氟沙星内标(m/z 366.0→322.0)、头孢他啶(m/z 547.4→468.0)、头孢他啶内标(m/z 553.4→474.0)、头孢吡肟(m/z 481.1→124.9)、头孢吡肟内标(m/z 484.0→125.0)、头孢噻肟(m/z 456.1→167.1/456.1→396.0)、头孢噻肟内标Moxifloxacin(m/z406.2→388.2)和头孢哌酮(m/z 644.164→114.7)、哌拉西林(m/z 516.212→232.90)、哌拉西林内标(m/z 521.0→233.0)、舒巴坦(m/z/231.908→139.70/231.908→187.70)、舒巴坦内标(m/z/236.90→192.70)他唑巴坦(m/z 299.028→137.60)、他唑巴坦内标(m/z302.00→137.60)。各个目标物的内标、去簇电压和碰撞电压参数见表1。

表1. 16种抗菌药物的质谱参数

16种抗菌药物标准品储备液配置：分别准确称取适量利奈唑胺、美罗培南、氟康唑、伏立康唑、泊沙康唑、伊曲康唑、卡泊芬净、莫西沙星、左氧氟沙星、头孢他啶、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢哌酮、哌拉西林、舒巴坦、他唑巴坦，使用适当溶剂溶解并定容配制成浓度均为10mg/mL的储备液。

10×混合校准品溶液的配制：使用50％甲醇作为稀释液，依据设定好的各抗菌药最高校准点浓度S6，分别加入适量体积的16种抗菌药物储备液，剩余体积使用50％甲醇补足，得到10×混合校准点S6。根据各校准点的倍比关系，依次稀释成S5～S1点。

10×混合质控品溶液的配制：使用50％甲醇作为稀释液，依据设定好的各抗菌药最高质控点浓度HQC,分别加入适量体积的16种抗菌药物储备液，剩余体积使用50％甲醇补足，得到10×混合质控点HQC。根据各质控点的倍比关系，依次稀释成MQC、LQC点。

校准品、质控品以及内标标准品的配制：

(1)取2％MOPS血浆溶液与10×混合校准品、混合质控品溶液按照9：1比例充分混合后得到1×校准品溶液和质控品溶液；或，使用2％MOPS血浆溶液作为稀释液，依据设置好的校准点及质控点浓度，稀释各抗菌药物储备液，充分混匀后得到1×校准品溶液和质控品溶液。

(2)内标标准品的配置：分别称取适量16种抗菌药物同位素内标，使用适当溶剂溶解并定容得到浓度均为1mg/ml的同位素内标储备液。使用5％MOPS水溶液作为稀释液，根据各抗菌药物内标使用终浓度，加入计算体积的各储备液体积，剩余体积使用稀释液补足，获得内标标准品，16种抗菌药物校准点及质控点终浓度见表2。

(3)样品冻干：将配置好的校准品溶液和质控品溶液放入冻干机中进行真空冷冻干燥，放入试剂盒中，试剂盒主要成分见表3。按照PilotES系列真空冷冻干燥机标准操作规程，选取如下冻干曲线对产品进行冷冻干燥，冻干曲线见表4-5。当冻干曲线为表4所示时，发现冻干样品外观形状较差，出现黏连胶状情况，基于此优化冻干曲线为表5所示，发现冻干后样本外观形状符合良好，无黏连胶状的情况，符合冻干品要求。

复溶液的配制：

以水为溶剂，配制含有质量分数为5％3-(N-吗啡啉)丙磺酸的水溶液。检测时，采用复溶液对校准品和质控品的冻干制品进行复溶。

表2. 16种抗菌药物校准点及质控点终浓度(μg/mL)

	S1	S2	S3	S4	S5	S6	QCL	QCM	QCH
										利奈唑胺	0.5	1	2.5	5	25	50	1.5	12.5	37.5
美罗培南	1	2	5	10	50	100	3	25	75
										氟康唑	0.2	0.4	1	2	10	20	0.6	5	15
伏立康唑	0.1	0.2	0.5	1	5	10	0.3	2.5	7.5
										泊沙康唑	0.05	0.1	0.25	0.5	2.5	5	0.15	1.25	3.75
伊曲康唑	0.1	0.2	0.5	1	5	10	0.3	2.5	7.5
										卡泊芬净	0.2	0.4	1	2	10	20	0.6	5	15
莫西沙星	0.1	0.2	0.5	1	5	10	0.3	2.5	7.5
										左氧氟沙星	0.2	0.4	1	2	10	20	0.6	5	15
头孢他啶	1	2	5	10	50	100	3	25	75
										头孢吡肟	1	2	5	10	50	100	3	25	75
头孢噻肟	0.5	1	2.5	5	25	50	1.5	12.5	37.5
										头孢哌酮	1	2	5	10	50	100	3	25	75
哌拉西林	1	2	5	10	50	100	3	25	75
										舒巴坦	0.5	1	2.5	5	25	50	1.5	12.5	37.5
他唑巴坦	0.5	1	2.5	5	25	100	1.5	12.5	37.5

表3.试剂盒主要组成成分

备注：内标标准品中，头孢哌酮和哌拉西林共用的是哌拉西林氘代物。

表4-1.样品冻干曲线

表4-2样品冻干曲线优化

实施例2

一种液相色谱串联质谱检测多种抗菌药物的方法，其包括以下步骤。

1、血浆/血清样本的预处理：

采用蛋白沉淀法进行待测样本前处理，取100μL血浆样本，向其中加入内标标准品100μL，加入甲醇沉淀剂300μL，经蛋白沉淀后，经过漩涡震荡，取上清液进行LC-MS/MS分析。

2、定性和定量检测：

采用蛋白沉淀法处理样本后获得的上清液进行液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)分析，待测物经色谱分离后，导入质谱仪，在离子源中离子化形成带电离子。在电场的作用下，聚焦进入三重四级杆质量分析器。在第一级四级杆(Q1)中，带电离子按质荷比分离，筛选出母离子，随后进入第二极四级杆(Q2)中，在碰撞气体和碰撞能量的作用下，碎裂形成碎片离子，产生的碎片离子进入到第三极四级杆(Q3)，按质荷比分离，筛选出目标子离子，最终进入检测器，产生信号。

将校准品中16种抗菌药物与相应内标的峰面积比值与标示浓度进行线性拟合，绘制标准曲线。将实际样本中的16种抗菌药物与内标的峰面积比值代入拟合的标准曲线方程，即可计算出待测物浓度。采用质控品评价或验证精密度和准确度、提取回收率、基质效应等性能。

高效液相色谱条件为：色谱柱为Thermo Hypersil C18或其他性能相当C18反相色谱柱，色谱柱规格为：长度50～100mm，内径2～3mm，颗粒直径为2～5μm，色谱柱的流速为0.4-0.7mL/min，色谱柱的柱温为40℃，色谱柱的进样体积为2～10μL。

色谱流动相中流动相A为含甲酸和乙酸铵的水溶液，甲酸的体积分数为0.1％，乙酸铵的终浓度为2mM/L。色谱流动相中流动相B为含体积分数0.1％甲酸的甲醇溶液。

色谱柱的梯度洗脱条件为：洗脱时间0～1.5min，流动相B的体积分数从2％～90％，流动相A的体积分数从98％到10％；洗脱时间1.5～1.9min，流动相B的体积分数保持在90％，流动相A的体积分数保持在10％；洗脱时间1.9～2.0min，流动相B的体积分数从90％到2％，流动相A的体积分数从10％到98％；洗脱时间2.0～3.5min，流动相B的体积分数保持2％，流动相A的体积分数保持98％。

质谱条件为：离子源为ESI电喷雾离子源，扫描模式为多反应监测，正离子扫描模式，喷雾电压为5500kV，离子源温度为550℃，雾化气流速为50psi，辅助加热气流速为50psi，图谱数据采集的质荷比范围为300～700m/z，采集的扫描频率为0.6s。

试验例1

基于实施例1提供的试剂盒，采用实施例2的检测方法对16种抗菌药物进行检测，具体如下。

(1)总离子流色谱图：16种抗菌药物的标准品和血浆样品的峰形比较对称，且没有杂峰干扰，说明在此条件下能够得到良好的检测，图1为血浆中16种抗菌药物及其内标标准品的总离子流色谱图。

(2)基质效应(matrix effect，ME)和提取回收率(extraction efficiency，EE)考察：由于本试验例采用的空白血浆基质为含2％MOPS的小牛血浆，且定量标曲由含2％MOPS的小牛血浆配制而得，因此对含2％MOPS的小牛血浆进行基质效应和提取回收率考察，测试结果见表5。

表5. 16种抗菌药物的基质效应和提取回收率结果

测试结果显示，16种抗菌药物三批质控品在含2％MOPS小牛血浆中基质效应均在87％-110％之间，且提取回收率在92.93％-117.6％之间；

(3)校准曲线：采用同位素内标定量法，利用TargetLynx软件以标准物与内标物的浓度比为X轴，标准物与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，并计算出血浆中待测物的浓度。检测结果见表6。

表6. 16种抗菌药物线性回归方程及线性相关系数

由结果可知，16种抗菌药物在各自浓度范围内的线性拟合方程，线性良好，相关系数在0.997以上，满足定量要求。

(4)精密度、准确度试验：根据试剂盒提供的三水平质控溶液，采用血浆加标方式配制低、中、高值质控品，每个浓度平行制备6份，分别计算测定值的平均值和标准差SD；每天制备和检测1次，以当天新制备标准曲线换算质控品浓度，连续3天，通过计算相对标准差(RSD)来评价批内批间精密度，通过相对偏差(RE)来评价批内批间准确度，结果见表7，表8。

表7批内精密度

表8批间精密度

(5)长期储存稳定性和复溶1个月稳定性。

长期复溶稳定性：取一份混合空白血浆，向其中加入低、中、高质控品，混合均匀后分别置于-20℃冰箱，冷冻12个月后按照操作说明书进行检测。以第0天未冻存样本检测数据为依据，计算样本指标成分的相对偏差，以评价全血样本冻存12个月的稳定性。

相对偏差计算公式：B＝100％×(M-T)/T；

式中：B：相对偏差；M：经过12个冻存后测试值；T：未冻融结果或理论值。

复溶1个月稳定性：取一份混合空白血浆，向其中加入低、中、高质控，混合均匀后分别置于-20℃冰箱，冷冻1个月后按照操作说明书进行检测。以第0天未冻存样本检测数据为依据，计算样本指标成分的相对偏差，以评价全血样本冻存1个月的稳定性。

相对偏差计算公式：B＝100％×(M-T)/T；

式中：B：相对偏差；M：经过1个月冻存后测试值；T：未冻融结果或理论值。

结果见表9。

表9标准品及质控品长期储存稳定性

由上述结果可知，本发明采用超高效液相色谱串联质谱技术同时测定了人体血浆中16种抗菌药物，针对目标物的出峰时间和离子对进行检测，灵敏度高。与此同时，采用同位素内标法定量可以消除基质干扰，而且不受预处理过程、进样体积和流动相等条件的影响，能够达到准确定量。

16种抗菌药物在的基质效应在74％-110％之间，且提取回收率较高(在92.93～117.64％之间)。方法的重现性结果表明，批内精密度范围为RSD在1.19％～9.07％，RE在-9.89％～12.42％，批间精密度范围为RSD在0.88％～11.81％，RE在-8.70～10.12％之间。一般而言，精密度须在20％以内，对于含量极低的化合物，可放宽至30％。如果使用灵敏度更高的仪器，精密度数据将得到改善。

试验例2

基于实施例1的配制方法，设置几组实验组：在血浆校准品及质控品配制时，血浆溶液中不加3-(N-吗啡啉)丙磺酸(No-MOPS)，加2％3-(N-吗啡啉)丙磺酸(2％MOPS)与加5％3-(N-吗啡啉)丙磺酸(5％MOPS)，进行稳定性的比较。检测结果见表10。

表10.不同浓度稳定剂准确度比较

由结果可知，添加MOPS的检测精确度显著优于未添加MOPS时的精确度。

综上，本发明中的方法灵敏度高、特异性强、准确且前处理过程较简单，3.5min之内可完成多种抗菌药物的分离和检测，方法稳定性良好，基质效应、提取回收率及精密度，满足临床检测要求，可用于临床上血浆中抗菌药物的定量分析，为临床上心血管疾病风险的健康评估提供一种可靠的检测方法。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于检测抗菌药物的试剂，其特征在于，其包括：用于抗菌药物液相色谱串联质谱检测的校准品和质控品中的至少一种；所述质控品以及所述校准品中包含有3-(N-吗啡啉)丙磺酸，所述校准品和所述质控品为冻干制品或冻干复溶液。

2.根据权利要求1所述的用于检测抗菌药物的试剂，其特征在于，所述试剂还包括内标标准品；

优选地，所述内标标准品中包含3-(N-吗啡啉)丙磺酸；

优选地，所述内标标准品中3-(N-吗啡啉)丙磺酸的质量分数为4％～7％。

3.如权利要求1或2所述的用于检测抗菌药物的试剂的制备方法，其特征在于，其包括：在用于抗菌药物液相色谱串联质谱检测的校准品溶液和/或质控品溶液中添加3-(N-吗啡啉)丙磺酸，将溶液冻干后，获得校准品和/或质控品的冻干制品。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，3-(N-吗啡啉)丙磺酸在校准品溶液和/或质控品溶液中的质量分数为1％～3％；

优选地，在校准品溶液和/或质控品溶液中添加3-(N-吗啡啉)丙磺酸的步骤包括：将3-(N-吗啡啉)丙磺酸与血浆基质混合后获得的血浆溶液与抗菌药物储备液混合，获得最终的校准品溶液和/或质控品溶液；

优选地，所述血浆溶液与抗菌药物储备液混合的步骤包括：取抗菌药物储备液，配制抗菌药物浓度为校准点n倍浓度的溶液作为混合校准品溶液和/或混合质控品溶液，n≥10；然后将所述混合校准品溶液和/或所述混合质控品溶液分别与血浆溶液混合，获得对应的校准品溶液和/或质控品溶液；其中，所述血浆溶液与所述混合校准品溶液或混合质控品溶液的体积比为(n-1)：(0.9～1.1)。

5.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括内标标准品的制备，步骤如下：在内标标准品溶液中添加3-(N-吗啡啉)丙磺酸，获得内标标准品；

优选地，在所述内标标准品中，3-(N-吗啡啉)丙磺酸的质量分数为4％～7％。

6.一种用于液相色谱串联质谱检测抗菌药物的试剂盒，其特征在于，其包括如权利要求1或2所述的用于检测抗菌药物的试剂或如权利要求3～5任一项所述的制备方法制备的用于检测抗菌药物的试剂。

7.一种用于检测抗菌药物的方法，其特征在于，所述方法包括：采用如权利要求1或2所述的用于检测抗菌药物的试剂或如权利要求3～5任一项所述的制备方法制备的用于检测抗菌药物的试剂对待测样本中的抗菌药物进行检测。

8.根据权利要求7所述的用于检测抗菌药物的方法，其特征在于，所述抗菌药物包括：利奈唑胺、美罗培南、氟康唑、伏立康唑、泊沙康唑、伊曲康唑、卡泊芬净、莫西沙星、左氧氟沙星、头孢他啶、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢哌酮、哌拉西林、舒巴坦和他唑巴坦中的至少一种。

9.根据权利要求7所述的用于检测抗菌药物的方法，其特征在于，在进行检测前，当所述质控品和/或校准品为冻干制品时，所述方法包括：采用复溶液对冻干的质控品和/或校准品进行复溶，所述复溶液中含有3-(N-吗啡啉)丙磺酸；

优选地，所述复溶液为含有质量分数为4％～5％3-(N-吗啡啉)丙磺酸的水溶液。

10.根据权利要求7～9任一项所述的用于检测抗菌药物的方法，其特征在于，所述检测的方法包括：在待测样本中添加蛋白沉淀剂和所述内标标准品，经蛋白沉淀后，取上清液用于液相色谱串联质谱检测；

优选地，所述液相色谱的条件如下：色谱柱为C18反相色谱柱，色谱柱规格为：长度50～100mm，内径2～3mm，颗粒直径为2～5μm，色谱柱的流速为0.4-0.7mL/min，色谱柱的柱温为40℃，色谱柱的进样体积为2～10μL；

优选地，所述液相色谱的流动相和洗脱时间如下：流动相A为含甲酸和乙酸铵的溶液，甲酸的体积分数为0.05％～0.15％，乙酸铵的终浓度为1～3mM/L；流动相B为体积分数为含0.05％～0.15％甲酸的甲醇溶液；洗脱时间0～1.5min，流动相B的体积分数从2％～90％，流动相A的体积分数从98％到10％；洗脱时间1.5～1.9min，流动相B的体积分数保持在90％，流动相A的体积分数保持在10％；洗脱时间1.9～2.0min，流动相B的体积分数从90％到2％，流动相A的体积分数从10％到98％；洗脱时间2.0～3.5min，流动相B的体积分数保持2％，流动相A的体积分数保持98％；

优选地，质谱条件为：离子源为ESI电喷雾离子源，扫描模式为多反应监测，正离子扫描模式，喷雾电压为5450～5600kV，离子源温度为530～570℃，雾化气流速为45～55psi，辅助加热气流速为45～55psi，图谱数据采集的质荷比范围为300～700m/z，采集的扫描频率为0.5～0.7s。

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