CN116183736B - 同时检测肺泡灌洗液中9种抗生素的lc-ms/ms分析方法 - Google Patents
同时检测肺泡灌洗液中9种抗生素的lc-ms/ms分析方法 Download PDFInfo
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Abstract
本公开涉及一种同时检测肺泡灌洗液中9种抗生素的LC‑MS/MS分析方法，(1)利用标准溶液分别建立9种抗生素的标准曲线；其中，所述9种抗生素包括头孢哌酮、头孢他啶、美罗培南、利奈唑胺、伏立康唑、氟康唑、哌拉西林、泊沙康唑和伊曲康唑；(2)将肺泡灌洗液样品进行样品前处理，得到待测样品；(3)利用LC‑MS/MS对待测样品进行检测，并利用步骤(1)确定的标准曲线确定待测样品中9种抗生素的含量。本公开提供的分析方法能够实现肺泡灌洗液中9种抗生素的同时检测，一份样本即可完成检测，并且本公开提供的分析方法重现性良好，加样回收率高，检测结果准确性高，检测过程简便快捷，分析时间短，实验成本低，有利于大批量的样本检测。
Description
技术领域
本公开涉及抗生素浓度监测技术领域，尤其涉及一种同时检测肺泡灌洗液中9种抗生素的LC-MS/MS分析方法。
背景技术
肺泡灌洗液，是在行纤维气管镜检查时，对气管肺泡进行灌洗后，所采集的肺黏膜表面的渗液，作为标本送检，完善相关免疫学、微生物学等检查，诊断呼吸系统疾病时，由于痰液受外界影响因素较多，不利于精确诊断而肺泡灌洗液不易受上呼吸道感染，也没有气管及支气管附有的黏液，有利于寻找致病菌，对疾病的诊断，以及治疗有指导意义。
细菌感染是致病性和死亡率的一个重要来源，使用抗生素治疗成为住院病人管理的一个重要方面。头孢哌酮、头孢他啶、美罗培南、伏立康唑、伊曲康唑、泊沙康唑、氟康唑、利奈唑胺、哌拉西林是几种常用的抗生素，分别针对于不同的细菌感染，但是均存在治疗窗窄，个体间差异较大的缺点。
目前已经证明基于标准给药方案的抗生素治疗的病人，其肺泡中的药物浓度往往不能达到有效治疗浓度，这大大影响了治疗效果，并可能使病人产生多种细菌的耐药性；因为不同的病人药物代谢动力学存在个体间的差异，简单的增加药物剂量可能会引起危险的毒副作用。因此需要进行严格的肺泡中的药物浓度监测，特别是针对治疗浓度狭窄的药物。
目前的抗生素浓度监测大多都是同一种类的抗生素放在一个方法包中，但在实际情况中，往往会存在联合用药的情况，特别是不同生理功能的抗生素同时用药，因此，若想对几类抗生素同时进行药物浓度监测，则需要一次采集较大量的样品，分别处理，分别监测，不仅样本的使用量较大，而且检测时间长，检测结果较慢。
因此，需要提供一种能够同时检测肺泡灌洗液中9种抗生素的液相色谱质谱分析方法，确保只需要用一份标本就可以完成多种抗生素的肺泡中的药物浓度监测，能够提高检测效率。
发明内容
为了解决上述技术问题，本公开提供了一种同时检测肺泡灌洗液中9种抗生素的LC-MS/MS分析方法。
第一方面，本公开提供了一种同时检测肺泡灌洗液中9种抗生素的LC-MS/MS分析方法，所述方法包括：
(1)利用标准溶液分别建立9种抗生素的标准曲线；
其中，所述9种抗生素包括头孢哌酮、头孢他啶、美罗培南、利奈唑胺、伏立康唑、氟康唑、哌拉西林、泊沙康唑和伊曲康唑；
(2)将肺泡灌洗液样品进行样品前处理，得到待测样品；
(3)利用LC-MS/MS对待测样品进行检测，并利用步骤(1)确定的标准曲线确定待测样品中9种抗生素的含量。
现有提供的方法包通常仅包括一类生理功能相近且极性相近的药物，本公开提供的9种抗生素的极性跨度较大，并无法使用目前现有的方法完成检测，并且在目前的质谱检测中，头孢哌酮和头孢他啶一般采用负离子检测模式，而其他抗生素一般采用正离子检测模式。
本公开提供的9种抗生素的极性大小见表1：
表1
| 抗生素 | 极性(logP) | 抗生素 | 极性(logP) |
| 头孢他啶 | -1.6 | 哌拉西林 | 0.3 |
| 美罗培南 | -0.6 | 伏立康唑 | 1 |
| 头孢哌酮 | -0.74 | 泊沙康唑 | 5.5 |
| 利奈唑胺 | 0.9 | 伊曲康唑 | 5.7 |
| 氟康唑 | 0.5 |
由表1可知，本公开中的9种抗生素极性跨度较大，且有部分物质的极性相近，在目前现有的方法中难以同时对上述9种抗生素进行含量检测。
本公开提供的分析方法在同一种采集模式(正离子采集进行检测分析，避免正负切换带来的一系列繁琐步骤和操作)的前提下，能够将不同生理功能且极性相差较大的抗生素放在同一方法包中进行分析，只需一份样本即可完成9种抗生素的同时检测。
作为本公开的一种优选技术方案，所述前处理方法包括：
将肺泡灌洗液样品、内标工作液和蛋白沉淀剂混合，离心取上清液后加入超纯水进行稀释，得到所述待测样品。
作为本公开的一种优选技术方案，所述蛋白沉淀剂选自乙腈。
作为本公开的一种优选技术方案，所述肺泡灌洗液样品与蛋白沉淀剂的体积比为1:(4-6)，例如1:4.5、1:5、1:5.5等。
作为本公开的一种优选技术方案，所述肺泡灌洗液样品与内标工作液的体积比为(10-20):1，例如12:1、15:1、18:1等。
作为本公开的一种优选技术方案，所述上清液与超纯水的体积比为1:(1-4)，例如1:2、1:3等。
本公开提供的样品前处理方法摈弃了复杂且时间较长的前处理过程，仅通过利用蛋白沉淀剂即可完成样品的前处理，操作简单，能够尽可能的降低前处理失误。
实际上，本公开提供的样品前处理方法配合本公开提供的检测方法能够实现在不添加空白基质的前提下实现标准曲线的确定。
由于肺泡灌洗液中的抗生素的浓度极低，因此，在目前的检测方法中，均需要采集大量的肺泡灌洗液，而本公开提供的分析方法以及样品前处理方法能够将样本使用量降低至100μL，极大的减小了样本使用量。
作为本公开的一种具体实施方式，所述待测样品的前处理方法包括：用移液枪移取肺泡灌洗液样品、内标工作液和乙腈，混匀5-10min，离心10-15min，取上清加水，混匀1-3min，取上清进样分析。
作为本公开的一种具体实施方式，所述待测样品的前处理方法包括：用移液枪移取肺泡灌洗液样品，加入内标工作液和乙腈，1500-2500r/min混匀5-10min，12000-14000r/min离心10-15min，取上清加水，1500-2500r/min混匀1-3min，取上清进样分析，进样量为4μL。
作为本公开的一种具体实施方式，所述待测样品的前处理方法包括：用移液枪移取100μL肺泡灌洗液样品，加入10μL内标工作液，加入400μL乙腈，2000r/min混匀5min，14000r/min离心10min，取上清100μL，加水100μL，2000r/min混匀1min，取上清150μL进样分析，进样量为4μL。
作为本公开的一种优选技术方案，在所述LC-MS/MS分析方法中，液相色谱参数包括：
色谱柱为：phenomenex Luna Omega Polar C18、phenomenex Kinetex Polar C18或Shim-pack Velox SP-C18；
流速：0.2-0.5mL/min；
梯度洗脱参数包括：
0.00min：A 95-100％，B 0-5％；
0.10-1.50min：A 30-60％，B 40-70％；
1.01-3.50min：A 0-10％，B 100-90％；
2.01-5.50min：A 95-100％，B 0-5％。
在本公开的梯度洗脱条件中，对于“0.10-1.50min和1.01-3.50min”或者对于“1.51-3.50min和3.01-5.50min”，其对应的梯度洗脱条件，并不指二者存在时间上的交叉，而是指在此范围内，可以择一使用，示例性的进行以下解释：对于“0.10-1.50min和1.01-3.50min”A相占比既可以参照0.10-1.50min中限定的30-60％，也可以参照1.01-3.50min中限定的0-10％，均能实现本公开的发明目的。
本公开所述0.10-1.50min可以是0.10-1.00min、0.10-1.10min、0.10-1.20min、0.10-1.30min、0.10-1.40min等。本公开所述1.01-3.50min可以是1.01-2.00min、1.01-2.40min、1.01-2.80min、1.01-3.00min、1.01-3.40min、1.11-2.00min、1.11-3.00min、1.11-3.40min、1.31-2.00min、1.41-2.00min等。本公开所述2.01-5.50min可以是2.11-5.50min、2.41-5.50min、2.81-5.50min、3.01-5.50min、3.21-5.50min、3.41-5.50min等。本公开所述95-100％可以是96％、97％、98％、99％等；所述0-5％可以是1％、2％、3％、4％等，所述30-60可以是35％、40％、45％、50％、55％等，所述40-70％可以是45％、50％、55％、60％、65％等，所述0-10可以是2％、4％、6％、8％等，所述100-90％可以是98％、96％、94％、92％等。
质谱检测仪的检测模式为ESI+检测模式，质谱参数包括：
干燥气温度：250-350℃，例如260℃、280℃、300℃、340℃等；干燥气流速：3-15L/min，例如4L/min、6L/min、8L/min、10L/min、12L/min、14L/min等；鞘气温度：300-400℃，例如320℃、340℃、360℃、380℃等；鞘气流速：8-11L/min，例如9L/min、10L/min等；喷雾器：40-50psi，例如42psi、45psi、48psi等；毛细管电压3000-4500V，例如3200V、3500V、3800V、4000V、4200V等。
相较于现有的对于头孢哌酮和头孢他啶的质谱检测，一般采用负离子检测模式，本公开提供了一种正离子检测模式即可完成对二者的质谱检测，进而能够和其他抗生素放在同一方法包中，实现一份样本同时检测9种抗生素，且分析时间短，定量准确性高，能够尽可能的缩短检测时间，具有优异的检测效率。
作为本公开的一种优选技术方案，在所述液相色谱参数中，还包括：
使用的流动相：A为含有0.1-0.2v/v％甲酸和1-5mM甲酸铵或乙酸铵的水溶液，B为含有0-0.2v/v％甲酸的乙腈。所述0.1-0.2v/v％可以是0.12v/v％、0.15v/v％、1.18v/v％等，所述1-5mM可以是2mM、3mM、4mM等，所述0-0.2可以是0.05v/v％、0.1v/v％、0.15v/v％等。
洗针液为含有0.1-0.5v/v％甲酸的乙腈，例如0.2v/v％、0.3v/v％、0.4v/v％等。
进样量为1-10μL，例如2μL、4μL、6μL、8μL等。
作为本公开的一种优选技术方案，所述梯度洗脱参数包括：
0.00min：A 95-100％，B 0-5％；
0.10-1.50min：A 30-60％，B 40-70％；
1.51-3.00min：A 0-10％，B 100-90％；
3.01-5.50min：A 95-100％，B 0-5％。
作为本公开的一种优选技术方案，所述梯度洗脱参数包括：
0.00min：A 95-100％，B 0-5％；
0.10-1.50min：A 30-45％，B 55-70％；
1.51-3.00min：A 0-10％，B 90-100％；
3.01-5.50min：A 95-100％，B 0-5％。
本公开所述95-100％可以是96％、97％、98％、99％等；所述0-5％可以是1％、2％、3％、4％等，所述30-45％可以是32％、34％、36％、40％、42％等，所述55-70％可以是58％、60％、62％、65％、68％等，所述0-10％可以是2％、4％、6％、8％等，所述90-100％可以是92％、94％、96％、98％等。
作为本公开的一种优选技术方案，所述9种抗生素使用的内标物包括头孢哌酮-D5、头孢他啶-D5、美罗培南-D6、利奈唑胺-D3、伏立康唑-D3、氟康唑-D4、哌拉西林-D5、泊沙康唑-D4和伊曲康唑-D5。
作为本公开的一种优选技术方案，所述标准溶液的制备方法包括：
将内标工作液与含有9种抗生素的标准工作液混合后，与蛋白沉淀剂混合，取上清液并利用超纯水稀释，得到所述标准溶液，所述标准工作液包括8个级别浓度。
作为本公开的一种优选技术方案，各所述级别浓度的标准工作液均利用稀释剂由中间液稀释得到，所述中间液利用稀释剂由母液稀释得到，所述母液利用溶剂溶解所述9种抗生素各自的标准品得到。
作为本公开的一种优选技术方案，所述内标工作液利用稀释剂由内标中间液稀释得到，所述内标中间液利用稀释剂由内标母液稀释得到。
因为制备母液关系到后续标准溶液的稳定性，作为本公开的一种优选技术方案，在制备所述母液时：
所述美罗培南标准品和头孢他啶标准品使用的溶剂各自独立地选自浓度为30-50％的甲醇水溶液或浓度为30-50％的乙腈水溶液。所述浓度为30-50％的甲醇水溶液可以是32％、35％、38％、40％、42％、45％、48％等。所述浓度为30-50％的乙腈水溶液可以是32％、35％、38％、40％、42％、45％、48％等。
在标曲的确定中，标准溶液的稳定性极为重要，本公开发现，虽然美罗培南和头孢他啶在甲醇中具有优异的溶解性，但是稳定性极差，虽然在后续的液相色谱-质谱检测中仍具有较高的回收率，但实际上无法保证检测的准确性；本公开在制备美罗培南和头孢他啶的母液时，通过选择特定的溶解溶剂，同时配合后续的稀释剂使用，能够保证美罗培南和头孢他啶的稳定性和溶解性，进而保证后续检测的准确性。
所述头孢哌酮和伊曲康唑标准品使用的溶剂独立地选自浓度为50-80％二氯乙烷的甲醇溶液或浓度为50-80％二氯乙烷的乙腈溶液。所述浓度为50-80％二氯乙烷的甲醇溶液可以是55％、60％、65％、70％、75％等。所述浓度为50-80％二氯乙烷的乙腈溶液可以是55％、60％、65％、70％、75％等。
利用目前常用的甲醇作为溶剂溶解头孢哌酮和伊曲康唑，并不能使二者全部溶解，本公开特异性的发现，采用50-80％二氯乙烷的甲醇/乙腈溶液制备母液，既能保证头孢哌酮和伊曲康唑的溶解性，又能保证后续制备的标准工作液在放置过程中不至于因为溶剂的挥发而导致无法使用的现象。
所述泊沙康唑标准品使用的溶剂选自浓度为60-100％的甲醇水溶液或浓度为60-100％的乙腈水溶液，所述甲醇水溶液和所述乙腈水溶液中还含有0.4-1％的甲酸。所述60-100％可以是65％、70％、80％、90％等。所述0.4-1％可以是0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％等。
本公开提供的泊沙康唑母液的制备方法能够保证泊沙康唑的溶解性以及存储稳定性。
所述利奈唑胺、氟康唑、哌拉西林、伏立康唑标准品使用的溶剂各自独立地选自浓度为70-90％的甲醇水溶液或浓度为70-90％的乙腈水溶液。所述70-90％可以是72％、75％、78％、80％、82％、85％、88％等。
在本公开中，上述浓度均指体积浓度，示例性的进行如下解释：浓度为80％二氯乙烷的甲醇溶液，指的是，二氯甲烷:甲醇的体积比为8:2。
在使用内标法进行LC-MS/MS检测时，标准溶液中的内标物的稳定性同样重要，作为本公开的一种优选技术方案，在制备所述内标母液时：
所述美罗培南-D6和头孢他啶-D5使用的溶剂各自独立地选自浓度为30-50％的甲醇水溶液或浓度为30-50％的乙腈水溶液。所述浓度为30-50％的甲醇水溶液可以是32％、35％、38％、40％、42％、45％、48％等。所述浓度为30-50％的乙腈水溶液可以是32％、35％、38％、40％、42％、45％、48％等。
在制备内标母液时，本公开提供的溶剂同样能够保证内标物的溶解性和存储稳定性。
所述头孢哌酮-D5和伊曲康唑-D5标准品使用的溶剂独立地选自浓度为50-80％二氯乙烷的甲醇溶液或浓度为50-80％二氯乙烷的乙腈溶液。所述浓度为50-80％二氯乙烷的甲醇溶液可以是55％、60％、65％、70％、75％等。所述浓度为50-80％二氯乙烷的乙腈溶液可以是55％、60％、65％、70％、75％等。
所述泊沙康唑-D4标准品使用的溶剂选自浓度为60-100％的甲醇水溶液或浓度为60-100％的乙腈水溶液，所述甲醇水溶液和所述乙腈水溶液中还含有0.4-1％的甲酸。所述60-100％可以是60％、70％、80％、90％等。所述0.4-1％可以是0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％等。
所述利奈唑胺-D3、伏立康唑-D3、氟康唑-D4、哌拉西林-D5标准品使用的溶剂各自独立地选自浓度为70-90％的甲醇水溶液或浓度为70-90％的乙腈水溶液。所述70-90％可以是72％、75％、78％、80％、82％、85％、88％等。
为了保证标准溶液的稳定性，进而保证检测结果的准确性，作为本公开的一种优选技术方案，所述稀释剂为甲醇水溶液或乙腈水溶液，所述甲醇或乙腈和水的体积比为3:7-5:5，例如3.5:6.5、4:6、4.5:5.5等。
本公开优选上述稀释剂能够保证标准工作液和内标工作液的存储稳定性，在一定的存储条件下，其包含的9种抗生素的含量保持稳定，进而减少了目前检测需要现用现配的时间，缩短了检测时间，提高了检测效率。
本公开通过选择特定的溶解试剂以及稀释剂，能够保证制备得到的标准溶液中的9种抗生素的溶解性和存储稳定性，不仅能够实现现用现配检测的准确性，还能够保证标准工作液、内标工作液或标准溶液在放置一定时间后，9种抗生素的浓度基本无变化，进而能够保证利用存储后的溶液进行检测的准确性，能够避免必须现用现配的要求，节省检测时间。
作为本公开的一种具体实施方式，所述标准溶液的制备包括：用移液器分别移取10μL标准工作液、10μL内标工作液分别置于1.5mL离心管中混合制成标准溶液，加入90μL生理盐水，加入400μL乙腈到上述各离心管中，将上述标准溶液分别在转速为1000-2000rpm下涡旋混匀30s-1min后，取100μL上清液，再加入100μL水，得到标准溶液。
本公开实施例提供的技术方案与现有技术相比具有如下优点：
(1)本公开提供的分析方法能够实现肺泡灌洗液中9种抗生素的同时检测，一份样本即可完成检测，并且本公开提供的分析方法重现性良好，加样回收率高，检测结果准确性高，检测过程简便快捷，分析时间短，实验成本低，有利于大批量的样本检测；
(2)本公开提供的标准溶液稳定性极佳，在-20℃下放置3个月后，其准确度基本保持稳定，能够极大地节约配置时间，降低检测成本。
附图说明
此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本公开的实施例，并与说明书一起用于解释本公开的原理。
为了更清楚地说明本公开实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为安捷伦1260/6470A检测的标准溶液中9种抗生素的色谱图；
图2为安捷伦1260/6470A检测的肺泡灌洗液样本中9种抗生素的色谱图；
图3为实施例4检测的肺泡灌洗液样本中9种抗生素的色谱图；
图4为实施例5检测的肺泡灌洗液样本中9种抗生素的色谱图；
图5为实施例6检测的肺泡灌洗液样本中9种抗生素的色谱图；
图6为实施例7检测的肺泡灌洗液样本中9种抗生素的色谱图；
图7为对比例14得到的液相色谱图；
图8为对比例15得到的液相色谱图。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本公开的上述目的、特征和优点，下面将对本公开的方案进行进一步描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本公开的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本公开，但本公开还可以采用其他不同于在此描述的方式来实施；显然，说明书中的实施例只是本公开的一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例1
本实施例提供了一种标准工作液的制备方法。
(1)配制9种抗生素标准品母液
天平精密称量头孢他啶标准品3.55mg，加入2mL甲醇:水＝1:1溶液进行溶解，纯度为85.8％，得到浓度为1524μg/mL的母液；
天平精密称量美罗培南标准品2.54mg，加入2mL甲醇:水＝1:1溶液进行溶解，纯度为98％，得到浓度为1243μg/mL的母液；
天平精密称量头孢哌酮标准品12.60mg，先加入1mL甲醇，再加入1mL二氯甲烷进行溶解，纯度为93.8％，得到浓度为5908μg/mL的母液；
天平精密称量利奈唑胺标准品5.39mg，加入2mL甲醇:水＝1:1溶液进行溶解，纯度为96.1％，得到浓度为2685μg/mL的母液；
天平精密称量哌拉西林标准品10.83mg，加入2mL甲醇:水＝1:1溶液进行溶解，纯度为99.6％，得到浓度为5203μg/mL的母液；
天平精密称量氟康唑标准品10.63mg，加入2mL甲醇:水＝1:1进行溶解，纯度为99.8％，得到浓度为5303μg/mL的母液；
天平精密称量伏立康唑标准品16.498mg，加入2mL甲醇进行溶解，纯度为99.8％，得到浓度为8233μg/mL；
天平精密称量泊沙康唑标准品4.354mg，加入2mL甲醇，再加入10μL甲酸进行溶解，纯度为99％，得到浓度为2155μg/mL的母液；
天平精密称量伊曲康唑标准品5.35mg，先加入1mL甲醇，再加入1mL二氯甲烷进行溶解，纯度为99.2％，得到浓度为2655μg/mL的母液。
(2)利用甲醇:水＝1:1的稀释液配制标准中间液，标准中间液混合，并利用甲醇:水＝1:1的稀释液进行稀释得到具有8种级别浓度的标准工作液，具体见表2：
表2
对比例1-2
本对比例提供了一种标准母液的制备方法。
与实施例1的区别在于，在本对比例制备头孢他啶和美罗培南的母液时，使用的溶剂均为甲醇(对比例1)；甲醇:(甲醇:水＝1:1)＝1:1(对比例2)。
若使用的溶剂为甲醇:(甲醇:水＝1:1)＝1:1，指的是先用甲醇:水＝1:1溶解，然后在添加等量的甲醇混合。
性能分析1
(1)将实施例1和对比例1-2提供的美罗培南母液在-20℃下放置3个月，然后按照实施例1提供的方法制备浓度级别为L8的美罗培南标准中间液(设计浓度为20μg/mL)，检测标准中间液的浓度，结果见表3：
表3
| 样品 | 溶剂 | L8点峰面积 | L8浓度(μg/mL) |
| 实施例1 | 甲醇:水＝1:1 | 2184220 | 20.05 |
| 对比例1 | 甲醇 | 280077 | 2.62 |
| 对比例2 | 甲醇:(甲醇:水＝1:1)＝1:1 | 1022248 | 9.56 |
由表3可知，若利用本公开限定的溶剂制备美罗培南的母液以及后续的中间液，能够保证美罗培南的稳定性，在-20℃下放置3个月后，其准确度仅下降0.0025倍，基本保持稳定，而不采用本公开限定的溶剂，则美罗培南的稳定性大幅度下降。
(2)制备与实施例1浓度类似的头孢他啶的母液，同时制备比实施例1浓度高的头孢他啶的母液，在-20℃下放置3个月，然后按照实施例1提供的方法制备浓度级别为L8的头孢他啶标准中间液(设计浓度为100μg/mL)，检测标准中间液的浓度，结果见表4：
表4
由表4可知，采用本公开提供的方法能够保证母液和标准中间液等溶液的稳定性，进而在节省时间的前提下保证检测结果的准确性。对比例2提供的溶解方法会导致头孢他啶在-20℃放置2个月之后再拿出来使用，出现析出现象，无法再次溶解，超声也无法再次溶解，母液浓度下降约5倍，并且，在溶剂为甲醇:(甲醇:水＝1:1)＝1:1条件下，母液浓度越高，稳定性越差。
对比例3-5
本对比例提供了一种标准母液的制备方法。
与实施例1的区别在于，在本对比例中制备头孢哌酮和伊曲康唑的母液时，使用的溶剂均为甲醇(对比例3)、40％二氯甲烷的甲醇溶液(对比例4)、90％二氯甲烷的甲醇溶液(对比例5)。
性能分析2
将实施例1和对比例3-5提供的头孢哌酮和伊曲康唑母液在-20℃下储存，反复使用5次，然后按照实施例1提供的方法制备浓度级别为L8的头孢哌酮和伊曲康唑标准工作液液(设计浓度分别为100μg/mL和20μg/mL)，检测标准工作液的浓度，结果见表5：
表5
由表5可知，利用本公开限定的溶剂制备头孢哌酮和伊曲康唑的母液以及后续的中间液，能够保证二者的稳定性，在-20℃下存储并反复使用后基本稳定，而对比例3-5提供的溶剂会导致在配置、放置及使用过程中或出现无法完全溶解，或者浓度变大的现象，即溶液稳定性大幅度降低。
对比例6-10
本对比例提供了一种标准母液的制备方法。
与实施例1的区别在于，在本对比例中制备泊沙康唑的母液时，使用的溶剂均为甲醇(对比例6)、乙腈(对比例7)、60％甲醇水溶液(对比例8)、60％乙腈水溶液(对比例9)、0.5％甲酸,50％甲醇水溶液(对比例10)。
性能分析3
将实施例1和对比例6-10提供的泊沙康唑母液在-20℃下储存，反复使用10次，然后按照实施例1提供的方法制备浓度级别为L8的泊沙康唑标准工作液液(设计浓度为20μg/mL)，检测标准工作液的浓度，结果见表6：
表6
由表6可知，采用本公开限定的溶剂制备泊沙康唑母液，能够保证在存储和反复使用过程中的浓度稳定性。若在溶剂中不添加适量的酸或者有机溶剂(甲醇/乙腈)的含量不在本公开的限定范围内，则均无法使泊沙康唑完全溶解。
对比例11-12
本对比例提供了一种标准母液的制备方法。
与实施例1的区别在于，在本对比例中，使用的稀释剂为甲醇或乙腈:水＜3:7的稀释剂(对比例11)、甲醇或乙腈:水＞1:1的稀释剂(对比例12)。
实验发现，若使用的稀释剂中的水含量过高，则标曲工作液置于-20℃冰箱反复冻融5次之后，9种物质浓度出现不同程度下降；若水的含量过低，则美罗培南、头孢他啶以及两个物质的内标-20℃放置3个月，出现不同程度下降，下降程度＞30％。
实施例2
本实施例提供了一种内标工作液的制备方法。
(1)配制内标母液
头孢他啶-D5标准品规格为1mg，加入2mL甲醇:水＝1:1进行溶解，纯度为90.1％，得到浓度为451μg/mL的母液；
美罗培南-D6标准品规格为1mg，加入2mL甲醇:水＝1:1进行溶解，纯度为100％，得到浓度为500μg/mL的母液；
头孢哌酮-D5标准品规格为1.047mg，先加入500μL甲醇，再加入500μL二氯甲烷进行溶解，纯度为90.1％，得到浓度为953μg/mL的母液；
利奈唑胺-D3标准品规格为1mg，加入2mL甲醇进行溶解，纯度为98.9％，得到浓度为495μg/mL的母液；
哌拉西林-D5标准品规格为1mg，加入2mL甲醇进行溶解，纯度为92.1％，得到浓度为461μg/mL的母液；
氟康唑-D4标准品规格为1mg，加入2mL甲醇进行溶解，纯度为98.5％，得到浓度为493μg/mL的母液；
伏立康唑-D3标准品规格为5mg，加入10mL甲醇:水＝1:1进行溶解，纯度为100％，得到浓度为500μg/mL的母液；
泊沙康唑-D4标准品规格为0.5mg，先加入2mL甲醇，再加入10μL甲酸进行溶解，纯度为97.6％，得到浓度为243μg/mL的母液；
伊曲康唑-D5规格为1mg，先加入1mL甲醇，再加入1mL二氯甲烷进行溶解，纯度为99.6％，得到浓度为498μg/mL的母液。
(2)利用甲醇:水＝1:1的稀释液配制内标中间液，内标中间液稀释得到内标工作液，具体见表7：
表7
| 抗生素 | 内标中间液浓度(μg/mL) | 内标工作液浓度(ng/mL) |
| 头孢他啶-D5 | 200 | 20000 |
| 美罗培南-D6 | 20 | 4000 |
| 头孢哌酮-D5 | 500 | 10000 |
| 利奈唑胺-D3 | 20 | 500 |
| 氟康唑-D4 | 20 | 1000 |
| 哌拉西林-D5 | 100 | 10000 |
| 伏立康唑-D3 | 20 | 4000 |
| 泊沙康唑-D4 | 20 | 1000 |
| 伊曲康唑-D5 | 20 | 2000 |
对比例13
本对比例提供了一种内标工作液的制备方法。
与实施例2的区别仅在于，在本对比例中，美罗培南-D6和头孢他啶-D5的内标母液使用的溶剂均为甲醇。
性能分析4
对实施例2和对比例13提供的内标母液在-20℃下放置一段时间，结果如下：
头孢他啶-D5在-20℃放置6个月之后，浓度下降了10倍，美罗培南-D6在-20℃放置6个月之后，已基本检测不出。
由此可知，采用本公开提供的制备内标母液的方法能够保证内标母液的稳定性，进而保证后续检测的准确性。
综上，由实施例1-2和对比例1-13的测试可知，本公开提供的制备标准工作液和内标工作液的方法能够尽可能的确保9种抗生素和其内标的稳定性，进而保证标曲的确定以及后续待测样品检测结果的准确性。
实施例3
本实施例提供了一种样本处理方法以及检测方法。
(1)配制标准溶液
首先用移液器分别移取10μL标准工作液、10μL内标工作液置于1.5mL离心管中混合制成标准溶液，加入90μL生理盐水，加入400μL乙腈到上述各离心管中，将上述标准溶液分别在转速为1000-2000rpm下涡旋混匀30s-1min后，取100μL上清液，再加入100μL水混合，得到标准溶液，参照上述方法，依次配制得到8种不同浓度的标准溶液。
(2)待测样本的前处理方法
用移液枪移取100μL支气管肺泡灌洗液待测样品，加入10μL内标工作液，加入400μL乙腈，2000r/min混匀5min，14000r/min离心10min，取上清100μL，加水100μL，2000r/min混匀1min，取上清150μL进样分析，进样量为4μL。
(3)标准溶液和待测样品的检测
使用高效液相色谱质谱联用仪对标准溶液进行检测，分别建立9种抗生素的标准曲线；
在建立标准曲线时，以目标物的峰面积和其对应内标峰面积的比值为Y，以目标物的浓度和其对应内标浓度的比值为X；
使用高效液相色谱质谱联用仪对待测样品进行检测，并利用建立的标准曲线确定待测样本中9种抗生素的浓度。
检测参数为：
A、检测仪器为安捷伦1260/6470A
所使用的分析色谱柱流动相为：A相：水(0.2％甲酸+5mM甲酸铵)，B相：乙腈，分析色谱柱采用梯度洗脱方式，色谱条件参数见表8：
表8
对于质谱条件，所使用的离子源参数见表9，离子对参数见表10，其中，Dwell为25ms，Cell Accelerator Voltage值为3V；
表9
| 参数 | 设定值 | 参数 | 设定值 |
| 采集模式 | ESI(﹢),MRM | Sheath Gas Flow | 11L/min |
| Gas Temp | 300℃ | Nebulizer | 40psi |
| Gas Flow | 5L/min | Capillary(+) | 4000V |
| Sheath Gas Temp | 400℃ | Delta-EMV(+) | 200V |
表10
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图1-2分别为利用安捷伦1260/6470A检测的标准溶液和肺泡灌洗液样品中的9种抗生素的液相色谱图，由图可知，本公开提供的样品前处理方法结合液相色谱-质谱检测条件，能够准确的分离并检测9种抗生素的含量。
实施例4
本实施例提供了一种检测方法。
与实施例3的区别在于，在本实施例中，利用安捷伦1260/6470A进行检测，梯度洗脱条件见表11：
表11
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实施例5
本实施例提供了一种检测方法。
与实施例3的区别在于，在本实施例中，利用安捷伦1260/6470A进行检测，梯度洗脱条件见表12：
表12
实施例6
本实施例提供了一种检测方法。
与实施例3的区别在于，在本实施例中，利用安捷伦1260/6470A进行检测，梯度洗脱条件见表13：
表13
实施例7
本实施例提供了一种检测方法。
与实施例3的区别在于，在本实施例中，利用安捷伦1260/6470A进行检测，梯度洗脱条件见表14：
表14
图3-6为实施例4-7检测的肺泡灌洗液样本中的9种抗生素的液相色谱图，由图可知，采用本公开提供的检测条件能够成功的将9种抗生素分离，进而能够进行后续的定量分析。
对比例14
本对比例提供了一种检测方法。
与实施例3的区别在于，本对比例的液相色谱条件(安捷伦1260/6470A)见表15：
表15
图7为本对比例的液相色谱图，由图可知，利用上述洗脱条件，得到的头孢他啶和美罗培南(保留时间为1.2-1.4min左右)的液相色谱图出现明显的峰展宽的现象，峰宽为0.5，同时，美罗培南出现拖尾，均会影响检测的准确性。
对比例15
本对比例提供了一种检测方法。
与实施例3的区别在于，本对比例的液相色谱条件(安捷伦1260/6470A)见表16：
表16
图8为本对比例得到的色谱图，由图可知，利用上述洗脱条件，得到的头孢哌酮的峰展宽，峰宽有0.5，同时，伏立康唑的峰出现拖尾，均会影响检测的准确性。
性能分析3
对本公开提供的分析方法进行线性、回收率和精密度等分析，方法如下：
(1)定量限和检出限
10μL标准工作液(混合标准溶液L1点)，加入不同体积空白肺泡灌洗液混匀制备不同浓度样本，10μL内标工作液加100μL上述样本，按实施例3提供的样本前处理条件和安捷伦1260/6470A仪器的测定条件，对样本进行测定，通过标准曲线确定9种抗生素的检测限、定量限见表17：
表17
| 目标抗生素 | 定量限(ng/mL) | 检出限(ng/mL) |
| 头孢他啶 | 10.52 | 3.51 |
| 美罗培南 | 5.21 | 1.74 |
| 头孢哌酮 | 4.36 | 1.45 |
| 利奈唑胺 | 3.85 | 1.28 |
| 氟康唑 | 8.45 | 2.82 |
| 哌拉西林 | 16.42 | 5.47 |
| 伏立康唑 | 8.45 | 2.82 |
| 泊沙康唑 | 6.13 | 2.04 |
| 伊曲康唑 | 5.39 | 1.80 |
由表17可知，本公开提供的检测方法的检出限和定量限均较低。
(2)线性分析
将上述配制的10μL的各个浓度的头孢哌酮、头孢他啶、美罗培南、利奈唑胺、伏立康唑、氟康唑、哌拉西林、泊沙康唑、伊曲康唑混合标准工作液，分别加入10μL内标工作液，分别置于1.5mL离心管中混合制成八种不同浓度的标准溶液，加入90μL生理盐水，加入400μL乙腈，将上述标准溶液分别在转速为1000-2000rpm下涡旋混匀30s-1min后，取100μL上清液，加入100μL水，进样4μL至LC-MS/MS分析(实施例3提供的安捷伦1260/6470A仪器的测定条件)，各物质线性范围见表18：
表18
由表18可知，本公开提供的分析方法的检测范围广，且线性相关性好。
(3)回收率和精密度
分别取头孢哌酮、头孢他啶、美罗培南、利奈唑胺、伏立康唑、氟康唑、哌拉西林、泊沙康唑、伊曲康唑标准工作液配制成低、中、高3种浓度进行加样回收率实验和精密度实验，按本公开提供的分析方法(实施例3)进行测定，重复分析测定5批次，头孢哌酮、头孢他啶、美罗培南、利奈唑胺、伏立康唑、氟康唑、哌拉西林、泊沙康唑、伊曲康唑回收率和精密度分别如表19所示：
表19：安捷伦1260/6470
由表19可知，本公开提供的分析方法重现性良好，加样回收率高，提高了检测结果的准确度。
需要说明的是，在本文中，诸如“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上所述仅是本公开的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本公开。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本公开的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本公开将不会被限制于本文所述的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (8)
1.一种同时检测肺泡灌洗液中9种抗生素的LC-MS/MS分析方法，其特征在于，所述方法包括：
（1）利用标准溶液分别建立9种抗生素的标准曲线；
其中，所述9种抗生素包括头孢哌酮、头孢他啶、美罗培南、利奈唑胺、伏立康唑、氟康唑、哌拉西林、泊沙康唑和伊曲康唑；
所述标准溶液的制备方法包括：
将内标工作液与含有9种抗生素的标准工作液混合后，与蛋白沉淀剂混合，取上清液并利用超纯水稀释，得到所述标准溶液，所述标准工作液包括8个级别浓度；
各所述级别浓度的标准工作液均利用稀释剂由中间液稀释得到，所述中间液利用稀释剂由母液稀释得到，所述母液利用溶剂溶解所述9种抗生素各自的标准品得到；
在制备所述母液时：
所述美罗培南标准品和头孢他啶标准品使用的溶剂各自独立地选自浓度为30-50%的甲醇水溶液；
所述头孢哌酮和伊曲康唑标准品使用的溶剂独立地选自浓度为50-80%二氯甲烷的甲醇溶液；
所述泊沙康唑标准品使用的溶剂选自浓度为60-100%的甲醇水溶液，所述甲醇水溶液中还含有0.4-1%的甲酸；
所述利奈唑胺、氟康唑、哌拉西林、伏立康唑标准品使用的溶剂各自独立地选自浓度为70-90%的甲醇水溶液；
所述稀释剂为甲醇水溶液，所述甲醇和水的体积比为3:7~5:5；
所述9种抗生素使用的内标物包括头孢哌酮-D5、头孢他啶-D5、美罗培南-D6、利奈唑胺-D3、伏立康唑-D3、氟康唑-D4、哌拉西林-D5、泊沙康唑-D4和伊曲康唑-D5；
在制备内标母液时：
所述美罗培南-D6和头孢他啶-D5标准品使用的溶剂各自独立地选自浓度为30-50%的甲醇水溶液；
所述头孢哌酮-D5和伊曲康唑-D5标准品使用的溶剂独立地选自浓度为50-80%二氯甲烷的甲醇溶液；
所述泊沙康唑-D4标准品使用的溶剂选自浓度为60-100%的甲醇水溶液，所述甲醇水溶液中还含有0.4-1%的甲酸；
所述利奈唑胺-D3、伏立康唑-D3、氟康唑-D4、哌拉西林-D5标准品使用的溶剂各自独立地选自浓度为70-90%的甲醇水溶液；
（2）将肺泡灌洗液样品进行样品前处理，得到待测样品；
所述前处理的方法包括：
将肺泡灌洗液样品、内标工作液和蛋白沉淀剂混合，离心取上清液后加入超纯水进行稀释，得到所述待测样品，所述蛋白沉淀剂选自乙腈；
（3）利用LC-MS/MS对待测样品进行检测，并利用步骤（1）确定的标准曲线确定待测样品中9种抗生素的含量；在所述LC-MS/MS分析方法中，液相色谱参数包括：
使用的流动相：A为含有0.1-0.2 v/v%甲酸和1-5 mM甲酸铵或乙酸铵的水溶液，B为含有0-0.2 v/v%甲酸的乙腈；
色谱柱为：phenomenex Luna Omega Polar C18、phenomenexKinetex Polar C18或Shim-packVelox SP-C18；
梯度洗脱参数包括：
0.00 min：A 95-100%，B 0-5%；
0.10-1.50 min：A 30-60%，B 40-70%；
1.51-3.00 min：A 0-10%，B 100-90%；
3.01-5.50 min：A 95-100%，B 0-5%；
质谱检测仪的检测模式为ESI+检测模式，质谱参数包括：
干燥气温度：250-350℃；干燥气流速：3-15 L/min；鞘气温度：300-400℃；鞘气流速：8-11 L/min；喷雾器：40-50 psi；毛细管电压3000-4500V。
2.根据权利要求1所述的LC-MS/MS分析方法，其特征在于，所述肺泡灌洗液样品与蛋白沉淀剂的体积比为1:(4-6)。
3.根据权利要求1所述的LC-MS/MS分析方法，其特征在于，所述肺泡灌洗液样品与内标工作液的体积比为(10-20):1。
4.根据权利要求1所述的LC-MS/MS分析方法，其特征在于，所述上清液与超纯水的体积比为1:(1-4)。
5.根据权利要求1所述的LC-MS/MS分析方法，其特征在于，在所述LC-MS/MS分析方法中，液相色谱参数包括：
流速：0.2-0.5 mL/min。
6.根据权利要求1所述的LC-MS/MS分析方法，其特征在于，在所述液相色谱参数中，还包括：
洗针液为含有0.1-0.5 v/v%甲酸的乙腈；
进样量为1-10 μL。
7.根据权利要求1所述的LC-MS/MS分析方法，其特征在于，所述梯度洗脱参数包括：
0.00 min：A 95-100%，B 0-5%；
0.10-1.50 min：A 30-45%，B 55-70%；
1.51-3.00 min：A 0-10%，B 90-100%；
3.01-5.50 min：A 95-100%，B 0-5%。
8.根据权利要求1所述的LC-MS/MS分析方法，其特征在于，所述内标工作液利用稀释剂由内标中间液稀释得到，所述内标中间液利用稀释剂由内标母液稀释得到。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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