CN111537649A - 一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗菌药物的试剂盒 - Google Patents

一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗菌药物的试剂盒 Download PDF

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Abstract

一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗菌药物的试剂盒，所述的抗菌药物包括：舒巴坦(SBT)、亚胺培南(IPN)、利奈唑胺(LNZ)、美洛培南(MPN)、莫西沙星(MXC)、哌拉西林(Pipracil，PRC)、替加环素(TGC)、头孢哌酮(CFZ)、万古霉素(VCM)、替考拉宁(TCL)；所述试剂盒包括如下试剂：洗脱液A、洗脱液B、混合标准品储备液、混合内标溶液、蛋白质沉淀剂和质控品；采用本发明的试剂盒检测血清中抗菌药物时，前处理过程简单，成本低，且灵敏度高、特异性强，5min之内完成10种抗菌药物的分离和检测，准确度与精密度基本满足要求，可用于临床上抗菌药物的定量分析，为临床上抗菌药物的治疗浓度监测提供一种可靠的检测方法。

Description

一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗菌药物的试 剂盒
技术领域
本发明属于分析检测技术领域，更具体的是涉及一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗菌药物的试剂盒。
背景技术
细菌感染是致病性和死亡率的一个重要来源，使用抗生素治疗成为住院病人管理的一个重要方面，特别是在重症监护病房(ICU)。然而，目前已经证明基于标准给药方案的抗生素治疗的病人，其血药浓度往往不能达到有效治疗浓度，这大大影响了治疗效果，并可能使病人产生多种细菌的耐药性。因为不同的病人药物代谢动力学存在个体间的差异，简单的增加药物剂量可能会引起危险的毒副作用。因此需要进行严格的的体内药物浓度监测，特别是针对治疗浓度狭窄的药物。
舒巴坦(SBT)是一种β-内酰胺酶抑制剂，对革兰阳性及阴性菌(除铜绿假单胞菌外)所产生的β-内酰胺酶均有抑制作用。头孢哌酮(CFZ)是三代头孢菌素，抗菌谱较广，对革兰阴性杆菌尤为有效。舒巴坦、头孢哌酮两者结合具有协同抗菌活性。头孢哌酮/舒巴坦作为为数不多对广泛耐药的鲍曼不动杆菌耐药率较低的抗生素之一，在ICU等重症感染患者中应用广泛。
哌拉西林(PRC)为广谱、半合成酰脲类青霉素，具有抗菌谱广、抗菌作用较强的特点，尤其对铜绿假单胞菌有强大的抗菌作用，目前在国内外广泛应用，并被认为是最有价值的一类青霉素。哌拉西林在临床上主要用于治疗绿脓杆菌及其他敏感的革兰氏阴性杆菌所导致的肺炎、败血症、呼吸道、胆道和泌尿系统感染、亚急性心内膜炎及化脓性脑膜炎等疾病。
替加环素(TGC)是近年开发上市的一类新甘氨酰四环素类抗生素，通过阻止氨基酸tRNA进入核糖体A位，从而抑制细菌蛋白质的合成起到杀菌作用。替加环素具有广谱抗菌活性，对其敏感的细菌有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、耐万古霉素肠球菌、耐青霉素肺炎链球菌、鲍曼不动杆菌和产超广谱β-内酰胺酶的革兰阴性菌等。
亚胺培南(IPN)是一种碳青霉烯类抗生素，其作用特点是抗菌谱广、抗菌活性强以及对β-内酰胺酶高度稳定，主要用于多重耐药的革兰阴性杆菌感染、严重需氧菌与厌氧菌混合感染的治疗以及病原未查明的严重感染，是治疗重症感染的一线用药。
美洛培南(MPN)是一种人工半合成的碳青霉烯类抗生素，它具有超广谱的抗菌活性，对临床常见的需氧及厌氧菌都显示出极强的活性，由于美洛培南组织穿透力强，分布广泛，在临床上用于治疗呼吸、泌尿道、外科、妇产科、皮肤及软组织感染和细菌性脑膜炎。
利奈唑胺(LNZ)是第一个应用于临床的新型唑烷酮类抗菌药物，该药作用机制独特，与其他药物无交叉耐药性，年龄、性别对药代动力学没有明显影响，对大多数革兰阳性菌包括多重耐药的肠球菌属、葡萄球菌属和肺炎链球菌等具有很好的抗菌作用。
莫西沙星(MXC)属第四代新型氟喹诺酮类广谱抗菌药物，通过抑制细菌的DNA螺旋酶A亚单位和拓扑异构IV的活性，阻断DNA的复制，发挥杀菌作用。莫西沙星对革兰阳性菌、革兰阴性菌、厌氧菌及非典型病原体(支原体、衣原体、军团菌)均有良好的抗菌活性，具有组织渗透力强、生物利用度高、作用时间长、不良反应少等优点。莫西沙星是临床上常用的抗菌药，主要应用于慢性支气管炎的急性发作、慢性阻塞性肺疾病、社区获得性肺炎以及皮肤和软组织感染。
万古霉素(VCM)是一种糖肽类抗菌药物，杀菌活性强，罕见诱导产生耐药，对革兰阳性菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌等所致感染疗效显著，是临床上治疗严重感染的常见药物。
替考拉宁(TCL)是游动放线菌属发酵产生的一种杀菌性新型糖肽类抗生素，作用机制与万古霉素及其他糖肽类抗生素相似，是继万古霉素后用于治疗多重耐药菌感染的重要抗生素之一，临床用于治疗各种严重的革兰阳性菌感染，特别是耐甲氧西林葡萄球菌感染。适用于治疗重症葡萄球菌(特别是甲氧西林耐药性葡萄球菌)感染，如脓毒症、脓毒性心内膜炎、急性骨髓炎和慢性骨髓炎急性发作、脓毒性关节炎、嗜中性粒细胞减少患者并发感染等。
目前国内外文献报道中测定人血清或血浆中抗菌药物的方法主要有HPLC-UV法和LC-MS/MS法，但是存在灵敏度低、单个样品分析时间长、样本用量大和进样量大等缺陷，有些甚至采用外标法定量，存在基质干扰，准确性差。中国专利(CN 110361481 A和CN110361482 A)分别公开了“一种血液中万古霉素药物浓度监测试剂盒及其检测方法”和“一种血液中利奈唑胺药物浓度监测试剂盒及其检测方法”，两者发明极为相同，均使用多维在线固相萃取液相色谱分析技术测定血液中的万古霉素和利奈唑胺，方法使用的样本量为4mL，采用外标法定量，单个样本分析时间长达17min。中国药物应用与监测2013年4月第10卷第2期，题为“HPLC-MS/MS法测定血浆中莫西沙星浓度”的方法采用左氧氟沙星作为内标检测患者血浆中莫西沙星的浓度，该方法对服用过左氧氟沙星的患者就不再适用了；中国临床药理学杂志第35卷第24期，题为“LC-MS/MS法同时测定人血浆中伏立康唑和替加环素的浓度”的文章中，也采用其他药物作为内标进行定量分析，缺乏普遍适用性和准确性。而同位素内标与待测物有基本相同或一致的物理化学性质、色谱行为和响应特征，是目前最准确的定量方法。再者，临床样本极其珍贵，因此前处理样本用量尽量要少，且进样量太大也会严重污染仪器，增加仪器维护成本。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗菌药物的试剂盒。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗菌药物的试剂盒，
所述抗菌药物包括：舒巴坦(Sulbactam，SBT)、亚胺培南(Imipenem，IPN)、利奈唑胺(Linezolid，LNZ)、美洛培南(Meropenem，MPN)、莫西沙星(Moxifloxacin，MXC)、哌拉西林(Pipracil，PRC)、替加环素(Tigecycline，TGC)、头孢哌酮(Cefoperazone，CFZ)、万古霉素(Vancomycin，VCM)、替考拉宁(Teicoplanin，TCL)；
上述抗菌药物对应的同位素内标物分别为：舒巴坦-d5(SBT-d5)、亚胺培南-d3(LNZ-d3)、美洛培南-d6(MPN-d6)、莫西沙星-13CD3(MXC-13CD3)、哌拉西林-d5(PRC-d5)和替加环素-d9(TGC-d9)；
所述试剂盒包括如下试剂：
洗脱液：洗脱液A：甲酸水溶液；洗脱液B：乙腈；
混合标准品储备液：含有SBT、IPN、LNZ、MPN、MXC、PRC、TGC、CFZ、VCM和TCL的甲醇溶液；
混合内标溶液：含有SBT-d5、LNZ-d3、MPN-d6、MXC-13CD3、PRC-d5和TGC-d9的甲醇溶液；
蛋白质沉淀剂：甲醇、乙腈与异丙醇的混合溶液；
质控品：质控品：含有抗菌药物的空白血清基质溶液，分为低、中、高三个浓度，分别为QC(L)、QC(M)、QC(H)；
QC(L)为QC(M)用空白血清基质稀释至10倍；
QC(M)为上述混合标准品储备液用空白血清基质稀释至200倍；
QC(H)为上述混合标准品储备液用空白血清基质稀释至50倍。
其中，所述血清为人或动物的血清。
其中，所述的空白血清基质为无抗菌药物的空白血清。
其中，所述的洗脱液A为含0.01％～0.2％甲酸的水。
其中，所述的蛋白质沉淀剂中甲醇、乙腈与异丙醇的体积比1:1:1～3。
其中，所述的混合标准品储备液为含有为含有SBT 2000000ng/mL、LNZ200000ng/mL、MPN 200000ng/mL、MXC 200000ng/mL、PRC 200000ng/mL、TGC 80000ng/mL、VCM800000ng/mL、TCL 2000000ng/mL、IPN 800000ng/mL和CFZ 10000000ng/mL的甲醇水溶液。
其中，所述的混合内标溶液为含有SBT-d5 150000ng/mL、LNZ-d3 5000ng/mL、MPN-d6 5000ng/mL、MXC-13CD3 5000ng/mL、PRC-d5 5000ng/mL和TGC-d9 10000ng/mL的甲醇水溶液。
上述超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗菌药物的试剂盒的制备方法；
(1)洗脱液A：取甲酸溶液1.5mL，加入超纯水1.5mL，涡旋5s，混匀得到洗脱液A；
洗脱液B：乙腈；
(2)混合标准品储备液：分别将抗菌药物配制成的标准品母液，浓度分别为：SBT100mg/mL、LNZ 20mg/mL、MPN 5mg/mL、MXC 10mg/mL、PRC10mg/mL、TGC 10mg/mL、VCM 50mg/mL、TCL 50mg/mL、IPN 2mg/mL和CFZ 50mg/mL，然后分别移取SBT 20μL、LNZ 10μL、MPN 40μL、MXC 20μL、PRC 20μL、TGC 8μL、VCM 16μL、TCL 40μL、IPN 400μL、CFZ 200μL加入226μL甲醇溶液，涡旋均匀，得到1mL混合标准品储备液；
(3)混合内标溶液：将浓度均为1mg/mL的SBT-d5、LNZ-d3、MPN-d6、MXC-13CD3、PRC-d5和TGC-d9的同位素内标母液以甲醇溶液配制成包含有SBT-d5 150000ng/mL、LNZ-d35000ng/mL、MPN-d6 5000ng/mL、MXC-13CD3 5000ng/mL、PRC-d5 5000ng/mL和TGC-d910000ng/mL的混合内标溶液；蛋白质沉淀剂：将甲醇、乙腈与异丙醇按照体积比1:1:1～3混合，涡旋均匀；
(4)质控品：取上述混合标准品储备液以空白血清基质配制成三个不同浓度QC(L)、QC(M)、QC(H)，其中，QC(L)，QC(M)，QC(H)中抗菌药物质控品对应浓度见表1；
表1抗菌药物质控品对应浓度(单位：ng/mL)
Figure BDA0002515653850000061
上述试剂盒在利用超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗菌药物中的应用也在本发明的保护范围之内。
具体检测方法如下：
超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗菌药物的方法，所述抗菌药物包括：舒巴坦(SBT)、亚胺培南(IPN)、利奈唑胺(LNZ)、美洛培南(MPN)、莫西沙星(MXC)、哌拉西林(PRC)、替加环素(TGC)、头孢哌酮(CFZ)、万古霉素(VCM)、替考拉宁(TCL)；
采用超高效液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的血清中的上述抗菌药物，先利用超高效液相色谱将目标待测物与血清基质中的干扰组分进行分离，再利用质谱同位素内标定量法，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物的峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算血清中抗菌药物的含量，具体色谱条件为：
(1)色谱条件：
流动相A：含0.01％～0.2％甲酸的水；在流动相A中添加了甲酸，可有效提高某些目标化合物的离子化效率；
流动相B：乙腈；
色谱柱：ACQUITY UPLC CSH C18(2.1×50mm，1.7μm)；
采用梯度洗脱的方式，见表2；
流速为0.2～0.5mL/min，每个样品采集时间为5.0min，柱温为30～50℃，进样体积为0.2～10μL；
表2流动相梯度洗脱参数
Figure BDA0002515653850000071
(2)质谱条件：在电喷雾电离检测模式下，多反应监测的质谱扫描模式；喷雾电压为3.0kV(ESI+)及2.5kV(ESI-)；源温度：120℃；雾化气温度：400℃，雾化气流速：800L/h，锥孔气流速：150L/h；同时监测目标物对应的标准品和内标母离子、子离子、去簇电压和碰撞电压，参数见表3；
表3质谱检测参数
Figure BDA0002515653850000081
其中，所述的血清为人或动物的血清。
其中，所述的预处理的血清按照如下方法制备：取50μL血清于1.5mL离心管中，向其中加入200μL含内标的蛋白沉淀剂，高速振荡5min；14000r/min，4℃离心5min后取上清液60μL至塑料内衬管中，待进样。
其中，所述的含内标的蛋白沉淀剂按照如下方法制备：取200μL上述混合内标溶液，加入19.8mL蛋白沉淀剂(甲醇与乙腈，异丙醇的体积比1:1:2)，混合均匀得含内标的蛋白沉淀剂。
其中，采用梯度稀释法进行标曲配制，将混合标准品储备液以空白血清基质配制成七个不同浓度点的校准品溶液，配制过程如下：
取10μL混合标准品储备液加入至190μL空白血清基质中作为第一个高值浓度点(S7)；取第一高值浓度点(S7)用等体积空白血清基质稀释得第二高值浓度点(S6)；取第一高值浓度点(S7)用3倍体积空白血清基质稀释得第三高值浓度点(S5)；取第二高值浓度(S6)点用9倍体积空白血清基质稀释得第四高值浓度点(S4)；取第三高值浓度点(S5)用9倍体积空白血清基质稀释得第五高值浓度点(S3)；取第四高值浓度点(S4)用4倍体积空白血清基质稀释得第六高值浓度点(S2)；取第五高值浓度点(S3)用4倍体积空白血清基质稀释得第七高值浓度点(S1)，具体过程如下表4；
表4标准曲线配制及浓度(单位：ng/mL)
Figure BDA0002515653850000091
有益效果：采用本发明的试剂盒检测血清中抗菌药物时，前处理过程简单，成本低，且灵敏度高、特异性强，5min之内完成10种抗菌药物的分离和检测，准确度与精密度基本满足要求，可用于临床上抗菌药物的定量分析，为临床上抗菌药物的治疗浓度监测提供一种可靠的检测方法。
附图说明
图1为抗菌药物标准品提取离子流谱图；
图2为血清中抗菌药物提取离子流谱图。
具体实施方式
为了加深对本发明的理解，下面将结合实施例和附图对本发明作进一步详述，该实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。
实施例1
1.材料
(1)方法学研究实验的样本来自于武汉亚洲心脏病医院2019年7月份门诊收集的血清样本。
(2)仪器：Xevo TQ-S三重四级杆质谱仪(Waters Corporation)；UPLC I-Class超高效液相色谱系统(配自动进样器，Waters Corporation)；SCILOGEX D2012高速台式离心机(美国)；超纯水仪(ELGA LabWater，英国)；多管涡旋混合仪(Vortex genie2，美国)；可调移液器(Eppendorf 0.5～10μL，10～100μL，100～1000μL)；玻璃仪器、量筒等。
(3)试剂耗材：MS级甲醇(Fisher，美国)；MS级乙腈(Fisher，美国)；HPLC级乙腈(Honeywell，美国)；MS级甲酸(Fisher，美国)；HPLC级甲醇(Honeywell，美国)；色谱柱：ACQUITY UPLC CSH C18(2.1×50mm，1.7μm)。
(4)标准品：替考拉宁(TCL)标准品购自欧洲药典(EP)，美洛培南(MPN)标准品购自TCI，替加环素(TGC)-d9内标购自cayman公司，其余化合物和内标均购自TRC公司。
(5)含有抗菌药物的空白血清基质，分为低、中、高三个浓度，分别为QC(L)、QC(M)、QC(H)，如表1所示。
试剂盒上下四周加膜，防震保温，左上方放置流动相A和B，左下方分别放置11个安瓿瓶，分别为标准液、质控品和混合内标溶液和质控品；右边分别放置25mL蛋白沉淀剂。
2.方法
(1)色谱条件
流动相A：含0.01％～0.2％甲酸的水；在流动相A中添加了甲酸，可有效提高某些目标化合物的离子化效率；
流动相B：乙腈；
色谱柱：ACQUITY UPLC CSH C18(2.1×50mm，1.7μm)；
采用梯度洗脱的方式，见表2；
流速为0.2～0.5mL/min，每个样品采集时间为5.0min，柱温为30～50℃，进样体积为0.2～10μL；
(2)质谱条件：在电喷雾电离检测模式下，多反应监测的质谱扫描模式；喷雾电压为3.0kV(ESI+)及2.5kV(ESI-)；源温度：120℃；雾化气温度：400℃，雾化气流速：800L/h，锥孔气流速：150L/h；同时监测目标物对应的标准品和内标母离子、子离子、去簇电压和碰撞电压，参数见表3；
(3)混合标准品储备液的配制：分别准确移取一定体积的抗菌药物标准品母液，加入226μL甲醇溶液，充分混匀得到1mL混合标准品储备液，浓度参下表5；
表5混合标准品储备液的配制
Figure BDA0002515653850000111
将上述混合标准品储备液以空白血清基质溶液配制成七个不同浓度点的校准品溶液，各标曲点的浓度如表4所示。
(4)混合内标溶液的配制：分别准确移取一定体积的抗菌药物同位素内标母液，加入820μL甲醇溶液，混匀得到1mL混合内标溶液，浓度见表6。
表6混合内标溶液配制
Figure BDA0002515653850000112
Figure BDA0002515653850000121
(5)质控品配制：取上述混合标准品储备液以无抗菌药物的空白血清配制成三个不同浓度QC(L)、QC(M)、QC(H)，其中，QC(L)，QC(M)，QC(H)中抗菌药物质控品对应浓度见表1；
(6)样品处理
1)校准品前处理：每个浓度点取50μL于1.5mL离心管中，向其中加入200μL含内标的蛋白沉淀剂(甲醇、乙腈与异丙醇的体积比1:1:2)，高速振荡5min；在14000r/min，4℃下离心5min后转移上清液60μL至塑料内衬管中待进样，进样量1μL。
2)血清样品前处理：取50μL血清于1.5mL离心管中，向其中加入200μL含内标的蛋白沉淀剂(甲醇、乙腈与异丙醇的体积比1:1:2)，高速振荡5min；在14000r/min，4℃下离心5min后转移上清液60μL至塑料内衬管中待进样，进样量1μL。
3)质控品前处理：分别取质控品溶液QC(L)、QC(M)、QC(H)各50μL于1.5mL离心管中，然后与血清样品前处理一致，此处不再赘述。
分析试剂盒中各组分见表7。
表7抗菌药物分析试剂盒组分的制备(100人份)
Figure BDA0002515653850000122
Figure BDA0002515653850000131
备注：所述含内标的蛋白沉淀剂按照如下方法制备：取200μL上述混合内标溶液加入至19.8mL蛋白沉淀剂中，即得含内标的蛋白沉淀剂。
3.方法验证
1)提取离子流色谱图：抗菌药物的标准品和血清样品的峰形比较对称，且没有杂峰干扰，说明在此条件下能够得到良好的检测。
2)校准曲线：采用同位素内标定量法，利用TargetLynx软件以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，并计算出血清中待测物的浓度。抗菌药物在各自浓度范围内的线性拟合方程，线性良好，相关系数在0.998以上，满足定量要求，见表8。
表8抗菌药物线性回归方程及线性相关系数
Figure BDA0002515653850000141
3)准确度考察：采用加标回收率试验评估方法的准确性。准备一混合空白血清样品，分别加入低、中、高3个浓度的混合标准品储备液，以相同步骤重复处理并测定5次，结果显示，抗菌药物的加标回收率在87.49％-105.71％之间，5次重复试验的RSD在0.51％-6.17％范围，统计结果见表9。
表9抗菌药物加标回收率结果
Figure BDA0002515653850000142
Figure BDA0002515653850000151
4)精密度试验：取无干扰空白血清样本，加入不同浓度的混合标准品储备液，得到低、中、高三个浓度血清样本，一天内重复处理6批，连续处理三天，以同位素内标法定量测定抗菌药物的浓度，批内精密度为2.87～13.64％，三日内分3批处理，计算批间精密度为3.17～11.93％，结果见表10。
表10批内批间精密度测试结果
Figure BDA0002515653850000161
Figure BDA0002515653850000171
Figure BDA0002515653850000181
Figure BDA0002515653850000191
4.讨论
本研究建立了一种超高效液相色谱串联质谱技术(UPLC-MS/MS)，同时测定人体血清中10种抗菌药物的方法。血清用量少，仅需50μL，且前处理简单，且一针分析多种物质只需5min，简单快速。
采用同位素内标法定量不仅可以极大消除基质干扰，而且结果不受前处理过程、仪器响应波动等条件的影响，能够达到准确定量。以加标回收率试验评估方法的准确性，结果显示，抗菌药物的加标回收率为87.49％-105.71％之间，5次重复试验的RSD在0.51％-6.17％，准确度良好。
方法的重现性结果表明，抗菌药物批内精密度为2.87～13.64％，批间精密度为3.17～11.93％，方法的重现性良好。实验为了得到更加稳定且灵敏度高的目标物信号，考察了不同流动相及电解质的种类和浓度，并尽可能实现化合物和基质干扰的基线分离。且建立的血清样品前处理过程非常简单，蛋白沉淀一步到位，血清用量仅50μL。
总之，该方法灵敏度高、特异性强、准确且前处理过程简单，5min之内完成化合物的分离和检测，准确度及精密度满足要求，可用于临床上血清抗菌药物的定量分析，为相关的药物浓度监测提供一种可靠的检测方法。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗菌药物的试剂盒，其特征在于，所述的抗菌药物包括SBT、IPN、LNZ、MPN、MXC、PRC、TGC、CFZ、VCM和TCL；
所述试剂盒包括如下试剂：
洗脱液：洗脱液A：甲酸水溶液；洗脱液B：乙腈；
混合标准品储备液：含有SBT、IPN、LNZ、MPN、MXC、PRC、TGC、CFZ、VCM和TCL的甲醇溶液；
混合内标溶液：含有SBT-d5、LNZ-d3、MPN-d6、MXC-13CD3、PRC-d5和TGC-d9的甲醇溶液；
蛋白质沉淀剂：甲醇、乙腈与异丙醇的混合溶液；
质控品：质控品：含有抗菌药物的空白血清基质溶液，分为低、中、高三个浓度，分别为QC(L)、QC(M)、QC(H)；
QC(L)为QC(M)用空白血清基质稀释至10倍；
QC(M)为上述混合标准品储备液用空白血清基质稀释至200倍；
QC(H)为上述混合标准品储备液用空白血清基质稀释至50倍。
2.根据权利要求1所述的一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗菌药物的试剂盒，其特征在于，所述血清为人或动物的血清。
3.根据权利要求1所述的一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗菌药物的试剂盒，其特征在于，所述的空白血清基质为无抗菌药物的空白血清。
4.根据权利要求1所述的一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗菌药物的试剂盒，其特征在于，所述的洗脱液A为含0.01％～0.2％甲酸的水。
5.根据权利要求1所述的一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗菌药物的试剂盒，其特征在于，所述的蛋白质沉淀剂中甲醇、乙腈与异丙醇的体积比1:1:1～3。
6.根据权利要求1所述的一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗菌药物的试剂盒，其特征在于，所述的混合标准品储备液为含有SBT 2000000ng/mL、LNZ 200000ng/mL、MPN 200000ng/mL、MXC 200000ng/mL、PRC 200000ng/mL、TGC 80000ng/mL、VCM 800000ng/mL、TCL 2000000ng/mL、IPN 800000ng/mL和CFZ 10000000ng/mL的甲醇水溶液。
7.根据权利要求1所述的一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗菌药物的试剂盒，其特征在于，所述的混合内标溶液为含有SBT-d5150000ng/mL、LNZ-d35000 ng/mL、MPN-d65000 ng/mL、MXC-13CD35000 ng/mL、PRC-d55000 ng/mL和TGC-d910000ng/mL的甲醇水溶液。
8.权利要求1-7中任意一项所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，
(1)洗脱液A：取甲酸溶液1.5mL，加入超纯水1.5mL，涡旋5s，混匀得到洗脱液A；
洗脱液B：乙腈；
(2)混合标准品储备液：分别将抗菌药物配制成的标准品母液，浓度分别为：SBT100mg/mL、LNZ 20mg/mL、MPN 5mg/mL、MXC 10mg/mL、PRC 10mg/mL、TGC 10mg/mL、VCM 50mg/mL、TCL 50mg/mL、IPN 2mg/mL和CFZ 50mg/mL，然后分别移取SBT 20μL、LNZ 10μL、MPN 40μL、MXC 20μL、PRC 20μL、TGC 8μL、VCM 16μL、TCL40μL、IPN 400μL、CFZ 200μL加入226μL甲醇溶液，涡旋均匀，得到1mL混合标准品储备液；
(3)混合内标溶液：将浓度均为1mg/mL的SBT-d5、LNZ-d3、MPN-d6、MXC-13CD3、PRC-d5和TGC-d9的同位素内标母液以甲醇溶液配制成包含有SBT-d5150000ng/mL、LNZ-d35000 ng/mL、MPN-d65000 ng/mL、MXC-13CD35000ng/mL、PRC-d55000 ng/mL和TGC-d910000ng/mL的混合内标溶液；
(4)蛋白质沉淀剂：将甲醇与乙腈按照体积比1:1:1～3混合，涡旋均匀；
(5)质控品：取上述混合标准品储备液以空白血清基质配制成三个不同浓度QC(L)、QC(M)、QC(H)，其中，
QC(L)中包含：SBT 1000ng/mL、LNZ 100ng/mL、MPN 100ng/mL、MXC 100ng/mL、PRC100ng/mL、TGC 40ng/mL、VCM 400ng/mL、TCL 1000ng/mL、IPN 400ng/mL和CFZ 5000ng/mL；
QC(M)中包含：SBT 10000ng/mL、LNZ 1000ng/mL、MPN 1000ng/mL、MXC 1000ng/mL、PRC1000ng/mL、TGC 400ng/mL、VCM 4000ng/mL、TCL 10000ng/mL、IPN 4000ng/mL和CFZ50000ng/mL；
QC(H)中包含：SBT 40000ng/mL、LNZ 4000ng/mL、MPN 4000ng/mL、MXC 4000ng/mL、PRC4000ng/mL、TGC 1600ng/mL、VCM 16000ng/mL、TCL40000 ng/mL、IPN 16000ng/mL和CFZ200000ng/mL。
9.权利要求1-8中任意一项所述的试剂盒在利用超高效液相色谱串联质谱法检测血清中抗菌药物中的应用。
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Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112986459A (zh) * 2021-04-15 2021-06-18 安徽万邦医药科技股份有限公司 一种人血浆中利奈唑胺的lc-ms/ms检测方法
CN113390975A (zh) * 2021-03-04 2021-09-14 杭州凯莱谱精准医疗检测技术有限公司 一种高效液相色谱串联质谱检测血清中脂溶性维生素的样品前处理方法
CN113933418A (zh) * 2021-09-30 2022-01-14 上海中科新生命生物科技有限公司 一种同时检测人血清中7种抗生素类药物浓度的方法
CN114354804A (zh) * 2021-12-31 2022-04-15 深圳市第三人民医院(深圳市肝病研究所) 试剂盒和样本中抗结核药物及其代谢物的检测方法
CN114965759A (zh) * 2022-05-16 2022-08-30 杭州度安医学检验实验室有限公司 一种基于lc-ms/ms检测32种抗生素的试剂盒和方法
CN114994215A (zh) * 2022-08-03 2022-09-02 北京华大吉比爱生物技术有限公司 氯唑沙宗的应用、检测酶抑制剂类抗生素药物浓度的方法、试剂盒及应用
CN115267027A (zh) * 2022-08-29 2022-11-01 上海市精神卫生中心（上海市心理咨询培训中心） 一种蛋白沉淀剂及包含其的用于精神类药物检测的试剂盒和检测方法
CN115494182A (zh) * 2022-11-14 2022-12-20 北京和合医学诊断技术股份有限公司 一种液相色谱串联质谱法检测血液中18种抗生素的方法及试剂盒
CN116087350A (zh) * 2022-07-25 2023-05-09 北京和合医学诊断技术股份有限公司 一种同时检测血液中9种抗生素的lc-ms/ms分析方法

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113390975A (zh) * 2021-03-04 2021-09-14 杭州凯莱谱精准医疗检测技术有限公司 一种高效液相色谱串联质谱检测血清中脂溶性维生素的样品前处理方法
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CN114354804A (zh) * 2021-12-31 2022-04-15 深圳市第三人民医院(深圳市肝病研究所) 试剂盒和样本中抗结核药物及其代谢物的检测方法
CN114965759A (zh) * 2022-05-16 2022-08-30 杭州度安医学检验实验室有限公司 一种基于lc-ms/ms检测32种抗生素的试剂盒和方法
CN116087350A (zh) * 2022-07-25 2023-05-09 北京和合医学诊断技术股份有限公司 一种同时检测血液中9种抗生素的lc-ms/ms分析方法
CN116106435A (zh) * 2022-07-25 2023-05-12 北京和合医学诊断技术股份有限公司 一种含有9种抗生素的标准溶液的制备方法及应用
CN116087350B (zh) * 2022-07-25 2023-10-24 北京和合医学诊断技术股份有限公司 一种同时检测血液中9种抗生素的lc-ms/ms分析方法
CN116106435B (zh) * 2022-07-25 2023-10-24 北京和合医学诊断技术股份有限公司 一种含有9种抗生素的标准溶液的制备方法及应用
CN114994215A (zh) * 2022-08-03 2022-09-02 北京华大吉比爱生物技术有限公司 氯唑沙宗的应用、检测酶抑制剂类抗生素药物浓度的方法、试剂盒及应用
CN115267027A (zh) * 2022-08-29 2022-11-01 上海市精神卫生中心（上海市心理咨询培训中心） 一种蛋白沉淀剂及包含其的用于精神类药物检测的试剂盒和检测方法
CN115494182A (zh) * 2022-11-14 2022-12-20 北京和合医学诊断技术股份有限公司 一种液相色谱串联质谱法检测血液中18种抗生素的方法及试剂盒

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