CN114354804A - 试剂盒和样本中抗结核药物及其代谢物的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明具体提供一种试剂盒和样本中抗结核药物及其代谢物的检测方法。所述试剂盒用于检测样本中抗结核药物及其代谢物，包括校准品、质控品、仪器质控品以及同位素内标准品；校准品和质控品中均含有利福平、异烟肼、利福喷丁、吡嗪酰胺、乙胺丁醇、氯法齐明、环丝氨酸、莫西沙星、左氧氟沙星、利奈唑胺、乙酰异烟肼、贝达喹啉及去乙酰利福平；仪器质控品包括含有利福平、异烟肼、利福喷丁、吡嗪酰胺、乙胺丁醇、氯法齐明、环丝氨酸、莫西沙星、左氧氟沙星、利奈唑胺、乙酰异烟肼、贝达喹啉及去乙酰利福平的甲醇溶液；同位素内标准品中包含校准品中所含物质对应的内标物。本发明的试剂盒可检测多种样本类型中抗结核药物及其代谢物的浓度。
Description
技术领域
本发明属于抗结核药物检测技术领域，尤其涉及一种试剂盒和样本中抗结核药物及其代谢物的检测方法。
背景技术
结核病具有耐多药(MDR-TB)和极度耐药(XDR-TB)的特性，因此如何抑制结核病的耐药性显得十分重要，治疗药物浓度监测(TDM)有利于为临床医生对结核病患者的早期个性化治疗和优化治疗提供借鉴。现有抗结核药物浓度监测方法一般通过试剂盒进行检测，但是目前的试剂盒只能进行单一药物分析或者同时评估一线抗结核药物，同时只能检测血浆或血清中抗结核药物的浓度，可检测的样本较少，并且根据目前的试剂盒的检测结果，并不能获得患者的药物代谢状况，也不能有效分析患者同时使用多种抗结核药物时药物之间是否有相互影响。
发明内容
本发明实施例的第一个目的在于提供一种试剂盒，以解决现有抗结核药物检测只能监测抗结核药物浓度而不能监测其相应的代谢状况的问题。
本发明实施例采用的技术方案如下：
一种试剂盒，用于检测样本中抗结核药物及其代谢物；
所述试剂盒包括：
校准品，所述校准品中含有利福平、异烟肼、利福喷丁、吡嗪酰胺、乙胺丁醇、氯法齐明、环丝氨酸、莫西沙星、左氧氟沙星、利奈唑胺、乙酰异烟肼、贝达喹啉以及去乙酰利福平；
质控品，所述质控品中含有利福平、异烟肼、利福喷丁、吡嗪酰胺、乙胺丁醇、氯法齐明、环丝氨酸、莫西沙星、左氧氟沙星、利奈唑胺、乙酰异烟肼、贝达喹啉以及去乙酰利福平；
仪器质控品，所述仪器质控品包括含有利福平、异烟肼、利福喷丁、吡嗪酰胺、乙胺丁醇、氯法齐明、环丝氨酸、莫西沙星、左氧氟沙星、利奈唑胺、乙酰异烟肼、贝达喹啉以及去乙酰利福平的甲醇溶液；
以及，同位素内标准品，所述同位素内标准品中包含有利福平-内标、异烟肼-内标、利福喷丁-内标、吡嗪酰胺-内标、乙胺丁醇-内标、氯法齐明-内标、环丝氨酸-内标、莫西沙星-内标、左氧氟沙星-内标、利奈唑胺-内标、乙酰异烟肼-内标、贝达喹啉-内标以及去乙酰利福平-内标。
优选地，所述试剂盒还包括C18-PFP混合型色谱柱以及校准品稀释液。
优选地，所述试剂盒还包括流动相A和流动相B；所述流动相A包括去离子水和溶于所述去离子水中的添加剂；所述流动相B包括甲醇和乙腈的混合液以及溶于所述混合液中的添加剂。
优选地，所述添加剂包括甲酸、乙酸、三乙胺、三氟乙酸中的任一种。
优选地，所述试剂盒还包括微孔板、前处理板封膜以及上机板封膜。
优选地，所述校准品还含有普瑞玛尼、利福布丁、阿米卡星、特立齐酮、乙硫异烟胺、丙硫乙酰胺、对氨基水杨酸、帕司烟肼以及美罗培南中的至少一种；
所述质控品还含有普瑞玛尼、利福布丁、阿米卡星、特立齐酮、乙硫异烟胺、丙硫乙酰胺、对氨基水杨酸、帕司烟肼以及美罗培南中的至少一种；
所述同位素内标准品还含有普瑞玛尼-内标、利福布丁-内标、阿米卡星-内标、特立齐酮-内标、乙硫异烟胺-内标、丙硫乙酰胺-内标、对氨基水杨酸-内标、帕司烟肼-内标以及美罗培南-内标中的至少一种。
相对于现有技术而言，本发明实施例提供的试剂盒，不仅可以监测患者抗结核药物的浓度，而且还能监测抗结核药物在患者体内的代谢物以及多种抗结核药物在患者体内的相互影响关系，同时还能够通过血浆、血清、脑脊液以及尿液来实现抗结核药物的监测，能有效地提高抗结核药物监测的通量和获得患者更多的药物服用信息和药物代谢信息。
本发明实施例的第二个目的在于提供一种样本中抗结核药物及其代谢物的检测方法，其采用的具体技术方案如下：
采用上述所述的试剂盒进行检测，包括以下步骤：
采用溶剂对所述同位素内标准品进行溶解处理，以获得释放剂；
将样本溶于所述释放剂中并纯化处理，以获得上清液；
对所述上清液进行稀释处理后，在液相色谱串联质谱仪中进行上机检测，以获取所述样本中的抗结核药物以及所述抗结核药物的代谢物状况。
优选地，所述样本包括血浆、血清、脑脊液以及尿液中的任一种。
优选地，所述上机检测的检测指标包括异烟肼、利福平、利福喷丁、环丝氨酸、乙胺丁醇、左氧氟沙星、莫西沙星、吡嗪酰胺、氯法齐明、贝达喹啉、利奈唑胺中至少一种的浓度；
以及，检测乙酰异烟肼、异烟酸、25-O-去乙酰利福平、25-O-去乙酰利福喷丁、吡嗪酸、5-羟吡嗪酸和贝达喹啉M2中至少一种的浓度。
优选地，还包括检测普瑞玛尼、利福布丁、阿米卡星、特立齐酮、乙硫异烟胺、丙硫乙酰胺、对氨基水杨酸、帕司烟肼、美罗培南中至少一种的浓度；以及，检测25-O-去乙酰利福布丁的浓度；
和/或，所述纯化处理为包括对溶于所述释放剂中的所述样本进行沉淀处理、冷冻处理和离心处理。
相对于现有技术，本发明实施例提供的样本中抗结核药物及其代谢物的检测方法，具有简单快捷无需分步操作的特点，不仅能够检测血浆样本，而且还能够检测血清样本、脑脊液样本以及尿液样本，从而可以有效地扩大了抗结核药物样本检测的种类，同时本检测方法采用同位素内标进行归一化校正，有效地提高检测结果的可靠性；更重要地是，本发明的检测方法，不但可以获取抗结核药物的浓度，还能够获取抗结核药物的代谢物浓度等相关信息，从而可以为患者给药提供可靠的方案，还可以获取多种抗结核药物的相互作用关系以及代谢是否异常等信息。
附图说明
为了更清楚地说明本发明施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例一中校准曲线中11种抗结核药物及2种抗结核药物的代谢物的提取离子流色谱图谱；
图2是本发明实施例二结核病患者在服用抗结核药物后血清样本中抗结核药物及其代谢物的提取离子流色谱图谱；
图3是本发明实施例三中结核病患者在服用抗结核药物后脑脊液样本中抗结核药物及其代谢物的提取离子流色谱图谱；
图4是本发明实施例四中结核病患者在服用抗结核药物后血浆样本中抗结核药物及其代谢物的提取离子流色谱图谱；
图5是本发明实施例五中结核病患者在服用抗结核药物后尿液样本中抗结核药物及其代谢物的提取离子流色谱图谱。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明做进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本申请至少涉及两方面的发明方案，其中，第一方面的发明方案是提供一种试剂盒，用于检测样本中抗结核药物及其代谢物。
具体地，所述试剂盒包括校准品、质控品、仪器质控品以及同位素内标准品。其中，所述校准品中含有利福平(Rifampicin,RFP)、异烟肼(Isoniazid,INZ)、利福喷丁(Rifapentine,RFT)、吡嗪酰胺(Pyrazinamide,PZN)、乙胺丁醇(Ethambutol,ETB)、氯法齐明(Clofazimine,CFM)、环丝氨酸(Cycloserine,CYS)、莫西沙星、左氧氟沙星、利奈唑胺、乙酰异烟肼、贝达喹啉(Bedaquilin,BDQ)以及去乙酰利福平；所述质控品中含有利福平、异烟肼、利福喷丁、吡嗪酰胺、乙胺丁醇、氯法齐明、环丝氨酸、莫西沙星、左氧氟沙星、利奈唑胺、乙酰异烟肼、贝达喹啉以及去乙酰利福平；所述仪器质控品包括含有利福平、异烟肼、利福喷丁、吡嗪酰胺、乙胺丁醇、氯法齐明、环丝氨酸、莫西沙星、左氧氟沙星、利奈唑胺、乙酰异烟肼、贝达喹啉以及去乙酰利福平的甲醇溶液；所述同位素内标准品中包含有利福平-内标、异烟肼-内标、利福喷丁-内标、吡嗪酰胺-内标、乙胺丁醇-内标、氯法齐明-内标、环丝氨酸-内标、莫西沙星-内标、左氧氟沙星-内标、利奈唑胺-内标、乙酰异烟肼-内标、贝达喹啉-内标以及去乙酰利福平-内标。
在一些实施方式中，校准品为含有利福平、异烟肼、利福喷丁、吡嗪酰胺、乙胺丁醇、氯法齐明、环丝氨酸、莫西沙星、左氧氟沙星、利奈唑胺、乙酰异烟肼、贝达喹啉以及去乙酰利福平的空白血浆或者空白血清或者空白脑脊液或者尿液。在一些实施方式中，校准品中，利福平的含量为40～60mg/L、异烟肼的含量为10～30mg/L、利福喷丁的含量为40～60mg/L、吡嗪酰胺的含量为100～150mg/L、乙胺丁醇的含量为15～35mg/L、氯法齐明的含量为2～10mg/L、环丝氨酸的含量为40～80mg/L、莫西沙星的含量为10～25mg/L、左氧氟沙星的含量为30～70mg/L、利奈唑胺的含量为20～70mg/L、乙酰异烟肼的含量为10～30mg/L、贝达喹啉的含量为3～15mg/L、去乙酰利福平的含量为10～30mg/L。在一些实施方式中，校准品还含有普瑞玛尼、利福布丁(Rifabutin,RFB)、阿米卡星、特立齐酮、乙硫异烟胺(Ethionamide,ETN)、丙硫乙酰胺、对氨基水杨酸(4-Aminosalicylic acid,P-ASA)、帕司烟肼以及美罗培南中的至少一种。当校准品中含有利福布丁-内标时，那么还含有25-O-去乙酰利福布丁。
在一些实施方式中，质控品为含有利福平、异烟肼、利福喷丁、吡嗪酰胺、乙胺丁醇、氯法齐明、环丝氨酸、莫西沙星、左氧氟沙星、利奈唑胺、乙酰异烟肼、贝达喹啉以及去乙酰利福平的空白血浆或者空白血清或者空白脑脊液或者尿液。在一些实施方式中，质控品中，利福平的含量为5～20mg/L、异烟肼的含量为1～15mg/L、利福喷丁的含量为8～25mg/L、吡嗪酰胺的含量为15～45mg/L、乙胺丁醇的含量为1～10mg/L、氯法齐明的含量为0.5～5mg/L、环丝氨酸的含量为10～30mg/L、莫西沙星的含量为1～8mg/L、左氧氟沙星的含量为1～10mg/L、利奈唑胺的含量为5～20mg/L、乙酰异烟肼的含量为1～15mg/L、贝达喹啉的含量为0.5～5mg/L、去乙酰利福平的含量为0.5～10mg/L。在一些实施方式中，质控品还含有普瑞玛尼、利福布丁、阿米卡星、特立齐酮、乙硫异烟胺、丙硫乙酰胺、对氨基水杨酸、帕司烟肼以及美罗培南中的至少一种。当质控品中含有利福布丁-内标时，质控品中还含有25-O-去乙酰利福布丁。
在一些实施方式中，仪器质控品中，甲醇溶液为甲醇的水溶液，并且甲醇的体积含量为30％～80％。在一些实施方式中，甲醇溶液中，利福平的含量为0.5～10mg/L、异烟肼的含量为0.1～5mg/L、利福喷丁的含量为1～12mg/L、吡嗪酰胺的含量为5～15mg/L、乙胺丁醇的含量为0.1～5mg/L、氯法齐明的含量为0.1～1mg/L、环丝氨酸的含量为1～10mg/L、莫西沙星的含量为0.1～2.5mg/L、左氧氟沙星的含量为0.5～5.5mg/L、利奈唑胺的含量为1～10mg/L、乙酰异烟肼的含量为0.5～8mg/L、贝达喹啉的含量为0.1～2.5mg/L、去乙酰利福平的含量为0.1～6mg/L。
在一些实施方式中，利福平-内标、异烟肼-内标、利福喷丁-内标、吡嗪酰胺-内标、乙胺丁醇-内标、氯法齐明-内标、环丝氨酸-内标、莫西沙星-内标、左氧氟沙星-内标、利奈唑胺-内标、乙酰异烟肼-内标、贝达喹啉-内标以及去乙酰利福平-内标分别为利福平-d8、异烟肼-d4、利福喷丁-d8、吡嗪酰胺-13C2,15N2、乙胺丁醇-d4、氯法齐明-d7、环丝氨酸-d3,15N、莫西沙星-d4、左氧氟沙星-d3、利奈唑胺-d3、乙酰异烟肼-d4、贝达喹啉-d6、去乙酰利福平-d8。组成同位素内标准品中的各组分按照质量比，利福平-d8：异烟肼-d4：利福喷丁-d8：吡嗪酰胺-13C2,15N2：乙胺丁醇-d4：氯法齐明-d7：环丝氨酸-d3,15N：莫西沙星-d4：左氧氟沙星-d3：利奈唑胺-d3：乙酰异烟肼-d4：贝达喹啉-d6：去乙酰利福平-d8＝2.5～7.5:2～4:2.5～7.5:5～8:0.7～1.8:0.7～1.8:5～7.5:0.5～3:0.5～3:0.1～1.5:2～9：0.5～3:2.5～8。如在一些实施方式中，同位素内标准品含有10μg的利福平-d8、6.25μg的异烟肼-d4、10μg的利福喷丁-d8、12.5μg的吡嗪酰胺-13C2,15N2、2.5μg的乙胺丁醇-d4、2.5μg的氯法齐明-d7、12.5μg的环丝氨酸-d3,15N、4μg的莫西沙星-d4、4μg的左氧氟沙星-d3、2μg的利奈唑胺-d3、7.5μg的乙酰异烟肼-d4、2μg的贝达喹啉-d6以及10μg的去乙酰利福平-d8。在一些实施方式中，同位素内标准品还含有普瑞玛尼-内标、利福布丁-内标、阿米卡星-内标、特立齐酮-内标、乙硫异烟胺-内标、丙硫乙酰胺-内标、对氨基水杨酸-内标、帕司烟肼-内标以及美罗培南-内标中的至少一种。当同位素内标准品中含有利福布丁-内标时，同位素内标准品中还含有25-O-去乙酰利福布丁-内标。
在一些实施方式中，所述试剂盒还包括C18-PFP混合型色谱柱以及校准品稀释液。在对样本中的抗结核药物及抗结核药物的代谢物进行检测时，需要结合液相色谱串联质谱法进行测试，由于试剂盒中包括C18-PFP混合型色谱柱，而C18-PFP混合色谱柱具有与C18色谱柱、PFP色谱柱所不相同的色谱保留机理，并且分析效果具有互补性，因而可以有效解决C18色谱柱、PFP色谱柱不能兼容多种化合物同时分析的问题。
基于上述的C18-PFP混合型色谱柱，所述试剂盒还包括流动相A和流动相B；所述流动相A包括去离子水和溶于所述去离子水中的添加剂；所述流动相B包括甲醇和乙腈的混合液以及溶于所述混合液中的添加剂。在一些实施方式中，所述添加剂包括甲酸、乙酸、三乙胺、三氟乙酸中的任一种。
在一些实施方式中，所述试剂盒还包括微孔板、前处理板封膜以及上机板封膜。优选地，微孔板为96孔板，以96孔板作为试剂盒的组分，可以有效提高检测通量，并且便于自动化检测。
在上述试剂盒的基础上，本申请第二方面的发明方案是提供一种样本中抗结核药物及其代谢物的检测方法。
样本中抗结核药物及其代谢物的检测方法以第一方面的所述的试剂盒进行检测。
具体地，检测方法包括以下步骤：
(1)采用溶剂对所述同位素内标准品进行溶解处理，以获得释放剂；
在步骤(1)中，具体是向同位素内标准品中加入甲醇或者乙腈或者异丙醇或者去离子水等溶剂中，使得同位素内标准品溶解，由此得到释放剂。
(2)将样本溶于所述释放剂中并纯化处理，以获得上清液；
在步骤(2)中，样本可以是采样得到的血浆、血清、脑脊液或尿液中的任一种。对样本进行纯化处理时，具体是先将样本、质控品、校准品分别加入96孔板中，随后加入步骤(1)得到的释放剂；接着采用前处理板封膜进行封膜处理；随后将经过封膜处理的96孔板转移至振荡仪中进行旋涡振荡处理；再将经过旋涡振荡处理得到的样本转移至--30℃～-15℃℃的环境中静置10min～360min；最后在2℃～12℃的条件下对静置处理的样本进行离心处理，离心时间为10min～30min，离心转速为2000rpm～4000rpm，离心后取上清液。经过冷冻处理再进行离心处理，可以有效去除样本中脂类、蛋白质等物质，减少脂类、蛋白质等物质对检测的干扰，使得不同样本类型之间的基质效应降低，并且同位素内标准品对不同基质间的差异表现出更好的校正效果，此外，使得样本在不需要添加同位素内标准品时回收率也能达到要求。
(3)对所述上清液进行稀释处理后，在液相色谱串联质谱仪中进行上机检测，以获取所述样本中的抗结核药物以及所述抗结核药物的代谢物状况。
在步骤(3)中，向步骤(2)得到的上清液加入超纯水，上清液与超纯水按照1:1～1:10的质量进行混匀，从而实现对上清液的稀释处理，接着使用上机板封膜进行封膜处理。在上机检测时，液相色谱串联质谱仪的色谱柱为C18-PFP混合型色谱柱，由于流动相B中同时含有甲醇和乙腈，从而可以兼顾更多的物质的分离和分析。
通过上机检测，可以获得包括异烟肼、利福平、利福喷丁、环丝氨酸、乙胺丁醇、左氧氟沙星、莫西沙星、吡嗪酰胺、氯法齐明、贝达喹啉、利奈唑胺中至少一种的浓度；同时当样本中含有异烟肼时，还能检测异烟肼的代谢物乙酰异烟肼、异烟酸的浓度；当样本中含有利福平时，还能检测利福平的代谢物25-O-去乙酰利福平的浓度；当样本中含有利福喷丁时，还能检测利福喷丁的代谢物25-O去乙酰利福喷丁的浓度；当样本中含有吡嗪酰胺时，还能检测吡嗪酰胺的代谢物吡嗪酸、5-羟吡嗪酸的浓度；当样本中含有贝达喹啉时，还能检测贝达喹啉的代谢物贝达喹啉M2的浓度。因此，本发明实施例提供的检测方法，不但能够检测包括血浆、血清、脑脊液以及尿液中抗结核药物及抗结核药物的代谢物，而且还能够根据检测结果，判断药物动力学(PK)、药物对机体产生的治疗作用和不良反应(PD)，并根据PK/PD参数准确反应抗结核药物对患者的作用过程，并据此制定有针对性的给药方案，从而提高结核病治疗效果，预防耐药性的产生；更重要的是，可以根据检测的结果，获取代谢物与原型药物比例的信息，以及获取患者同时服用多种抗结核药物时是否有相互作用以及是否有代谢异常等信息。
为更好的说明本申请的技术方案，下面通过多个实施例做进一步的解释说明。
实施例一
一种血浆样本中抗结核药物及抗结核药物的检测方法，包括以下步骤：
S10、试剂盒情况
试剂盒组分：校准品，1支，200μL/支；质控品，1支，200μL/支；仪器质控品，1支，200μL/支；同位素内标准品，1支，干粉/支；流动相添加剂，1支，2mL/支；校准品稀释液，1支，1mL/支；96孔微孔板，2块；前处理板封膜，1张；上机板封膜，1张；操作说明书，1本；
其中，校准品为无抗结核药物的空白血浆，并且校准品中含有51.2mg/L的利福平、19.2mg/L的异烟肼、51.2mg/L的利福喷丁、128mg/L的吡嗪酰胺、25.6mg/L的乙胺丁醇、6.4mg/L的氯法齐明、64mg/L的环丝氨酸、16.6mg/L的莫西沙星、41.7mg/L的左氧氟沙星、50mg/L的利奈唑胺、19.2mg/L的乙酰异烟肼、8.3mg/L的贝达喹啉以及20.4mg/L的去乙酰利福平；
质控品为无抗结核药物的空白血浆，并且质控品中含有11mg/L的利福平、6.88mg/L的异烟肼、13.75mg/L的利福喷丁、34.83mg/L的吡嗪酰胺、5.5mg/L的乙胺丁醇、1.15mg/L的氯法齐明、19.25mg/L的环丝氨酸、2.5mg/L的莫西沙星、6mg/L的左氧氟沙星、12.32mg/L的利奈唑胺、6.88mg/L的乙酰异烟肼、1.47mg/L的贝达喹啉以及4.4mg/L的去乙酰利福平；
仪器质控品为质量分数为50％甲醇水溶液，并且甲醇水溶液中含有2.75mg/L的利福平、1.72mg/L的异烟肼、3.44mg/L的利福喷丁、8.71mg/L的吡嗪酰胺、1.38mg/L的乙胺丁醇、0.29mg/L的氯法齐明、4.81mg/L的环丝氨酸、0.63mg/L的莫西沙星、1.5mg/L的左氧氟沙星、3.08mg/L的利奈唑胺、1.72mg/L的乙酰异烟肼、0.37mg/L的贝达喹啉以及1.10mg/L的去乙酰利福平；
同位素内标准品中含有含10μg的利福平-d8、6.25μg的异烟肼-d4、10μg的利福喷丁-d8、12.5μg的吡嗪酰胺-13C2,15N2、2.5μg的乙胺丁醇-d4、2.5μg的氯法齐明-d7、12.5μg的环丝氨酸-d3,15N、4μg的莫西沙星-d4、4μg的左氧氟沙星-d3、2μg的利奈唑胺-d3、7.5μg的乙酰异烟肼-d4、2μg的贝达喹啉-d6以及10μg的去乙酰利福平-d8；
流动相添加剂为甲酸。
S11、释放剂配置
向同位素内标准品中加入0.5mL的甲醇复溶，然后将同位素内标准品与甲醇(V/V)混合后配制成释放剂。
S12、样本提取
每个血浆样本、质控品、校准品分别取50μL加入对应的96孔微孔板内。随后分别加入150μL步骤S11的释放剂。用前处理板封膜进行封膜处理，然后放置于振荡仪上，涡旋振荡5min；并于-20℃的环境中放置20min；随后在8℃的条件下离心20min，获取上清液。
S13、稀释上机
将步骤S12的上清液取出50μL，加入50μL超纯水，上机板封膜进行封膜处理。
S14、上机检测
配制流动相A和流动相B，其中流动相A由1000mL的去离子水和1mL的流动相添加剂组成；流动相B由500mL的甲醇、500mL的乙腈、1mL的流动相添加剂组成；
以C18-PFP混合型色谱柱作为色谱柱，从仪器质控品瓶内取80μL，直接上机来检测系统的适配性；根据仪器设定程序自动得到各个分析物的浓度，结果如图1所示。重复检测，得到质控品中抗结核药物的％CV，结果如表1所示。
表1质控品中各抗结核药物的％CV状况
| 分析物 | 批次1(n＝6) | 批次2(n＝6) | 批次3(n＝6) | 批间(n＝18) |
| 异烟肼 | 8.53％ | 3.79％ | 8.61％ | 8.23％ |
| 利福平 | 8.22％ | 7.28％ | 7.37％ | 7.11％ |
| 利福喷丁 | 7.97％ | 5.96％ | 4.47％ | 9.66％ |
| 环丝氨酸 | 4.73％ | 5.88％ | 10.11％ | 9.32％ |
| 乙胺丁醇 | 4.35％ | 2.28％ | 4.43％ | 5.83％ |
| 左氧氟沙星 | 8.00％ | 2.81％ | 3.91％ | 7.19％ |
| 莫西沙星 | 13.77％ | 6.24％ | 4.53％ | 12.63％ |
| 吡嗪酰胺 | 2.57％ | 4.93％ | 7.78％ | 6.15％ |
| 氯法齐明 | 4.33％ | 3.47％ | 2.37％ | 4.94％ |
| 贝达喹啉 | 5.21％ | 4.18％ | 6.22％ | 5.12％ |
| 乙酰异烟肼 | 2.57％ | 3.93％ | 7.77％ | 5.18％ |
| 去乙酰利福平 | 9.00％ | 7.10％ | 9.36％ | 8.81％ |
| 利奈唑胺 | 7.65％ | 6.39％ | 5.52％ | 7.88％ |
注：表1中n表示重复次数。
从表1可以看出，各分析物的％CV均小于15％，表示方法稳定，数据采集可靠，说明本实施例中的质控品可用于评估方法的稳定性。
从图1的校准曲线提取离子流色谱图谱可以看出，能够对11种抗结核药物和两种抗结核药物的代谢物进行检测。
实施例二
结核病患者血清样本中抗结核药物及抗结核药物的检测方法，包括以下步骤：
S20、试剂盒情况
试剂盒组分：校准品，1支，200μL/支；质控品，1支，200μL/支；仪器质控品，1支，200μL/支；同位素内标准品，1支，干粉/支；流动相添加剂，1支，2mL/支；校准品稀释液，1支，1mL/支；96孔微孔板，2块；前处理板封膜，1张；上机板封膜，1张；操作说明书，1本；
其中，校准品为无抗结核药物的空白血清，并且校准品中含有51.2mg/L的利福平、19.2mg/L的异烟肼、51.2mg/L的利福喷丁、128mg/L的吡嗪酰胺、25.6mg/L的乙胺丁醇、6.4mg/L的氯法齐明、64mg/L的环丝氨酸、16.6mg/L的莫西沙星、41.7mg/L的左氧氟沙星、50mg/L的利奈唑胺、19.2mg/L的乙酰异烟肼、8.3mg/L的贝达喹啉以及20.4mg/L的去乙酰利福平；
质控品为无抗结核药物的空白血清，并且质控品中含有11mg/L的利福平、6.88mg/L的异烟肼、13.75mg/L的利福喷丁、34.83mg/L的吡嗪酰胺、5.5mg/L的乙胺丁醇、1.15mg/L的氯法齐明、19.25mg/L的环丝氨酸、2.5mg/L的莫西沙星、6mg/L的左氧氟沙星、12.32mg/L的利奈唑胺、6.88mg/L的乙酰异烟肼、1.47mg/L的贝达喹啉以及4.4mg/L的去乙酰利福平；
仪器质控品为质量分数为50％甲醇水溶液，并且甲醇水溶液中含有2.75mg/L的利福平、1.72mg/L的异烟肼、3.44mg/L的利福喷丁、8.71mg/L的吡嗪酰胺、1.38mg/L的乙胺丁醇、0.29mg/L的氯法齐明、4.81mg/L的环丝氨酸、0.63mg/L的莫西沙星、1.5mg/L的左氧氟沙星、3.08mg/L的利奈唑胺、1.72mg/L的乙酰异烟肼、0.37mg/L的贝达喹啉以及1.10mg/L的去乙酰利福平；
同位素内标准品中含有含10μg的利福平-d8、6.25μg的异烟肼-d4、10μg的利福喷丁-d8、12.5μg的吡嗪酰胺-13C2,15N2、2.5μg的乙胺丁醇-d4、2.5μg的氯法齐明-d7、12.5μg的环丝氨酸-d3,15N、4μg的莫西沙星-d4、4μg的左氧氟沙星-d3、2μg的利奈唑胺-d3、7.5μg的乙酰异烟肼-d4、2μg的贝达喹啉-d6以及10μg的去乙酰利福平-d8；
流动相添加剂为甲酸。
S21、释放剂配置
向同位素内标准品中加入0.5mL的甲醇复溶，然后将同位素内标准品与甲醇(V/V)混合后配制成释放剂。
S22、样本提取
每个血清样本、质控品、校准品分别取50μL加入对应的96孔微孔板内。随后分别加入150μL步骤S21的释放剂。用前处理板封膜进行封膜处理，然后放置于振荡仪上，涡旋振荡5min；并于-20℃的环境中放置20min；随后在8℃的条件下离心20min，获取上清液。
S23、稀释上机
将步骤S22的上清液取出50μL，加入50μL超纯水，上机板封膜进行封膜处理。
S24、上机检测
配制流动相A和流动相B，其中流动相A由1000mL的去离子水和1mL的流动相添加剂组成；流动相B由500mL的甲醇、500mL的乙腈、1mL的流动相添加剂组成；
以C18-PFP混合型色谱柱作为色谱柱，从仪器质控品瓶内取80μL，直接上机检测系统的适配性；根据仪器设定程序自动得到各个分析物的浓度，结果如图2所示。
从图2可以看出，可以通过检测结核病患者的血清以获得患者服用抗结核药物后的抗结核药物及其代谢物的状态，从而分析代谢物与原型药物比例的信息以及分析患者同时服用多种抗结核药物后各抗结核药物的相互作用以及是否有代谢异常等信息。
实施例三
结核病患者脑脊液样本中抗结核药物及抗结核药物的检测方法，包括以下步骤：
S30、试剂盒情况
试剂盒组分：校准品，1支，200μL/支；质控品，1支，200μL/支；仪器质控品，1支，200μL/支；同位素内标准品，1支，干粉/支；流动相添加剂，1支，2mL/支；校准品稀释液，1支，1mL/支；96孔微孔板，2块；前处理板封膜，1张；上机板封膜，1张；操作说明书，1本；
其中，校准品为无抗结核药物的空白脑脊液，并且校准品中含有51.2mg/L的利福平、19.2mg/L的异烟肼、51.2mg/L的利福喷丁、128mg/L的吡嗪酰胺、25.6mg/L的乙胺丁醇、6.4mg/L的氯法齐明、64mg/L的环丝氨酸、16.6mg/L的莫西沙星、41.7mg/L的左氧氟沙星、50mg/L的利奈唑胺、19.2mg/L的乙酰异烟肼、8.3mg/L的贝达喹啉以及20.4mg/L的去乙酰利福平；
质控品为无抗结核药物的空白脑脊液，并且质控品中含有11mg/L的利福平、6.88mg/L的异烟肼、13.75mg/L的利福喷丁、34.83mg/L的吡嗪酰胺、5.5mg/L的乙胺丁醇、1.15mg/L的氯法齐明、19.25mg/L的环丝氨酸、2.5mg/L的莫西沙星、6mg/L的左氧氟沙星、12.32mg/L的利奈唑胺、6.88mg/L的乙酰异烟肼、1.47mg/L的贝达喹啉以及4.4mg/L的去乙酰利福平；
仪器质控品为质量分数为50％甲醇水溶液，并且甲醇水溶液中含有2.75mg/L的利福平、1.72mg/L的异烟肼、3.44mg/L的利福喷丁、8.71mg/L的吡嗪酰胺、1.38mg/L的乙胺丁醇、0.29mg/L的氯法齐明、4.81mg/L的环丝氨酸、0.63mg/L的莫西沙星、1.5mg/L的左氧氟沙星、3.08mg/L的利奈唑胺、1.72mg/L的乙酰异烟肼、0.37mg/L的贝达喹啉以及1.10mg/L的去乙酰利福平；
同位素内标准品中含有含10μg的利福平-d8、6.25μg的异烟肼-d4、10μg的利福喷丁-d8、12.5μg的吡嗪酰胺-13C2,15N2、2.5μg的乙胺丁醇-d4、2.5μg的氯法齐明-d7、12.5μg的环丝氨酸-d3,15N、4μg的莫西沙星-d4、4μg的左氧氟沙星-d3、2μg的利奈唑胺-d3、7.5μg的乙酰异烟肼-d4、2μg的贝达喹啉-d6以及10μg的去乙酰利福平-d8；
流动相添加剂为甲酸。
S31、释放剂配置
向同位素内标准品中加入0.5mL的甲醇复溶，然后将同位素内标准品与甲醇(V/V)混合后配制成释放剂。
S32、样本提取
每个脑脊液样本、质控品、校准品分别取50μL加入对应的96孔微孔板内。随后分别加入150μL步骤S31的释放剂。用前处理板封膜进行封膜处理，然后放置于振荡仪上，涡旋振荡5min；并于-20℃的环境中放置20min；随后在8℃的条件下离心20min，获取上清液。
S33、稀释上机
将步骤S32的上清液取出50μL，加入50μL超纯水，上机板封膜进行封膜处理。
S34、上机检测
配制流动相A和流动相B，其中流动相A由1000mL的去离子水和1mL的流动相添加剂组成；流动相B由500mL的甲醇、500mL的乙腈、1mL的流动相添加剂组成；
以C18-PFP混合型色谱柱作为色谱柱，从仪器质控品瓶内取80μL，直接上机来检测系统的适配性；根据仪器设定程序自动得到各个分析物的浓度，结果如图3所示。
从图3的结果说明，可以通过检测结核病患者的脑脊液以获得患者服用抗结核药物后的抗结核药物及其代谢物的状态，从而分析代谢物与原型药物比例的信息以及分析患者同时服用多种抗结核药物后各抗结核药物的相互作用以及是否有代谢异常等信息。
实施例四
结核病患者血浆样本中抗结核药物及抗结核药物的检测方法，包括以下步骤：
S40、试剂盒情况
试剂盒组分：校准品，1支，200μL/支；质控品，1支，200μL/支；仪器质控品，1支，200μL/支；同位素内标准品，1支，干粉/支；流动相添加剂，1支，2mL/支；校准品稀释液，1支，1mL/支；96孔微孔板，2块；前处理板封膜，1张；上机板封膜，1张；操作说明书，1本；
其中，校准品为无抗结核药物的空白血浆，并且校准品中含有51.2mg/L的利福平、19.2mg/L的异烟肼、51.2mg/L的利福喷丁、128mg/L的吡嗪酰胺、25.6mg/L的乙胺丁醇、6.4mg/L的氯法齐明、64mg/L的环丝氨酸、16.6mg/L的莫西沙星、41.7mg/L的左氧氟沙星、50mg/L的利奈唑胺、19.2mg/L的乙酰异烟肼、8.3mg/L的贝达喹啉以及20.4mg/L的去乙酰利福平；
质控品为无抗结核药物的空白血浆，并且质控品中含有11mg/L的利福平、6.88mg/L的异烟肼、13.75mg/L的利福喷丁、34.83mg/L的吡嗪酰胺、5.5mg/L的乙胺丁醇、1.15mg/L的氯法齐明、19.25mg/L的环丝氨酸、2.5mg/L的莫西沙星、6mg/L的左氧氟沙星、12.32mg/L的利奈唑胺、6.88mg/L的乙酰异烟肼、1.47mg/L的贝达喹啉以及4.4mg/L的去乙酰利福平；
仪器质控品为质量分数为50％甲醇水溶液，并且甲醇水溶液中含有2.75mg/L的利福平、1.72mg/L的异烟肼、3.44mg/L的利福喷丁、8.71mg/L的吡嗪酰胺、1.38mg/L的乙胺丁醇、0.29mg/L的氯法齐明、4.81mg/L的环丝氨酸、0.63mg/L的莫西沙星、1.5mg/L的左氧氟沙星、3.08mg/L的利奈唑胺、1.72mg/L的乙酰异烟肼、0.37mg/L的贝达喹啉以及1.10mg/L的去乙酰利福平；
同位素内标准品中含有含10μg的利福平-d8、6.25μg的异烟肼-d4、10μg的利福喷丁-d8、12.5μg的吡嗪酰胺-13C2,15N2、2.5μg的乙胺丁醇-d4、2.5μg的氯法齐明-d7、12.5μg的环丝氨酸-d3,15N、4μg的莫西沙星-d4、4μg的左氧氟沙星-d3、2μg的利奈唑胺-d3、7.5μg的乙酰异烟肼-d4、2μg的贝达喹啉-d6以及10μg的去乙酰利福平-d8；
流动相添加剂为甲酸。
S41、释放剂配置
向同位素内标准品中加入0.5mL的甲醇复溶，然后将同位素内标准品与甲醇(V/V)混合后配制成释放剂。
S42、样本提取
每个血浆样本、质控品、校准品分别取50μL加入对应的96孔微孔板内。随后分别加入150μL步骤S31的释放剂。用前处理板封膜进行封膜处理，然后放置于振荡仪上，涡旋振荡5min；并于-20℃的环境中放置20min；随后在8℃的条件下离心20min，获取上清液。
S43、稀释上机
将步骤S12的上清液取出50μL，加入50μL超纯水，上机板封膜进行封膜处理。
S44、上机检测
配制流动相A和流动相B，其中流动相A由1000mL的去离子水和1mL的流动相添加剂组成；流动相B由500mL的甲醇、500mL的乙腈、1mL的流动相添加剂组成；
以C18-PFP混合型色谱柱作为色谱柱，从仪器质控品瓶内取80μL，直接上机来检测系统的适配性；根据仪器设定程序自动得到各个分析物的浓度，结果如图4所示。
从图4展示的结果说明，可以通过检测结核病患者的血浆以获得患者服用抗结核药物后的抗结核药物及其代谢物的状态，从而分析代谢物与原型药物比例的信息以及分析患者同时服用多种抗结核药物后各抗结核药物的相互作用以及是否有代谢异常等信息。
实施例五
结核病患者尿液样本中抗结核药物及抗结核药物的检测方法，包括以下步骤：
S50、试剂盒情况
试剂盒组分：校准品，1支，200μL/支；质控品，1支，200μL/支；仪器质控品，1支，200μL/支；同位素内标准品，1支，干粉/支；流动相添加剂，1支，2mL/支；校准品稀释液，1支，1mL/支；96孔微孔板，2块；前处理板封膜，1张；上机板封膜，1张；操作说明书，1本；
其中，校准品为无抗结核药物的空白尿液，并且校准品中含有51.2mg/L的利福平、19.2mg/L的异烟肼、51.2mg/L的利福喷丁、128mg/L的吡嗪酰胺、25.6mg/L的乙胺丁醇、6.4mg/L的氯法齐明、64mg/L的环丝氨酸、16.6mg/L的莫西沙星、41.7mg/L的左氧氟沙星、50mg/L的利奈唑胺、19.2mg/L的乙酰异烟肼、8.3mg/L的贝达喹啉以及20.4mg/L的去乙酰利福平；
质控品为无抗结核药物的空白尿液，并且质控品中含有11mg/L的利福平、6.88mg/L的异烟肼、13.75mg/L的利福喷丁、34.83mg/L的吡嗪酰胺、5.5mg/L的乙胺丁醇、1.15mg/L的氯法齐明、19.25mg/L的环丝氨酸、2.5mg/L的莫西沙星、6mg/L的左氧氟沙星、12.32mg/L的利奈唑胺、6.88mg/L的乙酰异烟肼、1.47mg/L的贝达喹啉以及4.4mg/L的去乙酰利福平；
仪器质控品为质量分数为50％甲醇水溶液，并且甲醇水溶液中含有2.75mg/L的利福平、1.72mg/L的异烟肼、3.44mg/L的利福喷丁、8.71mg/L的吡嗪酰胺、1.38mg/L的乙胺丁醇、0.29mg/L的氯法齐明、4.81mg/L的环丝氨酸、0.63mg/L的莫西沙星、1.5mg/L的左氧氟沙星、3.08mg/L的利奈唑胺、1.72mg/L的乙酰异烟肼、0.37mg/L的贝达喹啉以及1.10mg/L的去乙酰利福平；
同位素内标准品中含有含10μg的利福平-d8、6.25μg的异烟肼-d4、10μg的利福喷丁-d8、12.5μg的吡嗪酰胺-13C2,15N2、2.5μg的乙胺丁醇-d4、2.5μg的氯法齐明-d7、12.5μg的环丝氨酸-d3,15N、4μg的莫西沙星-d4、4μg的左氧氟沙星-d3、2μg的利奈唑胺-d3、7.5μg的乙酰异烟肼-d4、2μg的贝达喹啉-d6以及10μg的去乙酰利福平-d8；
流动相添加剂为甲酸。
S51、释放剂配置
向同位素内标准品中加入0.5mL的甲醇复溶，然后将同位素内标准品与甲醇(V/V)混合后配制成释放剂。
S52、样本提取
每个尿液样本、质控品、校准品分别取50μL加入对应的96孔微孔板内。随后分别加入150μL步骤S51的释放剂。用前处理板封膜进行封膜处理，然后放置于振荡仪上，涡旋振荡5min；并于-20℃的环境中放置20min；随后在8℃的条件下离心20min，获取上清液。
S53、稀释上机
将步骤S52的上清液取出50μL，加入50μL超纯水，上机板封膜进行封膜处理。
S54、上机检测
配制流动相A和流动相B，其中流动相A由1000mL的去离子水和1mL的流动相添加剂组成；流动相B由500mL的甲醇、500mL的乙腈、1mL的流动相添加剂组成；
以C18-PFP混合型色谱柱作为色谱柱，从仪器质控品瓶内取80μL，直接上机来检测系统的适配性；根据仪器设定程序自动得到各个分析物的浓度，结果如图5所示。
从图5展示的图谱可以看出，可以通过检测结核病患者的尿液以获得患者服用抗结核药物后的抗结核药物及其代谢物的状态，从而分析代谢物与原型药物比例的信息以及分析患者同时服用多种抗结核药物后各抗结核药物的相互作用以及是否有代谢异常等信息。
综上所述，本申请的检测方法，能够有效地扩展结核病患者采样检测的样本类型，同时不但可以检测结核病患者样本中的抗结核药物种类，还能够检测抗结核药物在体内的代谢情况，获取代谢物与原型药物比例的信息、患者同时服用多种抗结核药物时是否有相互作用以及是否有代谢异常等信息以及PK/PD数据，从而可有针对性的制定给药方案。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于检测样本中抗结核药物及其代谢物；
所述试剂盒包括：
校准品，所述校准品中含有利福平、异烟肼、利福喷丁、吡嗪酰胺、乙胺丁醇、氯法齐明、环丝氨酸、莫西沙星、左氧氟沙星、利奈唑胺、乙酰异烟肼、贝达喹啉以及去乙酰利福平；
质控品，所述质控品中含有利福平、异烟肼、利福喷丁、吡嗪酰胺、乙胺丁醇、氯法齐明、环丝氨酸、莫西沙星、左氧氟沙星、利奈唑胺、乙酰异烟肼、贝达喹啉以及去乙酰利福平；
仪器质控品，所述仪器质控品包括含有利福平、异烟肼、利福喷丁、吡嗪酰胺、乙胺丁醇、氯法齐明、环丝氨酸、莫西沙星、左氧氟沙星、利奈唑胺、乙酰异烟肼、贝达喹啉以及去乙酰利福平的甲醇溶液；
以及，同位素内标准品，所述同位素内标准品中包含有利福平-内标、异烟肼-内标、利福喷丁-内标、吡嗪酰胺-内标、乙胺丁醇-内标、氯法齐明-内标、环丝氨酸-内标、莫西沙星-内标、左氧氟沙星-内标、利奈唑胺-内标、乙酰异烟肼-内标、贝达喹啉-内标以及去乙酰利福平-内标。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括C18-PFP混合型色谱柱以及校准品稀释液。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括流动相A和流动相B；所述流动相A包括去离子水和溶于所述去离子水中的添加剂；所述流动相B包括甲醇和乙腈的混合液以及溶于所述混合液中的添加剂。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述添加剂包括甲酸、乙酸、三乙胺、三氟乙酸中的任一种。
5.如权利要求1至4任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括微孔板、前处理板封膜以及上机板封膜。
6.如权利要求1至4任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述校准品还含有普瑞玛尼、利福布丁、阿米卡星、特立齐酮、乙硫异烟胺、丙硫乙酰胺、对氨基水杨酸、帕司烟肼以及美罗培南中的至少一种；
所述质控品还含有普瑞玛尼、利福布丁、阿米卡星、特立齐酮、乙硫异烟胺、丙硫乙酰胺、对氨基水杨酸、帕司烟肼以及美罗培南中的至少一种；
所述同位素内标准品还含有普瑞玛尼-内标、利福布丁-内标、阿米卡星-内标、特立齐酮-内标、乙硫异烟胺-内标、丙硫乙酰胺-内标、对氨基水杨酸-内标、帕司烟肼-内标以及美罗培南-内标中的至少一种。
7.一种样本中抗结核药物及其代谢物的检测方法，其特征在于，采用权利要求1至6任一项所述的试剂盒进行检测，包括以下步骤：
采用溶剂对所述同位素内标准品进行溶解处理，以获得释放剂；
将样本溶于所述释放剂中并纯化处理，以获得上清液；
对所述上清液进行稀释处理后，在液相色谱串联质谱仪中进行上机检测，以获取所述样本中的抗结核药物以及所述抗结核药物的代谢物状况。
8.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述样本包括血浆、血清、脑脊液以及尿液中的任一种。
9.如权利要求7至8任一项的检测方法，其特征在于，所述上机检测的检测指标包括异烟肼、利福平、利福喷丁、环丝氨酸、乙胺丁醇、左氧氟沙星、莫西沙星、吡嗪酰胺、氯法齐明、贝达喹啉、利奈唑胺中至少一种的浓度；
以及，检测乙酰异烟肼、异烟酸、25-O-去乙酰利福平、25-O-去乙酰利福喷丁、吡嗪酸、5-羟吡嗪酸和贝达喹啉M2中至少一种的浓度。
10.如权利要求9所述的检测方法，其特征在于，还包括检测普瑞玛尼、利福布丁、阿米卡星、特立齐酮、乙硫异烟胺、丙硫乙酰胺、对氨基水杨酸、帕司烟肼、美罗培南中至少一种的浓度；以及，检测25-O-去乙酰利福布丁的浓度；
和/或，所述纯化处理为包括对溶于所述释放剂中的所述样本进行沉淀处理、冷冻处理和离心处理。
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