CN115389677A - 定量检测抗结核药物浓度的试剂、应用及试剂盒 - Google Patents

定量检测抗结核药物浓度的试剂、应用及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及制药技术领域，尤其是涉及定量检测抗结核药物浓度的试剂、应用及试剂盒。本发明提供的试剂和试剂盒能够用于高效液相串联质谱法高通量检测人血清中四种一线抗结核药物，一次检测可同时得到吡嗪酰胺、异烟肼、乙胺丁醇和利福平四种一线抗结核药物，具有灵敏度高，重复性好，准确性高，特异性好等特点。检测得到的吡嗪酰胺线性范围15～105μg/ml，异烟肼1～19μg/ml，乙胺丁醇1～14.5μg/ml，利福平0.4～13μg/ml，相关系数均r≥0.990。

Description

定量检测抗结核药物浓度的试剂、应用及试剂盒
技术领域
本发明涉及制药技术领域，尤其是涉及定量检测抗结核药物浓度的试剂、应用及试剂盒。
背景技术
结核病是病人感染结核分枝杆菌后引起的传染性疾病，抗结核病的药物主要被分为四类：一线抗结核药物、二线抗结核药物、新型抗结核药物以及复方制剂药物。涉及到的一线抗结核药物主要包括利福平(Rifampicin,RMP)、异烟肼(Isoniazid,INH)、吡嗪酰胺(Pyrazinamide,PZA)和乙胺丁醇(Ethambutol,EMB)。
抗结核药物测试主要有液相色谱法-紫外法，液相色谱-蒸发光散射法，液相色谱质谱法等。由于上述四种一线抗结核药物中乙胺丁醇无紫外吸收，所以必须带有蒸发光散射检测器进行检测，造成四种组分的同时准确检出困难。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于，针对采用高效液相串联质谱同时检测人血清中上述四种抗结核药物的方法，提供与之相适用的试剂及试剂盒。
为了解决上述技术问题，实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
第一方面，本发明提供定量检测抗结核药物浓度的第一试剂，所述抗结核药物包括吡嗪酰胺、异烟肼、乙胺丁醇和利福平；
所述第一试剂包括校准品、低值质控品、中值质控品、高值质控品和样本萃取液；
所述校准品包括至少1个浓度稀释梯度的吡嗪酰胺的BSA溶液、至少1个浓度稀释梯度的异烟肼的BSA溶液、至少1个浓度稀释梯度的乙胺丁醇的BSA溶液和至少1个浓度稀释梯度的利福平的BSA溶液；
所述低值质控品包括浓度为16.32～24.48μg/mL的吡嗪酰胺的BSA溶液、浓度为1.66～2.50μg/mL的异烟肼的BSA溶液、浓度为1.45～2.17μg/mL的乙胺丁醇的BSA溶液和浓度为0.93～1.39μg/mL的利福平的BSA溶液；
所述中值质控品包括浓度为43.35～58.65μg/mL的吡嗪酰胺的BSA溶液、浓度为6.97～9.43μg/mL的异烟肼的BSA溶液、浓度为5.44～7.36μg/mL的乙胺丁醇的BSA溶液和浓度为4.62～6.26μg/mL的利福平的BSA溶液；
所述高值质控品包括浓度为69.87～94.53μg/mL的吡嗪酰胺的BSA溶液、浓度为12.27～16.61μg/mL的异烟肼的BSA溶液、浓度为9.42～12.74μg/mL的乙胺丁醇的BSA溶液和浓度为8.34～11.28μg/mL的利福平的BSA溶液；
所述样本萃取液包括吡嗪酰胺、异烟肼、乙胺丁醇和利福平的同位素标记物的甲醇溶液，所述吡嗪酰胺的同位素标记物为吡嗪酰胺-15N,D3，所述异烟肼的同位素标记物为异烟肼-D4，所述乙胺丁醇的同位素标记物为乙胺丁醇-D4，所述利福平的同位素标记物为利福平-D4。
在可选的实施方式中，所述校准品吡嗪酰胺的BSA溶液的浓度稀释梯度为6个，其中吡嗪酰胺的浓度范围为15～105μg/mL；
所述校准品异烟肼的BSA溶液的浓度稀释梯度为6个，其中异烟肼的浓度范围为1～19μg/mL；
所述校准品乙胺丁醇的BSA溶液的浓度稀释梯度为6个，其中乙胺丁醇的浓度范围为1～14.5μg/mL；
所述校准品利福平的BSA溶液的浓度稀释梯度为6个，其中利福平的浓度范围为0.4～13μg/mL。
在可选的实施方式中，所述校准品吡嗪酰胺的BSA溶液的浓度稀释梯度为15μg/mL、33μg/mL、45μg/mL、57μg/mL、75μg/mL和105μg/mL；
所述校准品异烟肼的BSA溶液的浓度稀释梯度为1μg/mL、4.6μg/mL、7μg/mL、9.4μg/mL、13μg/mL和19μg/mL；
所述校准品乙胺丁醇的BSA溶液的浓度稀释梯度为1μg/mL、3.7μg/mL、5.5μg/mL、7.3μg/mL、10μg/mL和14.5μg/mL；
所述校准品利福平的BSA溶液的浓度稀释梯度为0.4μg/mL、2.92μg/mL、4.6μg/mL、6.28μg/mL、8.8μg/mL和13μg/mL。
在可选的实施方式中，所述低值质控品包括浓度为20.4μg/mL的吡嗪酰胺的BSA溶液、浓度为2.08μg/mL的异烟肼的BSA溶液、浓度为1.81μg/mL的乙胺丁醇的BSA溶液和浓度为1.16μg/mL的利福平的BSA溶液；
所述中值质控品包括浓度为51μg/mL的吡嗪酰胺的BSA溶液、浓度为8.2μg/mL的异烟肼的BSA溶液、浓度为6.4μg/mL的乙胺丁醇的BSA溶液和浓度为5.44μg/mL的利福平的BSA溶液；
所述高值质控品包括浓度为82.2μg/mL的吡嗪酰胺的BSA溶液、浓度为14.44μg/mL的异烟肼的BSA溶液、浓度为11.08μg/mL的乙胺丁醇的BSA溶液和浓度为9.81μg/mL的利福平的BSA溶液。
在可选的实施方式中，所述样本萃取液包括吡嗪酰胺-15N,D3的甲醇溶液、异烟肼-D4的甲醇溶液、乙胺丁醇-D4的甲醇溶液和利福平-D4的甲醇溶液；
所述吡嗪酰胺-15N,D3的甲醇溶液中吡嗪酰胺-15N,D3的浓度选自0.5～5μg/ml，所述异烟肼-D4的甲醇溶液中异烟肼-D4的浓度选自0.05～1μg/ml，所述乙胺丁醇-D4的甲醇溶液中乙胺丁醇-D4的浓度选自0.01～0.05μg/ml，所述利福平-D4的甲醇溶液中利福平-D4的浓度选自0.2～2μg/ml。
在可选的实施方式中，所述校准品、低值质控品、中值质控品和高值质控品中还包括乙二胺四乙酸二钠、柠檬酸和硫代硫酸钠。
第二方面，本发明提供非诊断目的的前述实施方式任一项所述第一试剂在高效液相串联质谱法检测人血清中抗结核药物成分浓度中的应用。
在可选的实施方式中，所述应用包括抗结核药物有效成分释放效果评价。
第三方面，本发明提供用于高效液相串联质谱法检测人血清中抗结核药物成分浓度的第二试剂，所述第二试剂包括第一试剂以及用于高效液相色谱的流动相A和流动相B；
所述流动相A为含有0.1％(v/v)甲酸的5mM的甲酸铵水溶液，所述流动相B为甲醇溶液。
第四方面，本发明提供用于高效液相串联质谱法检测人血清中抗结核药物成分浓度的试剂盒，所述试剂盒包括前述实施方式任一项所述第一试剂或前述实施方式所述的第二试剂。
本发明提供的试剂和试剂盒能够用于高效液相串联质谱法高通量检测人血清中四种一线抗结核药物，一次检测可同时得到吡嗪酰胺、异烟肼、乙胺丁醇和利福平四种一线抗结核药物，具有灵敏度高，重复性好，准确性高，特异性好等特点。检测得到的吡嗪酰胺线性范围15～105μg/ml，异烟肼1～19μg/ml，乙胺丁醇1～14.5μg/ml，利福平0.4～13μg/ml，相关系数均r≥0.990；低值质控品重复性的变异系数(CV)≤20％，中值质控品重复性的变异系数(CV)≤15％，高值质控品重复性的变异系数(CV)≤15％；准确度的相对偏差(B)≤±15％，加标回收率为85％～115％。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
下面对本发明的一些实施方式作详细说明。在不冲突的情况下，下述的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
本发明公开了高效液相质谱法高通量检测人血清中四种一线抗结核药物。人血清中的抗结核药物经过有机溶剂的蛋白沉淀，离心并且稀释后进行上样测试，且所有前处理都可以在96孔板中进行，使用排枪进行移取，实现批量前处理。样品经前处理后，进入液相色谱质谱联用仪进行检测，五分钟之内即可完成四种药物测试，方便，快速。由于人源样本难以获得，本发明采用BSA作为人血清的替代基质配制标准曲线的各个浓度点及质控。
1、下列实施例涉及到的材料和试剂如下：
Figure BDA0003843339260000021
Figure BDA0003843339260000031
2、使用到的仪器设备如下：
序号 设备名称 型号/规格
1 液相色谱串联质谱仪 AB SCIEX Triple Quad<sup>TM</sup> 4500MD
2 96孔板振荡器 MB100-4A
3 96孔板离心机 湘仪H2050R
4 10μL移液器 0.5～10μL
5 200μL移液器 20～200μL
6 1000μL移液器 100～1000μL
7 300μL 12孔移液器 30～300μL
8 96孔板 1mL
9 电子天平 十万分之一
3、检测方法步骤如下：
3.1实验操作
3.1.1产品校准品及质控品配制
(1)吡嗪酰胺、异烟肼、乙胺丁醇、利福平浓储液配制
精密称量吡嗪酰胺、异烟肼、盐酸乙胺丁醇和利福平标准品适量，分别置于10 mL的容量瓶中，加入甲醇溶解并稀释定容。
Figure BDA0003843339260000032
(2)次级储备液配制
精确移取浓储液，配置成浓度为1 mg/mL的次级储备液。
Figure BDA0003843339260000033
(3)4种抗结核药产品校准品C1～C6及产品质控品QCL～QCH的配制
产品校准品C6配制
精确移取吡嗪酰胺浓储液2.72514 mL，异烟肼浓储液0.49170 mL，乙胺丁醇浓储液0.47536 mL，利福平浓储液0.34117 mL，加入牛血清白蛋白溶液251.96661 mL，充分混匀得到校准品C6。
产品校准品C1配制
精确移取吡嗪酰胺次级储备液5.04mL，异烟肼次级储备液0.336mL，乙胺丁醇次级储备液0.336mL，利福平次级储备液0.1344mL，加入牛血清白蛋白溶液330.1536mL，充分混匀得到校准品C1。
产品校准品C2～C5及质控品QCL～QCH配制分别由校准品C6和校准品C1配制而成，稀释比例见下表。
Figure BDA0003843339260000041
3.1.2样本萃取液配制
精确称取吡嗪酰胺-15N,D3、异烟肼-D4、盐酸乙胺丁醇-D4和利福平-D4。在实际称量时需要对标准物质的纯度、所带的结晶水或者盐进行折算，分别转移至10mL的容量瓶中，加一定量甲醇，盖上瓶塞防止渗漏，上下颠倒至完全溶解后，加甲醇定容至10mL得到储备液，转移至25mL广口瓶中，贴标签，-80℃保存。
以生产0.5L样本萃取液为例，精确移取1mL吡嗪酰胺-15N,D3，100μL异烟肼-D4，10μL乙胺丁醇-D4和500μL利福平-D4于500mL容量瓶中，加甲醇稀释并定容。最后转移至600mL广口瓶中-80℃保存。
Figure BDA0003843339260000042
3.2样品处理方法
1)加校准品、质控品溶液：精密移取50μL校准品、质控品溶液，分别加入96孔板中；
2)加样本萃取液：精密移取200μL样本萃取液，分别加至96孔板中；
3)震荡：盖上96孔板垫/热塑封口膜，置于96孔板振荡器中，1500rpm充分震荡15min；
4)离心：于4℃、4000rpm离心10min。取100μL的上清液置于96孔板中；
5)稀释：在96孔板中精密移取300μL纯水稀释上清液；
6)震荡：盖上96孔板垫/热塑封口膜，置于96孔板振荡器中，1500rpm充分震荡10min；
7)离心：于4℃、4000rpm离心5min；
8)检测：将96孔板置于液相色谱-串联质谱仪中，1μL进样检测。
3.3液相参数
1)色谱条件
Figure BDA0003843339260000043
2)梯度
Figure BDA0003843339260000044
Figure BDA0003843339260000051
3.4质谱参数
1)离子信息
化合物名称 Q1 Q3 DP CE Dwell(msec)
Pyrazinamide 124.0 79.0 40 23 20
Pyrazinamide* 124.0 81.0 40 23 20
<sup>15</sup>N,D<sub>3</sub>-Pyrazinamide 128.1 84.1 40 25 20
Isoniazid* 138.1 79.0 40 39 20
Isoniazid 138.1 121.1 40 20 20
D<sub>4</sub>-Isoniazid 142.1 125.1 40 20 20
Ethambutol 205.0 116.1 100 28 15
Ethambutol* 205.0 55.1 60 45 15
D<sub>4</sub>-Ethambutol 209.1 120.2 40 14 15
Rifampicin* 823.5 791.4 30 25 15
Rifampicin 823.5 399.3 105 25 20
D<sub>4</sub>-Rifampicin 827.5 795.4 105 36 20
*定量离子对。
2)离子源参数
Figure BDA0003843339260000052
作为某次实施方式，本发明公开了一款检测人体血清中4种抗结核药含量的试剂盒，包括下列试剂：
Figure BDA0003843339260000053
Figure BDA0003843339260000061
实施例1试剂盒线性范围
1.1线性范围
1)验证方法：按样品处理方法处理待测产品校准品C1～C6溶液，每个浓度重复测试3次。可参考公式计算线性回归的相关系数r，相关系数r应≥0.990。
Figure BDA0003843339260000062
r：线性回归相关系数
xi：C1～C6的浓度
yi：对应浓度溶液中校准品与其内标的峰面积比值均值
2)接受标准：吡嗪酰胺、异烟肼、乙胺丁醇和利福平的相关系数r均≥0.990。
1.2实验结果
线性范围：吡嗪酰胺线性范围15～105μg/mL，异烟肼线性范围1～19μg/mL，乙胺丁醇线性范围1～14.5μg/mL，利福平线性范围0.4～13μg/mL。
Figure BDA0003843339260000063
Figure BDA0003843339260000071
1.3结论：吡嗪酰胺、异烟肼、乙胺丁醇和利福平线性回归的相关系数r均≥0.990，满足接受标准。
实施例2试剂盒重复性
2.1重复性
验证方法：在重复性条件下，按照检验方法使用试剂盒测试质控品，重复测试10次。可参考公式计算重复性的变异系数(CV)，低值质控品CV≤20％，高值质控品CV≤15％。
Figure BDA0003843339260000072
CV：重复性的变异系数
Figure BDA0003843339260000073
10次测量结果的平均值
S：10次测量结果的标准差
接受标准：低值质控品的变异系数CV≤20％，高值质控品的变异系数CV≤15％。
2.2实验结果
Figure BDA0003843339260000074
2.3结论：低值质控品的变异系数CV≤20％，高值质控品的变异系数CV≤15％，满足接受标准。
实施例3试剂盒批间差
3.1批间差
1)验证方法：按照检验方法使用三个不同批号的试剂盒测试质控品，重复测试3次。可参考公式计算批间相对极差(R)，低值质控品的批间相对极差R≤20％，高值质控品的批间相对极差R≤15％。
Figure BDA0003843339260000075
Figure BDA0003843339260000076
R：批间相对极差
Figure BDA0003843339260000077
每批3次测量结果的平均值
Figure BDA0003843339260000078
Figure BDA0003843339260000079
中的最大值
Figure BDA0003843339260000081
Figure BDA0003843339260000082
中的最小值
Figure BDA0003843339260000083
3批检测均值
2)接受标准：低值质控品的批间相对极差R≤20％，高值质控品的批间相对极差R≤15％。
3.2实验结果
Figure BDA0003843339260000084
3.3结论：低值质控品的批间相对极差R≤20％，高值质控品的批间相对极差R≤15％，满足接受标准。
实施例4试剂盒准确度
4.1准确度
验证方法：按照检验方法使用本试剂盒测试质控品QCL和QCH，重复测量3次。可参考公式计算准确度的相对偏差(B)，相对偏差应在[85％，115％]。
B＝(M-T)/T×100％
B：相对偏差
M：测试结果均值
T：标示值
接受标准：准确度的相对偏差B应≤±15％。
4.2实验结果
Figure BDA0003843339260000085
Figure BDA0003843339260000091
4.3结论：准确度的相对偏差B应≤±15％，满足接受标准。
实施例5试剂盒效期稳定性
5.1效期稳定性
验证方法：取在正常储存温度条件下(-18℃±8℃)避光保存超过有效期(6个月)后1个月内试剂盒，按照实施例1～4、实施例6进行检测，结果符合其相应要求。
接受标准：包装完整、无破损；最小包装标签的文字、内容应清晰、准确，封口严密，无渗漏；组分应半透明，无沉淀、颗粒或絮状物；试剂盒中各液体试剂的净含量应不少于标示值；吡嗪酰胺、异烟肼、乙胺丁醇和利福平线性回归的相关系数r均≥0.990；低值质控品的变异系数CV≤20％，高值质控品的变异系数CV≤15％；准确度的相对偏差B应≤±15％。
5.2实验结果
外观
(a)试剂盒的各组份应齐全、完整、无破损。
(b)最小包装标签的文字、内容应清晰、准确，封口严密，无渗漏。
(c)液体组分应半透明，无沉淀、颗粒或絮状物。
装量
装量 实测 standard 判定
C1 650μL ≥600μL 合格
C2 650μL ≥600μL 合格
C3 650μL ≥600μL 合格
C4 650μL ≥600μL 合格
C5 650μL ≥600μL 合格
C6 650μL ≥600μL 合格
QCL 650μL ≥600μL 合格
QCM 650μL ≥600μL 合格
QCH 650μL ≥600μL 合格
样本萃取液 25mL ≥22mL 合格
线性范围
线性范围：吡嗪酰胺线性范围15～105μg/mL，异烟肼线性范围1～19μg/mL，乙胺丁醇线性范围1～14.5μg/mL，利福平线性范围0.4～13μg/mL
Figure BDA0003843339260000092
Figure BDA0003843339260000101
重复性
Figure BDA0003843339260000102
准确度
Figure BDA0003843339260000103
5.3结论：包装完整、无破损；最小包装标签的文字、内容清晰、准确，封口严密，无渗漏；组分半透明，无沉淀、颗粒或絮状物；试剂盒中各液体试剂的净含量不少于标示值；吡嗪酰胺、异烟肼、乙胺丁醇和利福平线性回归的相关系数r均≥0.990；低值质控品的变异系数CV≤20％，高值质控品的变异系数CV≤15％；准确度的相对偏差B应≤±15％，满足接受标准。
实施例6试剂盒校准品
6.1外观
1)验证方法：随机取试剂盒中校准品各1瓶，在自然光下以矫正视力目视观察。
2)接受标准：包装完整、无破损；最小包装标签的文字、内容应清晰、准确，封口严密，无渗漏；组分应半透明，无沉淀、颗粒或絮状物。
实验结果：
(a)各校准品组份应包装完整、无破损。
(b)各校准品组份包装标签的文字、内容应清晰、准确，封口严密，无渗漏。
(c)各校准品组分应半透明，无沉淀、颗粒或絮状物。
结论：包装完整、无破损；最小包装标签的文字、内容应清晰、准确，封口严密，无渗漏；组分应半透明，无沉淀、颗粒或絮状物，满足接受标准。
6.2装量
验证方法：随机取试剂盒中校准品各1瓶，使用通用量具检测体积。
接受标准：试剂盒中校准品的净含量应不少于标示值。
实验结果
装量 实测 standard 判定
C1 650μL ≥600μL 合格
C2 650μL ≥600μL 合格
C3 650μL ≥600μL 合格
C4 650μL ≥600μL 合格
C5 650μL ≥600μL 合格
C6 650μL ≥600μL 合格
结论：试剂盒中校准品的净含量不少于标示值，满足接受标准。
6.3准确度
1)验证方法：按照检测方法以工作校准品定标，测试试剂盒的各校准品，重复检测3次。可参考公式计算准确度的相对偏差(B)，相对偏差应在[85％，115％]。
B＝(M-T)/T×100％
B：相对偏差
M：测试结果均值
T：标示值
2)接受标准：准确度的相对偏差B应≤±15％。
3)实验结果
Figure BDA0003843339260000111
Figure BDA0003843339260000121
4)结论：准确度的相对偏差B≤±15％，满足接受标准。
6.4均一性
验证方法：按照检测方法测试同一批号的10瓶校准品，根据参考文献《YY/T 1652-2019体外诊断试剂用质控物通用技术要求》中记载的公式(12)～(13)计算10个测量值的平均值
Figure BDA0003843339260000123
和标准差(S1)。再对该批号中的1瓶重复测试10次，计算结果平均值
Figure BDA0003843339260000124
和标准差(S2)。按照公式(14)～(15)计算出变异系数(CV)，C1～C3校准品的变异系数CV≤20％，C4～C6校准品的变异系数CV≤15％。
1)接受标准：C1～C3校准品的变异系数CV≤20％，C4～C6校准品的变异系数CV≤15％。
2)实验结果
Figure BDA0003843339260000122
Figure BDA0003843339260000131
Figure BDA0003843339260000132
Figure BDA0003843339260000141
Figure BDA0003843339260000142
Figure BDA0003843339260000151
Figure BDA0003843339260000152
Figure BDA0003843339260000161
3)结论：C1～C3校准品的变异系数CV≤20％，C4～C6校准品的变异系数CV≤15％，满足接受标准。
6.5稳定性
开封后稳定性
1)验证方法：开封后，在正常储存温度条件下(-18℃±8℃)避光保存超过开瓶有效期(15天)后1周内的试剂盒校准品进行检测，结果符合其相应要求。
2)接受标准：试剂盒中校准品的净含量不少于标示值；准确度的相对偏差B应≤±15％；C1～C3校准品的变异系数CV≤20％，C4～C6校准品的变异系数CV≤15％。
3)实验结果
A)装量
装量 实测 standard 判定
C1 650μL ≥600μL 合格
C2 650μL ≥600μL 合格
C3 650μL ≥600μL 合格
C4 650μL ≥600μL 合格
C5 650μL ≥600μL 合格
C6 650μL ≥600μL 合格
B)准确度
Figure BDA0003843339260000162
Figure BDA0003843339260000171
C)均匀性
Figure BDA0003843339260000172
Figure BDA0003843339260000181
Figure BDA0003843339260000182
Figure BDA0003843339260000191
Figure BDA0003843339260000192
Figure BDA0003843339260000201
4)结论：试剂盒中校准品的净含量不少于标示值；校准品准确度的相对偏差B≤±15％；C1～C3校准品的变异系数CV≤20％，C4～C6校准品的变异系数CV≤15％，满足接受标准。
效期稳定性
1)验证方法：取在正常储存温度条件下(-18℃±8℃)避光保存超过有效期(6个月)后1个月内试剂盒校准品进行检测，结果符合其相应要求。
2)接受标准：包装完整、无破损；最小包装标签的文字、内容应清晰、准确，封口严密，无渗漏；组分应半透明，无沉淀、颗粒或絮状物；试剂盒中校准品的净含量应不少于标示值；准确度的相对偏差B应≤±15％；C1～C3校准品的变异系数CV≤20％，C4～C6校准品的变异系数CV≤15％。
3)实验结果：
A)外观
(a)各校准品组份应包装完整、无破损。
(b)各校准品组份包装标签的文字、内容应清晰、准确，封口严密，无渗漏。(c)各校准品组分应半透明，无沉淀、颗粒或絮状物。
B)装量
装量 实测 standard 判定
C1 650μL ≥600μL 合格
C2 650μL ≥600μL 合格
C3 650μL ≥600μL 合格
C4 650μL ≥600μL 合格
C5 650μL ≥600μL 合格
C6 650μL ≥600μL 合格
C)准确度
Figure BDA0003843339260000211
D)均匀性
Figure BDA0003843339260000212
Figure BDA0003843339260000221
Figure BDA0003843339260000222
Figure BDA0003843339260000231
Figure BDA0003843339260000232
Figure BDA0003843339260000241
Figure BDA0003843339260000242
Figure BDA0003843339260000251
4)结论：校准品包装完整、无破损；最小包装标签的文字、内容应清晰、准确，封口严密，无渗漏；组分澄清，无沉淀、颗粒或絮状物；试剂盒中校准品的净含量不少于标示值；准确度的相对偏差B≤±15％；C1～C3校准品的变异系数CV≤20％，C4～C6校准品的变异系数CV≤15％，满足接受标准。
实施例7试剂盒质控品
7.1外观
1)验证方法：随机取试剂盒中质控品各1瓶，在自然光下以矫正视力目视观察。
2)接受标准：包装完整、无破损；最小包装标签的文字、内容应清晰、准确，封口严密，无渗漏；组分应半透明，无沉淀、颗粒或絮状物。
3)实验结果：
(a)各质控品组份包装完整、无破损。
(b)各质控品组份包装标签的文字、内容应清晰、准确，封口严密，无渗漏。
(c)各质控品组分半透明，无沉淀、颗粒或絮状物。
4)结论：包装完整、无破损；最小包装标签的文字、内容清晰、准确，封口严密，无渗漏；组分应半透明，无沉淀、颗粒或絮状物，满足接受标准。
7.2装量
1)验证方法：随机取试剂盒中质控品各1瓶，使用通用量具检测体积。
2)接受标准：试剂盒中质控品的净含量应不少于标示值。
3)实验结果
Figure BDA0003843339260000252
Figure BDA0003843339260000261
4)结论：试剂盒中质控品的净含量不少于标示值，满足接受标准。
7.3预期结果
1)验证方法：按照检测方法进行操作，以产品校准品定标，测试试剂盒中的各质控品，重复测试3次。质控品的检测结果应在该质控品的可接受范围内。
2)接受标准：质控品的检测结果应在该质控品的可接受范围内。
3)实验结果
Figure BDA0003843339260000262
4)结论：质控品的检测结果在该质控品的可接受范围内，满足接受标准。
7.4均一性
1)验证方法：按照检测方法测试测试同一批号试剂盒内质控品各10瓶，每个浓度水平的质控品随机编号1～10，每瓶重复测试3次。
3次测试按照以下顺序进行：1、3、5、7、9、2、4、6、8、10、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、2、4、6、8、10、1、3、5、7、9。
记录检测结果，根据参考文献《YY/T 1652-2019体外诊断试剂用质控物通用技术要求》中记载的公式(1)～(11)计算F、Sbb、Sr和CV瓶间。
2)接受标准：低值质控品的变异系数CV≤20％，高值质控品的变异系数CV≤15％。
3)实验结果：
Figure BDA0003843339260000263
Figure BDA0003843339260000271
Figure BDA0003843339260000272
Figure BDA0003843339260000273
Figure BDA0003843339260000281
Figure BDA0003843339260000282
4)结论：低值质控品的变异系数CV≤20％，高值质控品的变异系数CV≤15％，满足接受标准。
7.5稳定性
开封后稳定性
1)验证方法：开封后，取在正常储存温度条件下(-18±8℃)避光保存超过开瓶有效期(15天)的试剂盒质控品，各质控品分别取3支，每支重复测定2次。根据参考文献《YY/T1652-2019体外诊断试剂用质控物通用技术要求》中记载的公式(16)进行差异显著性检验，差异应不显著。
2)接受标准：t＜显著性水平a(a＝0.05)自由度为(n1+n2-2)的临界值ta(n1+n2-2)。
3)实验结果：
Figure BDA0003843339260000291
4)结论：t＜显著性水平a(a＝0.05)自由度为(n1+n2-2)的临界值ta(n1+n2-2)，满足接受标准。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.定量检测抗结核药物浓度的第一试剂，其特征在于，所述抗结核药物包括吡嗪酰胺、异烟肼、乙胺丁醇和利福平；
所述第一试剂包括校准品、低值质控品、中值质控品、高值质控品和样本萃取液；
所述校准品包括至少1个浓度稀释梯度的吡嗪酰胺的BSA溶液、至少1个浓度稀释梯度的异烟肼的BSA溶液、至少1个浓度稀释梯度的乙胺丁醇的BSA溶液和至少1个浓度稀释梯度的利福平的BSA溶液；
所述低值质控品包括浓度为16.32～24.48μg/mL的吡嗪酰胺的BSA溶液、浓度为1.66～2.50μg/mL的异烟肼的BSA溶液、浓度为1.45～2.17μg/mL的乙胺丁醇的BSA溶液和浓度为0.93～1.39μg/mL的利福平的BSA溶液；
所述中值质控品包括浓度为43.35～58.65μg/mL的吡嗪酰胺的BSA溶液、浓度为6.97～9.43μg/mL的异烟肼的BSA溶液、浓度为5.44～7.36μg/mL的乙胺丁醇的BSA溶液和浓度为4.62～6.26μg/mL的利福平的BSA溶液；
所述高值质控品包括浓度为69.87～94.53μg/mL的吡嗪酰胺的BSA溶液、浓度为12.27～16.61μg/mL的异烟肼的BSA溶液、浓度为9.42～12.74μg/mL的乙胺丁醇的BSA溶液和浓度为8.34～11.28μg/mL的利福平的BSA溶液；
所述样本萃取液包括吡嗪酰胺、异烟肼、乙胺丁醇和利福平的同位素标记物的甲醇溶液，所述吡嗪酰胺的同位素标记物为吡嗪酰胺-15N,D3，所述异烟肼的同位素标记物为异烟肼-D4，所述乙胺丁醇的同位素标记物为乙胺丁醇-D4，所述利福平的同位素标记物为利福平-D4。
2.根据权利要求1所述的第一试剂，其特征在于，所述校准品吡嗪酰胺的BSA溶液的浓度稀释梯度为6个，其中吡嗪酰胺的浓度范围为15～105μg/mL；
所述校准品异烟肼的BSA溶液的浓度稀释梯度为6个，其中异烟肼的浓度范围为1～19μg/mL；
所述校准品乙胺丁醇的BSA溶液的浓度稀释梯度为6个，其中乙胺丁醇的浓度范围为1～14.5μg/mL；
所述校准品利福平的BSA溶液的浓度稀释梯度为6个，其中利福平的浓度范围为0.4～13μg/mL。
3.根据权利要求2所述的第一试剂，其特征在于，所述校准品吡嗪酰胺的BSA溶液的浓度稀释梯度为15μg/mL、33μg/mL、45μg/mL、57μg/mL、75μg/mL和105μg/mL；
所述校准品异烟肼的BSA溶液的浓度稀释梯度为1μg/mL、4.6μg/mL、7μg/mL、9.4μg/mL、13μg/mL和19μg/mL；
所述校准品乙胺丁醇的BSA溶液的浓度稀释梯度为1μg/mL、3.7μg/mL、5.5μg/mL、7.3μg/mL、10μg/mL和14.5μg/mL；
所述校准品利福平的BSA溶液的浓度稀释梯度为0.4μg/mL、2.92μg/mL、4.6μg/mL、6.28μg/mL、8.8μg/mL和13μg/mL。
4.根据权利要求1所述的第一试剂，其特征在于，所述低值质控品包括浓度为20.4μg/mL的吡嗪酰胺的BSA溶液、浓度为2.08μg/mL的异烟肼的BSA溶液、浓度为1.81μg/mL的乙胺丁醇的BSA溶液和浓度为1.16μg/mL的利福平的BSA溶液；
所述中值质控品包括浓度为51μg/mL的吡嗪酰胺的BSA溶液、浓度为8.2μg/mL的异烟肼的BSA溶液、浓度为6.4μg/mL的乙胺丁醇的BSA溶液和浓度为5.44μg/mL的利福平的BSA溶液；
所述高值质控品包括浓度为82.2μg/mL的吡嗪酰胺的BSA溶液、浓度为14.44μg/mL的异烟肼的BSA溶液、浓度为11.08μg/mL的乙胺丁醇的BSA溶液和浓度为9.81μg/mL的利福平的BSA溶液。
5.根据权利要求2所述的第一试剂，其特征在于，所述样本萃取液包括吡嗪酰胺-15N,D3的甲醇溶液、异烟肼-D4的甲醇溶液、乙胺丁醇-D4的甲醇溶液和利福平-D4的甲醇溶液；
所述吡嗪酰胺-15N,D3的甲醇溶液中吡嗪酰胺-15N,D3的浓度选自0.5～5μg/ml，所述异烟肼-D4的甲醇溶液中异烟肼-D4的浓度选自0.05～1μg/ml，所述乙胺丁醇-D4的甲醇溶液中乙胺丁醇-D4的浓度选自0.01～0.05μg/ml，所述利福平-D4的甲醇溶液中利福平-D4的浓度选自0.2～2μg/ml。
6.权利要求1～5任一项所述的第一试剂，其特征在于，所述校准品、低值质控品、中值质控品和高值质控品中还含有乙二胺四乙酸二钠、柠檬酸和硫代硫酸钠。
7.非诊断目的的权利要求1～6任一项所述第一试剂在高效液相串联质谱法检测人血清中抗结核药物成分浓度中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用包括抗结核药物有效成分释放效果评价。
9.用于高效液相串联质谱法检测人血清中抗结核药物成分浓度的第二试剂，其特征在于，所述第二试剂包括第一试剂以及用于高效液相色谱的流动相A和流动相B；
所述流动相A为含有0.1％(v/v)甲酸的5mM的甲酸铵水溶液，所述流动相B为甲醇溶液。
10.用于高效液相串联质谱法检测人血清中抗结核药物成分浓度的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1～6任一项所述第一试剂或权利要求9所述的第二试剂。
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