CN112964709B - 一种样品中蛋白质的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本申请属于化学检测技术领域，具体涉及一种样品中蛋白质的检测方法。所述检测方法为采用浊度仪来测定；所述样品在酸性5‑磺基水杨酸水溶液中可溶解。该方法以浊度仪法测定蛋白质的含量，方法灵敏度高(检测限浓度3.351ng/ml、定量限浓度10.16ng/ml)，稳定性好(2小时至24小时内稳定)，准确度高，可准确的测定样品中蛋白质的量。

Description

一种样品中蛋白质的检测方法
技术领域
本申请属于化学检测技术领域，具体涉及一种样品中蛋白质的检测方法。
背景技术
酶法或发酵法生产的物质中可能含有酶或微生物组织的残留，其主要成份为蛋白质，外源性蛋白质有可能导致人体过敏等不良反应，因此，为更好的对样品进行质量控制，需对蛋白质的量进行定量检测并控制，以保证样品的安全性。
专利CN102000139A中公开了艾迪注射制剂的检测方法，其中涉及到蛋白质检查，具体内容为：蛋白质：取冻干粉针10-20mg加注射用水1ml使溶解、或取输液4-10ml浓缩至1ml、或取水针剂1ml；加新配制的30％磺基水杨酸溶液1ml，混匀，放置5分钟，不得出现浑浊。
中国药典2020年版二部葡萄糖质量标准蛋白质检查项，具体内容为：取本品1.0g，加水10ml溶解后，加磺基水杨酸(1→5)3ml，不得发生沉淀。
可见，浊度法作为蛋白质的定性检查方法已经被应用，上述两种检测的共同点均为定性检查，无法准确检测蛋白质的具体含量，目前尚无采用浊度仪法作为定量测定蛋白质的方法。
知乎帖子《蛋白质定量分析的十种方法(下)》，发表日期2020-07-21，公开了蛋白质定量分析的方法，其中提到：“浊度法蛋白质定量分析：利用沉淀剂与蛋白质反应所产生的浊度与标准溶液浊度比较而定量测得未知蛋白浓度的定量分析法。磺基水杨酸和三氯化铁是常用的蛋白质沉淀剂。30g·L-1磺基水杨酸作为沉淀剂可沉淀白蛋白、球蛋白及血红蛋白。50g·L-1三氯乙酸蛋白作沉淀剂，可沉淀白蛋白和球蛋白。”该帖子提及浊度法可以作为蛋白质的定量分析方法，但未详细说明到底怎么样操作才能实现用浊度法定量检测蛋白质的量。通过浊度比较仅可得知蛋白浓度的大致范围，但无法准确测得蛋白质的含量，在蛋白质浓度较低或相近时，肉眼的分辨率将无法确定是否有浊度或浊度的差异，无法扣除非蛋白质浊度的干扰。因此该方法仍为定性检查方法，无法准确检测蛋白质的具体含量。
专利CN101865926A中记载到：现行药典(2010年版)控制中药注射剂蛋白含量的方法沿用了以前的磺基水杨酸比浊法，控制的蛋白质限量约为37～110μg/ml左右，低于此限量的蛋白药典方法很难检出。因此，蛋白含量低于37μg/ml的中药注射剂将被视为“合格”，这导致磺基水杨酸法应用范围受限。该专利记载了浊度法测定蛋白质的方法的缺陷，即最低限量浓度过高，蛋白含量低于37μg/ml的溶液采用浊度法无法检测。
发明内容
为了解决上述的技术问题，本申请解决的技术问题在于提供一种样品中蛋白质的检测方法。本申请的检测方法能够实现样品中蛋白质的检测，且灵敏度高、准确性高与稳定性好。
有鉴于此，本申请提供了所述检测方法为浊度仪法，采用浊度仪来测定；所述样品需在酸性5-磺基水杨酸水溶液中可溶解。所述性5-磺基水杨酸水溶液浓度可以为10ppm5-磺基水杨酸溶液～5-磺基水杨酸饱和溶液。所述样品可以在酸性5-磺基水杨酸水溶液中可溶解的药品，药品辅料，食品等。
所述检测方法包括如下步骤：
(a)校正溶液的制备；
(b)供试品溶液的制备；
(c)标准品溶液的制备；
(d)测定法。
因样品溶液本身可能有浊度，需消除该浊度对蛋白质检测的干扰，所述校正溶液制备方法为：取待测样品，加溶剂溶解并配制成适宜浓度的溶液并测定该溶液的浊度，得校正溶液浊度，供试品溶液浊度扣除校正溶液浊度即为供试品溶液中蛋白质产生的浊度。
所述校正溶液溶解所用溶剂为水或适宜浓度的酸溶液。所述酸溶液为无浊度且对蛋白质生成的沉淀无干扰的酸溶液，例如盐酸溶液、硫酸溶液、硝酸溶液、磷酸溶液、甲酸溶液、乙酸溶液、甲磺酸溶液、马来酸溶液、琥珀酸溶液、酒石酸溶液、柠檬酸溶液、富马酸溶液，氢溴酸溶液，所述浓度可以为10ppm-该酸溶液的饱和溶液。
所述供试品溶液的制备方法为：取待测样品与5-磺基水杨酸，加水溶解并定量稀释制得所需浓度的溶液。
所述供试品溶液中5-磺基水杨酸的浓度为供试品溶液中蛋白质浓度的300～120000倍。
所述标准品溶液的制备方法为：取蛋白质标准品与5-磺基水杨酸，加溶剂溶解并定量稀释制得含蛋白质0～70μg/ml，并含与供试品溶液中相同浓度5-磺基水杨酸的溶液。
上述的样品中蛋白质的检测方法，详细步骤为：
5-磺基水杨酸溶液：取5-磺基水杨酸，加水溶解并定量稀释制得的溶液，记录浓度为C；
供试品溶液取待测样品，记录其质量为M1克，加5-磺基水杨酸溶液，记录5-磺基水杨酸溶液体积为V2毫升，振摇使溶解，用水定量稀释，摇匀记录稀释后的体积为V1毫升；
样品校正溶液取待测样品，记录其质量为M2克，加溶剂(水或盐酸溶液)溶解并定量稀释至V1毫升，摇匀；
标准品溶液取蛋白质标准品与5-磺基水杨酸溶液，用水制得含蛋白质0～70μg/ml、含5-磺基水杨酸浓度为C×V2/V1的线性关系溶液；
系统适用性标准品溶液浓度与相应浊度值的线性回归方程相关系数r应不小于0.99；
测定法取各标准品溶液，依法测定(中国药典2020年版通则0902第二法)，记录浊度值，计算标准品溶液浓度与相应浊度值的线性回归方程；另取溶剂、样品校正溶液、5-磺基水杨酸溶液、供试品溶液，同法测定，记录浊度值并用相应的线性回归方程计算蛋白质的含量，公式如下：
校正浊度值T＝T0-T1-(T2-T3)×(M1/M2)
含量％＝[T0-T1-(T2-T3)×(M1/M2)-b]/k×V1/M1×100％。
式中：T：校正浊度值；
T0：供试品溶液浊度值；
T1：20％5-磺基水杨酸浊度值；
T2：样品校正溶液浊度值；
T3：溶剂浊度值；
M1：供试品溶液中样品称样量；
M2：样品校正溶液中样品称样量；
V1：供试品溶液与校正溶液的体积；
b：线性回归方程中截距项；
k：线性回归方程中斜率项。
所述样品校正溶液中的溶剂为水或盐酸溶液。所述盐酸溶液的浓度为0.1mmol/L～10mol/L。
中国药典2020年版三部通则0731蛋白质含量测定法收载了6种蛋白质测定法，第2、3、4、5法均采用血清白蛋白质(牛)或蛋白质含量测定国家标准品进行相应测定。故本申请中采用血清白蛋白质(牛)来测定样品中蛋白质的含量。
本申请的样品中蛋白质的检测方法，其原理为：5-磺基水杨酸电离生成的磺酸根离子可与蛋白质中氨基酸阳离子结合，生成不溶性的蛋白质盐沉淀而产生浑浊，浊度值与蛋白质的浓度成正比。配制不同浓度的蛋白质溶液与5-磺基水杨酸反应并用浊度仪测定浊度值，浊度值与蛋白质浓度线性回归得线性方程；制备待测供试品溶液并通过浊度仪测定浊度值，浊度值代入线性方程可计算可求得蛋白质的浓度，进而计算得供试品中蛋白质的含量。
作为本发明的具体样品的检测方法，可以为：
一种头孢丙烯中蛋白质的检测方法，包括如下步骤：
5-磺基水杨酸溶液：取5-磺基水杨酸，加水溶解并定量稀释制得的溶液，记录浓度为C；
供试品溶液取头孢丙烯样品，记录其质量为M1克，加5-磺基水杨酸溶液，记录5-磺基水杨酸溶液体积为V2毫升，振摇使溶解，用水定量稀释，摇匀记录稀释后的体积为V1毫升；
样品校正溶液取头孢丙烯样品，记录其质量为M2克，加溶剂(水或盐酸溶液)溶解并定量稀释至V1毫升，摇匀；
标准品溶液取蛋白质标准品与5-磺基水杨酸溶液，用水制得含蛋白质0～70μg/ml、含5-磺基水杨酸浓度为C×V2/V1的线性关系溶液；
系统适用性标准品溶液浓度与相应浊度值的线性回归方程相关系数r应不小于0.99；
测定法取各标准品溶液，依法测定(中国药典2020年版通则0902第二法)，记录浊度值，计算标准品溶液浓度与相应浊度值的线性回归方程；另取溶剂、样品校正溶液、5-磺基水杨酸溶液、供试品溶液，同法测定，记录浊度值并用相应的线性回归方程计算蛋白质的含量，公式如下：
校正浊度值T＝T0-T1-(T2-T3)×(M1/M2)
含量％＝[T0-T1-(T2-T3)×(M1/M2)-b]/k×V1/M1×100％。
式中：T：校正浊度值；
T0：供试品溶液浊度值；
T1：20％5-磺基水杨酸浊度值；
T2：样品校正溶液浊度值；
T3：溶剂浊度值；
M1：供试品溶液中样品称样量；
M2：样品校正溶液中样品称样量；
V1：供试品溶液与校正溶液的体积；
b：线性回归方程中截距项；
k：线性回归方程中斜率项。
所述样品校正溶液中的溶剂为水或盐酸溶液。所述盐酸溶液的浓度为0.1mmol/L-12mol/L。
一种葡萄糖中蛋白质的检测方法，包括如下步骤：
5-磺基水杨酸溶液：取5-磺基水杨酸，加水溶解并定量稀释制得的溶液，记录浓度为C；
供试品溶液取葡萄糖样品，记录其质量为M1克，加5-磺基水杨酸溶液，记录5-磺基水杨酸溶液体积为V2毫升，振摇使溶解，用水定量稀释，摇匀记录稀释后的体积为V1毫升；
样品校正溶液取葡萄糖样品，记录其质量为M2克，加溶剂(水或盐酸溶液)溶解并定量稀释至V1毫升，摇匀；
标准品溶液取蛋白质标准品与5-磺基水杨酸溶液，用水制得含蛋白质0～70μg/ml、含5-磺基水杨酸浓度为C×V2/V1的线性关系溶液；
系统适用性标准品溶液浓度与相应浊度值的线性回归方程相关系数r应不小于0.99；
测定法取各标准品溶液，依法测定(中国药典2020年版通则0902第二法)，记录浊度值，计算标准品溶液浓度与相应浊度值的线性回归方程；另取溶剂、样品校正溶液、5-磺基水杨酸溶液、供试品溶液，同法测定，记录浊度值并用相应的线性回归方程计算蛋白质的含量，公式如下：
校正浊度值T＝T0-T1-(T2-T3)×(M1/M2)
含量％＝[T0-T1-(T2-T3)×(M1/M2)-b]/k×V1/M1×100％。
式中：T：校正浊度值；
T0：供试品溶液浊度值；
T1：20％5-磺基水杨酸浊度值；
T2：样品校正溶液浊度值；
T3：溶剂浊度值；
M1：供试品溶液中样品称样量；
M2：样品校正溶液中样品称样量；
V1：供试品溶液与校正溶液的体积；
b：线性回归方程中截距项；
k：线性回归方程中斜率项。
所述样品校正溶液中的溶剂为水或盐酸溶液。所述盐酸溶液的浓度为0.1mmol/L-12mol/L。
一种葡萄糖酸钙中蛋白质的检测方法，包括如下步骤：
5-磺基水杨酸溶液：取5-磺基水杨酸，加水溶解并定量稀释制得的溶液，记录浓度为C；
供试品溶液取葡萄糖酸钙样品，记录其质量为M1克，加5-磺基水杨酸溶液，记录5-磺基水杨酸溶液体积为V2毫升，振摇使溶解，用水定量稀释，摇匀记录稀释后的体积为V1毫升；
样品校正溶液取葡萄糖酸钙样品，记录其质量为M2克，加溶剂(水或盐酸溶液)溶解并定量稀释至V1毫升，摇匀；
标准品溶液取蛋白质标准品与5-磺基水杨酸溶液，用水制得含蛋白质0～70μg/ml、含5-磺基水杨酸浓度为C×V2/V1的线性关系溶液；
系统适用性标准品溶液浓度与相应浊度值的线性回归方程相关系数r应不小于0.99；
测定法取各标准品溶液，依法测定(中国药典2020年版通则0902第二法)，记录浊度值，计算标准品溶液浓度与相应浊度值的线性回归方程；另取溶剂、样品校正溶液、5-磺基水杨酸溶液、供试品溶液，同法测定，记录浊度值并用相应的线性回归方程计算蛋白质的含量，公式如下：
校正浊度值T＝T0-T1-(T2-T3)×(M1/M2)
含量％＝[T0-T1-(T2-T3)×(M1/M2)-b]/k×V1/M1×100％。
式中：T：校正浊度值；
T0：供试品溶液浊度值；
T1：20％5-磺基水杨酸浊度值；
T2：样品校正溶液浊度值；
T3：溶剂浊度值；
M1：供试品溶液中样品称样量；
M2：样品校正溶液中样品称样量；
V1：供试品溶液与校正溶液的体积；
b：线性回归方程中截距项；
k：线性回归方程中斜率项。
所述样品校正溶液中的溶剂为水或盐酸溶液。所述盐酸溶液的浓度为0.1mmol/L～10mol/L。
本申请的有益效果：
(1)本申请提供了一种样品中蛋白质的检测方法，该方法以血清白蛋白质(牛)为标准品并用浊度仪法测定蛋白质的方法，方法灵敏度高(定量限浓度10.16ng/ml)，稳定性好(2至24小时内稳定)，可准确的测定样品中蛋白质的含量。克服了现有技术中蛋白含量低于37μg/ml的溶液采用浊度法无法检测的技术偏见。
(2)系统适用性试验结果：5-磺基水杨酸溶液、样品溶液自身有一定的浊度，检测时需扣除。血清白蛋白质(牛)溶液浊度值极低，不干扰测定。
(3)稳定性试验结果：在0～2小时内，浊度值有下降趋势，2小时后各溶液的浊度值稳定，变化值均符合规定。
(4)线性关系试验结果：蛋白质在0～70μg/ml范围内与浊度值呈良好线性关系，相关系数符合规定，线性关系良好。
(5)精密度试验结果：浊度值RSD％符合规定，精密度良好。
(6)检测限与定量限试验结果：定量限浓度为10.16ng/ml；检测限浓度为3.351ng/ml。
(7)准确度试验结果：平均回收率均在90％以上，准确度良好。
(8)重复性试验结果：重复性试验均在90％以上，RSD％＜5％，结果表明重复性良好。
附图说明
图1为实施例1中线性关系试验的线性关系图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式来对本申请作更进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解本申请，但并不以此限制本发明。
本发明实施例中所用血清白蛋白质(牛)购自中国食品药品检定研究院；5-磺基水杨酸购自国药集团化学试剂有限公司；盐酸购自国药集团化学试剂有限公司；电子天平(万分之一)购自美国丹佛仪器公司；浊度仪购自美国哈希公司。
本发明实施例公开了一种样品中蛋白质的含量检测方法，所述检测方法为浊度仪法。因5-磺基水杨酸水溶液为酸性溶液，所述样品在酸性水溶液中可溶解。
所述检测方法包括如下步骤：
(a)校正溶液的制备；
(b)供试品溶液的制备；
(c)标准品溶液的制备；
(d)测定法。
所述校正溶液制备方法为：取待测样品，加溶剂溶解并配制成适宜浓度的溶液，目的为测定样品本身的浊度，供试品溶液浊度扣除校正溶液浊度即为供试品溶液中蛋白质产生的浊度。
所述校正溶液溶解所用溶剂为水或适宜浓度的酸溶液。所述适宜浓度的酸溶液为0.1mmol/L～10mol/L的盐酸溶液，优选为0.1mol/L盐酸溶液。
所述供试品溶液的制备方法为：取待测样品与5-磺基水杨酸，加水溶解并定量稀释制得所需浓度的溶液。所述供试品溶液的浓度为10ppm-样品的饱和溶液。
所述供试品溶液中5-磺基水杨酸的浓度为供试品溶液中蛋白质浓度的300～120000倍。
所述标准品溶液的制备方法为：取蛋白质标准品与5-磺基水杨酸，加溶剂溶解并定量稀释制得含蛋白质0～70μg/ml，并含与供试品溶液中相同浓度5-磺基水杨酸的溶液。
上述的样品中蛋白质的检测方法，详细步骤为：
5-磺基水杨酸溶液：取5-磺基水杨酸，加水溶解并定量稀释制得的溶液，记录浓度为C；
供试品溶液取待测样品，记录其质量为M1克，加5-磺基水杨酸溶液，记录5-磺基水杨酸溶液体积为V2毫升，振摇使溶解，用水定量稀释，摇匀记录稀释后的体积为V1毫升；
样品校正溶液取待测样品，记录其质量为M2克，加溶剂(水或盐酸溶液)溶解并定量稀释至V1毫升，摇匀；
标准品溶液取蛋白质标准品与5-磺基水杨酸溶液，用水制得含蛋白质0～70μg/ml、含5-磺基水杨酸浓度为C×V2/V1的线性关系溶液；
系统适用性标准品溶液浓度与相应浊度值的线性回归方程相关系数r应不小于0.99；
测定法取各标准品溶液，依法测定(中国药典2020年版通则0902第二法)，记录浊度值，计算标准品溶液浓度与相应浊度值的线性回归方程；另取溶剂、样品校正溶液、5-磺基水杨酸溶液、供试品溶液，同法测定，记录浊度值并用相应的线性回归方程计算蛋白质的含量，公式如下：
校正浊度值T＝T0-T1-(T2-T3)×(M1/M2)
含量％＝[T0-T1-(T2-T3)×(M1/M2)-b]/k×V1/M1×100％。
式中：T：校正浊度值；
T0：供试品溶液浊度值；
T1：20％5-磺基水杨酸浊度值；
T2：样品校正溶液浊度值；
T3：溶剂浊度值；
M1：供试品溶液中样品称样量；
M2：样品校正溶液中样品称样量；
V1：供试品溶液与校正溶液的体积；
b：线性回归方程中截距项；
k：线性回归方程中斜率项。
实施例1头孢丙烯中蛋白质的含量检测方法学验证与含量测定
1、5-磺基水杨酸的浓度与蛋白质浓度比例的确定
20％5-磺基水杨酸溶液：称取5-磺基水杨酸约40g置200ml量瓶中，加水溶解并定量稀释至刻度，摇匀，即得。
贮备溶液：取血清白蛋白质(牛)标准品约20.7mg，精密称定，加水溶解并定量稀释至250ml。
比例1：精密量取贮备溶液1、2、3、4、5ml置50ml量瓶中，加20％5-磺基水杨酸溶液2ml，得标准品溶液2、3、4、5、6；另取20％5-磺基水杨酸溶液2ml置50ml量瓶中，用水定量稀释至刻度，摇匀，得标准品溶液1。
比例2：精密量取贮备溶液1、2、3、4、5ml置50ml量瓶中，加20％5-磺基水杨酸溶液3ml，得标准品溶液2、3、4、5、6；另取20％5-磺基水杨酸溶液3ml置50ml量瓶中，用水定量稀释至刻度，摇匀，得标准品溶液1。
比例3：精密量取贮备溶液1、2、3、4、5ml置50ml量瓶中，加20％5-磺基水杨酸溶液4ml，得标准品溶液2、3、4、5、6；另取20％5-磺基水杨酸溶液4ml置50ml量瓶中，用水定量稀释至刻度，摇匀，得标准品溶液1。
比例4：精密量取贮备溶液1、2、3、4、5ml置50ml量瓶中，加20％5-磺基水杨酸溶液5ml，得标准品溶液2、3、4、5、6；另取20％5-磺基水杨酸溶液5ml置50ml量瓶中，用水定量稀释至刻度，摇匀，得标准品溶液1。
比例5：精密量取贮备溶液1、2、3、4、5ml置50ml量瓶中，加20％5-磺基水杨酸溶液10ml，得标准品溶液2、3、4、5、6；另取20％5-磺基水杨酸溶液10ml置50ml量瓶中，用水定量稀释至刻度，摇匀，得标准品溶液1。
比例6：精密量取贮备溶液10ml置50ml量瓶中，用水定量稀释至刻度，摇匀，精密量取1、2、3、4、5ml置50ml量瓶中，加20％5-磺基水杨酸溶液5ml，得标准品溶液2、3、4、5、6；另取20％5-磺基水杨酸溶液5ml置50ml量瓶中，用水定量稀释至刻度，摇匀，得标准品溶液1。
比例7：精密量取贮备溶液5ml置50ml量瓶中，用水定量稀释至刻度，摇匀，精密量取1、2、3、4、5ml置50ml量瓶中，加20％5-磺基水杨酸溶液5ml，得标准品溶液2、3、4、5、6；另取20％5-磺基水杨酸溶液5ml置50ml量瓶中，用水定量稀释至刻度，摇匀，得标准品溶液1。
测定法：取各标准品溶液，依法测定(中国药典2020年版通则0902第二法)，记录浊度值，计算标准品溶液浓度与相应浊度值的线性回归方程。测定结果见表1～表5。
可接受限度：相关系数≥0.99。
表1线性关系试验数据-比例1(2ml)
Figure BDA0002943729740000091
表2线性关系试验数据-比例2(3ml)
Figure BDA0002943729740000092
表3线性关系试验数据-比例3(4ml)
Figure BDA0002943729740000101
表4线性关系试验数据-比例4(5ml)
Figure BDA0002943729740000102
表5线性关系试验数据-比例5(10ml)
Figure BDA0002943729740000103
表6线性关系试验数据-比例6
Figure BDA0002943729740000104
表7线性关系试验数据-比例7
Figure BDA0002943729740000105
Figure BDA0002943729740000111
各比例的线性回归方程参数见表8。
表8各比例的线性回归方程参数
名称 截距 斜率 相关系数
比例1(2ml磺基水杨酸) -0.0435 2.779 0.9993
比例2(3ml磺基水杨酸) -0.0243 2.336 0.9995
比例3(4ml磺基水杨酸) 0.3687 1.870 0.9986
比例4(5ml磺基水杨酸) -1.810 1.761 0.9931
比例5(10ml磺基水杨酸) 0.5606 2.160 0.9995
比例6 0.1287 2.282 0.9996
比例7 0.0928 1.980 0.9942
结论：结果表明蛋白质在0～73.76μg/ml范围内与浊度值呈良好线性关系，相关系数符合规定，线性关系良好；上述各线性关系试验溶液中5-磺基水杨酸浓度与蛋白质浓度比为300-120000。
2、专属性试验
空白溶剂：水；
20％5-磺基水杨酸溶液：称取5-磺基水杨酸40.0592g置200ml量瓶中，加水溶解并定量稀释至刻度，摇匀，即得。
0.1mol/L盐酸溶液：精密量取盐酸5ml置500ml量瓶中，用水溶解并定量稀释至刻度，摇匀，即得。
5-磺基水杨酸溶液：精密量取20％5-磺基水杨酸溶液5ml置50ml量瓶中，用水定量稀释至刻度，摇匀，即得。
血清白蛋白质(牛)溶液：取血清白蛋白质(牛)标准品约20.7mg，精密称定，加水溶解并定量稀释至250ml，作为血清白蛋白质(牛)贮备溶液，精密量取3ml置50ml量瓶中，用水定量稀释至刻度，摇匀，即得。
样品溶液：取待测样品0.4990g置50ml量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液溶解并定量稀释至刻度，摇匀，即得。
血清白蛋白质(牛)溶液(0.1mol/L盐酸溶液)：取血清白蛋白质(牛)贮备溶液3ml置50ml量瓶中，用0.1mol/L盐酸溶液定量稀释至刻度，摇匀，即得。
标准品溶液：取血清白蛋白质(牛)贮备溶液3ml置50ml量瓶中，加20％5-磺基水杨酸溶液5ml，振摇使溶解，用水定量稀释至刻度，摇匀，即得。
供试品溶液：称取待测样品0.4990g置50ml量瓶中，加血清白蛋白质(牛)贮备溶液3ml，加20％5-磺基水杨酸溶液5ml，振摇使溶解，用水定量稀释至刻度，摇匀，即得。
检测及结果：取上述溶液，静置2小时，依法测定(中国药典2020年版通则0902第二法)，记录浊度值。
结果表明：(1)5-磺基水杨酸溶液、样品溶液自身有一定的浊度，检测时需扣除；
(2)血清白蛋白质(牛)溶液浊度值极低，不干扰测定；
(3)血清白蛋白质(牛)溶液(0.1mol/L盐酸溶液)校正浊度值与血清白蛋白质(牛)溶液(水)校正浊度值基本一致，表明0.1mol/L盐酸溶液与蛋白质无沉淀反应。
检测结果见表9。
表9专属性试验浊度检测数据
专属性试验 单位(NTU)
血清白蛋白质(牛)溶液 校正浊度值(扣除水浊度值)：0.030
血清白蛋白质(牛)溶液(0.1mol/L盐酸溶液) 校正浊度值(扣除0.1mol/L盐酸溶液浊度值)：0.039
5-磺基水杨酸溶液 0.252
血清白蛋白质(牛)溶液 0.056
样品溶液 0.364
标准品溶液 14.9
供试品溶液 14.9
3、稳定性试验
可接受限度：24小时内浊度值变化的绝对值不得大于2小时浊度值的5.0％。
测定法：取1项下5-磺基水杨酸溶液、标准品溶液、供试品溶液，分别于0小时、1小时、2小时、4小时、8小时、24小时测定浊度值，测定结果见表10。
表10专属性试验浊度检测数据(单位：NTU)
稳定性试验 0小时 1小时 2小时 4小时 8小时 24小时 MAX
5-磺基水杨酸溶液 0.274 0.264 0.258 0.255 0.258 0.258 1.2％
标准品溶液 16.7 15.1 14.9 14.9 14.6 14.6 2.0％
供试品溶液 17.4 15.6 14.9 14.9 14.7 14.6 2.0％
结论：在0～2小时内，浊度值有下降趋势，2小时后各溶液的浊度值稳定，变化值均符合规定。
4、线性关系试验
贮备溶液：取血清白蛋白质(牛)标准品约20.7mg，精密称定，加水溶解并定量稀释至250ml。
线性关系试验溶液：精密量取贮备溶液1、2、3、4、5ml置50ml量瓶中，加20％5-磺基水杨酸溶液5ml，得标准品溶液2、3、4、5、6；另取20％5-磺基水杨酸溶液5ml置50ml量瓶中，用水定量稀释至刻度，摇匀，得标准品溶液1。
测定法：取各标准品溶液，依法测定(中国药典2020年版通则0902第二法)，记录浊度值，计算标准品溶液浓度与相应浊度值的线性回归方程。测定结果见表11。
可接受限度：相关系数≥0.99。
表11线性关系试验数据
名称 V(ml) 浓度(μg/ml) 浊度值(NTU)
线性关系试验溶液1 0 0 0.139
线性关系试验溶液2 1 1.656 5.30
线性关系试验溶液3 2 3.312 9.37
线性关系试验溶液4 3 4.968 13.4
线性关系试验溶液5 4 6.624 17.7
线性关系试验溶液6 5 8.280 23.1
得线性关系图见图1。
得线性方程：A＝2.692C+0.3561，R＝0.9987。
结论：结果表明蛋白质在0～8.280μg/ml范围内与浊度值呈良好线性关系，相关系数符合规定，线性关系良好
5、系统精密度试验
确定在该检测条件下，仪器重复多次地完成同一变化过程所对应的结果变化。
供试品溶液：线性关系试验溶液4。
测定法：取供试品溶液，依法测定(中国药典2020年版通则0902第二法)，记录浊度值，连续测定6次，测定结果见表12。
可接受标准：浊度值RSD％≤5.0％。
表12精密度试验数据
精密度试验 1 2 3 4 5 6 平均 RSD％
浊度值(NTU) 13.6 13.5 13.6 13.5 13.5 13.5 13.5 0.38
结论：RSD％符合规定，精密度良好。
6、检测限与定量限试验
检测限：确定在该检测条件下，样品可以被检出的最低限度；
定量限：确定在该检测条件下，样品可以被准确定量的最低量。
测定法：取标准品溶液(1)测定浊度值，连续测定7次。按下列公式计算检测限及定量限。
检测限：DL＝3.3σ/S
定量限：QL＝10σ/S
σ：标准偏差，S：线性关系方程斜率。
测定结果见表13。
可接受限度：定量限浓度应小于线性关系试验2浓度。
表13检测限定量限试验数据
Figure BDA0002943729740000141
结论：符合规定，灵敏度良好。
7、准确度试验
确定待测样品用所确定的方法检测测定的结果与真实值接近的程度。
可接受限度：80％～115％。
准确度试验贮备溶液：同线性关系试验项下贮备溶液。
标准品溶液：同线性关系试验项下标准品溶液1、2、3、4、5、6。
样品校正溶液：称取待测样品0.5017g置50ml量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液溶解并定量稀释至刻度，摇匀，即得。
准确度供试品溶液：取待测样品原料约0.5g，精密称定，置50ml量瓶中，加入相应准确度贮备溶液，加入20％5-磺基水杨酸5ml，振摇使溶解，用水定量稀释至刻度，摇匀，即得。配制方法见表14。
表14准确度试验供试品溶液的配制方法
No 名称 样品(g) 准确度试验贮备溶液(ml) 定容至(ml)
1 空白供试品溶液 0.5 0 50
2 回收率1-1 0.5 1 50
3 回收率1-2 0.5 1 50
4 回收率1-3 0.5 1 50
5 回收率2-1 0.5 3 50
6 回收率2-2 0.5 3 50
7 回收率2-3 0.5 3 50
8 回收率3-1 0.5 4.5 50
9 回收率3-2 0.5 4.5 50
10 回收率3-3 0.5 4.5 50
测定法：取20％5-磺基水杨酸溶液、标准品溶液与准确度试验供试品溶液，静置2小时后测定。
取各标准品溶液，依法测定(中国药典2020年版通则0902第二法)，记录浊度值，计算标准品溶液浓度与相应浊度值的线性回归方程。另取0.1mol/L盐酸溶液、样品校正溶液、20％5-磺基水杨酸溶液、准确度试验供试品溶液，同法测定，记录浊度值并用相应的线性回归方程计算蛋白质的测得量与回收率，并计算回收率的平均值与相对标准偏差。测定结果见表15。
计算公式：
校正浊度值T＝T0-T1-(T2-T3)×(M1/M2)
M测＝[T0-T1-(T2-T3)×(M1/M2)-b]/k×50
回收率％＝M测/M投×100％。
式中：T：校正浊度值；
T0：供试品溶液浊度值；
T1：20％5-磺基水杨酸浊度值；
T2：样品校正溶液浊度值；
T3：0.1mol/L盐酸溶液浊度值；
M1：供试品溶液中样品称样量；
M2：样品校正溶液中样品称样量；
M测：供试品溶液中蛋白质测得量；
M投：供试品溶液中蛋白质投入量；
b：线性回归方程中截距项；
k：线性回归方程中斜率项。
表15准确度试验数据
Figure BDA0002943729740000151
结论：结果表明准确度良好。
8、重复性试验
确定同一份供试品，由同一分析人员经多次取样测定所得结果之间的接近程度。
可接受限度：RSD％≤5.0％。
重复性试验贮备溶液：配制方法同线性关系试验项下贮备溶液。
标准品溶液：制备方法线同性关系试验项下标准品溶液1、2、3、4、5、6。
样品校正溶液：同准确度试验样品校正溶液。
重复性试验供试品溶液：取待测样品原料约0.5g，精密称定，置50ml量瓶中，加入重复性试验贮备溶液3ml，加入20％5-磺基水杨酸5ml，振摇使溶解，用水定量稀释至刻度，摇匀，即得。平行制备6份，按准确度试验项同法制备空白供试品溶液。制备数据见表16。
表16重复性试验供试品溶液的配制方法
No 名称 样品(g) 重复性试验贮备溶液(ml) 定容至(ml)
1 空白供试品溶液 0.5021 0 50
2 重复性试验1 0.5028 3 50
3 重复性试验2 0.4980 3 50
4 重复性试验3 0.4967 3 50
5 重复性试验4 0.4978 3 50
6 重复性试验5 0.5049 3 50
7 重复性试验6 0.5029 3 50
测定法：取20％5-磺基水杨酸溶液、标准品溶液与重复性试验供试品溶液，静置2小时后测定。
取各标准品溶液，依法测定(中国药典2020年版通则0902第二法)，记录浊度值，计算标准品溶液浓度与相应浊度值的线性回归方程。另取0.1mol/L盐酸溶液、样品校正溶液、20％5-磺基水杨酸溶液、重复性试验供试品溶液，同法测定，记录浊度值并用相应的线性回归方程计算蛋白质的测得量与回收率，并计算回收率的平均值与相对标准偏差。测定结果见表17～表18。
表17线性关系试验数据
名称 V(ml) 浓度(μg/ml) 浊度值(NTU)
线性关系试验溶液1 0 0 0.164
线性关系试验溶液2 1 1.656 5.08
线性关系试验溶液3 2 3.312 8.93
线性关系试验溶液4 3 4.968 13.0
线性关系试验溶液5 4 6.624 16.6
线性关系试验溶液6 5 8.280 21.4
得线性方程：A＝2.498C+0.5188，R＝0.9990。
表18重复性试验数据
Figure BDA0002943729740000161
结论：结果表明重复性良好。
实施例2葡萄糖中蛋白质的含量检测方法学验证
1、线性关系试验
贮备溶液：取血清白蛋白质(牛)标准品20.51mg，精密称定，加水溶解并定量稀释至250ml。
线性关系试验溶液：精密量取贮备溶液1、2、3、4、5、10、25、45ml置50ml量瓶中，加20％5-磺基水杨酸溶液5ml，用水定量稀释至刻度，摇匀，得标准品溶液2、3、4、5、6、7、8、9；取20％5-磺基水杨酸溶液5ml置50ml量瓶中，用水定量稀释至刻度，摇匀，得标准品溶液1。
测定法：取各标准品溶液，依法测定(中国药典2020年版通则0902第二法)，记录浊度值，计算标准品溶液浓度与相应浊度值的线性回归方程。测定结果见表19。
可接受限度：相关系数≥0.99。
表19线性关系试验数据
名称 V(ml) 浓度(μg/ml) 浊度值(NTU)
线性关系试验溶液1 0 0 0.172
线性关系试验溶液2 1 1.639 3.2
线性关系试验溶液3 2 3.278 5.28
线性关系试验溶液4 3 4.918 8.0
线性关系试验溶液5 4 6.557 11.3
线性关系试验溶液6 5 8.196 12.3
线性关系试验溶液7 10 16.39 24.1
线性关系试验溶液8 25 40.98 58.6
线性关系试验溶液9 45 73.76 135
得线性方程：A＝1.761-1.8101，R＝0.9931。
结论：结果表明蛋白质在0～73.76μg/ml范围内与浊度值呈良好线性关系，相关系数符合规定，线性关系良好。
2、准确度试验
确定待测样品用所确定的方法检测测定的结果与真实值接近的程度。
可接受限度：80％～115％。
准确度试验贮备溶液：配制方法同线性关系试验项下贮备溶液。
标准品溶液：同线性关系试验项下标准品溶液1、2、3、4、5、6、7、8、9。
样品校正溶液：称取待测样品0.5004g置50ml量瓶中，加水溶解并定量稀释至刻度，摇匀，即得。
准确度供试品溶液：取待测样品原料约0.5g，精密称定，置50ml量瓶中，分别加入准确度贮备溶液5、10、25ml，加入20％5-磺基水杨酸5ml，振摇使溶解，用水定量稀释至刻度，摇匀，得准确度试验用空白样品、低浓度样品、中浓度样品、高浓度样品溶液。
测定法：取20％5-磺基水杨酸溶液、标准品溶液与准确度试验供试品溶液，静置2小时后测定。
取各标准品溶液，依法测定(中国药典2020年版通则0902第二法)，记录浊度值，计算标准品溶液浓度与相应浊度值的线性回归方程。另取水、样品校正溶液、20％5-磺基水杨酸溶液、准确度试验供试品溶液，同法测定，记录浊度值并用相应的线性回归方程计算蛋白质的测得量与回收率，并计算回收率的平均值与相对标准偏差。测定结果见表20。
计算公式：
校正浊度值T＝T0-T1-(T2-T3)×(M1/M2)
M测＝[T0-T1-(T2-T3)×(M1/M2)-b]/k×50
回收率％＝M测/M投×100％。
式中：T：校正浊度值；
T0：供试品溶液浊度值；
T1：20％5-磺基水杨酸浊度值；
T2：样品校正溶液浊度值；
T3：水浊度值；
M1：供试品溶液中样品称样量；
M2：样品校正溶液中样品称样量；
M测：供试品溶液中蛋白质测得量；
M投：供试品溶液中蛋白质投入量；
b：线性回归方程中截距项；
k：线性回归方程中斜率项。
表20准确度试验数据
准确度试验 回收率％
回收率-低
回收率-中 87.4
回收率-高 84.7
结论：结果表明准确度良好。
实施例3葡萄糖酸钙中蛋白质的含量检测方法学验证与含量测定
1、线性关系试验
贮备溶液：取血清白蛋白质(牛)标准品20.55mg，精密称定，加水溶解并定量稀释至250ml。
线性关系试验溶液：精密量取贮备溶液1、2、3、4、5ml置50ml量瓶中，加20％5-磺基水杨酸溶液5ml，用水定量稀释至刻度，摇匀，得标准品溶液2、3、4、5、6；取20％5-磺基水杨酸溶液5ml置50ml量瓶中，用水定量稀释至刻度，摇匀，得标准品溶液1。
测定法：取各标准品溶液，依法测定(中国药典2020年版通则0902第二法)，记录浊度值，计算标准品溶液浓度与相应浊度值的线性回归方程。测定结果见表21。
可接受限度：相关系数≥0.99。
表21线性关系试验数据
名称 V(ml) 浓度(μg/ml) 浊度值(NTU)
线性关系试验溶液1 0 0 0.160
线性关系试验溶液2 1 1.644 3.86
线性关系试验溶液3 2 3.288 7.43
线性关系试验溶液4 3 4.932 11.2
线性关系试验溶液5 4 6.576 15.5
线性关系试验溶液6 5 8.220 19.3
得线性方程：A＝2.236C-0.0243，R＝0.9995。
结论：结果表明蛋白质在0～8.220μg/ml范围内与浊度值呈良好线性关系，相关系数符合规定，线性关系良好。
2、准确度试验
确定待测样品用所确定的方法检测测定的结果与真实值接近的程度。
可接受限度：80％～115％。
准确度试验贮备溶液：配制方法同线性关系试验项下贮备溶液。
标准品溶液：同线性关系试验项下标准品溶液1、2、3、4、5、6。
样品校正溶液：称取待测样品0.5169g置50ml量瓶中，加水溶解并定量稀释至刻度，摇匀，即得。
准确度供试品溶液：取待测样品原料约0.5g，精密称定，置50ml量瓶中，分别加入准确度贮备溶液1、3、4.5ml，加入20％5-磺基水杨酸5ml，振摇使溶解，用水定量稀释至刻度，摇匀，得准确度试验用空白样品、低浓度样品、中浓度样品、高浓度样品溶液。
测定法：取20％5-磺基水杨酸溶液、标准品溶液与准确度试验供试品溶液，静置2小时后测定。
取各标准品溶液，依法测定(中国药典2020年版通则0902第二法)，记录浊度值，计算标准品溶液浓度与相应浊度值的线性回归方程。另取水、样品校正溶液、20％5-磺基水杨酸溶液、准确度试验供试品溶液，同法测定，记录浊度值并用相应的线性回归方程计算蛋白质的测得量与回收率，并计算回收率的平均值与相对标准偏差。测定结果见表22。
计算公式：
校正浊度值T＝T0-T1-(T2-T3)×(M1/M2)
M测＝[T0-T1-(T2-T3)×(M1/M2)-b]/k×50
回收率％＝M测/M投×100％。
式中：T：校正浊度值；
T0：供试品溶液浊度值；
T1：20％5-磺基水杨酸浊度值；
T2：样品校正溶液浊度值；
T3：水浊度值；
M1：供试品溶液中样品称样量；
M2：样品校正溶液中样品称样量；
M测：供试品溶液中蛋白质测得量；
M投：供试品溶液中蛋白质投入量；
b：线性回归方程中截距项；
k：线性回归方程中斜率项。
表22准确度试验数据
准确度试验 回收率％
回收率-低 90.9
回收率-中 99.3
回收率-高 101.5
结论：结果表明准确度良好。

Claims (4)

1.一种样品中蛋白质的含量检测方法，其特征在于，所述检测方法为采用浊度仪来测定；所述样品在酸性5-磺基水杨酸水溶液中可溶解；所述样品为头孢丙烯或葡萄糖或葡萄糖酸钙；
详细步骤为：
5-磺基水杨酸溶液：取5-磺基水杨酸，加水溶解并定量稀释制得的溶液，记录浓度为C；
供试品溶液 取待测样品，记录其质量为M1克，加5-磺基水杨酸溶液，记录5-磺基水杨酸溶液体积为V2毫升，振摇使溶解，用水定量稀释，摇匀记录稀释后的体积为V1毫升；
样品校正溶液 取待测样品，记录其质量为M2克，加溶剂溶解并定量稀释至V1毫升，摇匀；
标准品溶液 取蛋白质标准品与5-磺基水杨酸溶液，用水制得含蛋白质0～70μg/ml、含5-磺基水杨酸浓度为C×V2/V1的线性关系溶液；
系统适用性标准品溶液浓度与相应浊度值的线性回归方程相关系数r应不小于0.99；
测定法取各标准品溶液，依法测定，记录浊度值，计算标准品溶液浓度与相应浊度值的线性回归方程；另取溶剂、样品校正溶液、5-磺基水杨酸溶液、供试品溶液，同法测定，记录浊度值并用相应的线性回归方程计算蛋白质的含量，公式如下：
校正浊度值T＝T0-T1-(T2-T3)×(M1/M2)
含量％＝[T0-T1-(T2-T3)×(M1/M2)-b]/k×V1/M1×100％；
式中：T：校正浊度值；
T0：供试品溶液浊度值；
T1：20％5-磺基水杨酸浊度值；
T2：样品校正溶液浊度值；
T3：溶剂浊度值；
M1：供试品溶液中样品称样量；
M2：样品校正溶液中样品称样量；
V1：供试品溶液与校正溶液的体积；
b：线性回归方程中截距项；
k：线性回归方程中斜率项。
2.根据权利要求1所述的样品中蛋白质的含量检测方法，其特征在于，所述供试品溶液中5-磺基水杨酸的浓度为供试品溶液中蛋白质浓度的300-120000倍。
3.根据权利要求1所述的样品中蛋白质的含量检测方法，其特征在于，所述标准品溶液的制备方法为：取蛋白质标准品与5-磺基水杨酸，加溶剂溶解并定量稀释制得含蛋白质0～70μg/ml并含与供试品溶液中相同浓度5-磺基水杨酸的溶液。
4.根据权利要求1所述的样品中蛋白质的含量检测方法，其特征在于，所述样品校正溶液中溶剂为水或盐酸溶液。
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