CN117554535B - 一种液相色谱检测人尿液中草酸的检测方法以及试剂盒 - Google Patents

一种液相色谱检测人尿液中草酸的检测方法以及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及分析检测技术领域，尤其涉及一种液相色谱检测人尿液中草酸的检测方法以及试剂盒。所述检测方法包括：检测前对待测样品进行衍生处理，所述衍生处理包括：将所述待测样品与衍生试剂混合，得到混合溶液；其中，所述衍生试剂包括邻苯二胺和70~80wt%的磷酸水溶液；所述衍生试剂中，所述邻苯二胺和70~80wt%的磷酸水溶液的用量比为7~13 mg：1 ml；所述待测样品与衍生试剂的体积比为7~9：1。本发明采用上述衍生化处理方法，能够显著提升衍生试剂的稳定性，大大延长衍生试剂的保存时间，还能降低衍生化反应的温度至80℃以下；同时，还能提高草酸检测的加标回收率，进一步提升了检测的准确度。

Description

一种液相色谱检测人尿液中草酸的检测方法以及试剂盒
技术领域
本发明涉及分析检测技术领域，尤其涉及一种液相色谱检测人尿液中草酸的检测方法以及试剂盒。
背景技术
人体体液内草酸浓度的检测方法包括氧化滴定法、比色法、原子吸收光谱法、酶分析法、极谱描记法、同位素稀释法、离子特异性电极法和各种色谱法等。其中，高效液相色谱法（HPLC）凭借其灵敏度高、操作简单、重现性好等优势特点而倍受研究者的青睐。
目前，有关使用高效液相色谱法测定草酸的现有技术中，不乏已经使用高效液相色谱法来测定草酸的方案，比如专利CN104101679A以及文献《高效液相色谱法测定血和尿中的草酸》（张惠静,张世德,任建敏等.第三军医大学学报,1997(01):91-92.）等，均是以邻苯二胺和浓盐酸作为衍生试剂，与血和尿中草酸在高温（100～140℃）条件下反应生成具有强紫外吸收化合物2，3-二羟基喹喔啉，而后通过反相柱分离，从而进行血和尿中草酸的测定。但该方法存在衍生试剂稳定性差的问题，邻苯二胺和浓盐酸混合后保存时间较短，因此检测时需要现配现用，这不仅造成了衍生试剂的浪费，也一定程度上导致了使用的不便。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
针对上述技术问题，本发明意外发现，衍生试剂的稳定性差的原因与浓盐酸有关。后续通过大量研究后进一步发现，使用70~80wt%的磷酸水溶液和邻苯二胺作为衍生试剂时，不仅能够显著提升衍生试剂的稳定性，使其保存时间大大延长，还能大大降低衍生化反应的温度；同时，使用上述衍生试剂处理后还能提高草酸检测的加标回收率，检测准确度进一步提升。
基于此，本发明具有如下技术方案：
第一方面，本发明首先提供液相色谱检测人尿液中草酸的检测方法，包括：检测前对待测样品进行衍生处理，所述衍生处理包括：
将待测样品与衍生试剂混合，得到混合溶液；其中，所述衍生试剂包括邻苯二胺和70~80wt%的磷酸水溶液；
所述衍生试剂中，所述邻苯二胺和70~80wt%的磷酸水溶液的用量比为7~13 mg：1ml；所述待测样品与衍生试剂的体积比为7~9：1。
本发明发现，采用上述衍生化处理方法，能够显著提升衍生试剂的稳定性，大大延长衍生试剂的保存时间，还能降低衍生化反应的温度至80℃以下，使衍生化反应在水浴下即可实现；同时，使用上述衍生试剂处理后还能提高草酸检测的加标回收率，进一步提升了检测的准确度。
进一步优选地，所述磷酸水溶液的浓度为73~77wt%，可以选择73wt%、74wt%、75wt%、76wt%或77wt%。
进一步优选地，所述衍生试剂中，所述邻苯二胺和70~80wt%的磷酸水溶液的用量比为10 mg：1 ml。
作为优选，所述衍生处理的时间为0.75~1.5 h；进一步优选为1h。
进一步优选地，所述待测样品与衍生试剂的体积比为8：1。
作为优选，所述的液相色谱检测人尿液中草酸的检测方法包括：将所述混合溶液进行离心，取上清液进行液相色谱检测。
本发明中，采用上述衍生化处理后，可以选择不调整衍生后产物的pH，而直接离心对上清液进行液相色谱检测，这对检测效果无影响。但考虑到长时间检测可能会对设备造成影响，也可以在衍生化处理后对pH进行调整。
本发明中，可以使用本领域检测草酸时的常规流动相，进一步优选地，使用以下流动相A和流动相B进行等度洗脱：流动相A为体积分数为0.05~0.15%的甲酸水溶液；流动相B为甲醇。
更进一步地，流动相A为体积分数为0.1%的甲酸水溶液。
作为优选，所述流动相A与所述流动相B的体积比为83~87：13~17，进一步优选为85：15。
作为优选，所述液相色谱检测使用的色谱柱为C18柱；进一步优选为C18 5μm 4.6×150mm。
作为优选，所述液相色谱检测中，进样量为5~20 μL。
作为本发明的一种优选实施方案，所述液相色谱检测人尿液中草酸的检测方法包括如下步骤：
S1：衍生试剂配制
将邻苯二胺与70~80wt%的磷酸水溶液配制为7~13 mg/mL的衍生试剂，并在2~8℃保存；
具体实施中，本领域技术人员可以采用常规的配制方法，配制得到上述浓度的衍生试剂。如配制10 mg/mL的衍生试剂时，采用以下步骤：精确称取500 mg左右邻苯二胺，转移至50.00mL的容量瓶中，加一定量75wt%磷酸水溶液，盖上瓶塞防止渗漏，上下颠倒，超声至邻苯二胺完全溶解后，加75wt%磷酸定容至50.00mL，得10 mg/mL的衍生试剂。
上述浓度实际生产时可以进行等比例放大，具体步骤包括：以生产2.5 L样本萃取液为例，精确称取25 g邻苯二胺，转移至2.5 L的容量瓶中加一定量75wt%磷酸水溶液，盖上瓶塞防止渗漏，上下颠倒，超声至邻苯二胺完全溶解后，加75wt%磷酸水溶液定容至2.5 L。
S2：待测样品处理方法
1）将待测样品与所述衍生试剂混合，得到混合溶液，将所述混合溶液在60~80℃下衍生0.75~1.5 h；其中，所述待测样品与所述衍生试剂的体积比为7~9：1；
2）将衍生后的所述混合溶液在2~8℃、10000 rpm下离心5~10 min，上清液进行液相色谱检测；
具体实施过程中，本领域技术人员可以将所述上清液置于96孔U型板中，而后将96孔板置于液相中进行检测，在此不作限定。
S3：液相分析
色谱条件见表1：
表1
本发明中，通过控制上述进样量，可适配不同灵敏度的仪器。
进一步优选地，流动相的流速为1 mL/min。
进一步优选地，自动进样器的条件参数包括：
进样模式：满环携带进样；注射泵速度：中速；进样针高度：2.5 mm；洗针次数：3次。
第二方面，本发明提供上述检测方法在诊断肾结石病症方面的应用。
草酸钙是最常见的结石，主要是由于体内钙和草酸水平之间的不平衡或缺乏足够的结晶抑制剂而形成的。尿草酸过多或高草酸尿症的原因可根据病因和临床表现的严重程度分为原发性（罕见）和继发性（常见）高草酸尿症。本发明利用高效液相色谱法实现对尿液中草酸浓度测定，辅助肾结石病症的诊断。
第三方面，本发明提供上述检测方法在制备试剂或试剂盒方面的应用。
第四方面，本发明提供一种用于实施上述检测方法的试剂盒，包括衍生试剂和待测样品；所述待测样品包括人尿液、校准品和质控品中的至少一种。
作为优选，所述试剂盒中还含有流动相。
作为优选，所述试剂盒中还含有甲醇和体积分数为0.05~0.15%的甲酸水溶液。
作为优选，所述校准品中草酸的浓度范围为10~250 μg/mL；所述质控品中草酸的浓度范围为30~187 μg/mL。
第五方面，本发明提供上述检测盒在诊断肾结石病症方面的应用。
第六方面，本发明提供一种衍生试剂，其包括邻苯二胺和70~80wt%的磷酸水溶液。
作为优选，所述衍生试剂由邻苯二胺和磷酸水溶液组成。
进一步优选地，所述磷酸水溶液的浓度为70~80wt%。
作为优选，所述衍生试剂中，所述邻苯二胺和70~80wt%的磷酸水溶液的用量比为7~13 mg：1 ml。
进一步优选地，所述衍生试剂中，所述邻苯二胺和70~80wt%的磷酸水溶液的用量比为10 mg：1 ml。
第七方面，本发明提供所述衍生试剂在草酸的液相色谱检测中的应用。
作为优选，所述应用包括：检测前对待测样品进行衍生处理，所述衍生处理包括：
将待测样品与衍生试剂混合，并在60~80℃下进行衍生，得到混合溶液；其中，所述衍生试剂包括邻苯二胺和70~80wt%的磷酸水溶液。
作为优选，所述应用还包括：将衍生后的所述混合溶液进行离心，取上清液进行液相色谱检测。
基于上述技术方案，本发明的有益效果在于：
本发明通过优化衍生试剂，不仅大大降低衍生化反应的温度，还能显著提升衍生试剂的稳定性，使其保存时间大大延长，填补了市场上诊断人体尿液中草酸高效液相色谱法试剂盒的空白；同时，使用上述衍生试剂处理后还能提高草酸检测的加标回收率，检测准确度进一步提升，从而获得了一种能准确、高效地评价人尿液中草酸的高效液相色谱法检测方法以及试剂盒。该试剂盒能满足相关法规对试剂盒的线性、重复性、批间差、准确度、稳定性等的要求，对监测人尿液中草酸有重要作用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明提供的实施例1检测方法检测人尿液样本的色谱图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
若非特别说明，实施例中所用的各种原料均为市售常规原料，所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
本实施例首先提供一种液相色谱检测人尿液中草酸的检测方法，实验条件和方法具体如下：
1、试剂、标准品、质控品、重要耗材信息见表2：
表2
2、仪器
2.1 分析仪器见表3：
表3
2.2 其他仪器见表4：
表4
3、检测方法步骤
3.1实验操作
3.1.1工作校准品及质控品配制
（1）草酸储备液的配制
精密称取草酸标准品适量，置于合适的容量瓶中，加入水定容混匀，配制成10 mg/mL草酸储备液，标记为SSC-OA。
3.1.2产品校准品及质控品配制
（1）校准品S6配制见表5：
表5
（2）校准品S1~ S5配制见表6：
表6
（3）质控品配制见表7：
表7
3.1.3衍生剂配制
精确称取500 mg左右邻苯二胺，转移至50.00 mL的容量瓶中，加一定量75wt%磷酸，盖上瓶塞防止渗漏，上下颠倒，超声至邻苯二胺完全溶解后，加75wt%磷酸定容至50.00mL，得10 mg/mL的衍生试剂，2~8℃保存。
实际生产可以等比例放大：以生产2.5 L样本萃取液为例，精确称取25 g邻苯二胺，转移至2.5 L的容量瓶中加一定量75wt%磷酸，盖上瓶塞防止渗漏，上下颠倒，超声至邻苯二胺完全溶解后，加75wt%磷酸定容至2.5 L。
3.2 样品处理方法
1）精密移取100 μL校准品、质控品、样本溶液，分别加入到2 mL离心管中；
2）精密移取250 μL衍生剂，分别加入到以上对应的离心管中，混合均匀；
3）将混合后的样本放置于80℃水浴锅中1 h；
4）将处理后样本4 ℃、10000 rpm离心2 min。取200 μL的上清液置于96孔U型板中；
5）检测：将96孔板置于液相中，进行检测。
3.3 液相分析
1）色谱条件见表8：
表8
2）等度洗脱条件见表9：
表9
采用上述检测方法检测人尿液样本的色谱图如图1所示。
此外，本实施例还提供了用于实施上述检测方法的配套试剂盒，试剂盒中包括试剂见表10：
表10
4.1试剂盒外观
4.1.1外观
1）验证方法：随机取试剂盒中校准品各1瓶，在自然光下以矫正视力目视观察。
2）接受标准：包装完整、无破损；最小包装标签的文字、内容应清晰、准确，封口严密，无渗漏；组分应澄清，无沉淀、颗粒或絮状物。
4.1.2实验结果：
（a）试剂盒的各组份应齐全、完整、无破损。
（b）最小包装标签的文字、内容应清晰、准确，封口严密，无渗漏。
（c）液体组分应澄清、透明，无沉淀、颗粒或絮状物。
4.1.3结论：包装完整、无破损；最小包装标签的文字、内容清晰、准确，封口严密，无渗漏；组分澄清，无沉淀、颗粒或絮状物，满足接受标准。
4.2试剂盒装量
4.2.1装量
1）验证方法：随机取1试剂盒，用通用量具测量各液体组分的净含量。
2）接受标准：试剂盒中各液体试剂的净含量应不少于标示值。
4.2.2实验结果见表11：
表11
4.2.3结论：试剂盒中各液体试剂的净含量不少于标示值，满足接受标准。
4.3试剂盒线性范围
4.3.1线性范围
1）验证方法：按样品处理方法处理待测产品校准品S1~S6溶液，每个浓度重复测试3次。可参考公式计算线性回归的相关系数r，相关系数r应≥0.990。
；
：线性回归相关系数；
：S1~S6的浓度；
：对应浓度校准品中目标物的峰面积。
2）接受标准：草酸线性回归的相关系数≥0.990。
4.3.2实验结果见表12：
表12
4.3.3结论：草酸线性回归的相关系数均≥0.990，满足接受标准。
4.4试剂盒重复性
4.4.1重复性
1）验证方法：在重复性条件下，按照检验方法使用试剂盒测试质控品，重复测试10次。可参考公式计算重复性的变异系数（），质控品CV≤15%。
；
：重复性的变异系数；
：10次测量结果的平均值；
：10次测量结果的标准差。
2）接受标准：质控品的变异系数≤15%。
4.4.2实验结果见表13：
表13
4.4.3结论：质控品的变异系数CV≤15%，满足接受标准。
4.5试剂盒批间差
4.5.1批间差
1）验证方法：按照检验方法使用三个不同批号的试剂盒测试质控品，重复测试3次。可参考公式计算批间相对极差（R），质控品的批间相对极差R≤15%。
；
；
：批间相对极差；
：每批3次测量结果的平均值；/>
：/>中的最大值；
：/>中的最大值；
：3批检测均值。
2）接受标准：质控品的批间相对极差≤15%。
4.5.2实验结果见表14：
表14
4.5.3结论：质控品的批间相对极差≤15%，满足接受标准。
4.6试剂盒准确度
4.6.1准确度
1）验证方法：预先准备标准溶液作为A液。A液采用草酸纯品配制。选择合适浓度的临床样品，作为B液。将不同体积量的标准溶液A加入样品B中，配制成3个不同浓度的回收样品，覆盖待评价产品的测量区间。每个浓度重复检测3次。
；
：回收率；
：将标准溶液A加入样本B后的检测浓度均值；
：样品B的体积；
：标准溶液A的体积；
：样品B的浓度；
：样品A的浓度。
2）接受标准：回收率应在85% ~ 115%。
4.6.2实验结果见表15：
表15
4.6.3结论：回收率均在85% ~ 115%，满足接受标准。
4.7试剂盒效期稳定性
4.7.1效期稳定性
1）验证方法：取在正常储存温度条件下（2 ~ 8℃）避光保存超过有效期（12个月）后1个月内试剂盒，按照实施例1~4、实施例6进行检测，结果符合其相应要求。
2）接受标准：包装完整、无破损；最小包装标签的文字、内容应清晰、准确，封口严密，无渗漏；组分应澄清，无沉淀、颗粒或絮状物；试剂盒中各液体试剂的净含量应不少于标示值；草酸线性回归的相关系数r均≥0.990；质控品的变异系数CV≤15%；回收率均在85% ~115%。
4.7.2实验结果
1）外观
（a）试剂盒的各组份应齐全、完整、无破损。
（b）最小包装标签的文字、内容应清晰、准确，封口严密，无渗漏。
（c）液体组分应澄清、透明，无沉淀、颗粒或絮状物。
2）装量
结果见表16：
表16
3）线性范围见表17：
表17
4）重复性结果见表18：
表18
5）准确度结果见表19：
表19
4.7.3结论：包装完整、无破损；最小包装标签的文字、内容清晰、准确，封口严密，无渗漏；组分澄清，无沉淀、颗粒或絮状物；试剂盒中各液体试剂的净含量不少于标示值；草酸线性回归的相关系数r均≥0.990；质控品的变异系数CV≤15%；回收率均在85% ~ 115%，满足接受标准。
4.8试剂盒校准品
4.8.1外观
1）验证方法：随机取试剂盒中校准品各1瓶，在自然光下以矫正视力目视观察。
2）接受标准：包装完整、无破损；最小包装标签的文字、内容应清晰、准确，封口严密，无渗漏；组分应澄清，无沉淀、颗粒或絮状物。
3）实验结果：
（a）各校准品组份应包装完整、无破损。
（b）各校准品组份包装标签的文字、内容应清晰、准确，封口严密，无渗漏。
（c）各校准品组分应澄清，无沉淀、颗粒或絮状物。
4）结论：包装完整、无破损；最小包装标签的文字、内容应清晰、准确，封口严密，无渗漏；组分应澄清，无沉淀、颗粒或絮状物，满足接受标准。
4.8.2装量
1）验证方法：随机取试剂盒中校准品各1瓶，使用通用量具检测体积。
2）接受标准：试剂盒中校准品的净含量应不少于标示值。
实验结果见表20：
表20
3）结论：试剂盒中校准品的净含量不少于标示值，满足接受标准。
4.8.3准确度
1）验证方法：按照检测方法以工作校准品定标，测试试剂盒的各校准品，重复检测3次。可参考公式计算准确度的相对偏差（B），相对偏差应在[85%，115%]。
；
B：相对偏差；
M：测试结果均值；
T：标示值。
2）接受标准：准确度的相对偏差B应≤±15%。
3）实验结果见表21：
表21
4）结论：准确度的相对偏差B≤±15%，满足接受标准。
4.8.4均一性
1）验证方法：随机抽取同批次的10套试剂盒，对校准品随机编号1~10，在检测系统上每个包装单元分别检测3次。考虑测定系统随时间等因素引起的随机变异，3次测量采用不同的顺序进行，顺序为：1、3、5、7、9、2、4、6、8、10、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、2、4、6、8、10、1、3、5、7、9。
记录检测结果，检测结果按照下面的公式进行计算，/>，/>和/>：
；
；/>
；
；
；
；
；
；
；
；
；
式中：
：方差；
：指定参数第/>次测量值或计算结果；
：总平均值；
：样品/>重复测量次数；
：样品/>的第/>个结果；
：均方；
：自由度；
：/>检测值；
：有效测量次数；
：抽取的样品数量；
：测试总次数；
：瓶间标准差；
：瓶间标准差（重复性标准差）。
当时，以/>代替/>计算/>，结果符合要求。
当时，检测结果显示瓶间均匀性无显著性差异，计算结果/>，结果符合要求。
当、/>时，认为瓶间均匀性良好，计算结果/>，结果符合要求。
当、/>时，认为瓶间均匀性较差，不符合要求，结果符合要求。
2）接受标准：校准品C1~C6的变异系数≤15%。
实验结果见表22~23：
表22
表23
3）结论：校准品S1~S6的变异系数CV≤15%，满足接受标准。
4.8.5稳定性
a）开瓶稳定性
1）验证方法：开封后，在正常储存温度条件下（2 ~ 8℃）避光保存超过开瓶有效期（28天）后1周内的试剂盒校准品，按照4.8.2~4.8.4进行检测，结果符合其相应要求。
2）接受标准：试剂盒中校准品的净含量不少于标示值；准确度的相对偏差B应≤±15%；校准品S1~S6的变异系数CV≤15%。
3）实验结果
A）装量
结果见表24：
表24
B）准确度结果见表25：
表25
C）均匀性见表26~27：
表26
表27
4）结论：试剂盒中校准品的净含量不少于标示值；校准品准确度的相对偏差B≤±15%；校准品S1~S6的变异系数CV≤15%，满足接受标准。
b）效期稳定性
1）验证方法：取在正常储存温度条件下（2 ~ 8℃）避光保存超过有效期（12个月）后1个月内试剂盒校准品，按照4.8.1~4.8.4进行检测，结果符合其相应要求。
2）接受标准：包装完整、无破损；最小包装标签的文字、内容应清晰、准确，封口严密，无渗漏；组分应澄清，无沉淀、颗粒或絮状物；试剂盒中校准品的净含量应不少于标示值；准确度的相对偏差B应≤±15%；校准品S1~S6的变异系数CV≤15%。
3）实验结果：
A）外观
（a）各校准品组份应包装完整、无破损。
（b）各校准品组份包装标签的文字、内容应清晰、准确，封口严密，无渗漏。
（c）各校准品组分应澄清，无沉淀、颗粒或絮状物。
B）装量
结果见表28：
表28
C）准确度结果见表29：
表29
D）均匀性结果见表30~31：
表30
/>
表31
4）结论：校准品包装完整、无破损；最小包装标签的文字、内容应清晰、准确，封口严密，无渗漏；组分澄清，无沉淀、颗粒或絮状物；试剂盒中校准品的净含量不少于标示值；准确度的相对偏差B≤±15%；校准品S1~S6的变异系数CV≤15%，满足接受标准。
4.9试剂盒质控品
4.9.1外观
1）验证方法：随机取试剂盒中质控品各1瓶，在自然光下以矫正视力目视观察。
2）接受标准：包装完整、无破损；最小包装标签的文字、内容应清晰、准确，封口严密，无渗漏；组分应澄清，无沉淀、颗粒或絮状物。
3）实验结果：
（a）各质控品组份包装完整、无破损。
（b）各质控品组份包装标签的文字、内容应清晰、准确，封口严密，无渗漏。
（c）各质控品组分澄清，无沉淀、颗粒或絮状物。
4）结论：包装完整、无破损；最小包装标签的文字、内容清晰、准确，封口严密，无渗漏；组分应澄清，无沉淀、颗粒或絮状物，满足接受标准。
4.9.2装量
1）验证方法：随机取试剂盒中质控品各1瓶，使用通用量具检测体积。
2）接受标准：试剂盒中质控品的净含量应不少于标示值。
3）实验结果见表32：
表32
4）结论：试剂盒中质控品的净含量不少于标示值，满足接受标准。
4.9.3预期结果
1）验证方法：按照检测方法进行操作，以产品校准品定标，测试试剂盒中的各质控品，重复测试3次。质控品的检测结果应在该质控品的可接受范围内。
2）接受标准：质控品的检测结果应在该质控品的可接受范围内。
3）实验结果见表33：
表33
4）结论：质控品的检测结果在该质控品的可接受范围内，满足接受标准。
4.9.4均一性
1）验证方法：随机抽取同批次的10套试剂盒，对质控品随机编号1~10，在检测系统上每个包装单元分别检测3次。考虑测定系统随时间等因素引起的随机变异，3次测量采用不同的顺序进行，顺序为：1、3、5、7、9、2、4、6、8、10、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、2、4、6、8、10、1、3、5、7、9。
记录检测结果，检测结果按照下面的公式进行计算，/>，/>和/>：
；
；
；
；
；
；
；
；
；/>
；
；
式中：
：方差；
：指定参数第/>次测量值或计算结果；
：总平均值；
：样品/>重复测量次数；
：样品/>的第/>个结果；
：均方；
：自由度；
：/>检测值；
：有效测量次数；
：抽取的样品数量；
：测试总次数；
：瓶间标准差；
：瓶间标准差（重复性标准差）。
当时，以/>代替/>计算/>，结果符合要求。
当时，检测结果显示瓶间均匀性无显著性差异，计算结果/>，结果符合要求。
当、/>时，认为瓶间均匀性良好，计算结果/>，结果符合要求。
当、/>时，认为瓶间均匀性较差，不符合要求，结果符合要求。
2）接受标准：质控品的变异系数CV≤15%。
3）实验结果见表34：
表34
4）结论：质控品的变异系数CV≤15%，满足接受标准。
4.8.5稳定性
a）开瓶稳定性
1）验证方法：开封后，取在正常储存温度条件下（2~8℃）避光保存超过开瓶有效期（15天）的试剂盒质控品，各质控品分别取3支，每支重复测定2次。可参考公式进行差异显著性检验，差异应不显著。
；
：开瓶稳定期末的测定均值；
：新开瓶的测定均值；
：新开瓶的测定次数；/>
：开瓶稳定期末的测定次数；
：新开瓶的测定标准差；
：开瓶稳定器末的测定标准差。
当＜显著性水平α（α=0.05）自由度为（/>）的临界值/>，则两个平均值之间无显著差异。
2）接受标准：＜显著性水平α（α=0.05）自由度为（/>）的临界值。
3）实验结果见表35：
表35
4）结论：＜显著性水平α（α=0.05）自由度为（/>）的临界值/>，满足接受标准。
b）效期稳定性
1）验证方法：对稳定性研究数据进行统计处理，可根参考公式进行趋势显著性检验，趋势应不显著。
；
；
当时，表示趋势不显著，否则趋势显著。
2）接受标准：。
3）实验结果见表36~39：
表36
表37
表38
表39
4）结论：，满足接受标准。
本试剂盒采用液相色谱法测定人体尿液中草酸的含量，该试剂盒草酸线性范围为10 ~ 250 μg/mL，相关系数均r≥ 0.990；质控品的变异系数（CV）≤ 15%；质控品的批间相对极差（R）≤ 15%；回收率在85% ~ 115%范围内。
对比例1
本对比例提供一种液相色谱检测人尿液中草酸的检测方法，其与实施例1的区别仅在于：所述邻苯二胺和75wt%的磷酸水溶液的用量比为5mg/mL。
表40
表40为邻苯二胺和75wt%的磷酸水溶液的用量比为5mg/mL时的准确度数据；当邻苯二胺和75wt%的磷酸水溶液的用量比超出范围时，草酸高点的准确度无法满足实验要求。
对比例2
本对比例提供一种液相色谱检测人尿液中草酸的检测方法，其与实施例1的区别仅在于：所述尿液与衍生试剂的体积比为5：1。
表41
表41为尿液与衍生试剂的体积比为5：1时的准确度数据；当尿液与衍生试剂的体积比超出范围时，草酸高点的准确度无法满足实验要求。
对比例3
本对比例提供一种液相色谱检测人尿液中草酸的检测方法，其与实施例1的区别仅在于：将75wt%磷酸替换为浓盐酸。
表42
表42为浓盐酸与衍生试剂邻苯二胺混合放置2h后的准确度实验结果，正如前述，邻苯二胺在盐酸体系中会加速降解，从而影响结果的准确度。因此，若选择浓盐酸，须与邻苯分开加入，操作更加繁琐，此外，浓盐酸具有很强的挥发性，对于实验环境的要求更高。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (5)

1.一种液相色谱检测人尿液中草酸的检测方法，其特征在于，包括：将待测样品与衍生试剂混合，在60~80℃下衍生0.75~1.5 h，得到混合溶液，然后将所述混合溶液进行离心，取上清液进行液相色谱检测；
其中，所述衍生试剂为邻苯二胺和70~80wt%的磷酸水溶液；
所述衍生试剂中，所述邻苯二胺和70~80wt%的磷酸水溶液的用量比为7~13 mg：1 ml；
所述待测样品与衍生试剂的体积比为7~9：1。
2.根据权利要求1所述的液相色谱检测人尿液中草酸的检测方法，其特征在于，所述液相色谱检测包括使用流动相A和流动相B进行等度洗脱；其中，流动相A为体积分数为0.05~0.15%的甲酸水溶液；流动相B为甲醇。
3.根据权利要求2所述的液相色谱检测人尿液中草酸的检测方法，其特征在于，所述流动相A与所述流动相B的体积比为83~87：13~17。
4.根据权利要求1所述的液相色谱检测人尿液中草酸的检测方法，其特征在于，所述液相色谱检测使用的色谱柱为C18柱。
5.根据权利要求3所述的液相色谱检测人尿液中草酸的检测方法，其特征在于，所述液相色谱检测中，进样量为5~20 μL。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104101679A (zh) * 2014-07-24 2014-10-15 天津市第一中心医院 反相-高效液相色谱对人体血液和尿液中草酸浓度的测定方法
CN108333276A (zh) * 2018-05-09 2018-07-27 中国农业科学院蜜蜂研究所 一种识别高果糖浆掺假蜂蜜的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104101679A (zh) * 2014-07-24 2014-10-15 天津市第一中心医院 反相-高效液相色谱对人体血液和尿液中草酸浓度的测定方法
CN108333276A (zh) * 2018-05-09 2018-07-27 中国农业科学院蜜蜂研究所 一种识别高果糖浆掺假蜂蜜的方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
RP-HPLC法测定人血液和尿液中草酸;刘宏胜 等;中草药;20141031;第45卷(第20期);第2935-2938页 *
Sample preparation for HPLC determination of free and oligosaccharides-bound sialic acid in bovine colostrum;Min Peng Zhu 等;Advance Material Research;20130131;第641-642卷;第882-885页 *
不同产地燕窝中唾液酸含量的高效液相色谱法测定;卢端萍 等;时珍国医国药;20160229;第27卷(第2期);第371-373页 *
化妆品中草酸及其酯类和碱金属盐、十一烯酸及其盐和羟乙磷酸及其盐的分析方法研究;侯雪丽;中国优秀硕士学位论文全文数据库工程科技Ⅰ辑;20130415(第4期);第7, 21-22页 *
高效液相色谱法测定血和尿中的草酸;张惠静 等;第三军医大学学报;19970228(第01期);第2页 *

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