CN110261360B - 一种基于荧光光度法测定亚硫酸盐的方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于荧光光度法测定亚硫酸盐的方法及应用，所述方法包括以下步骤：(1)将定量的待测样品分散在定量的缓冲溶液或纯水中，提取待测样品中可能含有的亚硫酸盐，收集清液，取定量的清液与吡咯红Y和pH为6.0‑8.5缓冲溶液混合均匀，得到待测溶液A；(2)制备试剂空白溶液B；(3)在激发波长500‑580nm和发射波长540‑650nm下，以相同的条件分别测试待测溶液A、空白溶液B的荧光强度值，得到待测溶液A和空白溶液B的荧光强度值的差值；(4)用外标法定量。本发明的方法为一种新的亚硫酸盐的检测方法，可以用于食品中亚硫酸盐的检测，本发明方法灵敏度高、选择性好、简便快速，分析时间短。本发明的一种用于测定亚硫酸盐的试剂盒，使用简便、精确。

Description

一种基于荧光光度法测定亚硫酸盐的方法及应用

技术领域

本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种基于荧光光度法测定亚硫酸盐的方法及应用。

背景技术

现有测量亚硫酸盐的标准方法有以下几种：

比色法：如盐酸副玫瑰苯胺比色法，灵敏度和重现性高，是GB/T5009.34-2003中规定的仲裁方法。此法的不足是需要4h以上的分析时间，所形成络合物易与试样中的干扰物质反应，影响测定结果；操作过程中使用的四氯汞钠吸收液具有毒性，易污染环境且对操作者健康造成危害。

蒸馏-碘量法，是GB/T5009.34-2003中第二种方法，通过在密闭容器中蒸馏酸化后的样品来得到其中含有的SO₂，再使用乙酸铅溶液接收，最后经浓盐酸酸化后用碘液标定，该法缺点是操作耗时多。

蒸馏-碱滴定法，该法目前被许多国外机构所使用，用过量氢氧化钠接受酸化过且经氮气流蒸馏出的样品，再将接收液经酸化、氧化得到硫酸，用氢氧化钠标液标定，该法有较为广泛的适用范围，易于判定其终点，但是对设备、操作的要求较高。

食品生产加工行业中对亚硫酸盐的使用由来已久，食品中亚硫酸盐的危害性主要表现几个方面如：

亚硫酸盐类食品添加剂过量添加，食品中的营养成分会被大量破坏，导致食品本身营养价值降低；

人类摄入过量亚硫酸盐会出现如恶心、头痛、气喘、晕眩等不良反应，其中以哮喘病人反应尤甚。因此，检测并控制食品中亚硫酸盐的含量就显得重要了。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供一种基于荧光光度法测定亚硫酸盐的方法及应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种基于荧光光度法测定亚硫酸盐的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)将定量的待测样品分散在定量的缓冲溶液或纯水中提取待测样品中可能含有的亚硫酸盐，收集清液，取定量的清液与吡咯红Y和缓冲溶液混合均匀，得到待测溶液A，所述缓冲溶液的pH为6.0-8.5；

(2)制备与所述待测溶液A对应的试剂空白溶液B；

(3)在激发波长500-580nm和发射波长540-650nm下，以相同的条件分别测试待测溶液A、空白溶液B的荧光强度值，得到待测溶液A和空白溶液B的荧光强度值的差值；

(4)用外标法根据荧光强度值的差值与亚硫酸盐量的关系计算待测样品中亚硫酸盐的含量。

发明人通过研究发现在pH为6.0-8.5的缓冲溶液中吡咯红Y与亚硫酸根能够发生加成反应，导致吡咯红Y荧光强度猝灭，并且发现缓冲溶液、吡咯红Y与亚硫酸根组成的反应体系在反应后，反应体系的荧光强度的变化与亚硫酸根的含量呈线性关系，因此，以反应体系的荧光强度与空白试剂的荧光强度的差值作为响应值，可以利用反应体系的荧光强度的差值与亚硫酸根的含量的关系，测定样品中亚硫酸盐的含量，上述方法操作简易，快速、灵敏度高。

优选地，所述缓冲溶液的pH为6.0或者7.0-8.5。

优选地，所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液，所述缓冲溶液的pH为7.5-8.5。

发明人经过研究发现，在缓冲溶液的pH为7.5-8.5时，等浓度的缓冲溶液、吡咯红Y与亚硫酸根组成的反应体系在反应前后，反应体系的荧光强度的变化相对更大，即响应值更大，检测方法的效果更好。

优选地，所述缓冲溶液的pH为8.0。

发明人经过研究发现，在缓冲溶液的pH为8.0时，等浓度的缓冲溶液、吡咯红Y与亚硫酸根组成的反应体系在反应后，反应体系的荧光强度的变化相对更大，即响应值更大，检测方法的效果更好。

优选地，步骤(3)中，在激发波长525-570nm和发射波长550-580nm下，以相同的条件分别测试待测溶液A、空白溶液B的荧光强度值。

发明人经过研究发现，缓冲溶液、吡咯红Y与亚硫酸根组成的反应体系(即方法中所述待测溶液A)中，在激发波长525-570nm和发射波长550-580nm条件下具有较好的荧光强度值，方法的响应值更好，灵敏度更高。

优选地，步骤(3)中，在激发波长566nm和发射波长574nm条件下分别测试待测溶液A、空白溶液B的荧光强度值。

优选地，所述吡咯红Y在待测溶液A中的浓度为0.1μg/L～10μg/L。

优选地，所述吡咯红Y在待测溶液A中的浓度为1μg/L～6μg/L。

优选地，所述吡咯红Y在待测溶液A中的浓度为2μg/L～4μg/L。

发明人经过研究发现，缓冲溶液、吡咯红Y与亚硫酸根组成的反应体系(即方法中所述待测溶液A)中，吡咯红Y的浓度为2μg/L～4μg/L时，反应体系的荧光强度的变化相对更大，即响应值更大，检测方法的效果更好。

优选地，所述亚硫酸盐为亚硫酸钠、亚硫酸钾或者亚硫酸铵。

优选地，所述外标法的标准对照品的浓度范围为0.0μg/L～6.0μg/mL。

本发明还提供一种用于测定亚硫酸盐的试剂盒，所述试剂盒中包含有亚硫酸盐、缓冲剂和吡咯红Y；所述缓冲剂能够用于配制pH为6.0-8.5的缓冲液。

上述试剂盒中的亚硫酸盐用于配制亚硫酸盐标准溶液，试剂盒中的缓冲剂用于配制缓冲液提供吡咯红Y与亚硫酸根反应的环境，吡罗红作为指示剂，用于与亚硫酸根反应，用于指示亚硫酸根在样品中的含量。

优选地，所述亚硫酸盐为亚硫酸钠、亚硫酸钾或者亚硫酸铵，亚硫酸盐呈溶液形式。

优选地，所述缓冲剂为磷酸盐或者Tris-HCl。

优选地，所述缓冲剂为定量的磷酸一氢盐和磷酸二氢盐的混合物且磷酸一氢盐和磷酸二氢盐的混合物能够用于配制pH为6.0或者7.0-8.5的缓冲液；

或者缓冲剂包括缓冲盐A包和缓冲盐B包，缓冲盐A包中密封有定量的磷酸二氢盐，缓冲盐B包中密封有定量的磷酸氢二盐，其中，磷酸二氢盐和磷酸二氢盐的摩尔比为1:1；

所述磷酸一氢盐为磷酸氢二钠或者磷酸氢二钾，所述磷酸二氢盐为磷酸二氢钠或者磷酸二氢钾。

优选地，所述吡咯红Y呈溶液形式，所述亚硫酸盐呈溶液形式，试剂盒中还包括有试剂盒使用说明书，试剂盒使用说明书上文字记载试剂盒的使用方法，使用方法包括以下步骤：

(1)配制pH为7.5-8.5的磷酸盐缓冲液；

(2)配制吡咯红Y溶液；

(3)配制亚硫酸盐溶液；

(4)分别定量取步骤(2)的吡咯红Y溶液和步骤(1)得到的磷酸盐缓冲溶液若干份，每份分别加入定量的亚硫酸盐溶液，全部定容后，得到浓度为0.0μg/mL-6.0μg/mL的一系列的亚硫酸盐标准溶液，在激发波长Ex为566nm，发射波长Em为574nm条件下测定亚硫酸盐标准溶液荧光强度，得到标准溶液荧光强度和0.0μg/mL亚硫酸钠标准溶液空白样品的差值，获得荧光强度差值与亚硫酸盐浓度的标准曲线；

(5)将定量的待测样品分散在定量的缓冲溶液或纯水中，提取待测样品中可能含有的亚硫酸盐，收集清液；

(6)取同步骤(4)等量的吡咯红Y溶液和磷酸盐缓冲溶液和定量的清液混合，定容后得到待测样品溶液，设置空白试剂溶液，在激发波长Ex为566nm，发射波长Em为574nm条件下测定待测样品溶液和空白试剂溶液的荧光强度，获得荧光强度差值；

(7)根据步骤(4)得到的标准曲线计算待测样品中的亚硫酸盐浓度。

本发明的有益效果在于：本发明提供了一种基于荧光光度法测定亚硫酸盐的方法及一种用于测定亚硫酸盐的试剂盒，本发明的方法利用亚硫酸盐与吡咯红Y溶液发生反应导致吡咯红Y溶液荧光强度猝灭，猝灭程度(即反应体系的荧光强度与空白试剂的荧光强度差值)与试样中的亚硫酸盐含量成正比，在0.1μg/mL至6.0μg/mL之间呈现良好线性，本发明的一种基于荧光光度法测定亚硫酸盐的方法为一种新的亚硫酸盐的检测方法，可以用于食品中亚硫酸盐的检测，本发明方法灵敏度高、选择性好、简便快速，本发明方法是在室温条件下操作，亚硫酸盐与吡咯红Y溶液能在室温下发生反应，反应条件简单快速，分析时间短。本发明的一种用于测定亚硫酸盐的试剂盒提供了检测用的试剂，使得一种基于荧光光度法测定亚硫酸盐的方法操作更为简便、精确。

附图说明

图1为本发明的实施例的基于荧光光度法测定亚硫酸盐的方法的指示剂皮吡咯红Y的激发波长(Ex)和发射波长(Em)谱图。

图2为本发明的实施例的基于荧光光度法测定亚硫酸盐的方法中磷酸盐缓冲液的pH对响应值的影响结果图。

图3为本发明的实施例的基于荧光光度法测定亚硫酸盐的方法中吡咯红Y的浓度对响应值的影响结果图。

图4为本发明的实施例的基于荧光光度法测定亚硫酸盐的方法中亚硫酸盐的浓度的荧光光谱图。

图5为本发明的实施例的基于荧光光度法测定亚硫酸盐的方法中亚硫酸盐的浓度与响应值的线性关系图。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

作为本发明实施例的一种基于荧光光度法测定亚硫酸盐的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)将定量的待测样品分散在定量的缓冲溶液或纯水中，提取待测样品中可能含有的亚硫酸盐，收集清液，取定量的清液与吡咯红Y和缓冲溶液混合均匀，得到待测溶液A，所述缓冲溶液为pH为6.0的磷酸盐缓冲液，所述吡咯红Y在待测溶液A中的浓度为3μg/L；

(2)制备与所述待测溶液A对应的试剂空白溶液B；

(3)在激发波长566nm和发射波长574nm条件下分别测试待测溶液A、空白溶液B的荧光强度值，得到待测溶液A和空白溶液B的荧光强度值的差值；

(4)用外标法根据所述荧光强度值的差值与亚硫酸盐量的关系计算待测样品中亚硫酸盐的含量。

实施例2

本实施例与实施例1的唯一区别为：所述缓冲溶液为pH为6.5的磷酸盐缓冲液。

实施例3

作为本发明实施例的一种基于荧光光度法测定亚硫酸盐的方法，本实施例与实施例1的唯一区别为：所述缓冲溶液为pH为7.0的磷酸盐缓冲液。

实施例4

作为本发明实施例的一种基于荧光光度法测定亚硫酸盐的方法，本实施例与实施例1的唯一区别为：所述缓冲溶液为pH为7.5的磷酸盐缓冲液。

实施例5

作为本发明实施例的一种基于荧光光度法测定亚硫酸盐的方法，本实施例与实施例1的唯一区别为：所述缓冲溶液为pH为8.0的磷酸盐缓冲液。

实施例6

作为本发明实施例的一种基于荧光光度法测定亚硫酸盐的方法，本实施例与实施例1的唯一区别为：所述缓冲溶液为pH为8.5的磷酸盐缓冲液。

实施例7

作为本发明实施例的一种基于荧光光度法测定亚硫酸盐的方法，本实施例与实施例4的唯一区别为：所述吡咯红Y在待测溶液A中的浓度为1μg/L。

实施例8

作为本发明实施例的一种基于荧光光度法测定亚硫酸盐的方法，本实施例与实施例4的唯一区别为：所述吡咯红Y在待测溶液A中的浓度为2μg/L。

实施例9

作为本发明实施例的一种基于荧光光度法测定亚硫酸盐的方法，本实施例与实施例4的唯一区别为：所述吡咯红Y在待测溶液A中的浓度为4μg/L。

实施例10

作为本发明实施例的一种基于荧光光度法测定亚硫酸盐的方法，本实施例与实施例4的唯一区别为：所述吡咯红Y在待测溶液A中的浓度为5μg/L。

实施例11

作为本发明实施例的一种基于荧光光度法测定亚硫酸盐的方法，本实施例与实施例4的唯一区别为：所述吡咯红Y在待测溶液A中的浓度为6μg/L。

实施例12

一种用于测定亚硫酸盐的试剂盒，试剂盒中包含有亚硫酸盐、磷酸盐缓冲剂、吡咯红Y；

吡咯红Y为2mL-3mL的1mg/mL吡咯红Y溶液，吡咯红Y溶液封装于棕色安剖瓶中或者具有聚四氟乙烯垫片的棕色样品瓶中；

磷酸盐缓冲剂包括缓冲盐A包和B包，A包中密封有6.0g的磷酸二氢钠，B包中密封有7.2g的磷酸氢二钠或者A包中密封有6.8g的磷酸二氢钾，B包中密封有8.7g的磷酸氢二钾或者A包中密封有6.0g的磷酸二氢钠，B包中密封有8.7g的磷酸氢二钾或者A包中密封有6.8g的磷酸二氢钾B包中密封有7.2g的磷酸氢二钠；

亚硫酸盐为0.5mL-2mL的1mg/mL亚硫酸钠溶液或者亚硫酸钾溶液，溶液浓度以亚硫酸根浓度计量，亚硫酸钠溶液或者亚硫酸钾溶液封装于棕色安剖瓶中或者具有聚四氟乙烯垫片的棕色样品瓶中；

试剂盒中还包含有冰袋，用于运输或者使用时的保温。

本实施例的试剂盒的使用方法如下：

(1)将缓冲盐A包中的缓冲盐用超纯水溶解后定容至250mL的容量瓶中，得到0.2mol/L的磷酸一氢盐溶液，将缓冲盐B包中的缓冲盐用超纯水溶解后定容至250mL的容量瓶中，得到0.2mol/L的磷酸二氢盐溶液；

(2)取84.0mL的磷酸一氢盐溶液和16.0mL的磷酸二氢盐溶液混合得到pH为7.5的磷酸盐缓冲液或者取94.7mL的磷酸一氢盐溶液和5.3mL的磷酸二氢盐溶液混合得到pH为8.0的磷酸盐缓冲液；

(3)打开装有吡咯红Y溶液的安剖瓶或样品瓶，取1mL的1mg/mL吡咯红Y溶液定容在50mL的棕色容量瓶中得到0.02mg/mL吡咯红Y溶液；

(4)打开装有亚硫酸盐溶液的安剖瓶或样品瓶，取1mL亚硫酸盐溶液定容于100mL容量瓶中，得到10μg/L的亚硫酸盐溶液；

(5)取1.5mL的0.02mg/L吡咯红Y溶液、2mL步骤(2)得到的磷酸盐缓冲溶液8份，每份分别加入0.0mL、0.1mL、0.2mL、0.5mL、1mL、2mL、4mL、6mL的10μg/L的亚硫酸盐溶液，全部定容至10mL，得到0.0μg/mL、0.10μg/mL、0.20μg/mL、0.50μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL、4.0μg/mL、6.0μg/mL亚硫酸钠标准溶液，在激发波长Ex为566nm，发射波长Em为574nm条件下测定亚硫酸钠标准溶液荧光强度，得到标准溶液荧光强度和0.0μg/mL亚硫酸钠标准溶液空白的差值，获得荧光强度差值与亚硫酸盐浓度的标准曲线；

(6)将定量的待测样品分散在定量的缓冲溶液或纯水中，提取待测样品中可能含有的亚硫酸盐，收集清液；

(7)取1.5mL的0.02mg/L吡咯红Y溶液、2mL步骤(2)得到的磷酸盐缓冲溶液和1mL步骤(6)得到的清液，定容至10mL得到待测样品溶液，设置空白试剂溶液，在激发波长Ex为566nm，发射波长Em为574nm条件下测定待测样品溶液和空白试剂溶液的荧光强度，获得获得荧光强度差值；

(8)根据步骤(5)得到的标准曲线计算待测样品中的亚硫酸盐浓度。

实验例1

为验证本发明实施例的一种基于荧光光度法测定亚硫酸盐的方法的可行性和准确性，进行方法验证试验。

一、试验试剂：

亚硫酸钠储备液的配制方法：精密称取无水亚硫酸钠0.157g用超纯水定容于100.0mL的棕色容量瓶中，得到1.0mg/mL的亚硫酸根储备液，放冰箱5℃下保存，溶液浓度以亚硫酸根浓度计量，使用时按需要稀释。

荧光剂显色剂吡咯红Y溶液储备液配制方法：精密称取吡咯红Y0.100g用超纯水定容于100.0mL容量瓶，得浓度为1.0mg/mL储备液，室温下保存，使用时按需要稀释。

磷酸盐缓冲溶液的配制方法：精密称取7.2g磷酸氢二钠于用超纯水溶解后定容到250.0mL容量瓶中；精密称取6.8g磷酸二氢钾用超纯水溶解后定容到250.0mL容量瓶中；调节磷酸氢二钠溶液和磷酸二氢钾溶液的配比，配制pH分别为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5的0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液，缓冲溶液浓度以磷酸根浓度计量。

二、试验方法及结果

1、缓冲液pH值对荧光强度差值的影响

取若干个10mL的比色管，分别在每个比色管中加入不同pH(pH值分别为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5)的0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液2mL、1mL 1.0μg/mL亚硫酸钠溶液，随后加入1.5mL的0.02mg/L吡罗红Y溶液混匀后，用相应的pH值的0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液定容至10mL刻度线，作为标准样品，同时每个pH的体系设置一个试剂对应空白试样。

测试标准样品的激发波长和发射波长，其波谱图如图1所示，由图1可知，在激发波长525-570nm和发射波长550-580nm条件下具有较好的荧光强度值。

在荧光仪设置激发波长566nm、发射波长574nm条件下，测定各自空白和试样的荧光强度值，得到对应的荧光强度差值△F。结果如图2所示，由图2的结果可知，pH值分别为6.0-8.5的磷酸盐缓冲溶液中，加入有1mL 1.0μg/mL亚硫酸钠溶液的待测样与空白试样的荧光强度差值△F相对较大，具有较好的响应值，可以实现亚硫酸盐的检测。其中，pH值分别为6.0、7.0时△F在100左右，pH值分别为7.5、8.5时△F在500左右，pH值分别为8.0时△F在650-700之间，因此，pH值为8.0的磷酸盐缓冲液条件下，响应值相对最大，灵敏度最好，pH值分别为7.5、8.5时相对次之，pH值为6.0、7.0时相对又次之。

2、荧光显色剂吡罗红Y浓度对荧光强度差值的影响

取若干个10mL的比色管，分别在每个比色管中加入不同pH为8.0的0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液2mL、1mL 1.0μg/mL亚硫酸钠溶液，随后加入体积分别为0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL的0.02mg/L吡罗红Y溶液混匀后，用pH为8.0的0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液定容至10mL刻度线，此时，吡罗红Y在样品中的浓度依次分别为1μg/L、2μg/L、3μg/L、4μg/L、5μg/L、6μg/L，同时每个配制一个试剂对应空白试样。

在荧光仪设置激发波长566nm、发射波长574nm条件下，测定各自空白和试样的荧光强度值，得到对应的荧光强度差值△F。结果如图3所示，荧光强度差值△F均在200以上，响应值较高，灵敏度较好。相对而言，吡罗红Y溶液的用量为1.0mL、1.5mL、2.0mL时，即吡罗红Y在样品中的浓度依次分别为2μg/L、3μg/L、4μg/L时，响应值相对较高，灵敏度相对较好，其中吡罗红Y在样品中的浓度依次分别为3μg/L时，响应值相对最高，灵敏度相对最好。

3、亚硫酸盐浓度与荧光强度差值的关系

取8支10mL的比色管，分别加入1.5mL的0.02mg/L吡咯红Y溶液、pH为8.0的0.2mol/L的磷酸盐缓冲溶液2.00mL，然后按顺序加入适量亚硫酸钠标准溶液，用pH为8.0的0.2mol/L的磷酸盐缓冲溶液定容至10mL，使亚硫酸钠的浓度分别为0.0μg/mL、0.10μg/mL、0.20μg/mL、0.50μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL、4.0μg/mL、6.0μg/mL。亚硫酸钠的浓度为0.0μg/mL的样品为空白样品，浓度分别为0.10μg/mL、0.20μg/mL、0.50μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL、4.0μg/mL、6.0μg/mL为标准液样品。

在F97Pro荧光光度计下设置激发波长Ex为566nm条件下，检测上述8个样品的荧光光谱图，如图4所示，发现在发射波长为560nm～580nm的范围内，均有很好的响应值，峰值为574nm。

设置激发波长Ex为566nm，发射波长Em为574nm，分别测得空白样品和个标准液试样的荧光强度值F₀和F_n，得到荧光强度差值△F＝F₀-F_n。如图5所示，荧光强度差值△F与亚硫酸钠(Sulfite)浓度呈线性相关的关系，线性方程为y＝187.4x+32.5，相关系数R＝0.991，线性范围为0.10～6.0μg/mL，通过三倍噪音计算得的最低检出限为0.03μg/mL。

三、实施例3的一种基于荧光光度法测定亚硫酸盐的方法在检测食品中亚硫酸盐含量的应用。

1、黄芪中亚硫酸盐含量的检测方法，方法包括以下步骤：

(1)将药材店买来的黄芪于80℃烘干，粉碎机粉碎，称量黄芪粉末1.0g，转移到离心管内，加超纯水10mL，置于振荡器内振荡30分钟，离心取清液于洁净试管内备用；

(2)取若干10mL的比色管依次加入1.5mL的0.02mg/L吡咯红Y溶液、pH为8.0的0.2mol/L的磷酸盐缓冲溶液2.00mL，加入步骤(1)得到的清液1mL混合均匀后用超纯水定容至比色管的刻度线，设置平行样品3个，空白样品一个，加标样品作为质控一个，加标量1.0μg/mL亚硫酸钠标准溶液2.0mL；

(3)在激发波长Ex为566nm，发射波长Em为574nm下，分别测平行样品的荧光强度值，记为F，测试空白样品的荧光值记为F₀，得到荧光强度差值△F(△F＝F₀-F)；

(4)用外标法根据所述荧光强度值的差值与亚硫酸盐量的关系计算黄芪中亚硫酸盐的含量；

所述外标法具体操作如下：取8支10mL的比色管，分别加入1.5mL的0.02mg/L吡咯红Y溶液、pH为7.5的0.2mol/L的磷酸盐缓冲溶液2.00mL，然后按按顺序加入适量亚硫酸钠标准溶液，用pH为7.5的0.2mol/L的磷酸盐缓冲溶液定容至10mL，使亚硫酸钠的浓度分别为0.0μg/mL、0.10μg/mL、0.20μg/mL、0.50μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL、4.0μg/mL、6.0μg/mL，亚硫酸钠的浓度为0.0μg/mL的样品为空白样品，浓度分别为0.10μg/mL、0.20μg/mL、0.50μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL、4.0μg/mL、6.0μg/mL为标准液样品；

设置激发波长Ex为566nm，发射波长Em为574nm，分别测得空白样品和个标准液试样的荧光强度值F₀和F_n，得到荧光强度差值△F＝F₀-F_n；获得荧光强度差值△F与亚硫酸钠浓度的线性关系，根据线性关系计算得到清液中的亚硫酸盐的含量，进而得到黄芪中的亚硫酸盐含量。

测得结果，步骤(1)中得到的清液中亚硫酸根浓度均值为0.4μg/mL，黄芪药材亚硫酸钠含量4.0μg/g，加标回收率为92％。

2、白糖中亚硫酸盐含量的检测方法，方法包括以下步骤：

(1)超市购买的散装白糖，称取1.0g加高纯水溶解后，定容到100.0mL容量瓶中，得到白糖溶液；

(2)取若干10mL的比色管依次加入1.5mL的0.02mg/L吡咯红Y溶液、pH为8.0的0.2mol/L的磷酸盐缓冲溶液2.00mL，加入步骤(1)得到的白糖溶液1mL混合均匀后用超纯水定容至比色管的刻度线，设置平行样品3个，空白样品一个，加标样品作为质控一个，加标量1.0μg/mL亚硫酸钠标准溶液2.0mL；

(3)在激发波长Ex为566nm,发射波长Em为574nm下，分别测平行样品的荧光强度值，记为F，测试空白样品的荧光值记为F₀，得到荧光强度差值△F(△F＝F₀-F)；

(4)用外标法根据所述荧光强度值的差值与亚硫酸盐量的关系计算白糖中亚硫酸盐的含量；外标法同黄芪中亚硫酸盐含量的检测方法。

测得结果，步骤(1)中的白糖溶液中亚硫酸根浓度均值为0.14μg/mL，1.0g白糖中亚硫酸根含量14.0μg/g，加标回收率为100.9％。

3、啤酒中亚硫酸盐含量的检测方法，方法包括以下步骤：

(1)用移液管精准量取1.0mL超市新购珠江啤酒于100.0mL容量瓶中，用超纯水定容，得到啤酒溶液；

(2)取若干10mL的比色管依次加入1.5mL的0.02mg/L吡咯红Y溶液、pH为8.0的0.2mol/L的磷酸盐缓冲溶液2.00mL，加入步骤(1)得到的啤酒溶液1mL混合均匀后用超纯水定容至比色管的刻度线，设置平行样品3个，空白样品一个，加标样品作为质控一个，加标量1.0μg/mL亚硫酸钠标准溶液2.0mL；

(3)在激发波长Ex为566nm,发射波长Em为574nm下，分别测平行样品的荧光强度值，记为F，测试空白样品的荧光值记为F₀，得到荧光强度差值△F(△F＝F₀-F)；

(4)用外标法根据所述荧光强度值的差值与亚硫酸盐量的关系计算啤酒中亚硫酸盐的含量；外标法同黄芪中亚硫酸盐含量的检测方法。

测得结果，步骤(1)中的啤酒溶液中亚硫酸根浓度均值为1.37μg/mL，1.0mL啤酒中亚硫酸根含量137.0μg/mL，加标回收率为92.0％。

本发明基于亚硫酸盐与吡咯红Y作用使其荧光淬灭，建立了荧光光度猝灭法测定亚硫酸盐含量的新方法，方法操作简便、灵敏高。

使用F97Pro荧光光度计，设定激发波长Ex为566nm，发射波长Em为574nm，亚硫酸钠标准溶液的浓度在0.1μg-6.0μg mL的范围内，荧光强度差值呈线性，本法应用于白糖、啤酒、黄芪的样品测定，回收率好，结果满意。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (9)

1.一种基于荧光光度法测定亚硫酸盐的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)将定量的待测样品分散在定量的缓冲溶液或纯水中提取待测样品中可能含有的亚硫酸盐，收集清液，取定量的清液与吡咯红Y和缓冲溶液混合均匀，得到待测溶液A，所述缓冲溶液的pH为6.0-8.5；

(2)制备与所述待测溶液A对应的试剂空白溶液B；

(3)在激发波长500-580nm和发射波长540-650nm下，以相同的条件分别测试待测溶液A、空白溶液B的荧光强度值，得到待测溶液A和空白溶液B的荧光强度值的差值；

(4)用外标法根据荧光强度值的差值与亚硫酸盐量的关系计算待测样品中亚硫酸盐的含量。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液，所述缓冲溶液的pH为7.5-8.5。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述缓冲溶液的pH为8.0。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，在激发波长525-570nm和发射波长550-580nm下，以相同的条件下分别测试待测溶液A、空白溶液B的荧光强度值。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，在激发波长566nm和发射波长574nm条件下分别测试待测溶液A、空白溶液B的荧光强度值。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述吡咯红Y在待测溶液A中的浓度为0.1μg/L～10μg/L。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述吡咯红Y在待测溶液A中的浓度为1μg/L～6μg/L。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述亚硫酸盐为亚硫酸钠、亚硫酸钾或者亚硫酸铵，所述外标法的标准对照品的浓度范围为0.0μg/mL～6.0μg/mL。

9.一种用于测定亚硫酸盐的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含有亚硫酸盐、缓冲剂和吡咯红Y；所述缓冲剂能够用于配制pH为6.0-8.5的缓冲液，其中，所述吡咯红Y呈溶液形式，所述亚硫酸盐为亚硫酸钠、亚硫酸钾或者亚硫酸铵，亚硫酸盐呈溶液形式，所述缓冲剂为磷酸盐或者Tris-HCl，试剂盒中还包括有试剂盒使用说明书，试剂盒使用说明书上文字记载试剂盒的使用方法，使用方法包括以下步骤：

(1)配制pH为7.5-8.5的缓冲液；

(2)配制吡咯红Y溶液；

(3)配制亚硫酸盐溶液；

(4)分别定量取步骤(2)的吡咯红Y溶液和步骤(1)得到的缓冲溶液若干份，每份分别加入定量的亚硫酸盐溶液，全部定容后，得到浓度为0.0μg/mL-6.0μg/mL的一系列的亚硫酸盐标准溶液，在激发波长Ex为566nm，发射波长Em为574nm条件下测定亚硫酸盐标准溶液荧光强度，得到标准溶液荧光强度和0.0μg/mL亚硫酸盐标准溶液空白样品的差值，获得荧光强度差值与亚硫酸盐浓度的标准曲线；

(5)将定量的待测样品分散在定量的缓冲溶液或纯水中，提取待测样品中可能含有的亚硫酸盐，收集清液；

(6)取同步骤(4)等量的吡咯红Y溶液和缓冲溶液和定量的清液混合，定容后得到待测样品溶液，设置空白试剂溶液，在激发波长Ex为566nm，发射波长Em为574nm条件下测定待测样品溶液和空白试剂溶液的荧光强度，获得荧光强度差值；

(7)根据步骤(4)得到的标准曲线计算待测样品中的亚硫酸盐浓度。

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