CN107084929B - 肺炎球菌多糖的定量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种肺炎球菌多糖的定量检测方法。本方法以便宜易得的单糖制作组合糖作为标准品，代替外购多糖标准品，以组合糖和外购标准糖分别建立标准曲线，对同一批待测肺炎球菌多糖样品进行检测，两者检测结果进行比较得出校正系数，在以后的检测中，以组合糖代替外购标准糖，建立标准曲线，检测肺炎多糖样品浓度，通过校正系数校正，得出待检样品的最终浓度，该结果与外购标准糖作为标准品检测样品结果之间偏差不大于5％。本发明中组合糖所用各单糖便宜易得，分析方法简单，大大降低了分析成本，克服了外购标准糖成本昂贵的问题，实验结果偏差小，容易推广，在适当操作条件下，偏差可控制在0.4％内，可作为肺炎球菌多糖定量检测方法。
Description
技术领域
本发明属于药物分析领域，涉及一种肺炎球菌多糖的定量检测方法。
背景技术
肺炎球菌是引起儿童侵袭性脑膜炎、肺炎和中耳炎的主要病原菌之一，是导致成人和儿童罹患肺炎疾病住院甚至死亡的重要原因，肺炎球菌是一种革兰阳性菌，其基 本毒力因子为荚膜多糖，按荚膜多糖抗原性的不同，可将其分为不同的血清型。迄今 为止，23个血清型的肺炎链球菌多糖疫苗已经研制成功，在23价肺炎球菌多糖疫苗 成品指控项目中，23价肺炎球菌多糖含量是疫苗的重要检测指标。
现有的多糖定量检测方法有显色法，如蒽酮-硫酸法(吴凯、代泽友，改进的蒽酮法检测肺炎链球菌荚膜多糖结合物中多糖浓度(中国生物制品学杂志，2007，20(7)： 536-538)，但该方法只是简单的用葡萄糖作为标准品，通过建立标准曲线来获取肺炎 球菌多糖含量，所以结果往往与真实值偏差较大。因此，开发一种操作简单、测定结 果准确的肺炎球菌多糖定量检测方法，特别是多糖标准品的选择是目前亟待解决的问 题。
发明内容
本发明的目的是提供一种肺炎球菌多糖的定量检测方法。
本发明提供的肺炎球菌多糖的定量检测方法，包括如下步骤：
1)以一系列不同浓度的肺炎球菌多糖标准品与其相应的吸光度建立肺炎球菌多糖标准品的标准曲线；
2)配制不同浓度的肺炎球菌组合多糖，该浓度记为C组合理论；
根据步骤1)所得肺炎球菌多糖标准品的标准曲线，测定所述肺炎球菌组合多糖的检测浓度，该浓度记为C组合检测；
定义C组合理论×校正系数＝C组合检测；
所述肺炎球菌组合多糖由单糖组成；所述单糖的种类与摩尔比与所述步骤1)中所述肺炎球菌多糖标准品所含各单糖种类和摩尔比一致；
3)以一系列不同C组合理论的步骤2)所述肺炎球菌组合多糖与其对应的吸光度建立肺炎球菌多糖组合多糖的标准曲线；
4)将待测样品的吸光度代入步骤3)所述肺炎球菌多糖组合多糖的标准曲线，获得对应的所述待测样品的多糖浓度，记为C待测，则所述待测样品的实际多糖浓度为所 述校正系数×C待测。
上述方法中，所用肺炎球菌多糖标准品可购自丹麦国立血清研究所；
所述步骤1)和步骤3)建立标准曲线步骤中，向所述肺炎球菌多糖标准品或肺 炎球菌组合多糖中加入显色试剂进行显色反应；显色试剂为蒽酮硫酸溶液或四硼酸钠 硫酸溶液和咔唑的乙醇溶液，但并不局限于上述显色试剂，只要保证能与肺炎球菌多 糖标准品或肺炎球菌组合多糖进行显色反应，且显色深浅能与多糖浓度呈正比即可。 具体的，所述肺炎球菌多糖为1型肺炎球菌多糖时，可选用四硼酸钠硫酸溶液和咔唑 的乙醇溶液作为显色试剂。所述肺炎球菌多糖为其他类型时，可选用蒽酮硫酸溶液作 为显色试剂进行显色反应；更具体的，如所述肺炎球菌多糖为肺炎球菌12F型(PN12F) 时，选用蒽酮硫酸溶液作为显色试剂进行显色反应；所述肺炎球菌多糖为肺炎链球菌 1型多糖(PN1型)时，选用四硼酸钠硫酸溶液和咔唑的乙醇溶液作为显色试剂进行 显色反应。
所述蒽酮硫酸溶液和四硼酸钠硫酸溶液中，硫酸的浓度为50％～90％，具体可为75％；蒽酮硫酸溶液的浓度均为0.05g/100ml～0.2g/100ml，具体可为0.1g/100ml。所述 四硼酸钠硫酸溶液为将四硼酸钠溶于浓硫酸所得溶液；所述四硼酸钠与浓硫酸的用量 比为9.55g：1000ml。所述咔唑的乙醇溶液中，咔唑和无水乙醇的用量比为125mg： 100ml。
所述步骤1)和步骤3)建立标准曲线步骤中，所用显色反应均在沸水浴中进行； 反应时间为5～35min，具体可为20min；
反应完毕后还包括在水浴中静置的步骤；所述静置步骤中，静置的时间具体为 5～15min或10min；水浴的温度具体为0～80℃，具体可为40℃。
测定吸光度步骤中，吸光度的测量波长为400nm～700nm或530nm，具体可为620nm。该步骤可用紫外分光光度计完成；其中肺炎1型优选在530nm处测定吸光度 值。
所述步骤2)中，所述肺炎球菌组合多糖具体可为按照PN12F型肺炎球菌多糖的 结构式按照摩尔比为n葡萄糖：n半乳糖：n岩藻糖：nN-乙酰基甘露糖胺：nN-乙酰基半乳糖胺＝2：1：1：1：1 的比例配制而得的PN12F型组合糖，或者按照肺炎链球菌1型多糖(PN1型)的结构 式，按照摩尔比为n半乳糖醛酸：nN-乙酰-D-半乳糖胺＝2：1的比例配制而得的PN1型组合糖。
该方法适用于各种糖型的肺炎链球菌多糖，如如下各种糖型的肺炎链球菌2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17A、17F、18C、19A、 19F、20、22F、23F、33F型多糖，更具体可为肺炎链球菌1型多糖(PN1型)或肺炎 球菌12F型(PN12F)。
本发明为了克服现有技术的缺点与不足，减小实验结果的偏差，本发明开发了一种分析成本低、操作简单的定量检测方法。该方法以便宜易得的单糖为原料，按照标 准多糖中各单糖摩尔比混合配制而成得到组合糖，以组合糖和外购标准糖分别建立标 准曲线，对同一批待测肺炎球菌多糖浓度进行检测，两者检测结果进行比较得出校正 系数，在以后的检测中，以组合糖代替外购标准糖，建立标准曲线检测肺炎多糖浓度， 通过校正系数校正，得出肺炎多糖的最终浓度，该结果与外购标准糖作为标准品检测 结果偏差很小，不大于5.0％，在适当操作条件下，标准偏差可控制在0.4％。该方法 克服了外购标准糖成本昂贵的问题，大大降低了分析成本，具有重要的应用价值。
附图说明
图1为PN12F型肺炎球菌组合糖浓度与其相应吸光度线性关系。
图2为PN12F型肺炎球菌外购标准糖浓度与吸光度值线性关系。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获 得。
实施例1
肺炎球菌12F型(PN12F)
1.试剂与标准物质
⑴蒽酮硫酸溶液：将75ml浓硫酸缓慢加入25ml纯水中，充分搅拌冷却，精密 称取蒽酮0.1g，溶于上述硫酸溶液中。
⑵肺炎球菌多糖标准品：PN12F型肺炎多糖标准品来源于丹麦国立血清研究所。
⑶肺炎球菌12F多糖待测样品：201404002H2，各项检测指标均合格。
⑷肺炎球菌组合多糖：依据PN12F型肺炎球菌多糖的结构式，按照摩尔比为n 葡萄糖：n半乳糖：n岩藻糖：nN-乙酰基甘露糖胺：nN-乙酰基半乳糖胺＝2：1：1：1：1的比例配制PN12F型 组合糖。
2.仪器
⑴紫外分光光度计(UV-1800)
⑵比色皿：45*12.5*12.5(mm)
⑶试管：10ml
⑷分析天平：感量0.01mg
⑸移液器：Thermo，GH98732；eppendorf，232200A
⑹电热恒温水浴箱：HH.W21.420
3.试样制备
⑴PN12F型肺炎球菌多糖标准品溶液配制(标准糖)：PN12F型标准多糖(外购)10mg溶于2ml纯水中配制成5mg/ml的标准品溶液，取160μl用超纯水稀释至4ml， 配制成200μg/ml的标准品溶液。
⑵PN12F型肺炎球菌组合糖溶液配制(组合糖)：精密称取葡萄糖36.0mg、半乳 糖18.0mg、岩藻糖16.4mg、N-乙酰基甘露糖胺22.1mg、N-乙酰基半乳糖胺22.1mg， 用超纯水定容到100ml，临用前稀释7倍配制成163.7μg/ml的组合糖溶液。
⑶PN12F型样品糖(201404002H2)(150μg/ml)：精密称取样品糖15.0mg，用 超纯水稀释至100ml配制成浓度为150μg/ml的样品溶液。
4.测定步骤
4.1标准曲线的制备
在7个10ml试管中，分别加入标准糖溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml， 每管用超纯水补足至1.0ml。向7支试管中分别加4ml蒽酮硫酸溶液，盖上塞子，混 匀后放入试管架，沸水浴中20分钟后，再放入40℃水浴中10min，放置紫外分光光度 计中在波长620nm处测量吸光度。
以PN12F型标准糖浓度(μg/ml)与其相应的吸光度值做直线回归，相关系数不 低于0.99。
4.2试样的测定
在6个10ml试管中，分别加入组合糖溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8ml、1.0ml，每 管用超纯水补足至1.0ml。
在3个10ml试管中，分别加入肺炎球菌12F样品糖溶液0.2ml、0.4ml、0.6ml于 比色管中，平行3份，每管用超纯水补足至1.0ml。
向上述组合糖试管和样品糖试管中分别加4ml蒽酮硫酸溶液，盖上塞子，混匀后放入试管架，沸水浴中20分钟后，再放入40℃水浴中10min，放置紫外分光光度计中 在波长620nm处测量吸光度。
4.3实验结果及分析
⑴以PN12F型肺炎球菌标准多糖作为标准品测定结果如下：
表1 PN12F型标准糖各浓度对应的吸光度值
PN12F型肺炎球菌标准糖浓度与其吸光度线性关系见附图1
⑵以PN12F型标准糖作为标准品测定样品糖、组合糖结果如下：
表2 PN12F样品糖、组合糖浓度检测结果
⑶以PN12F型组合糖作为标准品计算待测样品结果如下：
表3 PN12F型组合糖各浓度对应的吸光度值
以PN12F型组合糖浓度与其相应吸光度做线性回归，线性关系见附图2
⑷以PN12F型组合糖浓度与其相应吸光度做直线回归，计算样品糖浓度如下：
表4以PN12F型组合糖浓度与其吸光度的线性关系，计算待测样品结果
由上表可以看出，以PN12F型组合糖浓度与其相应吸光度做线性回归计算待测样品浓度重复性较好，变异系数较小，但都与以PN12F型标准糖浓度与其相应吸光度做 线性回归检测样品结果值存在偏差，若在以后的实验中用PN12F型组合糖溶液作为标 准品检测样品，则需要找到其样品检测值与标准品检测值之间的关系。
⑸分析PN12F型组合糖理论浓度值与检测值之间的差异可得：
表5 PN12F型组合糖理论浓度值与检测值(μg/ml)之间的校正系数关系
表5中，理论值即为C组合理论；检测值即为C组合检测；
表6以PN12F型组合糖作为标准品检测样品结果*校正系数(1.9)与以PN12F 型标准糖作为标准品测定样品结果之间的偏差
备注：PN12F型标准糖作为标准品检测样品结果值为C标，PN12F型组合糖作为 标准品检测样品结果值C组合。
由上表可以得出：使用系数1.9校正(PN12F)2015004002H2样品的检测结果， 与外购标准品检测结果之间的标准偏差值均在3％以内，表明使用组合糖代替外购标 准糖来检测样品糖含量具有良好的重复性，且偏差均值为1.2％。
在以后的样品糖检测中，用组合糖作为标准品做标准曲线，将样品糖浓度检测结果乘以系数1.9即为样品糖实际浓度值，偏差小，解决了外购标准糖昂贵成本问题。
5.组合糖代替外购标准糖做标准曲线方法验证
5.1重复性试验
通过重复试验，计算待测样品的CV值与SD值，用PN12F外购标准糖检测待检 样品CV值为1.1％，组合糖检测待检样品CV值为1.3％，用组合糖与外购标准糖分别 做标准品检测样品，两者检测结果之间的偏差为1.2％，对上述PN2型到PN33F型共 24种组合糖做标准品分别进行重复性试验验证，CV值与SD值均在5％以内，表明用 组合糖代替外购标准糖来检测样品时，样品的处理方法和测定方法都具有良好的重复 性。
5.2加样回收率试验
平行取PN12F待检多糖样品6份，随机平均分成2组，向其中一组分别加入待检 样品的80％，100％，120％的组合糖标样，混合均匀后，按照“实施例4.1”和“实施 例4.2”的方法进行处理，计算组合糖加样回收率，检测结果如下：
表7 PN12F型组合糖加样回收率测定结果
表8 24种组合糖型加样回收率测定(n＝3)以及以组合糖作为标准品检测样品浓度时所用系数：
回收率均在95.3％～108.3％之间，表明用组合糖代替外购标准糖检测样品的准确 度较高，可很好地应用于日常分析和检测。
实施例2
肺炎链球菌1型多糖(PN1型)
6.试剂与标准物质
⑴四硼酸钠硫酸溶液：精密称取四硼酸钠9.55g，溶于浓硫酸1000ml中，两者 混匀，室温保存。
⑵咔唑溶液：精密称取咔唑125mg，加无水乙醇100ml，溶解后置于棕色瓶中， 2～8℃保存。
⑶肺炎球菌多糖标准品(PN1型)：PN1型肺炎多糖标准品来源于丹麦国立血清 研究所。
⑷肺炎球菌多糖待测样品(PN1型)：JK01B-A201307007，各项检测指标均合格。
⑸肺炎球菌组合多糖(PN1型)：依据PN1型肺炎球菌多糖的结构式，确定其由 半乳糖醛酸、N-乙酰-D-半乳糖胺两种单糖组成，摩尔比为n半乳糖醛酸：nN-乙酰-D-半乳糖胺＝2： 1，按照上述比例配制PN1型组合糖。
7.仪器
⑴紫外分光光度计(UV-1800)
⑵比色皿：45*12.5*12.5(mm)
⑶试管：10ml
⑷分析天平：感量0.01mg
⑸移液器：Thermo，GH98732；eppendorf，232200A
⑹电热恒温水浴箱：HH.W21.420
8.试样制备
⑴PN1型肺炎球菌多糖标准品溶液配制：PN1型标准多糖(外购)10mg溶于2ml 纯水中配制成5mg/ml的多糖溶液，取5mg/ml的多糖溶液85μl，用超纯水稀释至4ml， 配制成106.3μg/ml的标准品溶液。
⑵PN1型肺炎球菌组合糖溶液配制：精密称取半乳糖醛酸42.4mg、N-乙酰-D- 半乳糖胺22.1mg，用超纯水定容到500ml配制成129μg/ml的组合糖溶液。
⑶PN1型样品(JK01B-A201307007)(160μg/ml)：精密称取样品糖8.0mg， 用超纯水稀释至50ml配制成浓度为160μg/ml的溶液。
9.测定步骤
9.1标准曲线的制备
在7个10ml试管中，分别加入肺炎球菌多糖标准品溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、 0.8、1.0ml，每管用超纯水补足至1.0ml。向7支试管中分别加5ml四硼酸钠硫酸溶液， 盖上塞子，并在管口缠上封口膜，混匀后放入试管架，沸水浴中15分钟后冷却至20℃。 然后再加入0.2ml咔唑溶液，盖上塞子，混匀后放入试管架中沸水浴15min，冷却至 20℃后，放置紫外分光光度计中在波长530nm处测量吸光度。
以PN1型肺炎球菌标准试液中多糖浓度(μg/ml)与其相应的吸光度做直线回归，相关系数不低于0.99。
9.2试样的测定
在6个10ml试管中，分别加入肺炎球菌组合糖溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8ml，每管用超纯水补足至1.0ml。
在3个10ml试管中，分别加入肺炎球菌样品糖溶液0.2ml、0.4ml、0.6ml于比色 管中，平行3份，每管用超纯水补足至1.0ml。
向上述组合糖试管和样品糖试管中分别加5ml四硼酸钠硫酸溶液，盖上塞子，并在管口缠上封口膜，混匀后放入试管架，沸水浴中15分钟后冷却至20℃。然后再加 入0.2ml咔唑溶液，盖上塞子，混匀后放入试管架中沸水浴15min，冷却至20℃后， 放置紫外分光光度计中在波长530nm处测量吸光度。
9.3实验结果及分析
⑴以PN1型肺炎球菌标准糖作为标准品测定结果如下：
表9 PN1型标准糖各浓度对应的OD值
⑵以PN1型标准糖作为标准品测定样品糖、组合糖结果如下：
表10 PN1型样品糖、组合糖检测结果
⑶以PN1型肺炎球菌组合多糖作为标准品计算待测样品结果如下：
表11 PN1型肺炎球菌组合多糖各浓度对应吸光度值
⑷以PN1型组合糖溶液浓度与其相应吸光度做直线回归，检测结果如下：
表12以PN1型组合糖浓度与其吸光度做线性回归，计算待测样品浓度
由上表可以看出，以PN1型组合糖溶液浓度与其相应吸光度做线性回归计算待测样品结果重复性较好，变异系数较小，但都与以PN1型标准糖浓度与其相应吸光度做 线性回归检测样品结果值存在偏差，若在以后的实验中用PN1型组合糖溶液作为标准 曲线检测样品，则需要找到其样品检测值与标准检测值之间的关系。
⑸分析PN1型肺炎球菌组合糖理论浓度值与检测值之间的差异可得：
表13 PN1型肺炎球菌组合糖检测值与理论浓度值之间的校正系数关系
表13中，理论值即为C组合理论；检测值即为C组合检测；
表14以PN1型组合糖浓度与其相应吸光度值做线性回归计算样品结果*校正系 数(0.8)与以PN1型标准糖作为标准品测定样品结果之间的偏差
备注：PN1型肺炎球菌标准糖作为标准品检测样品结果值为C标，PN1型肺炎球 菌组合糖作为标准品检测样品结果值C组合。
由上表可以得出：使用系数0.8校正(PN1)JK01B-A201307007样品的检测结果， 与外购标准糖检测结果之间的标准偏差值均在3％以内，表明使用组合糖代替外购标 准糖来检测样品糖含量具有良好的重复性，且偏差均值为1.0％，可以使用该系数进行 实验。
10.组合糖代替外购标准糖做标准曲线方法验证
10.1重复性试验
通过重复试验，计算待测样品的CV值与SD值，用PN1型外购标准糖检测待检 样品CV值为1.1％，组合糖检测待检样品CV值为1.1％，用组合糖与外购标准糖分别 做标准品检测样品，两者检测结果之间的偏差为1.0％，表明用组合糖代替外购标准糖 来检测样品时，样品的处理方法和测定方法都具有良好的重复性。
10.2加样回收率试验
平行取待测多糖样品(160μg/ml)6份，每份取0.2ml，随机平均分成2组，其中 一组加入待测样品浓度的80％，100％，120％的组合糖溶液，混合均匀后，分别按照 “实施例4.1”和“实施例4.2”的方法进行处理和测定，计算组合糖的加样回收率。
表15 PN1型肺炎球菌组合糖加样回收率测定结果
从上表结果中可以看出，组合糖加样回收率在99.5％～106.1％之间，用组合糖代替外购标准糖做标准曲线，该方法准确度较高，重复性较好，价格便宜易得，可很好 地应用于日常分析和检测。
Claims (9)
1.一种肺炎球菌多糖的定量检测方法，包括如下步骤：
1)以一系列不同浓度的肺炎球菌多糖标准品与其相应的吸光度建立肺炎球菌多糖标准品的标准曲线；
2)配制不同浓度的肺炎球菌组合多糖，该浓度记为C组合理论；
根据步骤1)所得肺炎球菌多糖标准品的标准曲线，测定所述肺炎球菌组合多糖的检测浓度，该浓度记为C组合检测；
定义C组合理论×校正系数＝C组合检测；
所述肺炎球菌组合多糖由单糖组成；所述单糖的种类与摩尔比与所述步骤1)中所述肺炎球菌多糖标准品所含各单糖种类和摩尔比一致；
3)以一系列不同C组合理论的步骤2)所述肺炎球菌组合多糖与其对应的吸光度建立肺炎球菌多糖组合多糖的标准曲线；
4)将待测样品的吸光度代入步骤3)所述肺炎球菌多糖组合多糖的标准曲线，获得对应的所述待测样品的多糖浓度，记为C待测，则所述待测样品的实际多糖浓度为所述校正系数×C待测。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1)和步骤3)建立标准曲线步骤中，向所述肺炎球菌多糖标准品或肺炎球菌组合多糖中加入显色试剂，进行显色反应；显色试剂为蒽酮硫酸溶液或四硼酸钠硫酸溶液和咔唑的乙醇溶液；所述四硼酸钠硫酸溶液为由四硼酸钠和浓硫酸组成。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述蒽酮硫酸溶液中，硫酸的浓度为50％～90％；蒽酮硫酸溶液的浓度为0.05g/100ml～0.2g/100ml；所述四硼酸钠与浓硫酸的用量比为9.55g：1000ml；所述咔唑的乙醇溶液中，咔唑和无水乙醇的用量比为125mg：100ml。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述蒽酮硫酸溶液中，硫酸的浓度为75％；蒽酮硫酸溶液的浓度为0.1g/100ml。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1)和步骤3)建立标准曲线步骤中，所用显色反应均在沸水浴中进行；反应时间为5～35min；
反应完毕后还包括在水浴中静置的步骤。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述步骤1)和步骤3)建立标准曲线步骤中，反应时间为20min；
所述静置步骤中，静置的时间为5～15min；水浴的温度为0～80℃。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述静置步骤中，静置的时间为10min；水浴的温度为40℃。
8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于：测定吸光度步骤中，吸光度的测量波长为400nm～700nm。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：测定吸光度步骤中，吸光度的测量波长为530nm或620nm。
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