CN101657726A - 自动多糖比色分析 - Google Patents

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Abstract

本文提供一种自动测定糖浓度的方法。所述方法包括：制备一个或多个糖标准品和一个或多个稀释过的多糖试样；将所述一个或多个糖标准品和所述一个或多个稀释过的多糖试样的一部分连同稀释剂一起转移到多孔板中的一系列孔中；将一部分酸试剂转移到所述多孔板中的所述一系列孔中；混合所述多孔板中所述一系列孔的内容物；加热并冷却所述多孔板中所述一系列孔的内容物；振荡所述多孔板；和测量所述多孔板中所述一系列孔的内容物的辐射能吸收，其中所有步骤都是在无人工介入的情况下执行。

Description

自动多糖比色分析
技术领域
本发明涉及自动测定糖浓度的方法。
背景技术
测量各种样品中的糖含量是许多科学领域中的基本分析操作。众所周知的测定糖浓度的比色法包括使用蒽酮(R.多雷伍德(Dreywood，R.)，工业与工程化学(Ind.EngChem.)，分析版(Anal.Ed.)18：499，1946；E.E.莫斯(Morse，E.E.)，分析化学(Anal.Chem.)19：1012，1947；和D.L.莫里斯(Morris，D.L.)，科学(Science)107：254，1948)、酚试剂(杜波斯(Dubois)等人，自然(Nature)168：167，1951；杜波斯(Dubois)等人，分析化学(Anal.Chem.)28：350-56，1956；以及布鲁曼坎兹(Blumenkrantz)和埃斯波-汉森(Asboe-Hansen)，分析生物化学(Anal.Biochem.)54：484，1973)、地衣酚(orcinol)(埃文(Irwin)和里韦尔(Leaver)，自然(Nature)177：1126，1956)和间苯二酚(莫塞尼(Monsigny)等人，分析生物化学(Anal.Biochem.)175：525-30，1988)进行的分析。蒽酮分析用于测量含有中性己糖的多糖的糖浓度，而酚试剂(例如，间羟基联苯(mHDP)/3-苯基苯酚)则用于测量含有半乳糖醛酸或葡萄糖醛酸单糖的多糖的糖浓度。
用于糖浓度测定的各种比色分析内可变性的来源包括与操作人员进行样品制备和测量有关的因素，诸如样品处理、试剂稀释、试剂的不稳定性、加热和冷却时间的变化等。取样困难是应用许多所述分析时所固有的，这是因为通常需要从毫克/毫升浓度稀释到微克/毫升浓度，以使样品达到相对于标准品可定量的程度。尽管存在严格的方案，但取样的困难(即，需要操作人员将浓溶液稀释成极稀溶液)阻碍了这些分析发展成进行药品调配和标示量(label claim)调配的准确可靠的分析。因此，仍需要开发出自动测定糖浓度的有效方法。
发明内容
本文提供一种自动测定糖浓度的方法。所述方法包括：(1)制备一个或多个糖标准品，其包括以下步骤：(a)将一部分糖工作储备液(working stock solution)从糖工作储备液源容器转移到多个糖标准品接收容器中，(b)将一部分稀释剂从稀释剂源容器转移到所述多个糖标准品接收容器中，和(c)混合所述多个糖标准品接收容器的内容物，以制备所述一个或多个糖标准品；(2)制备一个或多个稀释过的多糖试样，其包括以下步骤：(a)将一部分多糖试样从多糖试样源容器转移到多个多糖试样接收容器中，(b)将一部分稀释剂从稀释剂源容器转移到所述多个多糖试样接收容器中，和(c)混合所述多个多糖试样接收容器的内容物，以制备所述一个或多个稀释过的多糖试样；(3)将一部分稀释剂从稀释剂源容器转移到多孔板的一系列孔中；(4)将所述一个或多个糖标准品的一部分从所述多个糖标准品接收容器中每一个转移到所述多孔板的一系列孔中；(5)将所述一个或多个稀释过的多糖试样的一部分从所述多个多糖试样接收容器中每一个转移到所述多孔板的一系列孔中；(6)将一部分酸试剂从酸试剂源容器转移到所述多孔板中所有所述含有所述稀释剂、所述一个或多个糖标准品和所述一个或多个稀释过的多糖试样的一系列孔中；(7)混合所述多孔板中所有所述含有所述稀释剂、所述一个或多个糖标准品和所述一个或多个稀释过的多糖试样的一系列孔的内容物；(8)用盖子覆盖所述多孔板；(9)加热所述多孔板；(10)冷却所述多孔板；(11)振荡所述多孔板；和(12)测量所述多孔板中所有所述含有所述稀释剂、所述一个或多个糖标准品和所述一个或多个稀释过的多糖试样的一系列孔的内容物的辐射能吸收，其中步骤1-12是在无人工介入的情况下执行。
在一个实施例中，在将所述多孔板冷却后执行额外步骤，即将一部分显色剂从显色剂源容器转移到所述多孔板中所有所述含有所述稀释剂、所述一个或多个糖标准品和所述一个或多个稀释过的多糖试样的一系列孔中。
欲使用本发明的方法分析糖浓度的多糖试样包括含有细菌荚膜多糖、活性细菌荚膜多糖或细菌荚膜多糖-蛋白质连结物的试样。示范性细菌荚膜多糖包括来自脑膜炎奈瑟菌(N.meningitidis，Nm)血清群Y和W135；B群链球菌(Group B Streptococcus，GBS)血清型Ia和III；和肺炎链球菌(S.pneumoniae)血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F的细菌荚膜多糖。
在另一个实施例中，所述方法包括：(1)制备一个或多个糖标准品，其包括以下步骤：(a)将一部分糖工作储备液从糖工作储备液源容器转移到多个糖标准品接收容器中，所述糖工作储备液包括一种或多种选自由鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、半乳糖醛酸、丙酮酸、N-乙酰基-D-半乳糖胺和N-乙酰基-D-甘露糖胺组成的群组的糖，(b)将一部分稀释剂从稀释剂源容器转移到所述多个糖标准品接收容器中，和(c)混合所述多个糖标准品接收容器的内容物，以制备所述一个或多个糖标准品；(2)制备一个或多个稀释过的多糖试样，其包括以下步骤：(a)将一部分多糖试样从多糖试样源容器转移到多个多糖试样接收容器中，所述多糖试样包括选自由肺炎链球菌血清型3、4、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F组成的细菌群组的细菌荚膜多糖，(b)将一部分稀释剂从稀释剂源容器转移到所述多个多糖试样接收容器中，和(c)混合所述多个多糖试样接收容器的内容物，以制备所述一个或多个稀释过的多糖试样；(3)将一部分稀释剂从稀释剂源容器转移到多孔板的一系列孔中；(4)将所述一个或多个糖标准品的一部分从所述多个糖标准品接收容器中每一个转移到所述多孔板的一系列孔中；(5)将所述一个或多个稀释过的多糖试样的一部分从所述多个多糖试样接收容器中每一个转移到所述多孔板的一系列孔中；(6)将一部分硫酸-蒽酮试剂从硫酸-蒽酮试剂源容器转移到所述多孔板中所有所述含有所述稀释剂、所述一个或多个糖标准品和所述一个或多个稀释过的多糖试样的一系列孔中；(7)混合所述多孔板中所有所述含有所述稀释剂、所述一个或多个糖标准品和所述一个或多个稀释过的多糖试样的一系列孔的内容物；(8)用盖子覆盖所述多孔板；(9)加热所述多孔板；(10)冷却所述多孔板；(11)振荡所述多孔板；和(12)测量所述多孔板中所有所述含有所述稀释剂、所述一个或多个糖标准品和所述一个或多个稀释过的多糖试样的一系列孔的内容物的辐射能吸收，其中步骤1-12是在无人工介入的情况下执行。
在另一个实施例中，所述方法包括：(1)制备一个或多个糖标准品，其包括以下步骤：(a)将一部分糖工作储备液从糖工作储备液源容器转移到多个糖标准品接收容器中，所述糖工作储备液包括半乳糖醛酸，(b)将一部分稀释剂从稀释剂源容器转移到所述多个糖标准品接收容器中，和(c)混合所述多个糖标准品接收容器的内容物，以制备所述一个或多个糖标准品；(2)制备一个或多个稀释过的多糖试样，其包括以下步骤：(a)将一部分多糖试样从多糖试样源容器转移到多个多糖试样接收容器中，所述多糖试样包括选自由肺炎链球菌血清型1和5组成的细菌群组的细菌荚膜多糖，(b)将一部分稀释剂从稀释剂源容器转移到所述多个多糖试样接收容器中，和(c)混合所述多个多糖试样接收容器的内容物，以制备所述一个或多个稀释过的多糖试样；(3)将一部分稀释剂从稀释剂源容器转移到多孔板的一系列孔中；(4)将所述一个或多个糖标准品的一部分从所述多个糖标准品接收容器中每一个转移到所述多孔板的一系列孔中；(5)将所述一个或多个稀释过的多糖试样的一部分从所述多个多糖试样接收容器中每一个转移到所述多孔板的一系列孔中；(6)将一部分硫酸-四硼酸盐试剂从硫酸-四硼酸盐试剂源容器转移到所述多孔板中所有所述含有所述稀释剂、所述一个或多个糖标准品和所述一个或多个稀释过的多糖试样的一系列孔中；(7)混合所述多孔板中所有所述含有所述稀释剂、所述一个或多个糖标准品和所述一个或多个稀释过的多糖试样的一系列孔的内容物；(8)用盖子覆盖所述多孔板；(9)加热所述多孔板；(10)冷却所述多孔板；(11)将一部分包括间羟基联苯的显色剂从显色剂源容器转移到所述多孔板中所有所述含有所述稀释剂、所述一个或多个糖标准品和所述一个或多个稀释过的多糖试样的一系列孔中；(12)振荡所述多孔板；和(13)测量所述多孔板中所有所述含有所述稀释剂、所述一个或多个糖标准品和所述一个或多个稀释过的多糖试样的一系列孔的内容物的辐射能吸收，其中步骤1-13是在无人工介入的情况下执行。
由于排除了传统糖浓度测定分析中与操作人员进行样品制备和测量有关的因素(例如，样品处理和溶剂稀释)，故使用本发明的方法改进了糖浓度测定的准确性。
具体实施方式
本发明提供一种针对自动测定糖浓度的方法。具体说来，所述方法包括：(1)制备一个或多个糖标准品，其包括以下步骤：(a)将一部分糖工作储备液从糖工作储备液源容器转移到多个糖标准品接收容器中，(b)将一部分稀释剂从稀释剂源容器转移到所述多个糖标准品接收容器中，和(c)混合所述多个糖标准品接收容器的内容物，以制备所述一个或多个糖标准品；(2)制备一个或多个稀释过的多糖试样，其包括以下步骤：(a)将一部分多糖试样从多糖试样源容器转移到多个多糖试样接收容器中，(b)将一部分稀释剂从稀释剂源容器转移到所述多个多糖试样接收容器中，和(c)混合所述多个多糖试样接收容器的内容物，以制备所述一个或多个稀释过的多糖试样；(3)将一部分稀释剂从稀释剂源容器转移到多孔板的一系列孔中；(4)将所述一个或多个糖标准品的一部分从所述多个糖标准品接收容器中每一个转移到所述多孔板的一系列孔中；(5)将所述一个或多个稀释过的多糖试样的一部分从所述多个多糖试样接收容器中每一个转移到所述多孔板的一系列孔中；(6)将一部分酸试剂从酸试剂源容器转移到所述多孔板中所有所述含有所述稀释剂、所述一个或多个糖标准品和所述一个或多个稀释过的多糖试样的一系列孔中；(7)混合所述多孔板中所有所述含有所述稀释剂、所述一个或多个糖标准品和所述一个或多个稀释过的多糖试样的一系列孔的内容物；(8)用盖子覆盖所述多孔板；(9)加热所述多孔板；(10)冷却所述多孔板；(11)振荡所述多孔板；和(12)测量所述多孔板中所有所述含有所述稀释剂、所述一个或多个糖标准品和所述一个或多个稀释过的多糖试样的一系列孔的内容物的辐射能吸收，其中步骤1-12是在无人工介入的情况下执行。
“糖标准品”是指各标准品具有已知的糖浓度的一系列标准品。所述一系列标准品可包括例如浓度在2.5nM到100nM范围内，诸如浓度为2.5nM、5nM、10nM、15nM、20nM、25nM、30nM、35nM、40nM、45nM、50nM、55nM、60nM、65nM、70nM、75nM、80nM、85nM、90nM、95nM和100nM的糖。将理论标准品浓度(例如，nM)对所述一系列标准品中各标准品浓度的一组相同样品的平均吸光度测量值作图，并通过线性回归分析计算斜率、y截距和相关系数(r)，产生标准曲线。
如本文所使用，术语“糖工作储备液”包括具有糖组合物的溶液，所述糖组合物反映来自特定细菌的荚膜多糖的多糖重复单元的组成。示范性细菌包括脑膜炎奈瑟菌血清群Y(葡萄糖重复单元)、脑膜炎奈瑟菌血清群W135(半乳糖重复单元)、B群链球菌血清型Ia(葡萄糖/半乳糖重复单元)、B群链球菌血清型III(葡萄糖/半乳糖重复单元)、肺炎链球菌血清型1(半乳糖醛酸重复单元)、肺炎链球菌血清型3(葡萄糖重复单元)、肺炎链球菌血清型4(半乳糖/N-乙酰基-D-半乳糖胺/N-乙酰基-D-甘露糖胺/丙酮酸重复单元)、肺炎链球菌血清型5(半乳糖醛酸重复单元)、肺炎链球菌血清型6A(半乳糖/葡萄糖/鼠李糖重复单元)、肺炎链球菌血清型6B(半乳糖/葡萄糖/鼠李糖重复单元)、肺炎链球菌血清型7F(半乳糖/葡萄糖/鼠李糖重复单元)、肺炎链球菌血清型9V(葡萄糖/半乳糖/半乳糖醛酸重复单元)、肺炎链球菌血清型14(葡萄糖/半乳糖重复单元)、肺炎链球菌血清型18C(半乳糖/葡萄糖/鼠李糖重复单元)、肺炎链球菌血清型19A(葡萄糖/鼠李糖重复单元)、肺炎链球菌血清型19F(葡萄糖/鼠李糖重复单元)和肺炎链球菌血清型23F(半乳糖/鼠李糖/葡萄糖重复单元)。
“源容器”(如糖工作储备液源容器、糖标准品接收容器、多糖试样源容器和多糖试样接收容器中所用)是指在储存和操作期间可用于容纳液体溶液的任何接受器(receptacle)。所属领域中众所周知此类容器，并且其包括(但不限于)玻璃试管、塑料试管、玻璃小瓶、塑料小瓶、塑料离心管和塑料微量离心管。
如本文所使用，“转移”(如在转移一部分糖工作储备液、转移一部分稀释剂、转移一部分多糖试样、转移所述一个或多个糖标准品的一部分、转移所述一个或多个稀释过的多糖试样的一部分和转移一部分酸试剂中所用)包括将液体从源容器运输或移动到接收容器，或将液体从源容器/接收容器运输或移动到多孔板的孔中。所属领域技术人员众所周知，可通过自动液体处理装置实现液体的转移。所述装置一般使用一个或多个能同时转移多个液体样品的多通道移液歧管(multichannel pipette manifold)。
“稀释剂”是指用于实现例如糖工作储备液或多糖试样的稀释的试剂，以及用作“空白”(即，不含糖/多糖)以进行依赖于辐射能吸收测量值的糖浓度测定的试剂。本发明所用的稀释剂例如包括注射用水(WFI)、生理盐水(即，0.9％NaCl)和琥珀酸盐缓冲的生理盐水。“混合”是指在接收容器或多孔板的孔中将各种组分相混或掺合。所属领域技术人员众所周知，可通过多种方式，例如包括反复移液(诸如通过自动液体处理装置执行)和振荡(诸如通过板振荡器执行)，来实现液体组分的混合。
如本文所使用，“多糖试样”包括含有已知组成的多糖的样品。试样中多糖的组成须为已知的，因为是使用从利用由适当糖标准品得到的吸光度数据产生的线性回归线获得的方程，通过测定所存在的糖重复单元的量(例如，以纳摩尔浓度为单位)，来得到糖浓度。用特定血清型多糖重复单元的分子量乘以由适当线性回归线获得的多糖重复单元的纳摩尔浓度，将提供多糖试样中所存在的多糖重复单元的纳克数。
已知组成的多糖的实例包括诸如来自脑膜炎奈瑟菌血清群Y、脑膜炎奈瑟菌血清群W135、B群链球菌血清型Ia、B群链球菌血清型III、肺炎链球菌血清型1、肺炎链球菌血清型3、肺炎链球菌血清型4、肺炎链球菌血清型5、肺炎链球菌血清型6A、肺炎链球菌血清型6B、肺炎链球菌血清型7F、肺炎链球菌血清型9V、肺炎链球菌血清型14、肺炎链球菌血清型18C、肺炎链球菌血清型19A、肺炎链球菌血清型19F和肺炎链球菌血清型23F的细菌荚膜多糖。试样中所含多糖可为未经修饰的、经活化的(即，经修饰以促进其连结)、经连结的(例如，与诸如CRM197等载体蛋白连结)或其任何组合。“稀释过的多糖试样”是指添加过稀释剂的多糖试样。
如本文所使用，“酸试剂”包括具有酸性pH值的试剂。在优选实施例中，酸试剂包括硫酸。在一些实施例中，除硫酸外，酸试剂还包括蒽酮。在其它实施例中，除硫酸外，酸试剂还包括四硼酸盐。
“加热所述多孔板”是指增加多孔板各孔中内容物的温度。酸pH值(即，如由酸试剂提供)与热的组合可将多糖分解成其组成单糖。对于本发明的方法，在高于环境温度且至多100℃温度的温度下，诸如在75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、96℃、97℃、98℃和99℃下，加热多孔板。在优选实施例中，在95±5℃下，将多孔板加热10±2分钟。所属领域技术人员众所周知，将多糖分解成其组成单糖所需的加热的时间量尤其视加热多糖的温度而定；温度越低，需要加热的时间越长。所属领域技术人员将有能力根据所用温度调节加热的时间。可通过所属领域中众所周知的任何方法，诸如将多孔板放入水浴中或放在加热板上，来实现多孔板的加热。
“冷却所述多孔板”是指降低多孔板各孔中内容物的温度。可通过所属领域中众所周知的任何方法，诸如将板从其热源移开并使其在环境温度下冷却，来实现多孔板的冷却。或者，可将板转移到温度(诸如4℃)低于环境温度的环境(例如，冰箱或水浴)中。
如本文所使用，“振荡所述多孔板”包括搅动多孔板以混合其孔中的内容物。在本发明的方法中，可使用诸如板振荡器等所属领域众所周知的任何装置，实现多孔板的振荡。“测量所述多孔板中所有所述一系列孔的内容物的吸光度”是指使用分光光度计测量含有空白的一系列孔、含有糖标准品的一系列孔以及含有多糖试样的一系列孔的吸光度。对于重复单元中含有诸如半乳糖、葡萄糖和鼠李糖等中性己糖的多糖(例如，肺炎链球菌血清型3、4、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F；Nm血清型Y和W135；以及GBS血清型Ia和III)，使用硫酸-蒽酮试剂，并测定吸光度。在一些实施例中，在625nm下测定吸光度。对于重复单元中含有半乳糖醛酸或葡萄糖醛酸的多糖(例如，肺炎链球菌血清型1和5)，使用硫酸-四硼酸盐试剂与mHDP，并测定吸光度。在一些实施例中，在520nm下测定吸光度。在本发明的方法中，通过包括空白、糖标准品和多糖试样的多份相同样品，诸如2、3、4、5、6份或更多份相同样品，来增加准确性。随后测定空白、糖标准品和多糖试样的一组相同样品的平均吸光度。
在某些实施例中，本发明的方法包括：在冷却多孔板后，将一部分显色剂从显色剂源容器转移到多孔板中所有含有稀释剂、一个或多个糖标准品和一个或多个稀释过的多糖试样的一系列孔中。“显色剂”是指包括在与糖反应后形成可检测(例如，利用分光光度计)颜色的物质的组合物。示范性成色物质包括蒽酮、mHDP和咔唑。
以下实例是出于说明目的提供，并且不用作限制。
实验
实例1：测定糖含量的自动蒽酮分析
使用蒽酮分析，测定重复单元中含有诸如半乳糖、葡萄糖和鼠李糖等中性己糖的多糖(例如，肺炎链球菌血清型3、4、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F；Nm血清型Y和W135；以及GBS血清型Ia和III)的糖含量。在硫酸和热的作用下，将多糖分解成其组成单糖。蒽酮试剂与己糖反应，形成黄绿色复合物，利用分光光度计(例如，在625nm下)读取其吸光度；在分析范围内，吸光度与所存在的己糖的量成比例。
试剂制备
使用下式计算各血清型储备液所需的糖重量，来制备50mM糖储备液：
Figure G2008800123428D00071
分子量显示于表I中。
表I-分子量
  糖   半乳糖   半乳糖醛酸   葡萄糖   丙酮酸   鼠李糖   N-乙酰基-D-半乳糖胺   N-乙酰基-D-甘露糖胺
  分子量(g/mol)   180.2   212.2   180.2   110.0   182.2   221.2   221.2
使用50mM糖储备液，制备1.0mM(肺炎链球菌血清型3、4、6A、6B、7F、9V、14、19A、19F和23F；Nm血清型Y和W135；以及GBS血清型Ia和III)和0.5mM(肺炎链球菌血清型18C)糖工作储备液，以反映各血清型的多糖重复单元的组成(表II和III)。
表II-肺炎链球菌糖工作储备液
Figure G2008800123428D00081
表III-脑膜炎奈瑟菌/B群链球菌糖工作储备液
Figure G2008800123428D00082
通过将1.0g蒽酮与500ml硫酸混合，来制备酸试剂(0.2％蒽酮-硫酸)。
标准品制备
对于所有Nm、GBS和肺炎链球菌血清型(除18C外)，利用杰纳斯(Janus)(珀金-埃尔默公司(Perkin-Elmer)，马萨诸塞州沃尔瑟姆(Waltham，MA))自动液体处理系统，在数组每一浓度5个的微量离心管中，使用适于所分析血清型的1.0mM工作储备液并将WFI作为稀释剂，制备15nM、30nM、45nM和60nM糖标准品(1ml等分试样)。对于肺炎链球菌血清型18C，使用0.5mM工作储备液，制备7.5nM、15nM、22.5nM和30nM糖标准品(1ml等分试样)。使用这些体积制得默认标准曲线(default standardcurve)。
样品制备
利用杰纳斯自动液体处理系统，在数组每一稀释液5个的微量离心管中，制备使样品(例如，肺炎链球菌血清型3、4、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F；Nm血清型Y和W135；以及GBS血清型Ia和III)达到分析范围所需的稀释液。可使用以下计算来估算所有Nm、GBS和肺炎链球菌血清型(除18C外)的样品量：
Figure G2008800123428D00091
如果未完全确定样品的预期浓度，则选择一定范围的稀释度(例如，1∶50、1∶75、1∶100、1∶150和1∶200)，以使至少一种落在分析范围内。
程序
使用整合有莱伯威尔移动臂(labware movement arm)以及供读取器整合、温度控制和混合的辅助仪器的杰纳斯自动液体处理系统，将一式五份100μl稀释剂(例如，WFI)分配到多孔板5个孔中；稀释剂用作空白。将一式五份100μl各适当标准品(例如，肺炎链球菌血清型3、4、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F；Nm血清型Y和W135；或GBS血清型Ia和III)分配到多孔板5个孔中，同样，将一式五份100μl各试样分配到多孔板5个孔中。
将200μl酸试剂添加到各孔中，并利用反复移液，充分混合各孔的内容物。将多孔板覆盖(手工或经由莱伯威尔移动臂)并在95±5℃加热10±2分钟，此后在环境温度下冷却≥10分钟。通过莱伯威尔移动臂将多孔板放到读板器上，轻柔振荡并在625nm下测定各孔中内容物的辐射能吸收。
使用肺炎链球菌血清型6A糖标准品和试样执行的自动操作的代表性实例显示于表IV和表V中。
表IV-肺炎链球菌血清型6A
  空白   6A标准品   6A标准品   6A标准品   6A标准品   6A样品   6A样品   6A样品   6A样品   6A样品
  15nM   30nM   45nM   60nM   1∶50   1∶75   1∶100   1∶150   1∶200
  0.058   0.321   0.555   0.799   1.023   0.883   0.615   0.505   0.371   0.283
  0.067   0.351   0.577   0.828   1.020   0.909   0.646   0.527   0.390   0.288
  0.058   0.347   0.604   0.840   1.069   0.916   0.653   0.544   0.414   0.299
  0.058   0.368   0.556   0.851   1.071   0.899   0.641   0.549   0.421   0.312
  0.087   0.350   0.548   0.807   1.044   0.869   0.616   0.524   0.402   0.301
表V-肺炎链球菌血清型6A
使用9个不同的96孔板执行9个实验；在各板上制备一式六份的标准品和样品。对于实验1-6，使用15nM、30nM和60nM标准品产生标准曲线。对于实验7-9，使用8nM、15nM、23nM和30nM标准品产生标准曲线。显示样品浓度(mg/ml)。AVG.：平均值；Stnd.Dev.：标准差；RSD：相对标准差。
实例2：测定糖含量的自动糖醛酸分析
使用糖醛酸分析，测定重复单元中含有半乳糖醛酸或葡萄糖醛酸的多糖(例如，肺炎链球菌血清型1和5)的糖含量。在硫酸、四硼酸钠和热的作用下，将多糖分解成其组成单糖。添加mHDP引起紫红色复合物的形成，并利用分光光度计(例如在520nm下)读取吸光度；在分析范围内，吸光度与所存在的糖醛酸的量成比例。
试剂制备
使用下式计算所需半乳糖醛酸的重量，来制备50mM半乳糖醛酸储备液：
Figure G2008800123428D00111
使用50mM半乳糖醛酸储备液，制备1.0mM半乳糖醛酸工作储备液。
通过将2.38g十水合四硼酸钠与500ml硫酸混合，来制备酸试剂(12.5mM四硼酸钠-硫酸)。
标准品制备
利用杰纳斯自动液体处理系统，在数组每一浓度5个的微量离心管中，使用1.0mM半乳糖醛酸工作储备液并将WFI作为稀释剂，制备2nM、4nM、8nM、12nM和16nM糖标准品(1ml等分试样)。使用这些体积制得默认标准曲线。
样品制备
利用杰纳斯自动液体处理系统，在数组每一稀释液5个的微量离心管中，制备使样品(例如，肺炎链球菌血清型1和5)达到分析范围所需的稀释液。可使用以下计算来估算两种肺炎链球菌血清型的样品量：
Figure G2008800123428D00112
如果未完全确定样品的预期浓度，则选择一定范围的稀释度(例如，1∶50、1∶75、1∶100、1∶150和1∶200)，以使至少一种落在分析范围内。
程序：
使用整合有莱伯威尔移动臂以及供读取器整合、温度控制和混合的辅助仪器的杰纳斯自动液体处理系统，将一式五份40μl稀释剂(例如，WFI)分配到多孔板5个孔中；稀释剂用作空白。将一式五份40μl各适当标准品(例如，肺炎链球菌血清型1和5)分配到多孔板5个孔中，同样，将一式五份40μl各试样分配到多孔板5个孔中。
将250μl酸试剂添加到各孔中，并利用反复移液，充分混合各孔的内容物。将多孔板覆盖(手工或经由莱伯威尔移动臂)并在90℃加热20分钟，此后在环境温度下冷却≥20分钟。将5μl 0.15％mHDP添加到各孔中，并利用反复移液，充分混合各孔的内容物。使多孔板的内容物在环境温度下反应15-20分钟，此后通过莱伯威尔移动臂将多孔板放到读板器上，轻柔振荡并在520nm下测定各孔内容物的辐射能吸收。
冠词“一”在本文中用于指一个或多于一个(即，至少一个)所述冠词的语法宾语。举例说来，“一因素”意思指一个或多个因素。
本说明书中提及的所有公开案和专利申请案都指示本发明所属领域技术人员的水平。所有公开案和专利申请案都以引用的方式并入本文中，引用的程度就如同指出将各个别公开案或专利申请案特定且个别地以引用的方式并入本文中一般。
尽管已借助说明以及出于理解清楚的目的而提供的实例相当详细地描述了前述本发明，但显然，可在随附权利要求的范围内实行某些修改和变更。

Claims (23)

1.一种自动测定糖浓度的方法，其包含以下步骤：
a)制备一个或多个糖标准品，其包含以下步骤：
(i)将一部分糖工作储备液从糖工作储备液源容器转移到多个糖标准品接收容器中；
(ii)将一部分稀释剂从稀释剂源容器转移到所述多个糖标准品接收容器中；和
(iii)混合所述多个糖标准品接收容器的内容物，以制备所述一个或多个糖标准品；
b)制备一个或多个稀释过的多糖试样，其包含以下步骤：
(i)将一部分多糖试样从多糖试样源容器转移到多个多糖试样接收容器中；
(ii)将一部分所述稀释剂从所述稀释剂源容器转移到所述多个多糖试样接收容器中；和
(iii)混合所述多个多糖试样接收容器的内容物，以制备所述一个或多个稀释过的多糖试样；
c)将一部分所述稀释剂从所述稀释剂源容器转移到多孔板的一系列孔中；
d)将所述一个或多个糖标准品的一部分从所述多个糖标准品接收容器中每一个转移到所述多孔板的一系列孔中；
e)将所述一个或多个稀释过的多糖试样的一部分从所述多个多糖试样接收容器中每一个转移到所述多孔板的一系列孔中；
f)将一部分酸试剂从酸试剂源容器转移到所述多孔板中所有所述含有所述稀释剂、所述一个或多个糖标准品和所述一个或多个稀释过的多糖试样的一系列孔中；
g)混合所述多孔板中所有所述含有所述稀释剂、所述一个或多个糖标准品和所述一个或多个稀释过的多糖试样的一系列孔的内容物；
h)用盖子覆盖所述多孔板；
i)加热所述多孔板；
j)冷却所述多孔板；
k)振荡所述多孔板；和
l)测量所述多孔板中所有所述含有所述稀释剂、所述一个或多个糖标准品和所述一个或多个稀释过的多糖试样的一系列孔的内容物的辐射能吸收，
其中步骤a-1是在无人工介入的情况下执行。
2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包含以下步骤：在冷却所述多孔板后，将一部分显色剂从显色剂源容器转移到所述多孔板中所有所述含有所述稀释剂、所述一个或多个糖标准品和所述一个或多个稀释过的多糖试样的一系列孔中。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述显色剂包含间羟基联苯。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述糖工作储备液包含一种或多种选自由鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、半乳糖醛酸、丙酮酸、N-乙酰基-D-半乳糖胺和N-乙酰基-D-甘露糖胺组成的群组的糖。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述多糖试样包含细菌荚膜多糖、活性细菌荚膜多糖或细菌荚膜多糖-蛋白质连结物中的一种或多种。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述细菌荚膜多糖包含选自由以下组成的细菌群组的细菌荚膜多糖：脑膜炎奈瑟菌(N.meningitidis)血清群Y、脑膜炎奈瑟菌血清群W135、B群链球菌(Group B Streptococcus)血清型Ia、B群链球菌血清型III、肺炎链球菌(S.pneumoniae)血清型1、肺炎链球菌血清型3、肺炎链球菌血清型4、肺炎链球菌血清型5、肺炎链球菌血清型6A、肺炎链球菌血清型6B、肺炎链球菌血清型7F、肺炎链球菌血清型9V、肺炎链球菌血清型14、肺炎链球菌血清型18C、肺炎链球菌血清型19A、肺炎链球菌血清型19F、肺炎链球菌血清型23F和其组合。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述酸试剂包含硫酸和蒽酮。
8.根据权利要求2所述的方法，其中所述酸试剂包含硫酸和四硼酸盐。
9.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述糖工作储备液源容器、所述糖标准品接收容器、所述多糖试样源容器和所述多糖试样接收容器都选自由玻璃试管、塑料试管、玻璃小瓶、塑料小瓶、塑料离心管、塑料微量离心管和其组合组成的群组。
10.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述稀释剂选自由注射用水、生理盐水、琥珀酸盐缓冲的生理盐水和其组合组成的群组。
11.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述稀释剂为注射用水。
12.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述转移是由自动液体处理装置执行。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述自动液体处理装置包含多通道移液歧管。
14.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述混合是通过反复移液来执行。
15.根据权利要求1或2所述的方法，其中加热所述多孔板是通过板式加热器执行。
16.一种自动测定糖浓度的方法，其包含以下步骤：
a)制备一个或多个糖标准品，其包含以下步骤：
(i)将一部分糖工作储备液从糖工作储备液源容器转移到多个糖标准品接收容器中，所述糖工作储备液包含一种或多种选自由鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、半乳糖醛酸、丙酮酸、N-乙酰基-D-半乳糖胺和N-乙酰基-D-甘露糖胺组成的群组的糖；
(ii)将一部分稀释剂从稀释剂源容器转移到所述多个糖标准品接收容器中；和
(iii)混合所述多个糖标准品接收容器的内容物，以制备所述一个或多个糖标准品；
b)制备一个或多个稀释过的多糖试样，其包含以下步骤：
(i)将一部分多糖试样从多糖试样源容器转移到多个多糖试样接收容器中，所述多糖试样包含选自由以下组成的细菌群组的细菌荚膜多糖：肺炎链球菌血清型3、4、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F；
(ii)将一部分所述稀释剂从所述稀释剂源容器转移到所述多个多糖试样接收容器中；和
(iii)混合所述多个多糖试样接收容器的内容物，以制备所述一个或多个稀释过的多糖试样；
c)将一部分所述稀释剂从所述稀释剂源容器转移到多孔板的一系列孔中；
d)将所述一个或多个糖标准品的一部分从所述多个糖标准品接收容器中每一个转移到所述多孔板的一系列孔中；
e)将所述一个或多个稀释过的多糖试样的一部分从所述多个多糖试样接收容器中每一个转移到所述多孔板的一系列孔中；
f)将一部分硫酸-蒽酮试剂从硫酸-蒽酮试剂源容器转移到所述多孔板中所有所述含有所述稀释剂、所述一个或多个糖标准品和所述一个或多个稀释过的多糖试样的一系列孔中；
g)混合所述多孔板中所有所述含有所述稀释剂、所述一个或多个糖标准品和所述一个或多个稀释过的多糖试样的一系列孔的内容物；
h)用盖子覆盖所述多孔板；
i)加热所述多孔板；
j)冷却所述多孔板；
k)振荡所述多孔板；和
l)测量所述多孔板中所有所述含有所述稀释剂、所述一个或多个糖标准品和所述一个或多个稀释过的多糖试样的一系列孔的内容物的辐射能吸收，
其中步骤a-1是在无人工介入的情况下执行。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述选自由肺炎链球菌血清型3、4、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F组成的细菌群组的细菌荚膜多糖为活性细菌荚膜多糖。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述选自由肺炎链球菌血清型3、4、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F组成的细菌群组的细菌荚膜多糖与载体蛋白连结。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述载体蛋白为CRM197。
20.一种自动测定糖浓度的方法，其包含以下步骤：
a)制备一个或多个糖标准品，其包含以下步骤：
(i)将一部分糖工作储备液从糖工作储备液源容器转移到多个糖标准品接收容器中，所述糖工作储备液包含半乳糖醛酸；
(ii)将一部分稀释剂从稀释剂源容器转移到所述多个糖标准品接收容器中；和
(iii)混合所述多个糖标准品接收容器的内容物，以制备所述一个或多个糖标准品；
b)制备一个或多个稀释过的多糖试样，其包含以下步骤：
(i)将一部分多糖试样从多糖试样源容器转移到多个多糖试样接收容器中，所述多糖试样包含选自由肺炎链球菌血清型1和5组成的细菌群组的细菌荚膜多糖；
(ii)将一部分所述稀释剂从所述稀释剂源容器转移到所述多个多糖试样接收容器中；和
(iii)混合所述多个多糖试样接收容器的内容物，以制备所述一个或多个稀释过的多糖试样；
c)将一部分所述稀释剂从所述稀释剂源容器转移到多孔板的一系列孔中；
d)将所述一个或多个糖标准品的一部分从所述多个糖标准品接收容器中每一个转移到所述多孔板的一系列孔中；
e)将所述一个或多个稀释过的多糖试样的一部分从所述多个多糖试样接收容器中每一个转移到所述多孔板的一系列孔中；
f)将一部分硫酸-四硼酸盐试剂从硫酸-四硼酸盐试剂源容器转移到所述多孔板中所有所述含有所述稀释剂、所述一个或多个糖标准品和所述一个或多个稀释过的多糖试样的一系列孔中；
g)混合所述多孔板中所有所述含有所述稀释剂、所述一个或多个糖标准品和所述一个或多个稀释过的多糖试样的一系列孔的内容物；
h)用盖子覆盖所述多孔板；
i)加热所述多孔板；
j)冷却所述多孔板；
k)将一部分包含间羟基联苯的显色剂从显色剂源容器转移到所述多孔板中所有所述含有所述稀释剂、所述一个或多个糖标准品和所述一个或多个稀释过的多糖试样的一系列孔中；
l)振荡所述多孔板；和
m)测量所述多孔板中所有所述含有所述稀释剂、所述一个或多个糖标准品和所述一个或多个稀释过的多糖试样的一系列孔的内容物的辐射能吸收，
其中步骤a-m是在无人工介入的情况下执行。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述选自由肺炎链球菌血清型1和5组成的细菌群组的细菌荚膜多糖为活性细菌荚膜多糖。
22.根据权利要求20所述的方法，其中所述选自由肺炎链球菌血清型1和5组成的细菌群组的细菌荚膜多糖与载体蛋白连结。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述载体蛋白为CRM197。
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20100224