FR2694809A1 - Dispositif réactionnel pour identifier un produit, et son procédé d'obtention. - Google Patents

Dispositif réactionnel pour identifier un produit, et son procédé d'obtention. Download PDF

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Abstract

Dispositif réactionnel (1) destiné à caractériser dans un échantillon liquide à tester, par au moins une réaction d'identification, la présence et/ou la quantité d'un produit recherché, ledit système comprenant au moins un réactif participant à la réaction d'identification, déposé (2) sous forme sèche sur un support (1) destiné à être mis au contact d'un milieu liquide, et non lié audit support, notamment par liaison chimique covalente, caractérisé en ce que d'une part ledit support consiste en un contenant unitaire (1) réactionnel, agencé pour recevoir directement la totalité de l'échantillon à tester, et pour servir d'enceinte réactionnelle, et d'autre part au moins un réactif, de nature labile, est déposé et contenu en couche (2) dans ledit contenant unitaire, dans une quantité prédéterminée.

Description

Dispositif réactionnel pour identifier un produit,
et son procédé d'obtention
La présente invention concerne un dispositif ou système réactionnel, permettant de caractériser dans un échantillon liquide à tester, par au moins une réaction d'identification, la présence et/ou la quantité d'un produit recherché.
On a déjà proposé un dispositif ou système réactionnel comprenant un ou plusieurs réactifs participant à une ou plusieurs réactions d'identification, déposés ou incorporés sous forme sèche sur un support inerte divisé (par exemple granulés), délitable ou soluble en présence d'une phase liquide, par exemple de liteau. Le ou les réactifs ne sont pas liés au support, par exemple par liaison chimique covalente. Chaque partie divisée, ou granulé, du support inerte contient une quantité prédéterminée d'un ou plusieurs réactifs participant à la réaction d'identification.
L'utilisation d'un tel dispositif ou système réactionnel s'effectue comme suit
- en fonction de la réaction d'identification, de la sensibilité recherchée, de la quantité présumée du produit recherché dans l'échantillon liquide à tester, etc, l'opérateur dose une quantité prédéterminée de granulés;
- ces granulés sont ensuite introduits dans un récipient réactionnel, et dissous en présence d'un solvant approprié, par exemple de l'eau; si la solution obtenue doit s'intégrer, avant, pendant ou après réaction, dans une chaîne de mesure optique, en réception et/ou émission d'un faisceau lumineux, alors il faut introduire dans le récipient réactionnel, outre la quantité prédéterminée de granulés, une quantité dosée de solvant;
- un échantillon liquide calibré à tester, présumé contenir le produit recherché, est alors introduit dans le récipient réactionnel;
- l'existence de la réaction d'identification, et/ou son intensité, dans le récipient réactionnel, carac térisent le produit recherché, en présence et/ou quantité; préférentiellement, la réaction d'identification est mise en évidence par voie optique, par exemple spectrophoto métrie.
Un tel dispositif réactionnel présente encore les inconvénients suivants.
I1 requiert des manipulations, certes limitées, mais néanmoins existantes, à savoir dosage des granulés et éventuellement dosage du solvant de dissolution. En conséquence, la précision et l'exactitude des résultats de l'analyse demeurent pour partie dépendantes de l'adresse et de l'attention du manipulateur.
Jusqu'à présent, il n'est pas apparu possible de disposer de ce type de conditionnement pour des réactifs fragiles, notamment photolabiles ou thermolabiles, tels qu'enzymes, sondes d'hybridation cytochimique, et microorganismes, etc.
La présente invention a pour objet un dispositif réactionnel permettant à la fois de conditionner un réactif labile, et d'intégrer ce dernier dans un processus réactionnel unitaire d'identification, c'est-à-dire ne nécessitant aucune manipulation de réactifs, hormis l'introduction initiale de l'échantillon liquide à tester.
Selon la présente invention, en combinaison, d'une part le support consiste en un contenant unitaire réactionnel, agencé pour recevoir directement la totalité de l'échantillon liquide à tester, et pour servir d'enceinte réactionnelle, et d'autre part, au moins un réactif, de nature labile, est déposé et contenu en couche dans ledit contenant unitaire, dans une quantité prédéterminée.
La présente invention a été rendue possible par la découverte d'un procédé d'obtention particulier du ou des réactifs à l'état sec. Ce procédé consiste à introduire une quantité prédéterminée d'un réactif, contenue dans un solvant, dans le contenant unitaire, à éliminer le solvant de façon relativement rapide, sous l'action conjuguée d'un vide appliqué à l'intérieur du contenant unitaire, d'une centrifugation de ce dernier, et éventuellement d'un apport de chaleur nécessaire à la vaporisation du solvant.
Ce procédé différent de la lyophilisation, qui consiste en l'action successive du froid et du vide, permet en effet une élimination rapide du ou des solvants dans lesquels sont dispersés ou dissous les réactifs, et préserve ainsi leurs propriétés ou capacités réactionnelles, en évitant en particulier toute dégradation ou dénaturation substantielle des réactifs thermolabiles, en maintenant à l'identique la ou les quantités des réactifs introduits sous forme liquide dans le contenant unitaire réactionnel, et en obviant éventuellement tout début de réaction interne entre les réactifs présents dans le contenant unitaire.
L'invention apporte en outre les avantages déterminants suivants.
Tous les réactifs, y compris le ou les réactifs fragiles, notamment labiles, peuvent être contenus dès le départ, en quantité dosée et prédéterminée, dans le contenant unitaire. On évite ainsi tout stockage séparé, puis manipulation complémentaire de certains réactifs.
Préalablement à l'introduction de l'échantillon liquide à tester, il n'y a pas lieu selon l'invention de compléter le milieu réactionnel par une quantité dosée de solvant ou autre phase liquide. L'introduction directe dans le contenant unitaire réactionnel de l'échantillon liquide à tester, en quantité dosée, constitue la seule manipulation requise pour l'analyse.
Grâce à l'invention, on peut utiliser des contenants réactionnels unitaires de volume relativement faible, par exemple de l'ordre de quelques centaines de microlitres, et en conséquence des quantités relativement faibles de réactifs. Consécutivement, pour une même réac tion d'identification, on n'a besoin que d'un faible volume de l'échantillon liquide à tester, ce qui pour certaines analyses apparaît particulièrement favorable.
Le dispositif réactionnel selon l'invention permet d'améliorer la sensibilité des réactifs thermolabiles usuels, puisque, pour des contenants unitaires de faible volume, une réaction d'identification pourra être détectée avec une quantité également faible dudit réactif et, qu'en définitive, selon l'invention le milieu réactionnel est reconditionné directement avec l'échantillon à tester.
Selon l'invention, dans la plupart des cas, on obtient un gain de sensibilité de l'ordre de 10 à 100.
Le dispositif réactionnel selon l'invention demeure compatible avec tous les appareils de mesure optique, dont il accroît la productivité en permettant un traitement automatique des contenants unitaires réactionnels.
Au sens de la présente invention, le produit recherché peut être tout produit, corps, ou composé, de nature chimique, par exemple un polluant de nature organique ou minérale, de nature biochimique, par exemple du cholestérol ou de 1 adénos l'adénosine-triphosphate (ATP), de na- ture biologique, par exemple un anticorps ou un antigène, un enzyme tel que la luciférase, de nature vivante, par exemple un micro-organisme.
En conséquence, la ou les réactions d'identification considérées par la présente invention sont
- de nature chimique, auquel cas le ou les réactifs concernés sont des composés, ou produits chimiques variés, choisis en fonction du produit recherché, et de la ou des réactions chimiques d'identification retenues, par exemple développement d'une couleur;
- de nature biochimique, auquel cas le ou les réactifs concernés sont des composés biochimiques, plus ou moins complexes, toujours choisis en fonction du produit recherché, et de la ou des réactions chimiques d'identification retenues;;
- de nature biologique, auquel cas le ou les réactifs concernés sont des réactifs biologiques variés, souvent fragiles, de nature thermolabile ou photolabile, tels qu'enzymes, co-enzymes, co-facteurs, anticorps, antigènes, etc, toujours choisis en fonction du produit recherché, et des mécanismes biologiques retenus, par exemple une réaction immuno-chimique;
- de nature physique, auquel cas le ou les réactifs concernés permettent directement ou indirectement une interaction de type physique avec l'échantillon liquide à tester, telle que la formation d'un précipité, résultant par exemple de l'interaction avec liaisons faibles entre le produit recherché et un ou plusieurs réactifs.
Préférentiellement, la ou les réactions d'identification retenues font intervenir une modification lumineuse du milieu réactionnel dans le contenant unitaire, de telle sorte qu'en agençant ce dernier avec des parois transparentes, et en l'intégrant dans une chaîne de mesure optique, on peut caractériser directement le produit recherché, en présence et/ou quantité. La modification lumineuse servant à la mesure peut être
- le développement d'une couleur, visible à l'oeil nu, ou sous éclairage en lumière non visible, par exemple
UV;
- l'absorption d'un faisceau lumineux reçu par le milieu réationnel, puis transmis par ce dernier dont phosphorescence;
- la luminescence du ou des produits des réactions d'identification;
- la fluorescence du ou des produits des réactions -d'identification.
Par "réactif", on entend non seulement -les produits engagés ou s'engageant dans une réaction d'identification, mais également tous ceux contribuant à une telle réaction, comme tout produit ou milieu tampon, un substrat enzymatique, un catalyseur, etc.
L'échantillon liquide à tester est toute quantité, calibrée en fonction du volume du contenant unitaire réactionnel, prélevée sur un milieu liquide présumé contenir le produit recherché. Il peut s'agir par exemple d'un échantillon d'un liquide alimentaire tel que du lait, d'un liquide corporel, tel qu'un plasma, etc...
Par "réactif labile", on entend tout produit ou composé particulièrement fragile dans sa structure ou sa composition, et susceptible d'être dénaturé ou dégradé par des températures au-delà de 30"C, et/ou en présence de la lumière. Il s'agit par exemple de protéines telles que des enzymes, et de microorganismes telscque des bactéries.
La présente invention présente encore les caractéristiques suivantes:
- la paroi du contenant unitaire réactionnel est agencée, en transparence, pour la réception et/ou l'émis- sion d'un faisceau lumineux servant à l'identification du produit recherché, et pour s'intégrer dans une chaîne de mesure optique;
- à la manière d'une barrette ou plaque de titration, une pluralité de contenants unitaires sont rassemblés ou juxtaposés ensemble et affectés séparément à dif férentes réactions d'identification respectivement, en relation avec un même milieu liquide à tester, par exemple du lait, du vin ou de l'eau;
- si la réaction d'identification fait intervenir plusieurs réactifs différents, tous ces derniers sont déposés et contenus en mélange sec dans le contenant unitaire;;
- si la caractérisation s'effectue par plusieurs réactions concomitantes et/ou successives, les différents réactifs des différentes réactions d'identification respectivement sont déposés et contenus en mélange sec dans le contenant unitaire.
La présente invention est maintenant décrite par référence aux dessins annexés, dans lesquels
- la Figure 1 représente un contenant unitaire réactionnel 1, selon la présente invention, ayant la forme d'une capsule ou cupule, revêtu d'un opercule 7, et au sein duquel est déposé et contenu en couche 2 une quantité prédéterminée d'un ou plusieurs réactifs sous forme sèche; la paroi 3 du contenant 1 est en matière plastique transparente;
- la Figure 2 représente les mêmes contenants unitaires 1, alignés selon une barrette ou plaque 4 de microtitration;
- la Figure 3 représente un sur-emballage 5, contenant plusieurs contenants unitaires 1, utilisables unitairement selon la demande.
Avec un contenant unitaire selon l'invention, l'utilisateur perfore ou retire l'opercule 7, et introduit dans le contenant 1, de manière manuelle ou automatique, un échantillon liquide à tester de volume ou quantité ca libré. Dès lors, par exemple sous incubation, se développent la ou les réactions d'identification, permettant d'aboutir à un ou plusieurs produits de réaction, lesquels permettent de caractériser le produit recherché, en présence et/ou quantité. Le ou lesdits produits de réaction peuvent être mesurés, notamment dans tout dispositif usuel de lecture optique, tel qu'un spectrophotomètre. Pour ce faire, la paroi des cupules 3 est transparente et agencée pour pouvoir s'intégrer dans une chaîne de mesure optique de tout appareil approprié.
Conformément à l'invention, on a testé un dispositif réactionnel selon l'invention, et un dispositif réactionnel antérieur, nécessitant des manipulations d'un opérateur, pour des dosages traditionnels de
- glucose, pour une concentration comprise entre 0,2 mg/l et 32 mg/l;
- ATP, pour une concentration comprise entre 1000 10-12 à 7,8 10-12 moles;
- et de protéines, pour une concentration comprise entre 15 mg/l et 1 mg/l.
Dans le premier cas, les réactifs usuels et propres à chaque analyse ont été rassemblés sous forme sèche dans une cupule telle que décrite précédemment, par évaporation sous centrifugation et sous vide; et dans le second cas les mêmes réactifs ont été manipulés de manière usuelle, telle que prescrite par les fournisseurs desdits réactifs. Les mesures finales ont été faites en spectrophotométrie.
Pour différentes concentrations des produits recherchés, les résultats obtenus n'ont pas été expérimentalement différents, selon qu'on utilise un dispositif réactionnel selon l'invention ou une méthode traditionnelle.
S'agissant du dosage du glucose, on illustre ciaprès les avantages de la présente invention, en comparant une méthode usuelle de dosage du glucose avec la méthode selon la présente invention.
Actuellement certaines sociétés proposent sur le marché, des kits de dosage pour la détermination du glucose (entre autre) par méthode spectrophotométrique (U.V.). Le principe en est simple : le glucose est phosphorylé par l'adénosine 5'-tri phosphate (ATP) en glucose6-phosphate (G.6.P.) dans une réaction catalysée par l'hexokinase (HK). En présence de glucose-6-phosphatedeshydrogénase (G.6.P-DH), le G.6.P est oxydé par le nicotinamide-adénine-dinucléotide-phosphate (NADP) en gluconate-6-phosphate. Il se forme du NADP réduit (NADPH).
Figure img00080001
<tb>
<SEP> HK
<tb> glucose <SEP> + <SEP> ATP <SEP> > <SEP> G.6.P <SEP> + <SEP> ADP
<tb> <SEP> G.6.P <SEP> DH
<tb> G.6.P. <SEP> + <SEP> NADP <SEP> A <SEP> gluconate <SEP> 6.P <SEP> + <SEP> NADPH <SEP> +
<tb>
La quantité de NADPH formée au cours de la réaction est proportionnelle à la quantité de glucose. On la détermine par spectrophotométrie à 340 nm.
Les réactions se font à pH 7,6 et nécessitent une incubation de 15 mn environ. La concentration en sucres doit se situer entre 5 mg/l à 1 g/l.
Classiquement, un coffret pour 120 dosages du glucose comprend (a) 3 flacons 1 contenant environ 7,2 g de lyophilisat,
composé de tampon tréthanomaline pH 7,6, et de
NADP 110 mg
ATP 260 mg
sulfate de Magnésium
stabilisateurs (b) 3 flacons 2 contenant environ 1,1 ml de suspension en
zymatique composée de
Hexokinase environ 320 U
Glucose-6-phosphate deshydrogénase environ 160 U (c) Solution aqueuse, stabilisée de D-Glucose (standard).
La méthode opératoire suivie est la suivante.
Préparation des solutions
(A) Dissoudre le contenu d'un flacon 1 avec 45 ml
d'eau distillée.
(B) Utiliser le contenu d'un flacon 2 sans diluer.
(C) Utiliser le contenu du flacon standard tel quel
(5 g/l).
Stabilité des solutions
(1) La solution (A) est stable 4 semaines à + 40C et
2 mois à 200C.
(2) Le contenu des flacons (B) est stable 1 an à +40C.
Ramener les solutions réactionnelles à 20-250C avant utilisation.
Mode opératoire
- Longueur d'onde : 340 nm
- Cuve verre : 1 cm d'épaisseur
- Température : 20 à 250C
- Volume du test : 3,02 ml
Figure img00100001
<tb> <SEP> Introduire <SEP> dans <SEP> Témoin <SEP> Essai
<tb> <SEP> les <SEP> cuves
<tb> Solution <SEP> A <SEP> 1,0 <SEP> ml <SEP> 1,0 <SEP> ml
<tb> Solution <SEP> échantillon <SEP> 0,1 <SEP> ml <SEP>
<tb> Eau <SEP> bidistillée <SEP> 2,0 <SEP> ml <SEP> 1,9 <SEP> ml
<tb> Suspension <SEP> B <SEP> 0,02 <SEP> ml <SEP> 0,02 <SEP> ml
<tb>
- Mélanger, attendre la fin de la réaction (environ
10 à 15 mn) et lire l'absorbance des solutions à
340 nm.
Selon la présente invention, le protocole suivant de microtitration a été utilisé
Figure img00100002
<tb> <SEP> Introduire <SEP> dans <SEP> Témoin <SEP> Essai
<tb> <SEP> les <SEP> cupules <SEP> cupule <SEP> n 1 <SEP> cupule <SEP> n 2 <SEP>
<tb> Solution <SEP> A <SEP> 100 <SEP> jl <SEP> 100 <SEP> pl <SEP>
<tb> Solution <SEP> échantillon <SEP> 10 <SEP> 1 <SEP>
<tb> Eau <SEP> bidistillée <SEP> 200 <SEP> p1 <SEP> 190 <SEP> y1 <SEP>
<tb> Suspension <SEP> B <SEP> 2 <SEP> pl <SEP> 2 <SEP> l <SEP>
<tb>
Les solvants sont ensuite éliminés des cupules par action conjuguée du vide et d'une centrifugation, et les cupules sont ensuite stockées avant usage, qui consiste a: :
Figure img00110001
<tb> <SEP> Introduire <SEP> dans <SEP> Témoin <SEP> Essai
<tb> <SEP> les <SEP> cuves <SEP> cupule <SEP> n01 <SEP> cupule <SEP> n 2 <SEP>
<tb> Solution <SEP> échantillon <SEP> - <SEP> 300 <SEP> ssl <SEP>
<tb> Solution <SEP> eau <SEP> distillée <SEP> 300 <SEP> yl <SEP>
<tb>
Selon l'invention, le gain de sensibilité passe de 1 à 30 et permet de détecter des concentrations de 50 pG/l au lieu de 0,050 mg/l.

Claims (7)

REVENDICATIONS
1) Dispositif réactionnel (1) destiné à caractériser dans un échantillon liquide à tester, par au moins une réaction d'identification, la présence et/ou la quantité d'un produit recherché, ledit système comprenant au moins un réactif participant à la réaction d'identification, déposé (2) sous forme sèche sur un support (1) destiné à être mis au contact d'un milieu liquide, et non lié audit support, notamment par liaison chimique covalente, caractérisé en ce pue d'une part ledit support consiste en un contenant unitaire (1) réactionnel, agencé pour recevoir directement la totalité de l'échantillon à tester, et pour servir d'enceinte réactionnelle, et d'autre part au moins un réactif, de nature labile, est déposé et contenu en couche (2) dans ledit contenant unitaire, dans une quantité prédéterminée.
2) Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que la paroi (3) du contenant unitaire (1) est agencée en transparence pour la réception et/ou l'émission d'un faisceau lumineux servant à l'identification du produit recherché.
3) Dispositif selon la revendication 2, caractérisé en ce que la paroi (3) du contenant unitaire (1) est agencée pour s'intégrer dans une chaîne de mesure optique.
4) Dispositif selon la revendication 1, du type barrette (4) ou plaque de titration, caractérisé en ce qu'une pluralité de contenants unitaires (1) sont rassemblés ou juxtaposés ensemble, et affectés séparément à différentes réactions d'identification respectivement, en relation avec un même milieu liquide à tester.
5) Dispositif selon la revendication 1, selon lequel différents réactifs participent à la réaction d'identification, caractérisé en ce que tous les réactifs sont déposés et contenus en mélange sec dans le contenant unitaire (1).
6) Dispositif selon la revendication 1, selon lequel la caractérisation s'effectue par plusieurs réactions concomitantes et/ou successives, caractérisé en ce que les différents réactifs des différentes réactions d'identification respectivement sont déposés et contenus en mélange sec dans le contenant unitaire (1).
7) Procédé d'obtention d'un dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on introduit une quantité prédéterminée du réactif labile, contenue dans un solvant, dans le contenant unitaire (1), et on élimine le solvant de façon relativement rapide, sous l'action conjuguée d'un vide appliqué à l'intérieur du contenant unitaire, d'une centrifugation de ce dernier, et éventuellement d'un apport de chaleur nécessaire à la vaporisation du solvant.
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