DE19757706C2 - Substrat, Vorrichtung und Verfahren zur schnellen Auswertung von Bindungsreaktionen durch interferometrische Schichtdickenmessung - Google Patents

Substrat, Vorrichtung und Verfahren zur schnellen Auswertung von Bindungsreaktionen durch interferometrische Schichtdickenmessung

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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Substrat, eine Vor­ richtung und ein Verfahren zur schnellen Auswertung von Bin­ dungsreaktionen durch interferometrische Schichtdickenmes­ sung.
Eine Reihe von immunologischen Tests setzt voraus, daß entweder das Antigen oder der Antikörper an eine Fest­ körperoberfläche gekoppelt werden. Dazu werden Festkör­ perträger wie Latexkugeln, Plastikröhrchen etc. verwen­ det. Der bei weitem erfolgreichste und am weitesten verbreitete Träger ist allerdings die Mikrotiterplatte. Techniken wie der ELISA- (enzyme-linked immunosorbent assay) Test oder radiologische Immun-Tests werden stan­ dardmäßig in wegwerfbaren Mikrotiterplatten durchge­ führt. Mikrotiterplatten sind Plastiktabletts aus transparenten Kunststoffen (Polystyrol, Polypropylene etc.) mit einer Anzahl (typischerweise 96) kleiner Reak­ tionstöpfchen. Proteine, wie beispielsweise Antikörper, können in den hydrophoben Behältern durch Physisorption gebundenen werden. Die Zugabe der zu testenden Lösungen und die folgenden Waschzyklen werden häufig durch auto­ matisierte Pippettierautomaten ausgeführt. Auch das Auslesen der Platten kann automatisiert werden. Für ELISA-Tests wird dabei die Farbreaktion anhand der opti­ schen Absorption der Lösung gemessen, bei radiologischen Tests die Menge radioaktiv markierter Substanzen. Al­ lerdings sind für diese Art Tests erstens Fluoreszenz- oder radioaktive Markierungen notwendig und zweitens insbesondere ELISA-Tests nicht immer quantitativ, d. h. weisen lediglich das Vorhandensein, nicht aber die exak­ te Menge einer Substanz nach.
Im Gegensatz dazu stehen Biosensoren, welche exakte Wer­ te, beispielsweise der optischen Schichtdicke eines Ad­ sorbates oder der Massenbelegung einer Oberfläche lie­ fern. Biosensoren sind reversibel und kontinuierlich arbeitende Meßaufnehmer zum Nachweis von Proteinen, Nu­ kleinsäuren oder Polyzuckern. Solche hochempfindlichen Meßwandler spielen dann eine große Rolle, wenn außer dem Vorhandensein eines Liganden auch noch dessen Konzentra­ tion bestimmt werden soll. Quantitative Meßaufnehmer können insbesondere dazu dienen, die Bindungskonstante eines Liganden zu bestimmen. Neben der Entwicklung ge­ eigneter Substrate und chemischer Ankopplungsverfahren ist die Automatisierung der quantitativen Bestimmung der Rezeptor-Ligand Bindung nach wie vor zu optimieren.
Zu den bekanntesten quantitativen Oberflächentechniken, welche optische Schichtdicken bestimmen, gehören die Oberflächen-Plasmonen-Resonanz (Liedberg, et al. 1983; Surface Plasmon Resonance for Gas Detection and Biosen­ sing, Sensors and Actuators, 4: 299-304), die reflektome­ trische Interferenz-Spektroskopie (Brecht et al. 1993; Interferometric immunoasay in a FIA-system: a sensitive and rapid approach in lable-free immunosensing. Blasen­ sors & Bioelectronics. 8: 387-392), sowie Quarzwaagen. Die ersten beiden Techniken messen optische Schichtdic­ ken mit einer Auflösung im Ångström-Bereich, während die Quarzwaage Massenbelegungen mit einer Nachweisgrenze im µg-Bereich mißt.
In Rädler, et al. 1993, Imaging optical thicknesses and separation distances of phospholipid vesicles at solid surfaces, J. Physics II France 3: 727-748, wird gezeigt, daß die Reflexions-Interferenz-Contrast-Mikroskopie (RICM) für einfache Schichtsysteme quantitativ auswert­ bare Interferenzintensitäten abbildet. Es werden insbe­ sondere planare Systeme von aufgedampften Magnesiumflu­ orit mit adhärierenden Vesikeln, gespreiteten Membranen oder durch Langmuir-Blodgett Technik übertragenen Lipid- Monolagen abgebildet. Es wird gezeigt, daß die (bei­ spielsweise in Fig. 1b dargestellte) Intensitätsänderung bei Proteinadsoprtion an eine Interferenzschicht von konstanter Dicke D (in diesem Fall 48 nm) meßbar bzw. mit RICM auf eine CCD Kamera abbildbar ist. Bei der Messung von Schichtdickenänderungen liefert eine planare Inter­ ferenzschicht jedoch lediglich ein Signal, welches zahl­ reichen Störungen unterworfen ist.
Aus DE 31 03 082 A1 ist es bekannt, zum Messen der optischen Dicke einer dünnen Schicht einen Träger zu verwenden, auf dem eine Schicht mit sich gleichmäßig ändernder ortsabhängiger Dicke ange­ ordnet ist, wobei die Intensität reflektierten Lichts gemessen wird, um durch einen Vergleich festzustellen, wann die optische Dicke der zu prüfenden Schicht mit der optischen Dicke einer Be­ zugsschicht übereinstimmt. Hierbei besteht keine Möglichkeit, die relative Änderung der optischen Dicke einer Schicht festzustellen, beispielsweise einer Adsorbatschicht in Mikrotiterplatten.
Aus DE 42 00 088 A1 ist es bekannt, zum Nachweis physikalischer, chemischer, biochemischer und biologischer Vorgänge Licht geeigne­ ter Wellenlänge oder eines geeigneten Spektralbereichs auf eine Probe, an der der Vorgang an oder in mindestens einer dünnen Schicht aus mindestens teilweise optisch transparentem Material abläuft, einzustrahlen, wobei hervorgerufene Interferenzerschei­ nungen gemessen werden. Auch hier werden keine Änderungen der op­ tischen Schichtdicke festgestellt, namentlich auch keine mittlere quadratische Intensitätsdifferenzen.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Substrat, eine Vor­ richtung und ein Verfahren bereit zu stellen, welche(s) erlaubt, die Änderung der optischen Dicke einer Schicht zur schnellen Aus­ wertung von Bindungsreaktionen zu bestimmen.
Diese Aufgabe wird durch ein Substrat, eine Vorrichtung und ein Verfahren mit den Merkmalen jeweils nach Anspruch 1, 22, 27 und 28 gelöst.
Bei der Lösung geht die Erfindung von dem Grundgedanken aus, daß sich auf Grund von Variationen im Abstand von Oberseite und Unter­ seite einer Schicht, beispielsweise einer Adsorbatschicht, bei ei­ ner Bestrahlung mit Licht variierende Interferenzmuster ergeben, wenn sich die optische Dicke der Schicht ändert. Dazu werden in oder auf einen Träger einer biofunktionalisierten Mikrotiterplatte mikrostrukturierte Interferenzschichten ein- bzw. aufgebracht.
Im erfindungsgemäßen Verfahren wird die optische Reflexions-In­ terferenz der Platte abgebildet und mit Hilfe von Bildverarbeitung ausgewertet. Dabei wird die mittlere quadratische Differenz der nomierten Intensitäten der Interferenzmuster vor und nach Adsorp­ tion zum Bestimmen der Änderung der optischen Schichtdicke ge­ nutzt. Die erfindungsgemäße Vorrichtung/das erfindungsgemäße Ver­ fahren basiert auf optische Interferenz, wobei die Dicke der in­ terferenzfähigen Beschichtung variiert. Diese wird durch optische Abbildung aufgelöst und durch ein einfaches Bildverarbeitungsver­ fahren ausgewertet.
Die Vorteile der Erfindung sind vielfältig:
  • 1. Die nachzuweisenden Liganden müssen nicht vorbehan­ delt oder markiert werden.
  • 2. Die Auswertung einer Platte mit einer größen Anzahl Tests ist in einem Schritt möglich und mit Hilfe eines schnellen Rechners in Sekunden zu bewerkstel­ ligen.
  • 3. Die Bestimmung der Änderung der optischen Schicht­ dicke des Adsorbats aus der mittleren quadratischen Differenz der nomierten Intensitäten hat eine hohe Empfindlichkeit mit einer Schichtdickenauflösung von einem Ångström (1 Å).
  • 4. Das Verfahren ist robust gegen äußere Schwankungen der Beleuchtungsintensität, als auch gegen Unregel­ mäßigkeiten in der genauen Mikrostrukturierung der Platte.
  • 5. Da der beschriebene Mikrotitertest auf einem bild­ gebendem Verfahren beruht, können durch weitere in­ telligente Bildverarbeitung oder durch visuelle Kontrolle offensichtliche Störungen, wie das Ausfällen von Reagenzien oder die Anlagerung eines Staubkorns, leicht bemerkt werden.
  • 6. Das bildgebende Verfahren läßt sich leicht mit Fluoreszenztechniken kombinieren.
Das Verfahren sollte daher Anwendung als interferometri­ scher Immunoassay finden, wobei die Vorteile insbesonde­ re in automatisierten Anlagen mit hohem Durchsatz von Mikrotiterplatten zum Tragen kommen. Es wird daher im folgenden auch erläutert, wie strukturierte Mikrotiter­ platten kostengünstig auf Kunststoffbasis hergestellt werden können.
Die Erfindung wird nachstehend mit Bezug auf die beige­ fügten Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:
Fig. 1a eine Darstellung einer integrierten Interferenz­ schicht mit lateral variierender Schichtdicke D, wobei die Adsorbatschicht δ Rezeptoren trägt und eine optische Schichtdickenänderung Δδ gemessen wird;
Fig. 1b eine Simulation der Reflektivität als Funktion der ortsabhängigen Schichtdicke D der Interferenz­ schicht; die Kurven entsprechen Adsorbatschichtdic­ ken von δ = 10, 20 und 30 Å;
Fig. 1c eine Darstellung der mittleren quadratischen Differenz der normierten Intensitäten S als Funkti­ on der optischen Schichtdickenänderung Δδ;
Fig. 2a eine Darstellung einer Mikrotiterplatte mit 12 Reaktionstöpfchen;
Fig. 2b eine in jedes Töpfchen integrierte (und mit dem Kunststoff 2 aufgefüllte) interferenzerzeugende Vertie­ fung;
Fig. 2c eine Darstellung eines Interferenzmusters einer Vertiefung, wie es in der abbildenden Reflexions- Interferenz-Mikroskopie sichtbar wird;
Fig. 3 einen Aufbau zur optischen Abbildung der Reflektivi­ tät der Mikrotiterplatte mittels Reflexions-Interfe­ renz-Kontrast-Mikroskopie; und
Fig. 4 einen Aufbau zur optischen Abbildung der Reflektivi­ tät der Mikrotiterplatte mittels Laser-Abtastung.
Das erfindungsgemäße Verfahren basiert auf der Verbindung zwischen einer biofuktionalisierten Schicht und einem inter­ ferenzfähigen Substrat. Im einfachsten Fall wird auf einen Abschnitt eines Trägers 1 (z. B. Glas oder Kunststoff) mit Brechungsindex n1 (beispielsweise n1 = 1,5) eine erste dünne (vorzugsweise heterogene) Schicht 2 mit einem zu n1 unter­ schiedlichen Brechungsindex n2 aufgetragen (siehe Fig. 1a), mit n2 vorzugsweise im Bereich von 1,3 bis 1,4. Diese erste Schicht ist mit einer biokompatiblen Adsorbatschicht 3 mit Brechnungsindex n3, vorzugsweise einer Polymerschicht verse­ hen, welche Antikörper oder Rezeptoren enthält. Die optische Schichtdicke δ dieser biokompatiblen Schicht 3 nimmt bei der Bindung von Liganden 4 aus einer wäßrigen Lösung 17 mit Bre­ chungssindex n4 zu. Zur Detektion der Schichtdickenzunahme wird das Substrat von unten, d. h. von der der biofunktionali­ sierten Schicht 3 abgewandten Seite, mit vorzugsweise mono­ chromatischem Licht beleuchtet und das entstehende Interfe­ renzmuster wird von einer Kamera aufgenommen. Die Intensität des reflektierten Lichts bestimmt sich aus der Überlagerung aller reflektierten Teilstrahlen (siehe: Azzam, R. et al. 1975; Ellipsometrie and polarized light, Amsterdam, North Holland). Dabei geht sowohl die Dicke D der Schicht 2, als auch die Dicke δ der Adsorbatschicht 3 ein. Zur genauen Bestimmung einer Schichtdickenänderung Δδ wird nun ausge­ nutzt, daß die Dicke D der Schicht 2 lateral variiert, so daß eine Vielzahl von Interferenz-Maxima und -Minima entsteht.
Fig. 1a zeigt eine erste Ausführungsform. Darin ist bei­ spielsweise eine dreiecksförmige Vertiefung und damit eine lineare Veränderung der Dicke D entsprechend dem schrägen Verlauf der Dreiecksflächen vom Ort darge­ stellt. Das Verhältnis der entsprechenden Interferenzin­ tensitäten Irefl/I0 ist in Fig. 1b gezeigt. Hier ist zu erkennen, daß sich die Lage der Maxima mit einer Zunahme der Dicke δ der Adsorbatschicht verschiebt. Die Inter­ ferenzbilder werden nun auf eine Weise verarbeitet, daß die Schichtdickenänderung Δδ lediglich aus der mittleren quadratischen Phasenverschiebung bestimmt wird. Dies entspricht der Verschiebung der in Fig. 1b dargestellten Reflektivitätskurven. Durch diese Verarbeitung wird die Bestimmung der Dickenänderung der Adsorbatschicht 3 un­ abhängig sowohl von Schwankungen des einfallenden Lichts, als auch von der genauen Form und Güte der mi­ krostrukturierten Interferenzschicht. Zur Auswertung werden vorzugsweise eine Anzahl von Maxima und gleich vielen Minima verwendet.
Der Darstellung in Fig. 1b liegen folgende Brechungsin­ dizes zugrunde: Träger 1 = Glas, n1 = 1,51; erste Schicht 2 = Interferenzschicht, n2 = 1,38; zweite Schicht 3 = Adsorbat (Protein), n3 = 1,55 wässrige Lö­ sung 17, n4 = 1,33.
In einer weiteren Ausführungsform wird auf dem Träger 1 nur die erste Schicht 2 aufgebracht, so daß eine Anlage­ rung an die Schicht 2 stattfindet.
Als weitere Ausführungsform weist die erste Schicht 2 bzw. zweite Schicht 3 nicht die Rezeptoren auf, an die sich Liganden binden, sondern umgekehrt die Liganden, an die sich die Rezeptoren binden. Es wird hierbei die wechselseitige Bindungswirkung von Rezeptoren und Ligan­ den genutzt.
In einer weiteren Ausführungsform wird anstelle eines Trägers mit Ausnehmungen ein ebener bzw. glatter Träger verwendet, auf den die Schicht 2 derart aufgebracht wird, daß der Abstand zwischen Ober- und Unterseite va­ riiert. Auf diese Weise wird in dieser Ausführungsform erreicht, daß die Dicke D der Schicht 2 variiert. Vor­ zugsweise wird die Schicht 2 in Form von Tropfen oder Tröpfchen aufgebracht (beispielsweise aufgespritzt oder mit einer Pipette aufgetragen). Diese läßt man eintrock­ nen oder polymerisieren. Alternativ wird eine ebene Schicht 2 aufgetragen, der anschließend eine Struktur aufgedruckt wird.
Für die zweite Schicht 3 wird vorzugsweise ein quellfä­ higes Material verwendet, das im trockenen Zustand eine Dicke von etwa 5 bis 200 Å, vorzugsweise etwa 10 bis 20 Å hat, während sie im gequollenen Zustand Dicken zwi­ schen 10 und 100000 Å, vorzugsweise 10000 Å aufweist. In diesem gequollenen Zustand weist diese Schicht vorzugs­ weise einen Brechungsindex n3 von 1,31 auf.
Die zu bestimmende Änderung der optischen Dicke der Schicht kann beispielsweise auf folgende Arten erfolgen. Zum einen ändert sich aufgrund von Anlagerungen die phy­ sikalische Dicke und somit auch die optische Dicke der Schicht, zum anderen kann eine Änderung der optischen Dicke auf einer Änderung des Brechungsindexes beruhen, die sich aufgrund von Einlagerungen in die Schicht er­ gibt.
Es wird jeweils ein Interferenzbild vor und nach (bzw. während) der Zugabe des Liganden aufgenommen und folgen­ de Operationen über der Fläche des Interferenzmusters ausgeführt (im Falle eines Vielfachtest, wie der wei­ ter unten gezeigten Mikrotiterplatte, werden diese Ope­ rationen natürlich für jede Bindungsfläche getrennt durchgeführt). Zunächst werden die Intensitäten nor­ miert:
Wobei die << die Mittelung über alle N × M Bildpunkte be­ deutet. Dann wird die Differenz der normierten Intensi­ täten IV,N der Bilder vor und nach der Bindung gebildet und quadratisch gemittelt:
wobei die Mittelung über alle N × M Bildpunkte eines Bild­ ausschnitts durchgeführt wird, welcher vorzugsweise gleich groß oder aber kleiner als das Interferenzmuster am Boden eines Mikrotiter-Töpfchens ist. Vorzugsweise wird über eine quadratische Fläche gemittelt. S wird bezeichnet als die "mittlere quadratische Differenz der normierten Intensitäten" zweier Interferenzmuster (IV, IN) vor bzw. nach der Adsorption. Für den auf diese Weise erhaltenen Wert S gilt:
wobei λ die verwendete Lichtwellenlänge bezeichnet und ni die jeweiligen Brechungsindizes, wie oben definiert. Gleichung (3) wird in vielen praktischen Fällen, in denen die Adsorbatschicht klein gegenüber λ/4 ist genügen, um die optische Schichtdickenzunahme Δδ aus dem gemes­ senen Wert für S direkt zu bestimmen. Die jeweilige Ge­ nauigkeit der Gleichung (3) läßt sich durch Vergleich mit den numerischen Werten für gegebene Brechungsindizes und Schichtdicken δ bestimmen. Somit ist für kleine Schichtdickenänderungen S proportional zur Schichtdic­ kenänderung Δδ. Die exakte Beziehung kann numerisch be­ stimmt und tabellarisch abgelegt werden. Für den Grenz­ fall, daß die Adsorbatschicht vor der Adsorption exakt Null ist, läßt sich obige Beziehung (3) unter Vernach­ lässigung von Vielfachreflexion herleiten. Fig. 1c zeigt die Größe S einer simulierten Probe, welche nach Gleichung (1) und (2) berechnet wurde als Funktion der Schichtdickenänderung Δδ. Dabei wurde angenommen, daß die Adsorbatschicht δ homogen, also nicht vom Ort abhän­ gig ist.
Herstellung interferometrischer Mikrotiterplatten
Optisch hochwertige, lateral strukturierte Interferenz­ schichten können durch standardmäßiges Aufdampfen die­ lektrischer Schichten auf Glas hergestellt werden. Die Strukturierung würde in diesem Fall durch Masken, welche zwischen den einzelnen Aufdampfzyklen entweder verscho­ ben oder ausgetauscht werden, erfolgen.
Gemäß einer Ausführungsform können Plastikplatten bzw. die Trägersubstanz strukturiert werden. Dies ist einfach und kostengünstig. Ein optisch niedrig oder nicht-doppelbrechendes Polymer (Polycarbonat, zy­ klische Olefine) kann beispielsweise im Spritzgußverfah­ ren auf eine Mikrotiterplattenform gebracht werden (Fig. 2a). Diese besteht aus einer Anordnung kleiner Pla­ stiktöpfchen mit flachem Boden. In einem zweiten Schritt wird mit Hilfe eines Stempels in jedem Töpfchen eine Vertiefung 5 von einigen wenigen Mikrometern Tiefe gepreßt (Fig. 2b). Beispielsweise ist die Vertiefung zwischen 5 und 2000 Nanometer tief. Für die exakte Form der Vertiefung 5 sind mehrere Möglichkeiten denkbar. Beispielsweise monoton ansteigende, vorzugsweise stetige Formen, wie konkave, konvexe, konische oder dachförmige Vertiefungen stellen einfache Lösungen dar. Im letzten Schritt wird ein zweites Polymer (Schicht 2) mit unter­ schiedlichem Brechungsindex im Gießverfahren aus der Lö­ sung auf die Vertiefung 5 aufgetragen, kann aber - wie in Fig. 1a gezeigt - über die Vertiefung 5 hinaus ver­ laufen. Da der Durchmesser des Stempels konstant ist, läßt sich durch Auftragen einer definierten Menge Lö­ sungsmittel die Schichtdicke D sehr reproduzierbar her­ stellen. Der zweite Kunststoff 2 soll in einem Lösungs­ mittel lösbar sein, welches den Kunststoff 1 nicht an­ greift. Durch Eintrocknen der Schicht 2 kann sich an der Oberfläche ein Meniskus ausbilden.
Auslesen des Reflexions-Interferenz-Signals
Die Reflektivität der Mikrotiterplatte kann mit Hilfe von Reflexions-Mikroskopie unter Auflichtbeleuchtung aufgenommen werden (siehe Fig. 3). Wird mit Hilfe eines schmalbandigen Interferenzfilters monochromatisches Licht erzeugt, werden die Interferenzen in den oben be­ schriebenen lateral strukturierten Vertiefungen 5 sicht­ bar. In der Praxis läßt sich weiterhin das Verhältnis von Interferenzsignal zu Hintergrundhelligkeit verbes­ sern, indem die Antiflex-Technik nach Pluta (Pluta, M; Advanced Light Microscopy, Elsevier, Amsterdam 1989) be­ nutzt wird. Fig. 3 zeigt den Strahlengang eines solchen Reflexions-Interferenz-Kontrast-Mikroskops nach Pluta. Wird die Probenkammer durch Immersionsöl direkt auf die λ/4-Platte 7 aufgebracht, so ist die erste reflektieren­ de Grenzfläche die Glas-Magnesiumfluorid 2 Grenzschicht (Fig. 1a).
Fig. 3 zeigt einen Aufbau zur optischen Abbildung der Reflektivität der Mikrotiterplatte mittels Reflexions- Interferenz-Kontrast-Mikroskopie. Der Träger 1 mit der eingebrachten Interferenzschicht 2 wird über einer λ/4- Platte 7 (optional) angeordnet. Dazwischen befindet sich ein Medium 6 mit gleichem Brechungsindex wie der Träger 1 und die λ/4-Platte 7 zur reflexionsfreien Ankopplung. Dieses Medium ist vorzugsweise ein Immersionsöl oder Si­ likon. Das von einer Quecksilberdampflampe 14 ausge­ strahlte Licht wird über ein Bandpass-Filter 13, das mo­ nochromatisches Licht erzeugt, über einen Polarisator 12 (optional), einen halbdurchlässigen Spiegel 9 und ein Objektiv 8 auf die zu messende Schicht gerichtet. Das reflektierte Licht durchdringt den halbdurchlässigen Spiegel 9 und gelangt über einen Analysator 10 (optio­ nal) zu einer Kamera 11. Diese kann eine CCD-Kamera sein.
Ein zweites mögliches Ausleseverfahren (Auslesevorrich­ tung) besteht in der Abtastung der Mikrotiterplatte mit einem Laser bzw. einer Laserdiode. Das reflektierte Licht wird mit einem eindimensionalen Detektor aufgenom­ men. Wird die Platte abgerastert, entsteht wiederum ein Interferenzsignal, wie in Fig. 1b dargestellt, und die Auswertung erfolgt analog zur abbildenden Reflexions- Interferenz.
Fig. 4 zeigt eine Ausführungsform mit Laserabtastung. Eine Abtastung der Mikrotiterplatte mit einem Laser 19 ist vorteilhaft in Anwendungen, bei denen die Geschwin­ digkeit des Ausleseprozeßes kritisch ist. In dieser Ausführungsform wird auf abbildende Optik verzichtet und die Mikrotiterplatte von einem Laserstrahl abgetastet, wobei die Intensität des reflektierten Strahls gemessen wird. In Fig. 4 wird der Laserstrahl durch einen drehba­ ren Spiegel 20 so umgelenkt, daß er die Probe über­ streicht und auf einen eindimensionalen Detektor 21 (vorzugsweise CCD) reflektiert wird. Die Vertiefungen der Mikrotiterplatte in dieser Ausführung der Abtastung sind vorzugsweise dach- oder keilförmige Vertiefungen, also lediglich in einer, der Abtastrichtung entsprechen­ den, Richtung variiert. Die Mittelungen nach Formel (1) und (2) entsprechen in diesem Fall der Mittelung entlang einer Linie. Bezugszeichen 18 bezeichnet einen Glasblock mit Antireflexbeschichtung.

Claims (36)

1. Substrat mit einem Träger (1) und mit einer auf mindestens einem Abschnitt des Trägers (1) angeordneten Schicht (2) oder mit zwei übereinander liegenden Schichten (2, 3), wo­ bei die am Träger (1) aufliegende Schicht (2) in mindestens einem Abschnitt eine sich ortsabhängig ändernde Dicke auf­ weist, die erste oder die zweite Schicht an ihrer freien Oberfläche Stoffe binden kann und dadurch ihre optische Dicke ändert und die Schichten so bemessen sind, daß an ih­ nen Lichtinterferenz beobachtbar ist.
2. Substrat nach Anspruch 1, wobei die sich ortsabhängig än­ dernde Dicke der am Träger (1) aufliegenden Schicht (2) mo­ noton variiert.
3. Substrat nach Anspruch 1 oder 2, wobei die sich ortsabhän­ gig ändernde Dicke der am Träger (1) aufliegenden Schicht (2) linear oder nicht-linear variiert.
4. Substrat nach Anspruch 2 oder 3, wobei die sich ortsabhän­ gig ändernde Dicke der am Träger (1) aufliegenden Schicht (2) zu konvexen oder konkaven oder konischen oder dachför­ migen Formen in Abschnitten der Schichtober- und/oder -un­ terseite führt.
5. Substrat nach einem der Ansprüch 1 bis 4, wobei die sich ortsabhängig ändernde Dicke der am Träger (1) aufliegenden Schicht (2) dadurch entsteht, daß die Schicht mindestens eine entsprechend geformte Vertiefung (5) im Träger (1) zu­ mindest teilweise ausfüllt.
6. Substrat nach Anspruch 5, wobei die Vertiefung (5) zwischen 1 und 10000 Nanometer tief ist.
7. Substrat nach Anspruch 6, wobei die Vertiefung (5) zwischen 5 und 2000 Nanometer tief ist.
8. Substrat nach Anspruch 7, wobei die Vertiefung (5) 600 Na­ nometer tief ist.
9. Substrat nach Anspruch 5, wobei die Vertiefung (5) eine Tiefe entsprechend einem ganzzahligen Vielfachen der halben Lichtwellenlänge des zur Beobachtung von Lichtinterferenz verwendeten Lichts in der am Träger (1) aufliegenden Schicht (2) aufweist.
10. Substrat nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei der Träger (1) mindestens eine Ausnehmung (16) aufweist, auf deren Bo­ den die am Träger aufliegende Schicht (2) mit sich ortsab­ hängig ändernder Dicke aufgebracht ist.
11. Substrat nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die am Träger (1) aufliegende Schicht (2) heterogen ist.
12. Substrat nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die am Träger (1) aufliegende Schicht (2) einen Brechungsindex n2 aufweist, der von dem Brechungsindex n1 des Trägers (1) verschieden ist.
13. Substrat nach Anspruch 12, bei dem der Träger (1) und die aufliegende Schicht (2) jeweils aus optisch transparenten Kunststoffen mit unterschiedlichem Brechungsindex herge­ stellt sind und die sich ortsabhängig ändernde Dicke mit gedruckten, aufgespritzten, gepreßten oder gegossenen in­ terferenzfähigen Strukturen erreicht wird.
14. Substrat nach Anspruch 12 oder 13, wobei n2 kleiner als n1 ist.
15. Substrat nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die stoffbindende Eigenschaft der Schicht (3) mit freier Ober­ fläche eine Bindungswirkung zwischen Rezeptor und Ligand (4) ist.
16. Substrat nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die Ände­ rung der optischen Dicke durch eine Änderung der physikali­ schen Dicke der Schicht (3) mit freier Oberfläche erfolgt.
17. Substrat nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei die Ände­ rung der optischen Dicke durch eine Änderung des Brechungs­ indexes der Schicht (3) mit freier Oberfläche erfolgt.
18. Substrat nach einem der Ansprüche 1 bis 17 mit zwei Schich­ ten (2, 3), wobei die zweite Schicht (3) einen zum Bre­ chungsindex n2 der am Träger (1) aufliegenden Schicht (2) unterschiedlichen Brechungsindex n3 aufweist, wobei vor­ zugsweise n2 kleiner als n3 ist.
19. Substrat nach einem der Ansprüche 1 bis 18 mit zwei Schich­ ten (2, 3), wobei die zweite Schicht (3) eine quellfähige Schicht ist.
20. Substrat nach einem der Ansprüche 1 bis 19 mit zwei Schich­ ten (2, 3), wobei die zweite Schicht (3) im trockenen Zu­ stand eine Dicke von 5 bis 200 Å aufweist.
21. Substrat nach Anspruch 19 und 20, wobei die zweite Schicht (3) im gequollenen Zustand eine Dicke von 10 bis 10000 Å aufweist.
22. Vorrichtung mit Mitteln zum Bestimmen der Änderung der op­ tischen Dicke einer Schicht mittels Lichtinterferenz und mit einem Substrat nach einem der Ansprüche 1 bis 21 als Messobjekt.
23. Vorrichtung nach Anspruch 22, bei der die Mittel zum Be­ stimmen der Änderung der optischen Dicke einer Schicht mit­ tels Lichtinterferenz eine Lichtquelle (14), einen halb­ durchlässigen Spiegel (9), ein Objektiv (8) und eine Kamera (11) umfassen.
24. Vorrichtung nach Anspruch 23, ferner mit einem Polarisator (12).
25. Vorrichtung nach Anspruch 24, ferner mit einem Analysator (10).
26. Vorrichtung nach Anspruch 24 oder 25, ferner mit einer λ/4-Platte (7).
27. Verfahren zur Bestimmung der Änderung der optischen Dicke einer Schicht, die ihre optische Dicke infolge der Bindung eines Stoffes ändert, mittels Lichtinterferenz, bei dem
  • a) die Schicht (2) auf einem Träger (1) aufgebracht ist und in mindestens einem Abschnitt eine sich ortsabhän­ gig ändernde Dicke aufweist,
  • b) ein Reflexions-Interferenzbild der Schicht vor der Bin­ dung des Stoffes zur Ermittlung von Referenzwerten und nach der Bindung des Stoffes zur Ermittlung von Meßwer­ ten erfaßt wird,
  • c) die ermittelten Intensitäten I gemäß
    normiert werden,
  • d) die mittlere quadratische Intensitätsdifferenz
    bestimmt wird, und
  • e) die optische Schichtdickenänderung Δδ gemäß
    bestimmt wird.
28. Verfahren zur Bestimmung der Änderung der optischen Dicke einer Schicht, die ihre optische Dicke infolge der Bindung eines Stoffes ändert, mittels Lichtinterferenz, bei dem
  • a) die Schicht als zweite Schicht (3) über einer ersten Schicht (2) liegt, die ihrerseits auf einem Träger (1) aufgebracht ist und in mindestens einem Abschnitt eine sich ortsabhängig ändernde Dicke aufweist,
  • b) ein Reflexions-Interferenzbild der Schicht vor der Bin­ dung des Stoffes zur Ermittlung von Referenzwerten und nach der Bindung des Stoffes zur Ermittlung von Meßwer­ ten erfaßt wird,
  • c) die ermittelten Intensitäten I gemäß
    normiert werden,
  • d) die mittlere quadratische Intensitätsdifferenz
    bestimmt wird, und
  • e) die optische Schichtdickenänderung Δδ gemäß
    bestimmt wird.
29. Verfahren nach Anspruch 27 oder 28, wobei das Reflexions- Interferenzbild mittels Reflexions-Interferenz-Kontrast- Mikroskopie aufgenommen wird.
30. Verfahren nach Anspruch 27 oder 28, wobei die zu erfassende Schicht mittels Laserlicht und Photodetektoren bildmäßig abgerastert wird.
31. Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 30, wobei aus der bestimmten mittleren quadratischen Differenz der normierten Intensitäten das Ausmaß der Phasenverschiebung zwischen den Interferenzbildern vor und nach der Bindung des Stoffes be­ stimmt wird.
32. Verfahren nach Anspruch 28, wobei die zweite Schicht (3) biofunktional ist.
33. Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 32, wobei die Oberseite und/oder Unterseite eines Abschnitts der am Trä­ ger (1) aufliegenden Schicht (2) eine konvexe oder konkave oder konische oder dachförmige Form aufweist.
34. Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 33, wobei mono­ chromatisches Licht verwendet wird.
35. Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 34, wobei Inter­ ferenzbilder vor, während und nach der Zugabe des dickenän­ dernden Stoffes bestimmt werden.
36. Verwendung des Substrates nach einem der Ansprüche 1 bis 21 in dem Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 35.
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