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TECHNISCHES
GEBIET
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Die vorliegende Erfindung betrifft
ein Verfahren sowie eine Vorrichtung zum Identifizieren einer vorzugsweise
biochemische Moleküle
umfassenden Substanz. Insbesondere besteht das Ziel der vorliegenden
Erfindung darin, die Technik der Analyse unbekannter Biomoleküle zu verbessern,
um Ergebnisse einfacher und schneller zu erhalten, sodass das Verfahren
ohne den Einsatz großer
Aufwendungen und hoher Kosten eingesetzt werden kann. Eine bevorzugte
Ausführungsart
der Erfindung ist ein Biosensor zum einfachen Nachweis unbekannter
Biomoleküle.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Es sind zahlreiche Versuche unternommen worden,
um den Substanztyp beispielsweise einer chemischen Substanz, vorzugsweise
eines Biomoleküls,
mit einem hohen Maß an
selektiven Bindungseigenschaften zu ermitteln.
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Es gibt Verfahren zum Analysieren
der optischen Eigenschaften einzelner Substanzen wie etwa des Absorptions-
oder Transmissionsverhaltens, aber alle diese Verfahren erfordern
sehr genaue Messgeräte,
welche Lichtquellen zum Emittieren definierter Wellenlängen sowie
sehr genauer Nachweisvorrichtungen umfassen, wodurch diese Verfahren sehr
aufwändig
werden.
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Es sind Verfahren zum Identifizieren
von Substanzen durch Messung von deren Oberflächeneigenschaften wie etwa
der Oberflächenkräfte oder der
Adhäsionsarbeit
bekannt. Die Adhäsionsarbeit einer
auf eine Festkörperoberfläche aufgebrachten Substanz
kann man durch Messen des Kontaktwinkels zwischen der Oberfläche und
einem darauf gebrachten Flüssigkeitströpfchen ermitteln.
Dieses Verfahren ist in einem Artikel von Israelachvili unter dem Titel „Interfacial
Forces", J. Vac.
Sci. Technol. A 10(5), Sept./Okt. 1992, S. 2961 bis 2971, beschrieben.
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Ein anderer Ansatz zur Abschätzung der
freien Oberflächenenergien
von Festkörperoberflächen erfordert
die direkte Untersuchung der Festkörper-Festkörper-Grenzflächen. In
einem Artikel von Chaudhury und Whitesides, Langmuir, Bd. 7, Nr.
5, 1991, S. 1013 bis 1025, wird die Messung der freien Oberflächenenergie
von elastischen Polymeren aus der Messung der Deformation halbkugelförmiger Linsen
von Polydimethylsiloxan-Elastomeren und deren chemischer Derivate
hergeleitet. Die Analysen der Linsendeformation erfolgten mittels
der Youngschen Gleichung und des Johnson-Kendall-Roberts-Modells (YRK). Bei den Analysen
wurden die über
die Grenzfläche
hinweg wirkenden Adhäsionskräfte gleich
den rücktreibenden
Kräften
gesetzt, die der Linsendeformation entgegenwirken. Um genaue Ergebnisse
zu erhalten, müssen
die Elastizitätsmodule und
die Poissonzahlen für
jedes Material bekannt sein. Außerdem
müssen
für ein
oder beide an der Messung beteiligte Materialien sphärische Linsen
mit sehr gut definiertem Radius und glatten Oberflächen hergestellt
werden.
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Eine Abschätzung der Eigenschaften und der
Art einer unbekannten Substanz kann man erhalten, indem man die
Adhäsionsarbeit
der auf eine Probenfläche
aufgebrachten Substanz ermittelt. Die oben erwähnten Verfahren sind jedoch
kompliziert und langwierig.
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Ein weiterer Aspekt bei der Ermittlung
der Bindungskonstanten von Substanzen durch Messung deren Oberflächeneigenschaften
besteht in der direkten Wechselwirkung zwischen mindestens zwei Molekülen. Solche
Wechselwirkungen, die sich von vielen schwachen Bindungen zwischen
geometrisch zusammenpassenden und mit unterschiedlichen chemischen
Gruppen beschichteten Oberflächen herleiten,
können
sehr stark sein. Im Bereich der Biomoleküle ist die Empfindlichkeit
der Bindungseigenschaften so stark ausgeprägt, dass die molekulare Erkennung
zwischen einem Rezeptormolekül
und einem Liganden, einem Antikörper
und einem Antigen sowie zwischen komplementären DNA-Strängen eine Basis zur Identifizierung
von biochemischen Substanzen wie beispielsweise von Biomolekülen bietet.
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Durch die Entwicklung von Rastersondenmikroskopen,
insbesondere des Rasterkraftmikroskops (atomic force microscope,
AFM) können
Oberflächen
in physiologischen Milieus mit molekularer Auflösung und mit Kräften bis
in den pN-Bereich
(Pikonewton) hinab analysiert werden, wie in einem Artikel von G.
Binnig, C. F. Quate und Ch. Gerber, Phys. Ref. Lett. 56, 930(1986),
beschrieben wird.
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Florin et al. haben mit dem Rasterkraftmikroskop
die Adhäsionskraft
zwischen der Spitze eines mit Avidin beschichteten AFM-Hebels einerseits
und mit Biotin versetzten Agaroseperlen andererseits gemessen. Sie
fanden, dass die zum Trennen der Spitze von den Perlen erforderliche
Kraft in Stufen zu 160 pN gequantelt ist (E.-L. Florin, V. T. Moy
und H. E. Gaub, Science, 264, 415(1994)). Dieses bekannte Verfahren
eignet sich jedoch nicht für
Messungen an Orten, wo das AFM-Verfahren nicht zur Verfügung steht.
Florin vermag außerdem
nicht zu zeigen, wie man unbekannte Substanzen charakterisieren
kann.
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In ähnlicher Weise zeigt die US-Patentschrift 5
620 857 die Verwendung einer Laseranordnung, die für die Reaktion
zwischen einem Analyten und einem Reagens und insbesondere für den Prozess
der Trennung eines ersten und eines zweiten Körpers verantwortlich ist. Es
wird vorgeschlagen, optische Zangen zum Bewegen von Mikrokugeln
aus Glas oder Latex zu verwenden, auf die biologische Moleküle aufgebracht
wurden, sodass die Moleküle
mit auf einer Festkörperoberfläche gebundenen
Molekülen
Wechselwirken können.
Die zur Trennung der Mikrokugeln von dem Substrat aufgewendete Laserleistung
liefert dabei einen Hinweis auf die Wechselwirkungskraft zwischen
den am Scheitelpunkt der Kugel wechselwirkenden Moleküle. Insofern
besteht kaum ein Unterschied zu der von Florin et al. veröffentlichten
Arbeit. Bei dem oben erwähnten
Fall mit dem AFM wird ein Piezoantrieb zum Verschieben im Subnanometerbereich
verwendet. Weetall et al. ersetzen in der US-Patentschrift 5 620
857 den Servoantrieb durch optische Zangen und weisen die Kraft auch
mit den Zangen nach.
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Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht
darin, ein Verfahren zum Identifizieren unbekannter Substanzen bereitzustellen,
das bezüglich der
erforderlichen Ausrüstung
weniger aufwändig
ist und weniger Prozessschritte erfordert.
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Das Verfahren soll leicht kontrollierbar
sein und zuverlässige
Ergebnisse liefern.
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Eine weitere Aufgabe der vorliegenden
Erfindung besteht darin, eine Vorrichtung zum Identifizieren von
Substanzen auf der Grundlage von deren Bindungseigenschaften gegenüber einer
bekannten Sonde bereitzustellen, die insbesondere ein biochemisches
Molekül
umfasst und keine hochkomplizierten Analysegeräte benötigt, die üblicherweise sehr teuer sind.
Außerdem
soll eine solche Vorrichtung leicht zu bedienen sein und als Biosensor
verwendet werden, durch den eine Vielzahl unbekannter Substanzen
identifiziert werden kann.
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ÜBERBLICK ÜBER DIE
ERFINDUNG
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Die vorliegende Erfindung betrifft
ein Verfahren nach Anspruch 1 zum Identifizieren einer vorzugsweise
biochemische Moleküle
umfassenden Substanz, die normalerweise auf eine Probenfläche aufgebracht
ist. Außerdem
wird eine definierte Sonde verwendet, die vorteilhafterweise zur
besseren Bedienung auf eine Kontaktfläche aufgebracht ist. Die beiden
mit den oben erwähnten
Schichten beschichteten Flächen
werden in Kontakt miteinander gebracht und anschließend voneinander
getrennt, während
gleichzeitig die physikalischen Parameter gemessen werden, die für die Wechselwirkung
zwischen der Substanz und der Sonde charakteristisch sind. Die erhaltenen
Ergebnisse werden zur Identifizierung mit Referenzwerten verglichen.
Diese Referenzwerte können
aufgelistet sein oder mit Referenzverfahren gemessen werden, wie
sie zum Beispiel oben in Bezug auf den Stand der Technik beschrieben
wurden.
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Zur Charakterisierung und Identifizierung
einer unbekannten Substanz stellt die von den Bindungsstärke abhängige Adhäsionsarbeit
einen geeigneten Parameter dar, der mit dem oben erwähnten Verfahren
der Erfindung gemessen werden kann. Gemäß der Erfindung wird vorgeschlagen,
einen gegossenen Elastomerstempel mit einer gut definierten Kontaktfläche zu verwenden,
auf den eine bekannte Sonde aufgebracht wird. Diese Sonde wird in
Richtung der Probenfläche
verschoben, auf die die unbekannte Substanz, vorzugsweise biochemische
Moleküle,
aufgebracht wurden, bis sich beide Flächen in einem gut definierten
Berührungskontakt
befinden.
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Der Begriff „Berührungskontakt" bedeutet, dass die
Oberflächenformen
der beiden aufeinander gesetzten Medien einander so ähnlich sind,
dass außer
dem durch starke Bindung an die Moleküle immobilisierten Wasser keine
Fluide in die Ebene, an der die Flächen aufeinander treffen, eindringen
können. Der
Begriff „Fluide" bezieht sich sowohl
auf Flüssigkeiten
als auch auf Gase.
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Während
die beiden Oberflächen
bis zum Berührungskontakt
zusammengebracht werden, wird während
dieser Belastungsphase die Kraft als Funktion von der Verschiebungsstrecke
vom Punkt des Erstkontakts zwischen den beiden Flächen bis
zum vollständigen
Berührungskontakt
ermittelt, der durch eine bestimmte Kraft gekennzeichnet ist. Anschließend werden
die beiden Flächen
so weit auseinandergezogen, bis sie vollständig voneinander getrennt sind.
Auch die Kraft während
der Trennphase wird als Funktion der Verschiebungsstrecke vom vollständigen Berührungskontakt
bis zum Punkt der beginnenden vollständigen Trennung ermittelt.
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Die während der Belastungsphase einwirkende
Kraft wird vom Punkt des Erstkontakts bis zur Maximalbelastung aufsummiert.
Dieses Integral entspricht der bei der elastischen Deformation des Stempels
gespeicherten Energie. Die während
der Entlastungsphase einwirkende Kraft wird ebenso vom Punkt der
Maximalbelastung bis zur Belastung null nach dem Spielausgleich
aufsummiert.
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Oberflächen, die von Substanzen mit
großer Adhäsionsarbeit
bedeckt sind, müssen
auseinandergezogen werden, bis sie abreißen. Die Differenz zwischen
den beiden Energien (Belastungsintegral, Entlastungsintegral) entspricht
der Adhäsionsarbeit
und entspricht jeweils der auf die Probenoberfläche aufgebrachten Substanz.
Der erhaltene Wert der Adhäsionsarbeit
kann nun mit einem aus gespeicherten Daten oder aus einer Referenzmessung
gewonnenen Wert verglichen werden.
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Ein weiteres alternatives Verfahren
zur Identifizierung einer Substanz durch Gewinnen von Ergebnissen
hoher Qualität
und Aussagekraft über
die Eigenschaften und die Art einer Substanz kann wie folgt durchgeführt werden:
Ebenso
wie bei dem oben erwähnten
Verfahren wird die unbekannte Substanz auf eine Probenfläche aufgebracht,
die mit einer Kontaktfläche
in Berührung gebracht
wird, die mit einer definierten Sonde (Prüfsubstanz) beschichtet ist.
Mindestens eine der Flächen,
vorzugsweise die Kontaktfläche,
ist aus einem flexiblen Material wie einem elastomeren Material hergestellt,
sodass die beiden Flächen
in Berührungskontakt
miteinander gelangen können.
Anschließend
werden beide Flächen
bis zur vollständigen
Trennung auseinandergezogen, indem auf mindestens eine der Flächen eine
zunehmende Kraft ausgeübt
wird. Es ist wichtig, dass die vorzugsweise auf die Kontaktfläche gerichtete
Kraft auf definierte Weise einwirkt, sodass der Trennschritt reversibel und
auf standardisierte Weise wiederholt werden kann.
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Ein für die Wechselwirkung zwischen
der unbekannten Substanz und der Prüfsubstanz charakteristischer
wert besteht in dem Zeitraum zwischen dem Einwirken der zunehmenden
Kraft zum Trennen der beiden Flächen
voneinander und dem Punkt der vollständigen Trennung. Der gemessene
Zeitraum besitzt Aussagekraft für
die zwischen der Substanz und der Prüfsubstanz wirkenden Bindungskräfte und ist
daher für
die unbekannte Substanz charakteristisch. Zur Identifizierung der
gemessenen Substanz muss der gemessene Zeitraum mit einem Vergleichswert
verglichen werden, der aus einer gespeicherten Datenmenge oder durch übliche Vergleichsmessungen
gewonnen werden kann.
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Anstatt der Einwirkung einer definierten
zunehmenden Kraft, wie oben beschrieben wurde, wirkt bei einem weiteren
alternativen Verfahren beim Trennschritt eine definierte konstante
Kraft auf mindestens eine der beiden Flächen ein. Dabei werden keine
physikalischen Parameter wie die einwirkenden Kräfte oder die Einwirkungsdauer
gemessen, sondern es interessiert nur, ob sich die beiden Flächen nach
Einwirken der konstanten Kraft in Kontakt befinden. Auf diese Weise
kann eine Substanz allein durch ihr Bindungsverhalten klassifiziert
werden. Durch dieses Einwirken einer konstanten Einzelkraft kann
ein Schwellenwert ermittelt werden, der eine grobe Entscheidung
darüber
erlaubt, ob die zu untersuchende Substanz der einwirkenden Kraft
widersteht, indem man prüft,
ob die beiden Flächen
sich noch berühren.
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Die letztere Alternative erlaubt
zwar nur eine grobe Einschätzung über die
Eigenschaften und die Art der Substanz, aber man kann das Verfahren
als erste Näherung
einer groben Identifizierung oder Unterscheidung von Substanzen
ansehen, und das Verfahren kann auf einfache Weise durchgeführt werden,
sodass es sich für
den Feldeinsatz eignet.
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Die Erfindung betrifft auch eine
Vorrichtung nach Anspruch 6 zum Identifizieren einer vorzugsweise
biochemische Moleküle
umfassenden Substanz, mittels derer das erfindungsgemäße Verfahren durchgeführt werden
kann. Hierfür
umfasst die Vorrichtung im Grunde zwei Trägermittel, und zwar eins für die zu
bestimmende Substanz und die andere für die bekannte Sonde (Prüfsubstanz).
Die Sonde wird auf eine Kontaktfläche aufgebracht, die eine Oberfläche eines
Trägermittels
ist, welches in Form eines Stempels aus einem elastomeren Material
gegossen ist. Um bei der Ermittlung der beteiligten Bindungskräfte zwischen
der Substanz und der Prüfsubstanz eine
bessere statistische Ausgewogenheit zu erzielen, beträgt die Kontaktfläche des
Stempels von weniger als einem μm2 bis zu mehreren mm2.
Die unbekannte Substanz hingegen wird auf eine Probenoberfläche wie
beispielsweise auf ein Glassubstrat aufgebracht, die aus einem starren
Material bestehen kann.
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Um die beiden Flächen in Kontakt zueinander
zu bringen sowie voneinander zu trennen, wird ein Trennmittel bereitgestellt,
das vorzugsweise mit der Stempelanordnung verbunden ist, sodass
der Stempel in Richtung der Probenfläche bewegt und von ihr entfernt
werden kann. Bei einer bevorzugten Ausführungsart umfasst das Trennmittel
einen Schrittmotorantrieb, mit dem eine definierte Verschiebungsstrecke
zwischen der Kontaktfläche
des Stempels und der Probenfläche
eingestellt werden kann.
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Ferner werden Messmittel zum Messen
beispielsweise der einwirkenden Kräfte bereitgestellt, die auf
die Oberflächen
gerichtet sind, um die Oberflächen
in Kontakt miteinander zu bringen oder sie voneinander zu trennen.
Desgleichen kann das Messmittel zur Ermittlung der Zeitspanne zwischen dem
Berührungskontakt
der beiden Oberflächen
und dem Zustand der vollständigen
Trennung vorgesehen sein. Es kann eine Lichtquelle zum Einkoppeln von
Licht in die Stempelanordnung bereitgestellt werden, um festzustellen,
ob der Stempel die Probenfläche
berührt
oder von ihr getrennt ist. Zu diesem Zweck muss der Stempel aus
einem lichtdurchlässigen
Material bestehen, sodass Licht in den Stempel eingekoppelt werden
kann, der als Lichtwellenleiter dient. Falls sich der Stempel und
die Probenoberfläche
berühren,
tritt das in den Stempel eingekoppelte Licht durch die Grenzflächenschicht
zwischen der Kontaktfläche
und der Probenfläche
in den Grundkörper,
auf dem die Probenfläche
bereitgestellt wird. Vorzugsweise besteht auch der Grundkörper der Probenfläche aus
einem lichtdurchlässigen
Material, sodass durchgelassenes Licht ohne hohe Verluste durch
den Grundkörper
treten kann. Unmittelbar am Grundkörper ist ein Nachweismittel
zum Messen der Intensität
des durchgelassenen Lichts angebracht.
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Falls zwischen der Kontaktfläche und
der Probenfläche
kein Kontakt besteht, ist die Intensität des durchgelassenen Lichts
infolge der Reflexion an der Kontaktfläche des Stempels deutlich verringert, der
durch ein Medium mit einem im Vergleich zum Stempelmaterial unterschiedlichen
Brechungsindex umgeben ist. Aus dem zum Beispiel mittels einer CCD-Kamera
oder ganz einfach mit dem Auge empfangenen Signal des Lichtnachweismittels
kann man genaue Informationen über
den tatsächlichen
Zustand der beiden Flächen
gewinnen, und zwar ob sie sich berühren oder voneinander getrennt
sind. Dieses Signal kann als Start- oder Stoppsignal zum Messen
der oben erwähnten
Zeitspanne zum Trennen der beiden Flächen dienen. Ebenso kann das
Lichtnachweismittel Informationen darüber bereitstellen, ob der Zustand
des Berührungskontakts
zwischen der Kontaktfläche
und der Probenfläche
erreicht wurde.
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Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsart
nach den Ansprüchen
16 und 17 kann die erfindungsgemäfle
Vorrichtung als Biosensor zum Nachweis und zur Charakterisierung
einer Vielzahl von Substanzen in Form von Biomolekülen verwendet
werden. Der Biosensor umfasst mindestens einen aus einem elastomeren
Material wie Polydimethylsiloxan (PDMS) hergestellten Stempel mit
einem Durchmesser von ungefähr
0,1 μm bis
1 mm und einem Durchmesser-Höhen-Verhältnis von
ungefähr
2 bis 10. Auf die Kontaktfläche
des Stempels werden chemische Verbindungen mit Molekülen aufgebracht, die
selektive Bindungseigenschaften aufweisen. Diese Prüfmoleküle werden
gerichtet so an der Kontaktfläche
aufgebracht, dass die aktive Seite jedes Moleküls von der Stempelfläche weg
zeigt und für
selektive Nachweiszwecke verwendet werden kann. Jedes Molekül ist fest
mit der Kontaktfläche
verbunden und kann mehrere Male verwendet werden. Wenn der Stempel
gegen die Probenfläche
gedrückt
wird und einen Berührungskontakt
herstellt, können
die einzelnen Moleküle
infolge der Nachgiebigkeit des Stempels ihre Liganden in einer spezifischen,
für biologische
Systeme typischen Weise erkennen und sich mit ihnen verbinden. Wird
der Stempel von der Probenfläche
weggezogen, wird eine stärkere
Kraft benötigt
als für
Vergleichssysteme ohne spezifische Erkennung. Die Bindungsenergie
kann wie oben ausgeführt
gemessen werden.
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Auf ähnliche Weise können in
einer automatischen Anordnung eine Vielzahl auf vielen einzelnen Probenflächen haftender
Substanzen geprüft
und klassifiziert werden, wenn die Probenflächen auf einer Mikrotiterplatte
angebracht sind.
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Außerdem kann der Biosensor eine
Mehrstempelanordnung bereitstellen, wobei jeder Stempel eine Kontaktfläche aufweist,
die mit einer Art von Biomolekülen
beschichtet ist, die unterschiedliche selektive Bindungseigenschaften
haben. Die Stempel der Anordnung sind durch ein normales Verbindungsmittel
miteinander verbunden, sodass der Kontakt zwischen den Kontaktflächen jedes
Stempels mit einer Probenfläche
gleichzeitig erfolgen kann.
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Der oben beschriebene Ansatz zum
Messen von biologischen Molekülen
mit dieser Art des erfindungsgemäßen Biosensors
funktioniert auch in verdünnten
und in Mischungssystemen. Bei einem verdünnten System ist die Oberfläche des
Sensors nur zum Teil mit der zu analysierenden Substanz bedeckt.
Zu einer teilweisen Bedeckung der Sensorfläche mit der zu analysierenden
Substanz kann es durch zu kurze Einwirkung einer Lösung mit
dieser Substanz auf die Oberfläche
oder durch einen niedrigen Haftkoeffizienten zwischen der Oberfläche und dieser
Substanz kommen. In einem Mischungssystem liegt die zu identifizierende
Substanz gemeinsam mit anderen Molekülen auf der Sensoroberfläche vor, die
gleichzeitig aus einer Lösung
mit mehreren Molekülarten
abgeschieden werden. In diesem Fall gibt der Anteil der mit der
zu identifizierenden Substanz beschichteten Sensorfläche den
relativen Haftkoeffizienten der verschiedenen Moleküle zu der
Oberfläche
und deren Konzentrationen wieder. In beiden Fällen kann die Adhäsionsarbeit
deutlich verringert sein, da die Dichte der zu identifizierenden
Substanz auf der Oberfläche
abnimmt.
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Gegen diese Effekte kann man durch
aktives Einfangen der zu identifizierenden Substanz aus der Lösung mittels
immobilisierter Fängermoleküle an der
Oberfläche
vorgehen. Bei diesem Vorgehen wird zuerst die Sensorfläche mit
einem Molekül
belegt, der die zu identifizierende Substanz spezifisch bindet und
immobilisiert und so an der Sensorfläche konzentriert. Der Vorteil
dieses in der Immunochemie üblichen
Vorgehens besteht zum Beispiel in der Verwendung der möglichen
hohen Affinitätskonstante und
der hohen Selektivität
zwischen den Fängermolekülen und
der zu identifizierenden Substanz. In diesem Fall bleibt die gemessene
Adhäsionsarbeit
auch bei verdünnten
oder Mischungslösungen
hoch.
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BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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Im Folgenden wir die Erfindung unter
Bezug auf die folgenden schematischen Zeichnungen ausführlich beschrieben.
Man beachte, dass die Figuren nicht maßstabsgerecht sind.
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1 veranschaulicht
eine schematische Seitenansicht einer Vorrichtung zum Identifizieren
einer Substanz,
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2 veranschaulicht
ein Diagramm zum Bestimmen der Adhäsionsarbeit,
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3a,b,c veranschaulicht
eine als Biosensor verwendete Vorrichtung zum Identifizieren von Biomolekülen,
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4 veranschaulicht
eine Anordnung zum Identifizieren der spezifischen biologischen
Wechselwirkung auf einer Titerplatte; und
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5 veranschaulicht
eine schematische Seitenansicht eine Biosensors als Mechanismus
zur Lichtübertragung.
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BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN
AUSFÜHRUNGSARTEN
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Das Grundkonzept der vorliegenden
Erfindung wird in Verbindung mit den 1 bis 5 beschrieben.
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1 zeigt
eine Vorrichtung zum Identifizieren einer vorzugsweise Biomoleküle umfassenden Substanz.
Die zu analysierende Substanz 1 wird auf eine Probenfläche 2 aufgetragen,
welche die Oberfläche
eines Glassubstrats 3 sein kann. Zum Messen der senkrecht
auf die Probenfläche 2 wirkenden
Kräfte
ist das Substrat 3 vorzugsweise auf einer Skala 4 angebracht,
die eine Anzeige 5 umfasst, auf der die Stärke der
tatsächlich
auf die Probenfläche 2 sowie auf
die Skala 4 ausgeübten
Kraft angezeigt wird.
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Auf einem Rahmen 4', der sich in
direktem Kontakt mit einem Grundgestell befindet, auf dem die Skala 4 angebracht
ist, wird ein Halterungsmittel 6 bereitgestellt, das senkrecht
verschiebbar mit einem Trennmittel 7 verbunden ist, welches zum
Beispiel als Schrittmotor oder einfach als handbediente Schraube
oder als piezoelektrisches Element ausgeführt ist.
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Der Grundkörper des Halterungsmittels 6 kann
wie später
erklärt
eine Lichtquelle 14 oder ein anderes Mittel zum Messen
physikalischer Parameter wie beispielsweise Kraftsensoren oder Lagesensoren
bereitstellen. Das Halterungsmittel 6 selbst oder ein weiterer
von diesem getrennter Körper 8 wird
bereitgestellt, der durch Gießen
als elastomerer Stempel mit einer Kontaktfläche 9 hergestellt
wird, auf den eine Prüfsubstanz
p aufgebracht wird.
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Durch Betätigung des Trennmittels 7 wird
der Stempel 8 so lange in Richtung Probenfläche 2 verschoben,
bis es zwischen beiden Flächen
zum gut definierten Berührungskontakt
kommt. Der Stempel 8 wird anschließend wie oben beschrieben zusammen mit
der Sonde p auf ähnliche
Weise von der Probenfläche 2 weggezogen.
Die während
der Belastungs- und der Entlastungsphase durch die Skala 4 gemessene
Kraft wird als Funktion von der Verschiebungsstrecke des Schrittmotorantriebs 7 ermittelt.
Mit dem Messmittel 4 ist ein Vergleichsmittel 13 verbunden, um
die gemessenen physikalischen Parameter zum Identifizieren der unbekannten
Substanz mit Referenzwerten zu vergleichen.
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In dem Diagramm von 2 ist die einwirkende Kraft auf der Ordinate
als Funktion von der Verschiebungsstrecke des Schrittmotorantriebs
auf der Abszisse dargestellt, wobei sich die Adhäsionsarbeit aus der Differenz
zwischen den Integralen der während
der Belastungs- und der Entlastungsphase wirkenden Kraft über die
Verschiebungsstrecke ergibt. In 2 stellt
die schraffierte Fläche
das Integral der Belastungsphase und die punktierte Fläche W des
Diagramms die Adhäsionsarbeit
zwischen der Substanz und der Prüfsubstanz
dar.
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Im Idealfall sind diese Messwerte
bei aus Polydimethylsiloxanen hergestellten elastischen Stempeln
von der Stärke
der Belastung und der Geschwindigkeit der Belastungs- und Entlastungszyklen
unabhängig.
Bei Stempeln aus realen Kunststoffen müssen für die Belastungs- und Entlastungszyklen
identische Geschwindigkeiten eingehalten werden. Die Kontaktfläche des
Stempels 8 kann von weniger als einem Quadratmikrometer
bis zu mehreren Quadratmillimetern betragen. Eine große Kontaktfläche des Stempels,
die sich in Berührungskontakt
mit der Stempelfläche
befindet, bildet Durchschnittswerte über viele Moleküle und stellt
somit die bei vielen Biosensoranwendungen erforderlichen statistischen
Informationen bereit. Die Oberfläche
des Stempels ist wesentlich größer als
die Spitze des Rasterkraftmikroskops bei dem gut bekannten AFM-Verfahren,
sodass die mittels der oben erwähnten
erfindungsgemäßen Erfindung
gewonnenen Ergebnisse von statistischem Wert sind.
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Ein sehr wichtiger Aspekt der erfindungsgemäßen Vorrichtung
besteht darin, dass man die Kontaktfläche mit definierten biologischen
Molekülen
bedecken kann, die empfindliche Bindungseigenschaften aufweisen.
So ist es möglich,
dass die Kontaktfläche
des Stempels zum Beispiel mit einem Liganden bedeckt ist, der speziell
aktive und unversehrte Moleküle
einfängt
und ausrichtet und so denaturierte oder anderweitig inaktive Moleküle aussondert.
Dies ist in 3 zu sehen,
in der eine als Biosensor verwendete erfindungsgemäße Vorrichtung
gezeigt ist. Der Stempel 8 ist mit einer speziellen Schicht
von Biomolekülen
beschichtet, die die Sonde p darstellen, welche mit entsprechenden
auf der Probenfläche 2 in 3 bereitgestellten Substanzen 1 sehr
selektiv wechselwirkt. Der Stempel 8 wird anschließend auf die
Probenfläche 2 abgesenkt,
sodass die speziellen Biomoleküle
der Sonde p mit der auf die Probenfläche 2 aufgebrachten
Substanz 1 chemisch Wechselwirken.
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Die Erkennung funktioniert auch bei
verdünnten
und Mischungssystemen, obwohl die Adhäsionsarbeit mit abnehmender
Dichte der zu identifizierenden Substanz auf der Oberfläche deutlich
verringert sein kann.
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Bei dem in 3b gezeigten verdünnten und/oder Mischungssystem
ist die Oberfläche 9 des Sensors,
während
sie sich in Kontakt mit der Probenfläche 2 befindet, nur
teilweise mit der zu analysierenden Substanz 1 bedeckt.
Zur teilweisen Bedeckung der Sensorfläche 9 mit der zu analysierenden Substanz 1 kann
es kommen, wenn die die Substanz 1 enthaltende Lösung zu
kurz auf die Probenfläche einwirkt
oder wenn der Haftkoeffizient zwischen der Fläche 2 und dieser Substanz 1 klein
ist. Bei einem Mischungssystem liegt die zu identifizierende Substanz 1 gleichzeitig
mit anderen Molekülen 15 auf
der Fläche 9 des
Sensor vor, die parallel aus einer mehrere Molekülarten enthaltenden Lösung abgeschieden
wurden. In diesem Fall gibt der Anteil der durch die Substanz 1 beschichteten
Kontaktfläche 9 des Sensors
den relativen Haftkoeffizienten und die Konzentration der verschiedenen
Moleküle
an der Fläche wieder.
In beiden Fällen
kann die Adhäsionsarbeit
mit abnehmender Dichte der zu identifizierenden Substanz auf der
Fläche
deutlich verringert sein.
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Eine Strategie zur Verhinderung dieser
Effekte besteht im aktiven Einfangen der zu identifizierenden Substanz 1 aus
der Lösung
an der Oberfläche
durch immobilisierte Fängermoleküle, wie
in der linken und rechten Zeichnung von 3c gezeigt ist. Bei dieser Strategie
wird die Fläche 9 des
Sensors zuerst mit einem Molekül
wie der Prüfsubstanz
p beschichtet, die die zu identifizierende Substanz 1 bindet
und immobilisiert und so an der Sensorfläche konzentriert. Die Vorteile
dieser in der Immunochemie üblichen
Verfahrensweise besteht zum Beispiel in der Verwendung der möglicherweise
hohen Affinitätskonstanten
und der hohen Selektivität
zwischen dem Fängermolekül und der
zu identifizierenden Substanz. In diesem Fall bleibt die gemessene
Adhäsionsarbeit
auch bei verdünnten
oder Mischungslösungen
hoch.
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In ähnlicher Weise können viele
der in 4 gezeigten Probenflächen 2 auf
einer Mikrotiterplatte 10 angeordnet werden, sodass eine
automatische Vorrichtung die Substanzen 1 testen kann,
die an jeder auf einer Mikrotiterplatte 10 angeordneten
Probenfläche
bereitgestellt werden. Folglich kann ein automatisch verschobener
Stempel 8 in der durch die Pfeile angezeigten Weise nacheinander
mit verschiedenen Probenflächen 2 Wechselwirken.
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Sämtliche
Ausführungsarten
der in den 1, 3 und 4 gezeigten erfindungsgemäßen Vorrichtung
beruhen auf einer Waage als Kraftübertragungsvorrichtung. Die
beschriebenen Anordnungen sind einfacher als andere typische Ansätze für Sensoren
wie Gitterkopplungsvorrichtungen oder Quarzwaagen. Eine noch einfachere
Mehrkanalerkennung lässt
sich durch Verwendung eines Halterungsmittels erreichen, das eine
Vielzahl einzelner Stempel vorzugsweise mit Durchmessern zwischen
einem Bruchteil eines Mikrometers und mehreren Millimetern sowie
Breite-Höhe-Verhältnissen
von ungefähr zehn
bereitstellt, d. h., dass die Stempel zehnmal so lang wie ihr Durchmesser
sind.
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Eine solche Anordnung ist in 5 gezeigt, bei der ein Halterungsmittel 6 eine
Vielzahl einzelner Stempel 8 bereitstellt, die mit den
anderen jeweils über
ein Verbindungsstück 11 verbunden
sind. Im Idealfall sind der Einzelstempel 8 und das Verbindungsstück 11 aus
lichtdurchlässigem
PDMS hergestellt.
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Im Rahmen einer Fertigungstoleranz
von ungefähr
1% weisen alle Stempel 8 dieselbe Länge auf und sind mit Molekülen bedeckt,
die Unterschiede erkennen können.
Diese Stempel 8 werden in Berührungskontakt mit der Probenfläche 2 gebracht
und nach wenigen Sekunden wird die Gesamtheit der elastomeren Stempel 8 langsam
von der Probenfläche 8 entfernt.
Die Stempel 8 ohne spezifische Wechselwirkung verlassen
die Probenfläche
sofort, während
die Stempel 8 mit spezifischer Wechselwirkung in Kontakt
mit der Oberfläche
bleiben und so lange gedehnt werden, bis die elastische Kraft die Wechselwirkungskraft übersteigt.
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Zur Identifizierung der unbekannten
Substanzen kann die Adhäsionsarbeit
wie in dem oben beschriebenen Beispiel durch genaue Messung der Trennzeit
ermittelt werden. Da die lichtdurchlässigen Stempel für das von
einer Lichtquelle 14 ermittierte Licht als Wellenleiter
dienen, kann die Trennung mittels eines Erkennungsmittels 12 wie
beispielsweise eines menschlichen Auges oder einer unter der ebenfalls
aus einem lichtdurchlässigen
Material hergestellten Probenfläche
positionierten CCD-Kamera leicht nachgewiesen werden.
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LISTE DER
BEZUGSNUMMERN
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- 1
- Substanz
- 2
- Probenfläche
- 3
- Substrat
- 4
- Skala
- 4'
- Rahmen
- 5
- Anzeige
- 6
- Halterungsmittel
- 7
- Trennmittel
- 8
- Körper, Stempel
- 9
- Kontaktfläche
- 10
- Mikrotiterplatte
- 11
- Verbindungsstück
- 12
- Erkennungsstück
- 13
- Vergleichsmittel
- 14
- Lichtquelle
- 15
- Fängermoleküle
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