DE3786388T2

DE3786388T2 - Analytisches Gerät und Verfahren zum Nachweis von Chlamydia Trachomatis und Neisseria Gonorrhoeae.

Info

Publication number: DE3786388T2
Application number: DE87114415T
Authority: DE
Inventors: Vincent Andrew Varitek
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1986-10-16
Filing date: 1987-10-02
Publication date: 1994-01-05
Anticipated expiration: 2007-10-03
Also published as: AU605185B2; CA1306415C; AU7948287A; JPS63198969A; JP2541793B2; EP0264036A2; EP0264036B1; JPH07104354B2; ATE91178T1; EP0264036A3; ES2042526T3; DE3786388D1; JPH08105898A

Description

Hintergrund der Erfindung

Die vorliegende Erfindung ist allgemein gerichtet auf eine Vorrichtung und ein Verfahren zum genauen Nachweis von Chlamydia trachomatis und Neisseria gonorrhoeae Antigenen. Der Nachweis dieser beiden Arten von Antigenen ist kompliziert aufgrund der Schwierigkeit, eine ausreichende Menge einer zu untersuchenden Probe zu erhalten und aufgrund der geringen Konzentration an Antigen, die in derartigen Proben vorhanden ist. Daher ist es wünschenswert, eine Vorrichtung und ein Verfahren zu entwickeln, bei denen minimale Mengen einer Probe genau untersucht und minimale Mengen des betreffenden Antigens nachgewiesen werden können.
Eine Vorrichtung, die angewandt werden kann, um Antigene mit Hilfe eines Bindungs-Assays zu identifizieren ist TESTPACKTM, hergestellt von Abbott Laboratories, Abbott Park, Illinois und das beschrieben ist in der EP-A-0 217 403, die eine ältere europäische Anmeldung ist, die unter den Art. 54(3) EPÜ fällt.
Allgemein wird bei der Vorrichtung ein Enzym-Immunoassay- Verfahren angewandt und sie umfaßt eine Vielzahl von im wesentlichen kugelförmigen bzw. sphärischen festen Teilchen, die in einer porösen faserförmigen Matrix immobilisiert sind. Auf der Oberfläche der Teilchen kann eine Substanz als Überzug vorhanden sein, die in der Lage ist, mit dem in einer Probe vorhandenen Analyten zu reagieren. Die Probe wird mit der porösen Matrix in Kontakt gebracht, wobei der in der Probe vorhandene Analyt an der Oberfläche der Mikroteilchen gebunden wird wo er nachgewiesen werden kann.
Es wurden andere Methoden zum Nachweis von Chlamydia trachomatis und Neisseria gonorrhoeae entwickelt wie in den US-PS 4 497 899 und 4 497 900 angegeben. Diese Patentschriften beschreiben besonders das Absorbieren der betreffenden Antigene an einer festen Phase, wo sie dann mit Antikörper behandelt, gewaschen, mit Antiglobulin behandelt, und gewaschen werden und wo schließlich die Menge des an den Antigen/Antikörper-Komplex gebundenen Antiglobulins bestimmt wird. Trotz dieser Methoden sind weitere Verbesserungen notwendig, um geringe Konzentrationen an Antigen zu identifizieren oder geringe Mengen an Probe auf Chlamydia trachomatis und Neisseria gonorrhoeae zu analysieren. Diese Probleme wurden erkannt und ihre Lösung ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung.

Zusammenfassung der Erfindung

Gemäß einer Ausführungsform ist die vorliegende Erfindung gerichtet auf eine Festphasen-Assay-Vorrichtung, die geeignet ist für Bindungs-Assays zur Bestimmung des Vorhandenseins von Chlamydia trachomatis und Neisseria gonorrhoeae Antigenen in einer Probe, wie in den Ansprüchen definiert. Die Festphasen- Vorrichtung umfaßt eine im wesentlichen ebene Schicht aus einem Material, das eine poröse Matrix aus Fasern aufweist und gekennzeichnet ist durch eine Vielzahl von im wesentlichen sphärischen festen Teilchen, umfassend Polytetrafluorethylen, mit einem mittleren Durchmesser von 0,1 bis 10 um. Die Teilchen werden in der Matrix auf den Fasern festgehalten und sind darin immobilisiert. Die im wesentlichen ebene Schicht hat eine erste, mit der Probe in Kontakt kommende Oberfläche und eine zweite, der ersten Oberfläche gegenüberliegende Oberfläche und ist so in der Vorrichtung angeordnet, daß, wenn die Vorrichtung bei der Durchführung des Assays angewandt wird, mindestens ein Teil der Probe, die mit der ersten Oberfläche in Berührung kommt, durch die im wesentlichen ebene Schicht zu der zweiten Oberfläche hindurchgeht. Die Polytetrafluorethylen-Teilchen dienen dazu, das Antigen zu binden, das dann durch Immunoenzym-Verfahren bestimmt werden kann. Mit der Vorrichtung können ferner interne Vergleiche (on-board controls) angewandt werden, um eine genaue Identifizierung- sicherzustellen und leicht ablesbare Ergebnisse zu erhalten.
Gemäß einer anderen Ausführungsform ist die vorliegende Erfindung gerichtet auf ein Verfahren zur Durchführung eines Bindungs-Assays zur Bestimmung des Vorhandenseins von Chlamydia trachomatis und Neisseria gonorrhoeae Antigenen in einer Test- Probe. Das Verfahren umfaßt die folgenden Stufen:
a) Zusammenbringen einer porösen Matrix aus Fasern mit einer Vielzahl von im wesentlichen sphärischen festen Teilchen, umfassend Polytetrafluorethylen, mit einem mittleren Durchmesser von 0,1 bis 10 um, wobei die Teilchen innerhalb der Matrix auf den Fasern festgehalten und immobilisiert werden, wodurch das Antigen in der Probe an die Teilchen gebunden wird unter Bildung eines Antigen-Komplexes auf den Teilchen,
b) Zusammenbringen des Antigen-Komplexes auf den Teilchen mit einer zweiten Substanz, die mit dem Antigen reagieren kann und die markiert ist mit einer Substanz, die in der Lage ist, eine nachweisbare Reaktion in Gegenwart von dem Antigen und einer Indikatorsubstanz hervorzurufen, wodurch die markierte Substanz an den Antigen-Komplex auf den Teilchen gebunden wird,
c) Entfernen von nicht gebundener markierter Substanz von dem Material,
d) Zusammenbringen des Komplexes mit der Indikatorsubstanz und
e) Nachweis der Reaktion, die auftritt als Funktion des Vorhandenseins oder der Menge an Antigen in der Probe.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform ist die vorliegende Erfindung gerichtet auf ein Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins von Chlamydia trachomatis und Neisseria gonorrhoeae Antigenen in einer flüssigen Probe. Das Verfahren umfaßt die folgenden Stufen:
a) Inkubieren einer Vielzahl von im wesentlichen sphärischen festen Teilchen, umfassend Polytetrafluorethylen, mit einem mittleren Durchmesser von etwa 0,1 bis etwa 10 um, mit einer Probe der Flüssigkeit, wodurch das Antigen an die Teilchen gebunden wird unter Bildung eines Antigen-Komplexes auf den Teilchen, -b) Zusammenbringen einer porösen faserförmigen Matrix mit den inkubierten Teilchen, wobei zumindest ein Teil der Teilchen in der Matrix auf mindestens einem Teil der Fasern festgehalten und immobilisiert wird,
c) Nachweis des Vorhandenseins von Antigen, das an die Teilchen gebunden ist.
In der Stufe c) wird der gebundene Teilchen-Komplex beobachtet durch Behandlung mit einem enzym-konjugierten Antikörper oder Antigen der/das behandelt worden ist mit einer Indikatorsubstanz, so daß der Komplex entweder visuell oder instrumentell beobachtet werden kann.
Die vorliegende Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß Mikroteilchen aus Polytetrafluorethylen verwendet werden, um Chlamydia trachomatis und Neisseria gonorrhoeae Antigen wirksam zu binden. Es hat sich gezeigt, daß Polytetrafluorethylen anderen Mikroteilchen überlegen ist. Das ist von besonderem Wert, da im allgemeinen die interessierenden Proben klein sind oder eine geringe Antigen-Konzentration besitzen.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist eine Seitenansicht eines teilweisen Schnitts durch eine analytische Vorrichtung, die erfindungsgemäß angewandt werden kann.
Fig. 2 ist ein Aufriß der Vorrichtung der Fig. 1.
Fig. 3A, 3B, 3C und 4A, 4B, 4C sind Aufrisse verschiedener Ausführungsformen der Vorrichtung der Fig. 1 und zeigen verschiedene Beispiele für Kontrollbereiche.
Fig. 5 ist eine perspektivische Ansicht der Vorrichtung der Fig. 1, bei der der Vorfilter vom Hauptteil der Vorrichtung entfernt ist.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung ist gerichtet auf ein verbessertes Verfahren zur Identifizierung von Chlamydia trachomatis (Chlamydia) und Neisseria gonorrhoeae (Gonorrhoeae) Antigenen, die in einer Probe vorhanden sind. Insbesondere sind die Vorrichtung und das Verfahren geeignet zum Nachweis des Vorhandenseins kleiner Mengen von Chlamydia und Gonorrhoeae Antigenen in einer biologischen Flüssigkeit.
Allgemein wird bei der Vorrichtung und dem Verfahren eine verbesserte Form eines Festphasen-Immunoassay-Verfahrens zur Durchführung von colorimetrischen oder anderen Enzym-Immunoassay-Analysen für biologische Flüssigkeiten angewandt. Die in Fig. 1 angegebene Vorrichtung zeigt einen Querschnitt durch die verschiedenen Komponenten, die für ein Verständnis der erfindungsgemäßen Verbesserungen erforderlich sind.
Die Vorrichtung 10 umfaßt eine im wesentlichen ebene, im allgemeinen kreisförmige, scheibenförmige Reaktions-Matrix 12.
Die Matrix 12 enthält die erfindungsgemäßen sphärischen Teilchen, wie hier beschrieben, und ist so innerhalb der Vorrichtung 10 angeordnet, daß die verschiedenen chemischen Reaktionen und Veränderungen, die notwendig sind, um ein Bindungs-Assay durchzuführen, darin stattfinden können zum visuellen oder instrumentellen Nachweis.
Die Matrix 12 besitzt eine mit der Probe in Kontakt kommende Oberfläche 12a und eine gegenüberliegende Oberfläche 12b. Die Filter-Matrix 12 ist eine "poröse" Filter-Matrix, d. h. daß die Matrix aus einem Material besteht, in das Flüssigkeiten eindringen und durch das sie leicht hindurchgehen können. Geeignete Materialien können Glasfasern, Cellulose, Nylon oder andere faserförmige Materialien umfassen, wie sie bekannt sind. Ein bevorzugtes Material ist "Whatman GF/D" Glasfaser-Filterpapier (Whatman Reeve Angel, Inc., Clifton, New Jersey) mit einer nominellen Dicke von 0,81 mm (0,032 inch), wobei die Dicke jedoch kein kritischer Faktor ist.
Die Vorrichtung 10 umfaßt zusätzlich einen Träger 14, in dem die Matrix 12 angeordnet ist. Der Träger 14 kann aus irgendeinem geeigneten Material wie Kunststoff, Metall oder einer anderen starren oder halb-starren Substanz bestehen. Besonders bevorzugt als Material für den Träger 14 ist ein Kunststoff, der kommerziell als "ABS" bekannt ist und erhältlich ist von Monsanto Company, St.Louis, Missouri. Bei der gezeigten bevorzugten Ausführungsform umgibt der Träger 14 vollständig die Matrix 12 und dient als Stütze und Halter dafür. Um diese Funktion auszuüben, hat der Träger 14 im allgemeinen einen kreisförmigen Flansch 16 zum Stützen und festen Halten der Matrix 12. Eine Flüssigkeits-Kammer wird im allgemeinen definiert durch Seitenwände, die gebildet werden durch eine äußere Wandseite 16a des Flansches 16 und eine Grundwand, die gebildet wird durch die mit der Probe in Kontakt kommende Oberfläche 12a der Matrix 12.
Die Vorrichtung 10 umfaßt ferner ein Absorptionsmittel 20, das, wie gezeigt, in dem Träger 14 angeordnet ist, um während der Anwendung der Vorrichtung Flüssigkeiten zu absorbieren. Das Absorptionsmittel 20 der Vorrichtung 10 kann eine oder mehrere Schichten von Material umfassen und steht, wie gezeigt, in physikalischem Kontakt mit dem Trennmaterial 18, wenn (ein solches) verwendet wird, oder mit der Reaktions-Matrix 12. Dieses besonders bevorzugte Merkmal ermöglicht es, daß überschüssige Flüssigkeit, während der Durchführung eines Assays unter Verwendung der Vorrichtung 10, leicht absorbiert wird, soweit notwendig, nach dem Durchgang derartiger überschüssiger Flüssigkeit aus der Reaktionsmatrix 12 während des Assay-Verfahrens. Das Absorptionsmittel 20 kann im wesentlichen irgendein Feuchtigkeit oder Flüssigkeit zurückhaltendes Material sein, z. B. ein solches, das erhältlich ist von James River und bezeichnet wird als "150 Point" bzw. "50 Point" oder, was besonders bevorzugt ist, eine Kombination aus einer oder mehreren Schichten jedes der obigen (Materialien).
Ein Trennmittel ist vorgesehen, um den Flüssigkeitsstrom in den Festphasen-Analysevorrichtungen zu begrenzen. Dieser Aspekt ist besonders vorteilhaft, wenn er angewandt wird in Festphasen-Analysevorrichtungen mit einer durchlässigen Reaktions-Oberfläche oder Matrix oder Filterschicht und einer Absorptionsschicht zur Absorption von Flüssigkeiten, die in der Vorrichtung angewandt wird, um den Strom von Flüssigkeiten von der Reaktions-Oberfläche in das Absorptionsmittel zu ermöglichen, während der Rückfluß von Flüssigkeiten aus der Absorptions-Schicht in die Reaktions-Matrix verhindert wird.
Wie in Fig. 1 gezeigt, umfaßt das Trennmittel eine Schicht aus einem Trennmaterial 18, die sich unter der Matrix 12 in den Träger 14 erstreckt. Das Trennmaterial 18 steht in Kontakt mit der Oberfläche 12b der Matrix 12 und wirkt, wenn die Vorrichtung angewandt wird, um die Flüssigkeit, die durch die Matrix 12 hindurch zu der und durch die Oberfläche 12b und in die Schicht 18 geht, an einem erneuten Kontakt mit der Oberfläche 12b zu hindern. Die Schicht 18 wird angewandt als eine flüssigkeitsbegrenzende Schicht und um dazu beizutragen, "Hintergrund"-Störungen in der Matrix 12 zu verhindern oder auszuschalten. Dieses Merkmal ist jedoch nicht wesentlich oder kritisch für die grundlegenden Funktionen oder Konzepte der Matrix 12 und kann, wenn dies erwünscht ist, von der Vorrichtung weggelassen werden. Wenn es weggelassen wird, arbeitet die Vorrichtung im allgemeinen zufriedenstellend bei einem Assay, aber möglicherweise mit geringerer Empfindlichkeit (verringerter nachweisbarer Reaktion).
Die Schicht 18 kann irgendein geeignetes Material umfassen, das einen begrenzten, im wesentlichen "Einwege"-Strom von Flüssigkeit oder Feuchtigkeit hervorrufen kann. Beispiele von für diesen Zweck besonders geeigneten Materialien sind gewebte Polyethylen-Materialien, hergestellt und verkauft von Ethyl Visqueen Corp., Baton Rouge, Louisiana unter der Bezeichnung "X-6108", 31,75 um (1,25 mil), sowie solche Materialien, wie sie in den US-PS 3 939 135 und 4 342 314 beschrieben sind. Ein anderes geeignetes Material ist "LydairTM Grad 254" von Lydall, Inc., Manchester, Connecticut.
Bei den Fig. 1, 2 und 5 der Zeichnungen kann die analytische Vorrichtung 10 nach der Erfindung gegebenenfalls ein Filtermittel 22 umfassen, das über der Oberfläche 12a der Reaktions-Matrix 12 angeordnet ist. Das Filtermittel 22 kann in den Träger 14 mit Hilfe eines Rückhalteringes 22a eingepreßt sein und vorzugsweise einen entfernbaren Teil 22b mit einem Griffteil 22c umfassen. Das Mittel 22 besteht ferner z. B. aus einem geeigneten porösen oder faserförmigen Material 22d, wie einer Glas- oder Cellullose-Filtermembran in einer Kunststoffumgebung; besonders bevorzugt sind "LydairTM Grad 254" von Lydall und "GF/F" oder "GF/D" von Whatman Reeve Angel, Inc., Clifton, New Jersey, entweder allein oder in Kombination.
Obwohl die Vorrichtung 10, wie oben beschrieben, eine visuell ablesbare Reaktion erzeugen kann, kann auch eine instrumentelle Bestimmung einer nachweisbaren Reaktion durchgeführt werden, z. B. entsprechend der Reflexion von sichtbarem Licht oder der Intensität der Fluoreszenz oder ähnlichem, hervorgerufen durch die Matrix 12 als Ergebnis der chemischen oder biologischen Reaktionen und Veränderungen, die darin auftreten, wenn ein Assay durchgeführt wird. Folglich kann die nachweisbare Reaktion der Vorrichtung 10 z. B. mit einem Reflektometer gemessen werden.
Ein verallgemeinertes Beispiel, wie ein direktes diagnostisches Assay mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung durchgeführt werden kann, ist das folgende:
Stufe a): Aufbringen einer Test-Probe, enthaltend das/den zu bestimmende(n) Antigen oder Antikörper, auf die Reaktions- Matrix, auf der Mikroteilchen immobilisiert sind;
Stufe b): Aufbringen von enzym-markiertem Antikörper oder Antigen zu dem Antigen oder Antikörper der Stufe a);
Stufe c): Waschen zum Entfernen von nicht gebundenem Material und
Stufe d): Aufbringen einer Indikatorsubstanz, die in Anwesenheit des Enzymteils des Konjugats der Stufe b) eine nachweisbare Farbe oder andere Reaktion in der Reaktions- Matrix hervorruft.
Gemäß einer anderen Ausführungsform kann die vorliegende Erfindung angewandt werden durch Inkubieren der Probe mit einer Vielzahl von sphärischen festen Teilchen aus Polytetrafluorethylen. Nachdem der Analyt an die Teilchen gebunden worden ist, werden die Teilchen mit einer porösen faserförmigen Matrix in Kontakt gebracht, wodurch zumindest ein Teil der Teilchen in der Matrix festgehalten und immobilisiert wird. Die gebundenen Teilchen werden dann mit einem enzym-konjugierten Antikörper oder Antigen behandelt. Die Teilchen werden gewaschen, um überschüssiges Enzym-Konjugat zu entfernen und eine Indikator-Substanz wird zugegeben, um eine nachweisbare Farb- oder sonstige Reaktion hervorzurufen. Bei einer noch anderen Ausführungsform können die sphärischen festen Teilchen, umfassend Polytetrafluorethylen angewandt werden als Festphasen-Komponenten bei den in den US-PS 4 497 899 und 4 497 900 beschriebenen Verfahren.
Bei der vorliegenden Erfindung sind das Verfahren und die Vorrichtung gekennzeichnet durch die Verwendung einer Vielzahl von sphärischen festen Teilchen aus Polytetrafluorethylen, um den Analyten zu binden. Ein Beispiel für Polytetrafluorethylen- Teilchen sind TeflonTM-Teilchen, ein Warenzeichen von DuPont E.I. De Nemours & Co., Wilmington, Delaware. Vorzugsweise sind die Teilchen Homopolymere von Polytetrafluorethylen; Derivate von Polytetrafluorethylen können jedoch ebenfalls verwendet werden.
Die Polytetrafluorethylen-Teilchen werden in der Fasermatrix abgeschieden (entweder vor oder nach dem Binden des Antigens, abhängig von dem angewandten Verfahren), wo sie festgehalten und immobilisiert werden. "Festgehalten und immobilisiert" bedeutet, daß die Teilchen, wenn sie sich einmal auf dem Fasermaterial befinden, zu keiner wesentlichen Veränderung ihrer Stellung innerhalb des Materials (d. h. zu anderen Fasern hin) in der Lage sind oder daß sie nicht vollständig ohne Zerstörung von dem Material entfernt werden können. Es ist keine spezielle Behandlung erforderlich, um die Teilchen auf der Faser-Matrix festzuhalten und zu immobilisieren, da es sich gezeigt hat, daß sie leicht an den Fasern haften, wenn sie diesen ausgesetzt worden sind.
Die Teilchen haben einen einzelnen mittleren Durchmesser von etwa 0,1 bis etwa 10 um, vorzugsweise von etwa 2 bis etwa 5 um, und eine mittlere Dichte von etwa 2,14 g/cm³. Es ist zu bemerken, daß die Teilchen als Aggregate mit einem Durchmesser, der > 200 um sein kann, vorliegen können. Die Teilchen sind im wesentlichen nicht überzogen und tatsächlich hat es sich gezeigt, daß dies die bevorzugte Methode zur Durchführung des Assays für Chlamydia und Gonnorhoeae ist. Andere Ausführungsformen können jedoch das Überziehen der Teilchen mit Antikörper oder anderen Substanzen umfassen, um die Bindung von Antigen zu unterstützen.
Die Polytetrafluorethylen-Mikroteilchen sind außerordentlich stabil unter verschiedenen Bedingungen und können daher für sehr unterschiedliche Proben, enthaltend die Chlamydia oder Gonnorhoeae Antigene, verwendet werden. Z.B. sind die Mikroteilchen gegenüber starken Säuren und Basen sowie den meisten organischen Lösungsmitteln stabil. Die Mikroteilchen sind auch von -240º bis 260ºC stabil und weil sie hydrophob sind können sie minimale Mengen Wasser absorbieren.
Bei der Durchführung eines Immunoassays für Chlamydia und Gonnorhoeae hat es sich gezeigt, daß die Polytetrafluorethylen- Mikroteilchen überlegene Ergebnisse ergeben, verglichen mit anderen potentiellen polymeren Teilchen. Das wird z. B. in den folgenden Beispielen gezeigt:

Beispiel 1

Verschiedene Mikroteilchen wurden auf ihre Fähigkeit untersucht, Antigen in einem für Chlamydia spezifischen Enzym- Immunoassay zu binden.
Bei dem Verfahren wurden Chlamydia-Antigene von Mikroteilchen-Suspensionen absorbiert. Der gebundene Analyt wurde von dem nicht-gebundenen Analyten durch Zentrifugieren abgetrennt und der gebundene Analyt nachgewiesen unter Verwendung von Kaninchen-anti-Chlamydia- und Ziegen-anti-Kaninchen-Globulin, konjugiert mit Meerrettich-peroxid, um Immunkomplexe nachzuweisen. Der angewandte Indikator war o-Phenylendiamin. Nach der Farbentwicklung wurden die Mikroteilchen abzentrifugiert und der Überstand in Küvetten überführt zur Messung der relativen Absorption bei 492 nm mit einem Spektrophotometer.
Bei diesem Versuch wurde die Fähigkeit jeder Art von Mikroteilchen gemessen, den Analyten in einer Suspension, enthaltend Chlamydia, zu absorbieren. Die nicht-spezifische Bindung wurde ebenfalls bewertet durch parallele Untersuchung jeder Art von Mikroteilchen in verdünnten Lösungen, enthaltend keinen Analyten (Blindprobe).
Die für 7 Arten von Mikroteilchen erhaltenen Ergebnisse waren wie folgt: Mikroteilchen Durchmesser Feststoffe Absorption bei 492 nm Chlamydia Blindprobe Polystyrol (PS) carboxyliertes PS Polymyxin B-PS Weizenkeime Agg. PS Glycin PS kationisches PS Polytetrafluorethylen
Die Ergebnisse zeigen, daß die Polytetrafluorethylen- Mikroteilchen eine überlegene Fähigkeit besaßen, Analyten zu absorbieren, wenn sie den Mikroorganismen ausgesetzt waren. Das Polytetrafluorethylen zeigte auch eine geringe nicht-spezifische Bindung.

Beispiel 2

Die Empfindlichkeit von Polytetrafluorethylen-Teilchen wurde ferner gezeigt durch Messung der Absorption bei 492 nm, wenn sie abnehmenden Gehalten an Mikroorganismen ausgesetzt wurden. Es wurde ein ähnliches Zentrifugen-Enzym-Immunoassay-Verfahren durchgeführt wie in Beispiel 1. Die bei verschiedenen Konzentrationen an Chlamydia gemessenen Absorptionen sind unten angegeben: Chlamydia (Organismen/ml) Absorption bei 492 nm keine
Die Ergebnisse zeigen ausgezeichnete Empfindlichkeit bis zu so geringen Mengen wie 50 000 Organismen/ml mit einem über 3-fachen Unterschied zwischen der Blindprobe und der Probe mit diesem Gehalt.

Beispiel 3

Die Empfindlichkeit der Polytetrafluorethylen-Teilchen wurde ferner bewertet in der Festphasen-Vorrichtung (TESTPACKTM) durch Immobilisieren von Mikroteilchen in der Glasfaser-Matrix unter Bildung der Reaktions-Matrix. Die Reaktions-Matrix wurde dann mit Chlamydia Mikroorganismen in verschiedenen Konzentrationen behandelt und die visuelle Farbänderung und Reflexion nach Behandlung mit einer Indikatorsubstanz gemessen.
Die Ergebnisse waren wie folgt: Konzentration an Chlamydia/ml Probe Signal visuell % Reflexion Blindprobe
Das Signal wurde visuell nach einer 1 bis 4 Skala für die Farbintensität gemessen, wobei positive Ergebnisse mit 4 eine blau-schware Farbe und 1 eine hell-blaue Farbe sind. Das Signal wurde auch mit einem Reflektometer, das die prozentuale Reflexion mißt, quantitativ bestimmt. Die prozentuale Reflexion entspricht der Farbintensität, wobei die die geringste Reflexion eine sehr dunkle Farbe anzeigt.
Die Ergebnisse zeigen, daß ein positives Ergebnis nachgewiesen werden konnte bei so geringen Konzentrationen wie 5·10² Mikroorganismen/ml. Visuell war bei 5·10² Mikroorganismen/ml eine leichte Färbung nachweisbar, was eine positive Reaktion anzeigte, obwohl der Punkt nicht mehr innerhalb der Farbskala lag; das instrumentelle Signal zeigte jedoch einen deutlichen Unterschied zwischen der Blindprobe und den 5·10² Mikroorganismen/ml. Diese Ergebnisse zeigen eine ausgezeichnete Empfindlichkeit der erfindungsgemäßen Vorrichtung und des Verfahrens gegenüber geringen Konzentrationen an Chlamydia.
Obwohl bei allen obigen Beispielen Chlamydia angewandt wurde, sind die Vorrichtung und das Verfahren ebenso anwendbar auf die Identifizierung von Gonorroeae Antigenen.
Die vorliegende Erfindung kann auch "on-board"-Kontrollbereiche umfassen, um gleichzeitig eine nachweisbare Reaktion anzuzeigen, die einer positiven Kontrolle entspricht (die eine nachweisbare Reaktion zeigt, die ein Zeichen für ein verwertbares Testergebnis ist, unabhängig von dem Vorhandensein oder Nicht-Vorhanden des interessierenden Analyten in der Probe) und einer negativen Probe (die eine nachweisbare Reaktion nur dann zeigt, wenn das Assay-Ergebnis nicht verwertbar ist). Bei dieser Ausführungsform der Erfindung werden das gleiche Volumen einer Testprobe und von Assay-Reagentien gleichzeitig in Kontakt gebracht mit den Verfahrens-Kontrollen und Testbereichen, wodurch die Notwendigkeit von getrennten Kontrolltests entfällt, wie sie nach dem Stand der Technik allgemein durchgeführt werden.
Bei den Fig. 3A-C und 4A-C können negative und positive "on-board"-Kontrollbereiche 30 bzw. 32 auf der Reaktionsfläche oder Matrix 12 der Analysevorrichtung 10 vorgesehen sein. Der in dem Bereich 34 gebundene Analyt zeigt dem Benutzer ein positives Testergebnis. Allgemein sind die Kontrollbereiche 32 und 34 so ausgebildet, daß sie dem Benutzer ein leicht erkennbares Ergebnis zeigen, wie in Fig. 3C gezeigt.
Der negative Kontrollbereich 30 wird gebildet, indem der Bereich 30 während des Assays frei gehalten wird von Substanzen, die die Enzymmarkierung oder ein anderes ein Signal erzeugendes Material enthalten. Der positive Kontrollbereich 32 wird gebildet durch eine Substanz, die in der Lage ist, die Enzymmarkierung oder ein anderes ein Signal erzeugendes Material zu binden unabhängig von dem Vorhandensein des interessierenden Antigens. Der den Analyten bindende Bereich 34 wird gebildet durch Aufbringen (coating) der Mikroteilchen aus Polytetrafluorethylen an dieser Stelle, um das interessierende Antigen zu binden. Bei anderen Ausführungsformen kann die Vorrichtung nur den den Analyten bindenden Bereich 34 enthalten und andere Formen der Bereiche 30, 32 und 34 können ebenfalls angewandt werden.

Claims

1. Festphasen-Assay-Vorrichtung (10), die geeignet ist für Bindungs-Assays zur Bestimmung des Vorhandenseins eines Analyten in einer Probe, wobei die Vorrichtung umfaßt eine im wesentlichen ebene Schicht (12) aus einem Material, das eine poröse Matrix aus Fasern und eine Vielzahl von im wesentlichen sphärischen festen Teilchen mit einem mittleren Durchmesser von 0,1 bis 10 um aufweist, wobei die Teilchen in der Matrix auf den Fasern festgehalten und immobilisiert sind, die im wesentlichen ebene Schicht (12) eine erste, mit der Probe in Kontakt kommende Oberfläche (12a) und eine zweite, der ersten Oberfläche gegenüberliegende Oberfläche (12b) aufweist, so daß, wenn die Vorrichtung bei der Durchführung des Assays angewandt wird, mindestens ein Teil der Probe, die mit der ersten Oberfläche (12a) in Berührung kommt, durch die im wesentlichen ebene Schicht zu der zweiten Oberfläche (12b) hindurchgeht, dadurch gekennzeichnet, daß die festen Teilchen im wesentlichen aus Tetrafluorethylen bestehen, das in der Lage ist, Chlamydia trachomatis oder Neisseria gonorrhoeae direkt zu binden.

2. Assay-Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Vorrichtung zusätzlich ein Filtermittel (22) umfaßt, das in Beziehung zu der ersten Oberfläche (12a) der im wesentlichen ebenen Schicht so angeordnet ist, daß die Probenflüssigkeit durch das Filtermittel (22) hindurchgeht, bevor sie mit der ersten Oberfläche (12a) in Kontakt kommt.

3. Assay-Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Vorrichtung zusätzlich ein Absorptionsmittel (20) umfaßt, das in Beziehung zu der unteren Oberfläche (12b) der im wesentlichen ebenen Schicht (12) so angeordnet ist, daß mindestens ein Teil der Flüssigkeit, die durch die im wesentlichen ebene Schicht (12) hindurch geht, von dem Absorptionsmittel absorbiert wird.

4. Assay-Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die im wesentlichen ebene Schicht (12) ferner eine Reaktions- Oberfläche umfaßt mit einem negativen Kontroll-Bereich (30), einem positiven Kontroll-Bereich (32) und einem Analyt- Bindungsbereich (34) umfaßt, um ein erstes repräsentatives Symbol für einen ersten Anschein beim Auftreten eines positiven Test-Ergebnisses bei der Anwendung der Vorrichtung zu ergeben und um ein zweites repräsentatives Symbol zu ergeben, das von dem ersten repräsentativen Symbol verschieden ist, beim Auftreten eines negativen Test-Ergebnisses bei der Anwendung der Vorrichtung.

5. Assay-Vorrichtung nach Anspruch 4, wobei der positive Kontroll-Bereich (32) auf der Reaktions-Oberfläche in Form eines rechteckigen Balkens gebildet wird.

6. Assay-Vorrichtung nach Anspruch 5, wobei der Analyt- Bindungsbereich (34) auf der Reaktions-Oberfläche in Form von zwei rechteckigen Balken auf gegenüberliegenden Seiten des positiven Kontroll-Bereichs (32) gebildet und senkrecht zu diesem orientiert ist, wobei der Analyt-Bindungs-Bereich (34) zusammen mit dem positiven Kontroll-Bereich (32) ein "+"-Zeichen bildet und wobei der positive Kontroll-Bereich (32) allein so wirkt, daß er ein "-"-Zeichen bildet beim Auftreten eines negativen Test-Ergebnisses.

7. Assay-Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die sphärischen festen Teilchen ein Homopolyiner aus Polytetrafluorethylen sind.

8. Bindungs-Assay-Verfahren unter Verwendung einer festen Phase, die in der Lage ist, Chlamydia trachomatis oder Neisseria gonorrhoeae Antigene in einer flüssigen Probe zu binden, umfassend das Zusammenbringen der flüssigen Probe mit einer festen Phase, bestehend im wesentlichen aus Polytetrafluorethylen-Teilchen, wobei Chlamydia trachomatis oder Neisseria gonorrhoeae Antigene direkt an die feste Phase gebunden werden.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Polytetrafluorethylen- Teilchen einen mittleren Durchmesser von 0,1 bis 10 um besitzen.

10. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Polytetrafluorethylen- Teilchen Homopolymere aus Polytetrafluorethylen sind.

11. Verfahren nach Anspruch 8, wobei nach dem Zusammenbringen die Teilchen in einer faserigen Matrix abgeschieden werden, wo sie festgehalten werden.

12. Verfahren nach Anspruch 11, umfassend die folgenden Stufen:

a) Inkubieren einer Vielzahl von im wesentlichen sphärischen festen Teilchen, umfassend Polytetrafluorethylen mit einem mittleren Durchmesser von 0,1 bis 10 um, mit einer Probe der Flüssigkeit, wodurch das Antigen an die Teilchen gebunden wird unter Bildung eines Antigen-Komplexes auf den Teilchen,

b) Zusammenbringen einer porösen faserförmigen Matrix mit den inkubierten Teilchen, wobei zumindest ein Teil der Teilchen in der Matrix auf mindestens einem Teil der Fasern festgehalten und immobilisiert wird,

c)-Nachweis des Vorhandenseins von Antigen, das an die Teilchen gebunden ist.

13. Verfahren nach Anspruch 8, wobei vor dem Zusammenbringen die Teilchen in einer faserigen Matrix abgeschieden werden, wo sie festgehalten werden.

14. Verfahren nach Anspruch 13, umfassend die folgenden Stufen:

a) Zusammenbringen einer porösen Matrix aus Fasern mit einer Vielzahl von im wesentlichen sphärischen festen Teilchen, umfassend Polytetrafluorethylen mit einem mittleren Durchmesser von 0,1 bis 10 um, wobei die Teilchen innerhalb der Matrix auf den Fasern festgehalten und immobilisiert werden, wodurch das Antigen in der Probe an die Teilchen gebunden wird unter Bildung eines Antigen-Komplexes auf den Teilchen,

b) Zusammenbringen des Antigen-Komplexes mit einer zweiten Substanz, die mit dem Antigen reagieren kann und die markiert ist mit einer Substanz, die in der Lage ist, eine nachweisbare Reaktion in Gegenwart von dem Antigen und einer Indikatorsubstanz hervorzurufen, wodurch die markierte Substanz an den Komplex auf den Teilchen gebunden wird,

c) Entfernen von nicht gebundener markierter Substanz von dem Material,

d) Zusammenbringen des Komplexes mit der Indikatorsubstanz und

e) Nachweis der Reaktion, die auftritt als Funktion des Vorhandenseins oder der Menge an Antigen in der Probe.