DE69929075T2

DE69929075T2 - Biochip mit einer mehrzahl von bereichen zur molekularen erkennung, und dazu geeignete auslesevorrichtung

Info

Publication number: DE69929075T2
Application number: DE69929075T
Authority: DE
Inventors: Michel Ida; Alain Fargeix; François PERRAUT; Alexandre Lagrange
Original assignee: Biomerieux SA; Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Current assignee: Biomerieux SA; Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Priority date: 1998-10-05
Filing date: 1999-10-04
Publication date: 2006-08-17
Anticipated expiration: 2019-10-05
Also published as: JP4588216B2; US6537801B1; DE69929075D1; JP2002526773A; AU772833B2; EP1119769A1; CA2345372A1; ATE313797T1; WO2000020861A1; ES2255298T3; EP1119769B1; FR2784189B3; AU5870699A; FR2784189A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Biochip mit einer Vielzahl von Zonen zur molekularen Erkennung sowie eine Vorrichtung zum Auslesen eines solchen Biochips. Unter Biochip versteht man einen Chip oder einen Träger mit einer oder mehreren Erkennungszonen genannten Zonen, die mit Molekülen versehen sind, die Erkennungseigenschaften aufweisen. In der Folge des Textes wird die Bezeichnung "Biochip" sowohl für biologische als auch – sprachlich unzutreffend – für chemische Analysechips benutzt.
Die Erkennungsmoleküle können zum Beispiel Oligonucleotide, Polynucleotide, Proteine wie etwa Antikörper oder Peptide, Lektine oder jedes andere System des Ligand-Rezeptor-Typs sein. Insbesondere können die Erkennungsmoleküle DNA- oder RNA-Fragmente umfassen.
Wenn der Biochip mit einer zu analysierenden Probe in Kontakt gebracht wird, interagieren die Erkennungsmoleküle zum Beispiel durch Komplexierung oder Hybridisierung mit den sogenannten "Zielmolekülen" der Probe. Indem man also einen Biochip mit einer Vielzahl Erkennungszonen mit verschiedenen Erkennungsmolekülen ausstattet, die selektiv auf unterschiedliche Zielmoleküle ansprechen, ist es möglich, eine große Anzahl verschiedet artiger in der Probe enthaltener Moleküle zu detektieren und eventuell zu quantifizieren. Jede Erkennungszone umfasst einen einzigen Typ identischer Moleküle.
Die auf dem Biochip gebildeten Komplexe können mittels einer Fluoreszenzmarkierung geortet bzw. erkannt werden, angewandt auf die Zielmoleküle des Musters.
Die erfindungsgemäße Auslesevorrichtung dient dazu, die Operation zum Auslesen der in den Erkennungszonen eines Chips vorhandenen markierten oder nichtmarkierten Moleküle zu erleichtern.
Das Auslesen der Erkennungszonen kann nämlich auch ohne Marker erfolgen. Eine solche Technologie ist aus dem Stand der Technik schon bestens bekannt. Unter den direkten Hybridisierungsdetektionsmethoden kann man insbesondere die Detektion der Massenänderung, der Dickenänderung und der Indexänderung unterscheiden. Man kennt auch photothermische Methoden, die in dem Dokument (1) beschrieben werden, dessen Referenz am Ende der vorliegenden Beschreibung angegeben ist. Schließlich haben Boccara et al. in den Dokumenten (2) und (3) eine photothermische Deflexionsmethode beschrieben. Perfektionierungen dieser Technik sind anschließend in dem Dokument (4) erschienen. Die Referenzen dieser Dokumente sind am Ende der vorliegenden Beschreibung angegeben.
Die Anwendungen der Erfindung betreffen also die Gebiete der biologischen und chemischen Analyse.
Spezielle Anwendungen auf dem Gebiet der biologischen Analyse können die Untersuchung von Polymorphismen und Mutationen, die Sequenzierung durch Hybridisierung und die Verfolgung bzw. Fortschreibung der Expression von Genen.
Stand der Technik
Die Anzahl der Erkennungszonen eines Chips ist variabel in Abhängigkeit vom Typ der Analyse, die man durchführen möchte. Man unterscheidet auch sogenannte "niederdichte" Chips mit einigen zehn bis einigen hundert Erkennungszonen und "hochdichte" Chips, die mehrere tausend bis mehrere zehntausend solche Zonen umfassen können.
Die Zonen der hochdichten Chips sind von kleiner Größe. Die Ausdehnung der Zonen liegt unter 100 μm, ja sogar unter 10 μm.
Wie oben angegeben, kann man bei der Ortung von Komplexen, die sich auf einem Biochip gebildet haben, auf fluoreszierende Marker zurückgreifen. Die Marker, zum Beispiel das Fluoreszein oder das Phycoerythrin können direkt auf den Zielmolekülen der zu analysierenden Probe gekoppelt werden. Die Zielmoleküle können auch durch Indirekterkennungsgruppierungen bzw. -gruppen, etwa Biotin oder Digoxigenin (dioxigènine), markiert werden.
Wenn also die Erkennungsmoleküle einer bestimmten Erkennungszone interagiert haben oder sich mit markierten Zielmolekülen hybridisiert haben, ist der fluoreszierende Marker in diesen Zonen fixiert.
Das Auslesen eines Biochips umfasst die Erregung der fluoreszierenden Marker unter der Einwirkung eines auf den Chip gerichteten sogenannten Erregungslichts und für jede Erkennungszone die Aufzeichnung der durch das Erregungslicht verursachen Fluoreszenz.
Die Detektion einer Fluoreszenz in einer Erkennungszone ermöglicht, indem man den in dieser Zone präsenten Erkennungsmolekültyp kennt, auf das Vorhandensein von (markierten) Zielmolekülen in der zu analysierenden Probe zu schließen, die fähig sind, mit dem bekannten Erkennungsmolekül zu interagieren. Eventuell kann die Intensität der Fluoreszenz gemessen werden, um daraus die Konzentration der betreffenden Zielmoleküle der Probe abzuleiten.
Zur Erläuterung dieser Techniken, insbesondere auf den Gebieten der genetischen Biologie, kann auf die Dokumente (6), (7) und (8) verwiesen werden, deren Referenzen am Ende der vorliegenden Beschreibung angegeben sind.
Für niederdichte Biochips kann das Auslesen der Erkennungszonen mit Bildherstellungsstationen erfolgen, die mit CCD-Kameras ausgerüstet sind. Diese Stationen sind jedoch schlecht an die hochdichten Chips angepasst. Die CCD-Kameras müssen nämlich eine beträchtliche Anzahl Detektionspixel aufweisen, und da der Fluoreszenzlichtfluss bei hochdichten Chips besonders schwach ist, müssten die Kameras zusätzlich gekühlt werden, um ihr Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern.
Für die hochdichten Chips greift man aus Fluoreszenzscanner zurück, die ermöglichen, den Chip abzutasten, um sukzessive die Erkennungszonen zu analysieren.
Diese Scanner sind zur Aufzeichnung der Fluoreszenz jeder Zone mit einem konfokalen optischen System ausgerüstet, das einem photoelektrischen Sensor zugeordnet ist. Der Scanner ermöglicht, Objekte mit einer sehr guten räumlichen Auflösung zu beobachten (von 1 bis 10 μm) und das konfokale optische System ermöglicht, sich freizumachen von Störlichtemissionseffekten (Autofluoreszenz, Spiegelung ...).
Zur Erläuterung eines Scanners für hochdichte Chips kann kann auf das Dokument (4) verwiesen werden, dessen Referenz ebenfalls am Ende der vorliegenden Beschreibung angegeben ist.
Die Fluoreszenzscanner liefern elektrische Signale, die man erfasst, um ein zweidimensionales Bild des Biochips zu erzeugen. Die Signale werden auch benützt, um die räumliche Struktur der Oberfläche des Biochips zu erkennen und um die sich dort befindlichen Erkennungszonen zu orten und zu begrenzen.
Schließlich wird die Intensität des Signals für jede Erkennungszone als Analyseresultat aufgezeichnet.
Diese Analyseresultate können anschließend Gegenstand einer entsprechenden Informatikverarbeitung sein, um eine wichtige biologische oder chemische Information zu erhalten.
Indes hat eine solche Signalverarbeitung den Nachteil, für jede Erkennungszone eine große Anzahl Messpunkte oder Pixel zu benötigen.
Die genaue Abgrenzung jeder Erkennungszone macht es nämlich notwendig, für jede Erkennungszone über eine ausreichende Bildpixeldichte zu verfügen.
In der Praxis stellt man fest, dass für eine Signalverarbeitung unter akzeptablen Bedingungen für jede Erkennungszone eine Pixelzahl von ungefähr 36 bis 64 nötig ist, je nach Größe.
Die Signalverarbeitung für hochdichte Biochips erfordert also aufwändige Verarbeitungs- und Speicherungs-Informatikeinrichtungen. Die Verarbeitung ist also teuer.
Außerdem ist die Bildsegmentierung gemäß den Erkennungszonen nicht vollkommen zuverlässig.
Die Dokumente (9) und (10), deren Referenzen am Ende der vorliegenden Beschreibung angegeben sind, beschreiben andere Auslesemöglichkeiten eines Biochips, die ermöglichen, die obigen Schwierigkeiten in einem gewissen Maße zu vermeiden.
Das Dokument (9) sieht vor, auf dem Chip Erkennungs- und Ortungselemente zu platzieren, die ermöglichen, das Auslesen zu erleichtern, und ermöglichen, das Auslesen des Biochips mit Auslesevorrichtungen durchzuführen, etwa mit Kompaktbildplatten (CD-ROM). Vor der Analyse der die zu analysierenden Zielmoleküle enthaltenden Probe werden die molekularen Erkennungszonen des Biochips mit einem reflektierenden Film überzogen, gebildet durch Metallkügelchen, die durch "Brückenmoleküle" an seiner Oberfläche verankert werden. Diese reflektierenden Kügelchen werden funktionalisiert, um auch Zielmoleküle der Probe anhängen zu können. Während der Hybridisierung muss ein selbiges Zielmolekül an zwei Punkten befestigt werden: einerseits an der Oberfläche des Biochips, in den molekularen Erkennungszonen, und andererseits an der Oberfläche eines der Metallkügelchen, das sich über dieser Erkennungszone befindet. Nach der Hybridisierung bricht eine entsprechende chemische Bearbeitung die Brückenmoleküle, welche die Metallkügelchen an der Oberfläche verankern, und die Oberfläche des Biochips wird gespült. Nur die Metallkügelchen, die dann durch eine minimale Anzahl von Zielmolekülen auf der Oberfläche zurückgehalten werden, bleiben präsent und bilden ebenso viele "Bits" der biologischen Information.
Bei der in dem Dokument (9) vorgeschlagenen Verarbeitung ist für die Analyse ein zusätzliche biochemischer Schritt notwendig. Dieser beruht auf der Spaltung der Brückenmoleküle. Zudem wird die Hybridisierung der Zielmoleküle in den Erkennungszonen sehr verzögert durch das Vorhandensein der Metallkugeln, welche die Geschwindigkeit der Diffusion der Zielmoleküle in Richtung der die Erkennungszonen tragenden Oberfläche beträchtlich reduziert. Daraus kann eine sehr langsame Analyse resultieren. Außerdem ist die Relation zwischen der Anzahl der Metallkugeln, die schließlich an der Oberfläche hängen bleiben, und der anfänglichen Konzentration der Zielmoleküle in der Probe, keine Relation, die eine leichte Quantifizierung ermöglicht. Es handelt sich vielmehr um eine Treppenstufen-Relation (relation en marche d'escalier) (über einer Schwelle bleiben die Kugeln nicht hängen; darüber bleiben sie hängen. Der dynamische Bereich, in dem die Anzahl der hängenbleibenden Kugeln dazwischen liegt und in dem folglich eine Quantifizierung möglich ist, ist wahrscheinlich sehr klein).
Nach Dokument (10) ist der Biochip mit Bezugspunkten versehen, die Erkennungszonen zugeordnet sind. Diese Bezugspunkte unterscheiden sich jedoch von den Erkennungsmolekülen und sind physisch von den Erkennungszonen getrennt. Die Bezugspunkte können unabhängig von einer Hybridisierungs- oder Komplexierungsreaktion detektiert werden, während des Abtastens des Biochips.
Sobald die Position der Bezugspunkte bekannt ist, kann man die zwischen der sukzessiven Detektion von zwei Bezugspunkten verstrichene Zeit messen, um eine Funktion zu erstellen, welche die relative Position des Scanners auf dem Biochip verbindet bzw. verknüpft. Diese Funktion kann dazu dienen, den Ort der Erkennungszonen auf dem Biochip genauer zu bestimmen.
Die Benutzung von Bezugspunkten auf dem Biochip ermöglicht definitiv, die Lokalisierung der Messzonen zu verbessern und deren Auslesung zu erleichtern. Diese Funktion kann dazu dienen, den Ort der Erkennungszonen auf dem Biochip genauer zu bestimmen.
Jedoch, um das optische System des Scanners über den Erkennungszonen genau zu führen, sollte die relative Verschiebung des Biochips und/oder des optischen Auslesesystems des Scanners ausreichend fein gesteuert werden.
Diese Steuerung ist nicht allzu schwierig, wenn die Erkennungszonen ausreichend große und von geringer Anzahl sind. Die relative Verschiebung des Biochips und des optischen Systems kann effizient mit mechanischen Einrichtungen erfolgen, die relativ wenig kosten.
Jedoch sind für hochdichte Chips mit Erkennungszonen, die einige μm nicht überschreiten, extrem genaue mechanische Einrichtungen erforderlich, um eine korrekte Abtastung der Erkennungszonen und die Erstellung eines scharten und nicht deformierten Bildes zu garantieren.
Extrem genaue mechanische Einrichtungen sind auch unerlässlich, um eine Abtastung kleindimensionierter Erkennungszonen mit gleichmäßiger Geschwindigkeit zu erzielen, um das erhaltene Bild korrigieren und in Abhängigkeit von der Verschiebung auswerten zu können.
Zur Erläuterung: für einen hochdichten Chip mit zum Beispiel 300 × 300 aneinandergrenzenden Erkennungszonen mit einer Seitenlänge von 20 μm und für eine Abtastung typischen Ausmaßes mit 7 × 7 Punkten bedarf es einer Verschiebungsauflösung von 3 μm, einer Genauigkeit dieser Verschiebung von 1 μm (±0,5 μm) und einer Positionierungswiederholbarkeit von 1 μm (±0,5 μm). Die Verschiebungsgeschwindigkeit muss konstant sein und die Parallelität der Verschiebungen für die Abtastung muss bis auf 0,3 mrad genau gewährleistet sein. Eine billige Mechanik hat diese Eigenschaften nicht.
Außerdem muss man, um das optische System vor der Auslesung des Chips einzustellen, den Chip räumlich ausrichten und mit einer Auflösung von 10 μm, einer Genauigkeit von ungefähr 5 μm und einer Wiederholbarkeit von ungefähr 10 mm verschieben. Diese Eigenschaften gelten für eine Sektionstiefe bzw. Fokustiefe (profondeur de section) des optischen Systems von 100 μm. Die Reduzierung der Sektionstiefe bzw. Fokustiefe auf 10 μm erfordert dann beim Einstellen eine minimale Auflösung von 2,5 μm, eine Genauigkeit von 0,5 μm und eine Wiederholbarkeit von 1 μm.
Die Notwendigkeit genauer mechanischer Einrichtungen macht diese Biochip-Auslesevorrichtungen besonders teuer.
Zudem, da die Oberfläche der Erkennungszonen der hochdichten Biochips klein ist, ist es notwendig, die Biochips langsam abzutasten, um bei jeder Abtastung jeder Erkennungszonen ein ausreichend großes Quantum an Lichtenergie zu sammeln.
Nun macht aber ein langsames Abtasten die Analyse des Biochips zu einem langwierigen Vorgang, wenn dieser eine große Anzahl von Erkennungszonen umfasst.
Das durch Fluoreszenz erzeugte Lichtquantum kann etwas erhöht werden, indem man die Marker der Zielmoleküle mit leistungsstarken Lasern anregt. Jedoch macht die Verwendung solcher Ausrüstungen die Auslesevorrichtung noch teurer.
Der Stand der Technik wird auch in den Dokumenten (11), (12) und (13) illustriert. Das Dokument (11) bezieht sich auf die Detektion und die Quantifizierung von Zellen, aber nicht auf die molekulare Erkennung. Die Dokumente (12) und (12) beschreiben Auslesesysteme mit langsamen Positionierungsmechanismen, bei denen sich das Problem einer "Echtzeit"-Auslesung nicht stellt.
Darstellung der Erfindung
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine Vorrichtung zum Auslesen eines Biochips ohne die oben genannten Schwierigkeiten vorzuschlagen.
Eine Aufgabe ist insbesondere die Realisierung einer kostengünstigen Vorrichtung, die das Auslesen hochdichter Biochips ermöglicht.
Eine andere Aufgabe ist die Realisierung einer Vorrichtung, die ermöglicht, die Chips schneller abzutasten und so die Analysezeit zu reduzieren, ohne die Messqualität zu beeinträchtigen.
Eine weitere Aufgabe ist die Realisierung einer Vorrichtung, die ermöglicht, die Position und Ausrichtung einer Erkennungszone schnell zu finden, ohne eine Überabtastung bzw. Totalabtastung (sur-échantillonnage) des Bilds des Chips.
Noch eine Aufgabe ist die Realisierung eines Biochips, der so an die genannte Auslesevorrichtung angepasst ist, dass die Kosten für die Abtastmechanismen maximal reduziert werden.
Zur Lösung dieser Aufgaben hat die Erfindung eine Echtzeit-Auslesevorrichtung eines Biochips mit einer Vielzahl von Erkennungszonen und einer Vielzahl von optischen Positionierungsbezugselemente zum Gegenstand, wobei die Erkennungszonen DNA- oder RNA-Fragmente enthalten und bezüglich der optischen Positionierungsbezugselemente festgelegte Plätze einnehmen, und die Vorrichtung dabei umfasst:

– einen optischen Kopf, fähig ein einfallendes Licht auf den Biochip zu projizieren,
– Relativverschiebungseinrichtungen des Kopfs und des genannten Biochips, die eine Abtastung des Biochips ermöglichen und makroskopische (großmaßstäbliche) Verschiebungseinrichtungen sowie mikroskopische (kleinmaßstäbliche) Verschiebungseinrichtungen umfassen,
– ein Analysesystem genanntes erstes optisches System, dem optischen Kopf zugeordnet, um ein aus den Erkennungszonen stammendes Licht wenigstens auf einen ersten elektrooptischen Sensor zu projizieren,
– ein Positionierungssystem genanntes zweites optisches System, dem optischen Kopf zugeordnet, um ein von wenigstens einem Positionierungsbezugselement stammendes Licht auf wenigstens einen zweiten elektrooptischen Sensor zu projizieren, und
– Nachführungseinrichtungen der Verschiebungseinrichtungen des genannten optischen Kopfs, um die Verschiebungseinrichtungen in Abhängigkeit von elektrischen Signalen des elektrooptischen Sensors des optischen Positionierungssystems zu steuern, wobei die Nachführungseinrichtungen mit den mikroskopischen Verschiebungseinrichtungen verbunden sind, dadurch gekennzeichnet, dass der optische Kopf eine Fokussierlinse und wenigstens einen Aktor zur axialen und/oder lateralen Fokussierverschiebung der Linse und ein drittes dem optischen Kopf zugeordnetes optisches System zur Projektion eines von der Reflexion des auf dem Biochip einfallenden Lichts stammenden Lichts auf einen dritten elektrooptischen Sensor sowie mit dem Aktor verbundene Nachführungseinrichtungen zur Steuerung der Fokussierverschiebung der Linse umfasst.

In der Folge der Beschreibung wird das von den Erkennungszonen als Reaktion auf das einfallende Licht abgestrahlte Fluoreszenz-, Reflexions-, Diffusitäts- oder Brechungslicht der Einfachheit halber als "von den markierten Molekülen stammendes Licht" bezeichnet.
Die mikroskopischen Verschiebungen werden benutzt, um die Position des optischen Kopfs entsprechend wenigstens drei Achsen zu verfeinern (einer erste Achse, der optischen Achse des ersten optischen Systems entsprechend, sowie zwei zu dieser ersten Achse senkrechten Achsen).
Unter Erkennungszone versteht man hier einen Teil des Biochips, der an seiner Oberfläche Moleküle mit der Fähigkeit aufweist, einen bestimmten Zielmolekültyp zu erkennen.
Die Abtaststeuerung des optischen Kopfs mit den elektrischen Signalen des Positionierungssystems ermöglicht, die Relativverschiebung des Chips und des optischen Kopfs in Echtzeit zu korrigieren, so dass man mit kostengünstigen mechanischen Verschiebungseinrichtungen eine extrem genaue Positionierung erzielen kann. Insbesondere ist es möglich, mechanische Einrichtungen wie etwa Aktoren zu verwenden, wie sie üblicherweise bei Kompaktplatten-Auslesevorrichtungen eingesetzt werden.
Die Steuerung ermöglicht außerdem, hinsichtlich einer kontinuierlichen Auslesung der Fluoreszenz der Erkennungszonen eine Verschiebung mit einer relativ homogenen Geschwindigkeit zu erzielen.
Es empfiehlt sich, zu diesem Thema zu präzisieren, dass das den Steuerungs- bzw. Nachführungseinrichtungen zugeordnete optische Positionierungssystem eine Einrichtung bildet, die das Auslesen des Biochips in Echtzeit ermöglicht. Mit anderen Worten ermöglicht diese Einrichtung, in Echtzeit die Ausleseposition in Bezug auf die Erkennungszonen und/oder die optischen Positionierungsbezugselemente zu kennen.
Zudem ermöglicht die Genauigkeit der durch die Steuerung erlangten Einstellgenauigkeit die Verwendung eines konfokalen optischen Systems mit einer geringen Sektionstiefe bzw. Fokustiefe (profondeur de section), so dass der Einfluss eines von dem Substrat des Biochips stammenden Störlichts reduziert wird. Man kann also eine bessere Signaldynamik realisieren.
Die optischen System der Auslesevorrichtung, dank einer geringen Sektionstiefe bzw. Fokustiefe frei von Störlicht, können mit einer größeren numerischen Apertur realisiert werden und infolgedessen mehr Licht sammeln. Daher ist ein schnelleres Auslesen möglich und/oder die Quelle des einfallenden Lichts kann weniger leistungsstark sein.
Dank der Einstellungssteuereinrichtungen kann das Auslesen der Erkennungszonen kontinuierlich erfolgen, gleichzeitig mit der Einstellung. Diese Eigenschaft gewährleistet außerdem, dass die Ortung auf dem Biochip nicht verloren geht, und ermöglicht, die Genauigkeit der Messungen zu erhöhen, unabhängig von den Abtastbedingungen.
Nach einer vereinfachten speziellen Realisierung der Vorrichtung kann diese ein einziges optisches System enthalten, welches das erste und das zweite optische System umfasst, und wenigstens einen für das erste und das zweite optische System gemeinsamen elektrooptischen Sensor, wobei dieser gemeinsame Sensor nicht nur das Licht empfängt, das von den Erkennungszonen stammt, sondern auch das von den Positionierungsbezugselementen stammende Licht. Der gemeinsame Sensor ist dann mit einem Signalverarbeitungssystem und mit den Abtastungssteuereinrichtungen des optischen Kopfs verbunden.
Bei dieser Realisierung liefert der gemeinsame optische Sensor also Signale, die sowohl zur Analyse der Fluoreszenz als auch zur Steuerung der Relativverschiebung des Chips und des optischen Kopfs dienen (Abtastung).
Die Erfindung betrifft auch einen Biochip mit einer Vielzahl von Erkennungszonen und einer Vielzahl von optischen Positionierungsbezugselementen.
Erfindungskonform überlagern die Erkennungszonen die optischen Positionierungsbezugselemente ganz oder teilweise, so dass sie diese ganz oder teilweise überdecken.
Die den Erkennungszonen zugeordneten optischen Positionierungsbezugselemente umfassen zum Beispiel das Erregungslicht reflektierende Bereiche. Sie ermöglichen, den Biochip auszurichten, die Stellen der Erkennungszonen zu finden und eine genaue Abtastung durchzuführen, unabhängig davon, ob eine Hybridisierung stattgefunden hat oder nicht. Die Positionierungsbezugselemente können sich insbesondere in Form von sogenannten Führungsspuren präsentieren.
Nach einem speziellen Aspekt können die Positionierungsbezugselemente so konzipiert sein, dass sie für das einfallende Ausleselicht eine bestimmte Reflexionskraft aufweisen, die sich von derjenigen der benachbarten Erkennungszonen unterscheidet.
Nach einer speziellen Realisierungsmöglichkeit des Chips kann jeder Erkennungszone ein optisches Bezugselement zugeordnet werden. Es ist also nicht notwendig, ein Bild des ganzen Biochips zu erzeugen, um die Stelle jeder Zone zu kennen.
Die Möglichkeit, die Stellen der Erkennungszonen genau zu bestimmen, ermöglicht, genaue Messungen durchzuführen, ohne Überabtastung bzw. Totalabtastung (sur-échantillonnage) und mit einer reduzierten Anzahl Pixel für jede Erkennungszone.
Außerdem, sobald jede Erkennungszone gefunden ist, ist es möglich, für eine oder mehrere gegebene Zonen eine lokale Analyse durchzuführen, indem man den optischen Kopf oder den Chip verschiebt, um den Kopf in direkte Gegenüberstellung zu der oder den gewünschten Zonen zu bringen.
Es gibt mehrere Möglichkeiten zur Erfassung des von den Erkennungszonen des Chips kommenden Lichts.
Nach einer ersten Möglichkeit kann man den optischen Kopf gegenüber einer Erkennungszone immobilisieren und eine Erfassung des Signals während einer bestimmten Zeit durchführen und dann zu einer nächsten Zone überzugehen.
Wie oben angegeben, ermöglichen die optischen Bezugselemente und die Steuereinrichtungen, den Kopf mit ausreichender Genauigkeit zu positionieren, so dass eine zuverlässige Analyse durchgeführt werden kann. Zudem ermöglichen die optischen Bezugselemente, eine Erkennungszone auch dann noch genau zu lokalisieren, wenn diese kein Fluoreszenzlicht abstrahlt.
Die Signale der Sensoren können auch "fliegend" erfasst werden, indem man den optischen Kopf kontinuierlich längs einer Vielzahl von Erkennungszonen verschiebt, die so Seite an Seite angeordnet sind, dass sie eine geschlossene Überdeckung des aktiven Teils des Biochips bilden, zum Beispiel durch Aneinandergrenzung. In diesem Fall integriert man die Signale, um das empfangene Lichtquantum während der Abtastzeit einer oder mehrerer Erkennungszonen zu bestimmen.
Schwankungen der Verschiebungsgeschwindigkeit können jedoch die Analyse des pro Zeiteinheit durch die Erkennungszonen abgestrahlten Lichtquantums beeinflussen.
So kann man gemäß einer zweiten Analysemöglichkeit die empfangenen Signale in Abhängigkeit von einer Zeit normalisieren, die vergeht, während der optische Kopf aufeinanderfolgende Positionierungsbezugselemente passiert, die den durchlaufenen Erkennungszonen zugeordnet sind.
Gemäß einer dritten Möglichkeit, ebenfalls einer "fliegenden" Erfassung entsprechend, kann man die Relativgeschwindigkeit des optischen Kopfs und des Chips kontinuierlich steuern, indem man die Zeit misst, während der der optische Kopf aufeinanderfolgende Bezugselemente passiert.
Die Erfindung betrifft auch einen Biochip, der durch eine wie oben beschriebene Vorrichtung ausgelesen werden kann und bei dem die molekularen Erkennungszonen den Positionierungsbezugselementen ganz oder teilweise überlagert sind, so dass sie diese ganz oder teilweise überdecken.
Diese Eigenschaft ist besonders vorteilhaft, denn sie vermeidet eine "Vereinnahmung" der Oberfläche des Biochips durch die Positionierungsbezugselemente. Sie ermöglicht nämlich, dass ein größerer Teil, ja sogar die Gesamtheit der Oberfläche des Chips für die molekularen Erkennungszonen zur Verfügung steht.
Die Positionierungsbezugselemente ermöglichen, den Biochip auszurichten, aber auch die Erkennungszonen zu finden und zu identifizieren. Zu diesem Zweck nehmen diese vorzugsweise in Bezug auf die Positionierungsbezugselemente festgelegte Stellen ein.
Es genügen sehr feine bzw. dünne Positionierungsbezugselemente, um den Biochip zu positionieren und/oder die Erkennungszonen zu identifizieren.
Es hat sich jedoch gezeigt, dass man eine gute Genauigkeit nur mit Positionierungsbezugselementen erzielt, deren Oberfläche nicht vernachlässigbar ist gegenüber derjenigen der Erkennungszonen, denen sie zugeordnet sind.
Die Eigenschaft, entsprechend der die Positionierungsbezugselemente von Erkennungszonen ganz oder teilweise überlappt werden, ermöglicht, ihre Oberfläche zu vergrößern und so die Steuerung der Positionierung des Biochips in Bezug auf die Auslesevorrichtung zu verbessern. Auch die Auslesegenauigkeit nimmt zu.
Wenn die Positionierungsbezugselemente sich in Form von Führungsspuren präsentieren, die dazu bestimmt sind, zur Positionierungssteuerung ein einfallendes kohärentes Strahlungsbündel zu führen, empfiehlt sich, eine der Breite des Strahlungsbündels entsprechende Breite der Spur vorzusehen.
Eine sehr genaue Ortung der Spur erzielt man mit Positionierungsbezugselementen, deren Fläche 30 bis 100 % der Gesamtfläche des Chips einnimmt.
Aufgrund der Herstellungskosten der Biochips in Bezug auf ihre Nutzfläche ist die Überlappung der Positionierungsbezugselemente zudem wirtschaftlich von Vorteil.
Außerdem erleichtert die Zunahme der Fläche der Positionierungsbezugselemente das Auslesen und ermöglicht, Auslesevorrichtungen mit einer geringeren Lichtleistung und einer geringeren Empfindlichkeit zu verwenden.
Dies reduziert dann ebenfalls die Kosten der Auslesevorrichtungen.
Schließlich reduziert die Möglichkeit, für die Positionierung eine schwächere Lichtquelle zu benutzen, das Risiko, die auf den molekularen Erkennungszonen vorgesehenen fluoreszierenden Marker zu hemmen oder zu verbrennen.
Außerdem können die Positionierungsbezugselemente so konzipiert sein, dass sie im Wesentlichen transparent für wenigstens ein Fluoreszenzlicht sind, das von den Erkennungszonen abgestrahlt wird als Reaktion auf wenigstens ein einfallendes Ausleselicht.
Wenn der Laserstrahl von der Rückseite her ausliest, kann die Reflexionskraft der Positionierungsbezugselemente und/oder einer Grenzfläche zwischen dem in den Erkennungszonen angebrachten Garniturmaterial und den Positionierungsbezugselementen so gewählt werden, dass sie höher als 0 % ist und vorzugsweise zwischen 1 und 10 % und noch genauer zwischen 1 und 5 % enthalten ist.
Wenn der Laserstrahl von der Vorderseite her ausliest, kann die Reflexionskraft der Positionierungsbezugselemente und/oder einer Grenzfläche zwischen dem in den Erkennungszonen angebrachten Garniturmaterial und den Positionierungsbezugselementen so gewählt werden, dass sie höher als 0 % ist, also zwischen 1 und 100 % enthalten ist.
Unter Vorderseite und Rückseite des Biochips versteht man jeweils die in den Erkennungszonen mit den Erkennungsmolekülen versehene Seite (Vorderseite) und die entgegengesetzte, freie Seite (Rückseite).
Außerdem kann der Biochip zwischen den Positionierungsbezugselementen und den Erkennungszonen eine Zwischenschicht aus einem Material umfassen, dessen Reflexionskraft sich von derjenigen der Positionierungsbezugselemente unterscheidet. Diese Zwischenschicht ermöglicht dann, eine bestimmte Reflexion des einfallenden Lichts auf den Positionierungsbezugselementen zu erzielen, unabhängig von der Garnitur der molekularen Erkennungszonen und unabhängig von dem flüssigen oder gasförmigen Medium, mit dem der Biochip in Kontakt gebracht wird.
Bei der Realisierung der Positionierungsbezugselemente gibt es verschiedene Möglichkeiten. Insbesondere können sie eine Folge von Bereichen umfassen, die abwechselnd unterschiedliche Eigenschaften bezüglich des einfallenden Lichts haben.
Nach einer ersten Möglichkeit können benachbarte Bereiche der Positionierungsbezugselemente jeweils unterschiedliche optische Wege für das einfallende Licht aufweisen. Den Unterschied bei den optischen Wegen kann man insbesondere erzielen, indem man benachbarte Bereiche aus unterschiedlichen Materialien und/oder mit unterschiedlichen Dicken und/oder mit unterschiedlichen Dotierungen realisiert. Die Wahl unterschiedlicher Materialien oder Dotierungen verleiht ihnen unterschiedliche Brechzahlen.
Nach einer anderen Realisierungsmöglichkeit der Positionierungsbezugselemente können diese Bereiche aus doppelbrechendem Material umfassen, welche die Polarisationsorientierung eines einfallenden polarisierten Ausleselicht modifizieren können.
Eine weitere Realisierungsmöglichkeit besteht darin, benachbarte Bereiche der Positionierungsbezugselemente aus Materialien mit jeweils unterschiedlichen Reflexionseigenschaften herzustellen.
Weitere Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung gehen besser aus der nachfolgenden Beschreibung hervor, die sich auf die beigefügten Figuren bezieht. Diese Beschreibung ist nur erläuternd und nicht einschränkend.
Kurzbeschreibung der Figuren
Die 1 ist eine vereinfachte schematische Darstellung einer erfindungskonformen Auslesevorrichtung.
Die 2 ist eine spezielle schematische Darstellung eines Details der 1.
Die 3 ist eine schematische und vereinfachte Draufsicht eines erfindungskonformen Biochips, der mit der Vorrichtung der 1 ausgelesen werden kann.
Die 4 ist eine schematische und vereinfachte Draufsicht eines erfindungskonformen Biochips, der ein Beispiel einer Auslesesequenz eines solchen Chips darstellt.
Die 5 bis 9 sind vereinfachte schematische Schnitte von Teilen von erfindungskonformen Biochips, die andere Realisierungsmöglichkeiten illustrieren.
Detaillierte Beschreibung von Ausführungsarten der Erfindung
Das Bezugszeichen 10 der 1 bezeichnet einen Biochip, der eine Vielzahl mit spezifischen Erkennungsmolekülen ausgestatteter Erkennungszonen umfasst und eventuell Führungsspuren und/oder den Erkennungszonen zugeordnete optische Positionierungsbezugselemente. Die Letzteren sind in der 1 aus Gründen der Vereinfachung nicht dargestellt und werden weiter unten im Detail beschrieben.
In dem beschriebenen Beispiel sind die spezifischen Erkennungsmoleküle durch fluoreszierende Gruppierungen bzw. Gruppen markiert, die aber durch das Licht reflektierende, streuende oder beugende Gruppierungen bzw. Gruppen ersetzt werden können, ohne den Rahmen der Erfindung zu verlassen.
Der Chip ist vor einer Auslesevorrichtung 12 angeordnet. Diese Vorrichtung ist dazu bestimmt, die Erkennungszonen abzutasten, um fluoreszierende Marker tragende Moleküle zu erregen, die in den Erkennungszonen befestigt sind, und um ein durch diese Moleküle erzeugtes fluoreszierendes Licht aufzuzeichnen.
Das Abtasten der Erkennungszonen erfolgt durch eine Relativverschiebung zwischen der Auslesevorrichtung 12, oder einem Teil von dieser, und dem Biochip 10.
In dem Beispiel der 1 erzielt man die makroskopische Relativverschiebung mit Hilfe von Aktoren 14, zum Beispiel Aktoren mit Motoren, die den Biochip 10 verschieben. Eine mikroskopische Verschiebung der Linse 22 realisiert man mittels eines elektromagnetischen Aktors 24. Der rechteckige Biochip wird in einer Ebene verschoben, die senkrecht ist zu einer optischen Achse Ω der Auslesevorrichtung.
Diese Ebene ist auch zu der Ebene der Figur senkrecht.
Die Verschiebung kann in zwei in der Figur angegebenen, zueinander senkrechten Richtungen x und y stattfinden.
Die Auslesevorrichtung 12 umfasst einen optischen Kopf 20 mit einer Fokussierlinse 22 mit einer optischen Achse Ω. Die Linse des optischen Kopfs hat eine doppelte Funktion, nämlich ein Erregungslicht auf den Biochip zu richten sowie ein als Reaktion auf das Erregungslicht von dem Biochip abgestrahltes Fluoreszenzlicht zu sammeln.
Das Erregungslicht ist ein monochromatisches Licht mit einer ersten Wellenlänge, zum Beispiel der Größenordnung 633 nm. Es wird durch einen Laser 30 geliefert, dessen Strahl durch einen dichroitischen Spiegel 32 auf den optischen Kopf gerichtet wird. Die Fokussierlinse 22 dient der Fokussierung des Strahls auf die Biochip-Rückseite 18, aktive Seite genannt.
Der dichroitische Spiegel 32 reflektiert 80 bis 95 % des Laserlichts auf die Fokussierlinse. Die restlichen 5 bis 20 % durchqueren den Spiegel 32 und werden von einem "Bezugssensor" genannten elektrooptischen Sensor 33 gesammelt.
Der Bezugssensor 33 ermöglicht, die zeitlichen Schwankungen der Intensität des durch den Laser 30 emittierten Strahls zu messen. Diese Messung wird bei der Analyse der durch den Biochip abgestrahlten Fluoreszenz berücksichtigt, um die Analyse freizumachen von den durch den Laser verursachten Intensitätsänderungen.
Ein erstes optisches Analysesystem 40 ist dem optischen Kopf zugeordnet und auf die optischen Achse Ω ausgerichtet, um ein Fluoreszenzlicht, erzeugt durch eventuell auf dem Biochip vorhandene erregte markierte Moleküle auf einen (oder mehrere) elektrooptischen Sensor(en) 42 zu projizieren, der in der Folge des Textes Analysesensor genannt wird.
Noch genauer wird das Fluoreszenzlicht durch die Fokussierlinse 22 des optischen Kopfs 20 zu einem Strahl geformt. Dieser Strahl durchquert den dichroitischen Spiegel 32, dann eine Konvergenzlinse 44, die ihn auf ein Diaphragma 46 konvergiert. Das Diaphragma kann in der Praxis ein kleines Loch in einem opaken Schirm sein. Es ermöglicht ein räumliches Filtern entsprechend der optischen Achse Ω und verleiht dem optischen System einen konfokalen Charakter.
Das mit dem punktförmig beleuchteten Objekt konjugierte Diaphragma lässt nur das aus der beleuchteten Zone stammende Licht (Erregungslicht) passieren, in einer dünnen "Scheibe", vergleichbar mit einer Objektebene. Der Vorteil eines konfokalen Systems ist evident, insbesondere zum Auslesen von DNA-Chips. Die Möglichkeit, eine "Scheibe" des Objektraums zu definieren, wird benutzt, um eine interessierende Ebene, die die Molekularerkennungszonen enthält, vom übrigen Chip zu isolieren (Glasträger, Puffer (tampons)). Das empfangene Licht ist also frei von Störlicht, das von eventuellen kolorierten Zentren des Trägers stammt, und frei von einem leuchtenden kontinuierlichen Hintergrund.
Das Fluoreszenzphänomen der fluoreszierenden Marker, enthalten auf den in den Erkennungszonen zurückgehaltenen Zielmolekülen, drückt sich durch eine Umwandlung des Erregungslichts in ein Licht aus, dessen Wellenlänge größer ist als die des Erregungslichts.
Die Wellenlänge des Fluoreszenzlichts beträgt in dem beschriebenen Beispiel zum Beispiel 670 nm.
Ein Interferenzfilter 48 ist zwischen der Fokussierlinse 22 des optischen Kopfs und der Konvergenzlinse 44 angeordnet. Er ermöglicht, in dem durch das optische Analysesystem empfangenen Licht ein Spektralband zu isolieren, das im Wesentlichen dem Fluoreszenzspektralband entspricht. Derart werden die Störlichter noch mehr eliminiert.
Das Bezugszeichen 50 bezeichnet eine Verarbeitungseinheit der durch den Analysesensor 42 gelieferten Signale. In dem beschriebenen Beispiel ist der Analysesensor 42 ein Fotovervielfacher-Sensor, der ein analoges Signal liefert, das proportional ist zu der Intensität des empfangenen Fluoreszenzlichts.
Das Signal des Analysesensors kann während einer Zeitdauer integriert werden, in welcher der optische Kopf das Licht einer bestimmten Erkennungszone empfängt. Wie oben erwähnt, kann das Signal auch in einem "fliegenden" Messverfahren während einer Abtastung des Chips aufgezeichnet werden. Das Signal kann auch digitalisiert werden, um es entsprechend Algorithmen zu verarbeiten, die an die Art der durchgeführten Analyse angepasst sind.
Die Verarbeitungseinheit 50 erhält auch ein Bezugssignal von dem Bezugssensor 33. Die Berücksichtigung des Bezugssignals ermöglicht, die durch den Analysesensor gelieferten Signale, die – wie schon erwähnt – von Schwankungen der Intensität des Lasers befreit sind, zu normalisieren.
Der einem Teilerwürfel 34 zugeordnete dichroitische Spiegel 32 ermöglicht, das von einer Reflexion, einer Beugung oder Brechung oder einer Diffusität des auf den Chip einfallenden Laserlichts stammende Licht auf ein zweites optisches System zu lenken. Dieses reflektierte Licht kommt zum Beispiel von den Führungsspuren und/oder den Positionierungsbezugselementen, die auf dem Biochip vorhanden sind. Falls der Biochip keine Führungsspuren umfasst, kann er auf einer Platte abgeschieden werden, die Führungsspuren umfasst.
Das zweite optische System 60, Positionierungssystem genannt, umfasst eine Linse 64, die ermöglicht, das Licht zu fokussieren, das von wenigstens einem elektrooptischen Sensor 62 empfangen wird, etwa von Vierquadranten- oder Multiquadrantendetektoren, die einem astigmatischen optischen Analysesystem des Strahls zugeordnet sind. Der elektrooptische Sensor 62 kann auch eine CCD-Anordnung oder einen differentiellen Photowiderstand oder irgend ein Positionierungsmesssystem umfassen.
Der elektrooptische Sensor des Positionierungssystems ist mit einer Einheit 70 verbunden, Steuerungseinheit genannt. Diese Steuerungseinheit ermöglicht zum Beispiel, die Signale des Sensors zu decodieren, um zu detektieren, wenn der optische Kopf ein Positionierungsbezugselement passiert, die Anzahl der passierten Positionierungsbezugselemente zu zählen und die Abtastverschiebung zu steuern, um einer Serie von Positionierungsbezugselementen zu folgen, die einer Serie von Erkennungszonen entsprechen. Zu diesem Zweck ist die Steuerungseinheit 70 mit den Aktoren 14 und/oder 24 verbunden, um die Bewegungen des Biochips und/oder der Linse 22 zu steuern. Sie ermöglicht auch, den optischen Kopf dynamisch längs einer Abtaststrecke zu bewegen, vorgeschrieben durch auf dem Biochip angeordnete Positionierungsbezugselemente.
Die Aktoren können zum Beispiel so gesteuert werden, dass die Intensität des durch den Sensor des optischen Positionierungssystems empfangenen Lichts innerhalb eines festgelegten Bereichs bleibt. Der Betriebspunkt entspricht einem Gleichgewichtszustand. Man gibt einen Positionssollwert vor und das Steuerungssystem hält diesen Sollwert aufrecht. Man versucht zum Beispiel zu realisieren, dass die Verteilung der Lichtintensität auf dem Multiquadrantendetektor immer dieselbe ist.
Ein zweiter Teilerwürfel 36, angeordnet in dem zweiten optischen System, ermöglicht, einen Teil des Lichts dieses optischen Systems auf ein drittes optisches System 80 zu lenken, Einstellsystem genannt.
Das optische Einstellsystem 80 umfasst eine Linse 84 zur Fokussierung des von einem elektrooptischen Sensor 82 empfangenen Lichts, der einem astigmatischen optischen Analysesystem des Strahls oder einer CCD-Anordnung oder einem differentiellen Photowiderstand oder irgend einem Positionsmesssystem zugeordnet ist.
Das auf den Sensor des optischen Einstellsystem gelenkte Licht stammt von einer Reflexion des Laserlichts auf dem Biochip. Es kann insbesondere von Positionierungsbezugselementen oder einer Glas-Reflexion auf der aktiven Seite des Biochips stammen.
Der Sensor 82 des optischen Einstellsystems 80 ist auch mit einer Steuerungseinheit 70 verbunden. Diese Einheit dient der Steuerung eines Aktors 24 der Linse 22 des optischen Kopfs 20. Der Aktor 24 ermöglicht, die Linse 22 längs der Achse Ω zu verschieben, um die Einstellung des optischen Systems auf den Biochip oder – noch genauer – auf bestimmte Teile des Biochips, kontinuierlich zu korrigieren.
Die Steuerungseinheit kann zum Beispiel so konzipiert sein, dass sie die Linse 22 des optischen Kopfes derart verschiebt, dass die Fläche eines Fokussierungsspots auf dem Sensor des Einstellsystems kontrolliert bzw. gesteuert wird in Bezug auf die Fläche (Form und/oder Position) eines Bezugsspots (zum Beispiel rund).
Gemäß einer vereinfachten Realisierungsart kann der elektrooptische Sensor des ersten optischen Systems 40, das heißt des optischen Analysesystems, sowohl zur Lieferung von Signalen dienen, die dem von den Erkennungszonen stammenden Licht entsprechen, als auch von Signalen, die dem durch die Führungsspuren und/oder die Positionierungsbezugselemente reflektierten oder gestreuten Licht entsprechen.
In diesem Fall ist der Sensor nicht nur mit der Signalverarbeitungseinheit 50 verbunden, sondern auch – wie in der 1 mit gestrichelter Linie dargestellt –, mit der Steuerungseinheit 70, um die Relativverschiebung zwischen Chip und optischem Kopf zu steuern und eventuell die Linse des optischen Kopfs einzustellen.
Bei dieser Realisierungsart enthält die Auslesevorrichtung ein einziges optisches System, das auf funktionelle Weise das erste und zweite (und eventuell dritte) optische System umfasst.
Die 2 zeigt eine spezielle Realisierung des optischen Analysesystems.
Aus Gründen der Vereinfachung stellt die 2 nur ein Detail der Vorrichtung dar, wobei die anderen Bauteile mit den in Bezug auf die 1 beschriebenen identisch sind.
Das optische Analysesystem 40 der 2 umfasst einen Interferenzfilter 48 sowie ein Fokussierobjektiv 44a, das der Fokussierung eines von dem optischen Kopf 20 empfangenen Fluoreszenzlichtstrahls auf ein erstes Ende einer optischen Faser 47 dient.
Das zweite Ende der optischen Faser 47 ist mit einem elektrooptischen Sensor 42 für einen Photovervielfacher oder einer Avalanchephotodiode verbunden. Die optische Faser 47 (schwach mehrmodenartig) spielt die Rolle des konfokalen Diaphragmas 46 der 1.
Die optischen Analysesysteme der 1 und 2 sind, wie schon oben erwähnt, konfokale Systeme.
Die hauptsächlichen Eigenschaften eines konfokalen Systems sind seine hohe räumliche Auflösung und seine hohe axiale Auflösung. Die axiale Auflösung drückt die Fähigkeit des Systems aus, ein sehr kleines Beobachtungsvolumen um die Fokussierebene herum zu isolieren, das heißt, Störlichter von außerhalb dieses Volumens zu eliminieren. Sie wird durch eine Pds genannte "Sektionstiefe" bzw. "Fokustiefe" ("profondeur de section") des Systems charakterisiert.
Die Sektions- bzw. Fokustiefe Pds, schon oben erwähnt, kann man durch folgende Formel ausdrücken:
wo λ die Wellenlänge ist, ausgedrückt in μm, und u der Halbwinkel des numerischen Apertur-Kegels des optischen Systems ist.
Die für das optische Analysesystem verwendeten Linsen haben numerische Aperturen der Größenordnung 0,4 bis 0,5. Man kann also Sektions- bzw. Fokaltiefen der Größenordnung 1,8 bis 2,8 μm erzielen. Zudem werden 16 bis 22 % des durch den Biochip abgestrahlten Lichtflusses durch die Linse gesammelt.
In der Folge wird nun ein Realisierungsbeispiel eines an die Auslesevorrichtung angepassten Biochips beschrieben.
Die 3 zeigt einen solchen Biochip. Der Biochip 10 umfasst einen Träger 100 mit Erkennungszonen 110. Die Zonen 110 fallen zum Beispiel mit Elektroden zusammen, die an der Oberfläche des Trägers ausgebildet sind. Diese Elektroden werden selektiv mit einem Überzug bzw. einer Garnitur versehen, der bzw. die mit einer bestimmten chemischen oder biologischen Verbindung interagieren kann. Wie im Einführungsteil der Beschreibung erwähnt, kann diese Garnitur insbesondere Erkennungsmoleküle umfassen, die sich für eine Hybridisierung mit Zielmolekülen eignen.
Die verschiedenen Erkennungszonen 110 sind jeweils mit unterschiedlichen, für bestimmte Zielmoleküle spezifischen Erkennungsmolekülen garniert.
Jede Erkennungszone umfasst einen einzigen Typ identischer Moleküle. Die Moleküle einer selben Zone unterscheiden sich vorzugsweise von den Molekülen aller anderen Zonen.
Man sieht, dass die rechteckigen Erkennungszonen 110 zeilen- und spaltenförmig angeordnet sind. Jedoch sind auch andere Aufteilungsmuster der Substratoberfläche möglich, zum Beispiel kreisförmige.
Der Biochip 10 umfasst auch ein Gitter 120, gebildet durch Positionierungsbezugselemente, die den Erkennungszonen zugeordnet sind. In dem dargestellten Beispiel umfasst dieses Gitter Führungsspuren 122 in Form von geradlinigen Streifen, die sich jeweils zwischen den aufeinanderfolgenden Zeilen der Erkennungszonen erstrecken.
Die Führungsspuren sind reflektierende oder partiell reflektierende, fluoreszierende oder diffuse bzw. streuende Spuren, fähig einen Teil des Erregungslichts zu der Vorrichtung zurückzusenden. Sie können auch phasenverschiebend sein, das heißt bei der Ausbreitung der Retourwelle eine Strahlengangdifferenz erzeugen. Das zu der Vorrichtung zurückgesendete Erregungslicht wird durch das zweite und eventuell dritte optische System analysiert, um die Zeilen von Erkennungszonen zu orten und zu lokalisieren und das Abtasten des Biochips zu ermöglichen. Die reflektierenden Spuren können auch eine strukturierte Oberfläche haben, mit phasenverschiebenden Ätzungen, fähig Interferenzfiguren zu bilden oder in das Erregungslicht eine Phasenverschiebung einzuführen. Diese Interferenz- oder Phasenverschiebungsfiguren, empfangen durch das optische Positionierungssystem der Auslesevorrichtung, können auch zur Ortung oder Steuerung der Abtastung dienen.
Die Positionierungsbezugselemente umfassen auch optische Bereiche 124, Codierer genannt.
Die Codierer 124 befinden sich vorzugsweise auf den Führungsspuren 122, am Anfang und Ende jeder Erkennungszone gemäß einer der Größe dieser Zonen entsprechenden Teilung.
Bei einer speziellen Realisierung können die Codierer so beschaffen sein, dass sie das Licht schwach reflektieren.
Die Codierer sind zum Beispiel Bereiche, die einer Unterbrechung des reflektierenden Materials oder einer Unterbrechung der strukturierten Oberfläche der Führungsspuren 122 entsprechen.
Gemäß einer anderen Möglichkeit können die Spuren schwach reflektierend sein und sich längs von Erkennungszonenreihen erstrecken. Sie umfassen zum Beispiel nicht reflektierende Bereiche (oder Codierer).
Man betrachtet eine Oberfläche als schwach reflektierend, wenn der Prozentsatz des reflektierten Lichts unter 50 % liegt und vorzugsweise unter 5 %.
Nach einer Variante kann der Chip auch nur mit Führungsspuren versehen sein, die zum Beispiel reflektierende Bereiche sind.
Die Zuordnung von Codierern oder – allgemeiner – Positionierungsbezugselementen ermöglicht eine besonders schnelle und genaue Lokalisierung jeder einzelnen Erkennungszone.
Jedoch ist es auch möglich, einer Gruppe von Erkennungszonen ein einzige Bezugselement zuzuordnen; zum Beispiel ein Bezugselement für jede Erkennungszonenzeile oder -spalte.
Bei der Herstellung der Bezugselemente greift man auf klassische Techniken der Mikroelektronik zurück. Sie umfasst zum Beispiel eine Abscheidung einer reflektierenden Schicht aus Metall, zum Beispiel aus Aluminium, Nickel oder Chrom, über die gesamte Oberfläche, und die photolithographische Ausbildung eines Musters in dieser Schicht entsprechend den gewünschten Positionierungsbezugselementen.
Die Metallschicht kann zum Beispiel mittels eines chemischen Flüssigphasen-Ätzverfahren oder einem Gasphasen-Plasmaätzverfahren entsprechend einem Ätzmuster geätzt werden, das durch eine Resist-Ätzmaske festgelegt wird.
Nach der Ätzung und der Eliminierung des Resists kann auf dem Träger eine dünne Siliciumdioxidschicht gebildet werden, um die Kompatibilität der Oberfläche für das Pfropfen von biologischen Molekülen zu verbessern.
Präzisiert sei, dass die Erkennungszonen nicht unbedingt benachbart sein müssen und die Positionierungsbezugselemente sich nicht unbedingt am Rand der Erkennungszonen befinden müssen.
Nach einer nicht dargestellten Konfiguration können Positionierungsbezugselemente sich im Innern der Erkennungszonen befinden.
Eine solche Konfiguration stört nicht, wenn das von den Erkennungszonen stammende Licht ein Fluoreszenzlicht ist: die Unterscheidung zwischen dem Fluoreszenzlicht und dem durch die Erkennungszonen reflektierten Licht erfolgt auf der Basis der unterschiedlichen Wellenlängen dieser beiden Lichter.
Im Falle einer Detektion von nicht-fluoreszierenden aber zum Beispiel streuenden oder beugenden Molekülen kann die Unterscheidung durch eine Frequenzcodierung der Signale erfolgen oder durch eine Messung unter einem anderen Winkel als dem für die Positionssteuerungen benutzten.
Nach der Realisierung der Positionierungsbezugselemente können die Erkennungszonen mit den Erkennungsmolekülen garniert werden. Die Synthese dieser Moleküle und ihre Befestigung in den Erkennungszonen finden gemäß an sich bekannten photolithographischen Synthesetechniken statt.
Man kann feststellen, dass die Oberfläche des Biochips nicht vollkommen eben ist. An den reflektierenden Bereichen der Positionierungsbezugselemente weist sie eine Überdicke von 50 nm bis 200 nm auf.
Solche Dickenunterschiede sind gering im Verhältnis zu den Sektions- bzw. Fokustiefe des vorgeschlagenen optischen Analysesystems.
Die Realisierung der Positionierungsbezugselemente und der Synthese der Erkennungsmoleküle sind Operationen, die auf einer Glas- oder Siliciumplatte (Wafer) für eine Vielzahl von Biochips kollektiv stattfinden können. Diese Platte wird anschließend zertrennt, um die einzelnen Biochips zu erhalten.
Die 4 stellt ebenfalls einen Biochip 10 dar, mit Führungsspuren 122 und optischen Positionierungsbezugselementen in Form von Codierern 124a aus einem reflektierenden Material (zum Beispiel Cr), angeordnet längs der Spuren 122.
Auf der Oberfläche des Chips sieht man eine Vielzahl von gestrichelt dargestellten quadratischen Erkennungszonen oder Zellen 110. Jede Erkennungszone wird von vier Führungsspuren durchquert.
In der 4 sind die sukzessiven Positionen eines Erregungslichtspots schematisch durch strichpunktierte Kreise dargestellt. Die Positionen tragen die Bezugsbuchstaben A bis G.
Die Verschiebungseinrichtungen des Chips (Aktoren) sind so, dass man die Bewegung des Lichtspots zerlegen kann in eine Bewegung entsprechend einer ersten Achse x, schnelle Achse genannt, und entsprechend einer zweiten Achse y, langsame Achse genannt.
Ein Beispiel eines Ausleseverfahrens eines Biochips liefert die Tabelle I, die in Verbindung mit den Bezugsbuchstaben zur Positionsangabe des Lichtspots in der 4 gelesen werden muss.
Die nachfolgende Tabelle I gibt insbesondere für jede Position die ausgeführte Bewegung an und präzisiert die Aktivierung der Einstellungs-, Positionierungs- und Auslesefunktionen (Analyse).
TABELLE 1
Die Angaben "Spur 1", "Spur 2" geben in Reihenfolge die Spuren 122 in der y-Richtung an, ausgehend von der Unterseite der Figur, und die Angaben "Zelle Nr.1 ", "Zelle Nr.2" geben die in der x-Richtung aufeinanderfolgenden Erkennungszonen, ausgehend von der linken Seite der Figur.
Die Bezugszeichen 152, 154 in den Figuren deuten ein Signal an, das erzeugt werden könnte durch einen Sensor des Positionierungssystems bei einer Abtastung des Spots oberhalb der Codierer 124a jeweils gemäß der x- und y-Achse.
Die 5 ist eine schematische Schnittdarstellung eines Biochipteils, bei dem die Bezugszeichen 201 und 202 jeweils Seiten eines Substrats 200 bezeichnen, die aus Gründen der Vereinfachung Vorder- und Rückseite genannt werden.
Das Substrat 200 ist aus einem für das einfallende Ausleselicht durchlässigen Material, zum Beispiel aus Glas. Es ist auf seiner Vorderseite 201 mit einer ersten Schicht 220 überzogen.
Die erste Schicht 220 umfasst abwechselnd aneinandergrenzende Bereiche 221 und 222, jeweils aus einem ersten Material und einem zweiten Material. Das erste Material, zum Beispiel Siliciumnitrid, hat eine erste Reflexionskraft für das einfallende Licht, und zweite Material, zum Beispiel Siliciumoxid, hat eine zweite Reflexionskraft für das einfallende Licht, die sich von der ersten Reflextionskraft unterscheidet. Der Unterschied zwischen der ersten und der zweiten Reflexionskraft beträgt ungefähr 1 bis 5 %, zum Beispiel 2 %.
Die Bereiche 221 und 222 der ersten Schicht können eine Führungsspur bilden und sind Positionierungsbezugselemente.
Eine zweite Schicht 210 ist eine funktionelle Schicht, die Reagenzien umfasst und die Erkennungszonen bildet. Zu diesem Thema kann man sich auf die vorhergehende Beschreibung beziehen.
Bei dieser Realisierungsart wie auch bei den anderen Realisierungsarten der 6 bis 9 sind die Bereiche 221 und 222 im Wesentlichen transparent, das heißt, dass die einfallenden Strahlen sie durchqueren und dass diese Letzteren ein Auslesen der Erkennungszonen ermöglichen. Die Bereiche 221 und 222 sind von Erkennungszonen und Positionierungsbezugselementen überlagert, die selbst im Wesentlichen transparent sind.
Die Schicht 210 kann direkt auf der ersten Schicht oder – vorzugsweise – auf einer Befestigungsschicht 211 gebildet werden, die dazu dient, die Erkennungsmoleküle zu fixieren.
Die Erkennungsmoleküle werden unter chemischen oder biologischen Verbindungen wie etwa DNA-Sonden, Antikörpern oder Antigenen ausgewählt.
Die Verwendung eines transparenten Trägers 200 ermöglicht, das Ausleselicht von der Rückseite 202 einfallen zu lassen, was den Kontakt der Vorderseite mit einem zu analysierenden Medium erleichtert. In den Bereichen 221, 222 reflektierte Strahlen sind in Form von Pfeilen dargestellt.
Die 6 zeigt eine andere Realisierungsmöglichkeit, die eine Variante in Bezug auf die 5 darstellt.
Auf dem Träger 200 wird eine Siliciumnitridschicht abgeschieden und so geätzt, dass sich voneinander beabstandete erste Zonen 221 bilden. Anschließend wir eine Siliciumoxidschicht 224 so abgeschieden, dass die ersten Bereiche 221 umgeben und überdeckt werden. Die Siliciumoxidschicht umfasst dann zweite Bereiche 222, die sich mit den ersten Bereichen 221 abwechseln und eine andere Reflexionskraft als diese aufweisen.
Die Siliciumoxidschicht 224 wird mit einer funktionellen Schicht 210 überzogen.
Eine andere Realisierungsmöglichkeit der Positionierungsbezugselemente des Biochips ist in der 7 dargestellt.
In dieser Figur ist der Träger 200, aus Glas, von der Vorderseite 210 her lokal so dotiert worden, dass sich voneinander beabstandete Bereiche 223 bilden.
Die dotierten Bereiche 223 wechseln sich also ab mit vorsätzlich nicht-dotierten oder mit einer anderen Konzentration dotierten Bereichen.
Der Dotierungsunterschied zwischen den Bereichen 223 und dem übrigen Substrat bewirkt eine Indexdifferenz und folglich eine Strahlengangdifferenz zwischen den einfallenden Lichtstrahlen, je nach Dotierungszustand des jeweiligen Bereichs.
Die Strahlengangdifferenz, proportional zu der Indexdifferenz zwischen den dotierten und den nicht-dotierten Bereichen, führt bei den einfallenden Strahlen zu einer Phasenverschiebung. Diese Phasenverschiebung erzeugt einen Phasenkontrast zwischen den verschiedenen dotierten und nicht-dotierten Bereichen. Dieser kann durch die Auslesevorrichtung detektiert und ausgewertet werden für die relative Positionierung des Chips und die Ortung der Erkennungszonen.
Die dotierten Bereiche 223 bilden also Positionierungsbezugselemente im Sinne der Erfindung.
In dem Beispiel der Figur werden die einfallenden Strahlen durch die Oberseite des mit einer funktionellen Schicht 210 überzogenen Substrats reflektiert.
Um die Reflexion zu verbessern oder wenigstens eine unabhängige Reflexion der funktionellen Schicht und des Mediums zu garantieren, mit dem diese in Kontakt gebracht werden soll, kann zwischen dem Träger und der funktionellen Schicht eine Reflexionszwischenschicht 226 vorgesehen werden, zum Beispiel aus Aluminiumoxid. Der Index und die Dicke dieser Schicht werden so gewählt, dass der Stapel der optischen Dünnschichten 200, 223, 226 und 210 einen dichroitischen Spiegel bildet, dessen Reflexionskraft beherrscht wird gemäß den bekannten Techniken zur Abscheidung optischer Dünnschichten. Für die Schicht 226 wird zum Beispiel ein Index gewählt, der höher ist als der der Bezugselemente und des Trägers.
Die Zwischenschicht kann als Befestigungsschicht dienen und einer Befestigungsschicht für die Reagenzien der molekularen Erkennungszonen zugeordnet sein.
Eine weitere Realisierungsmöglichkeit der Positionierungsbezugselemente des Biochips ist in der 8 dargestellt.
In dem Beispiel dieser Figur erhält man die Positionierungsbezugselemente, indem man in den Träger 200 Vertiefungen 225 ätzt, von seiner Oberseite 201 aus. Die Tiefe e der Vertiefungen wird vorzugsweise so festgelegt, dass e = λ/4n, wobei λ eine Wellenlänge des einfallenden Lichts ist und n der optische Index des Trägers 200.
Lichtstrahlen, reflektiert von der Oberseite in den geätzten und in den nicht-geätzten Bereichen, durchqueren unterschiedliche Materialdicken und weisen daher eine Strahlengangdifferenz auf.
Die Strahlengangdifferenz ist proportional zu der Tiefe der Ätzungen und bewirkte eine Phasenverschiebung zwischen den Strahlen.
Vergleichbar mit dem Beispiel der 7 erzeugt die Phasenverschiebung eine durch eine Auslesevorrichtung detektierbaren Phasenkontrast.
Eine die Erkennungszonen bildende funktionelle Schicht 210 bedeckt die Oberseite 210.
Wie oben beschrieben, kann zwischen dem Träger und der funktionellen Schicht eine Zwischenschicht und/oder eine Befestigungsschicht vorgesehen werden.
Die 9 zeigt ein letzte Realisierungsbeispiel der Positionierungsbezugselemente des Biochips.
In diesem Beispiel werden die Positionierungsbezugselemente nicht aufgrund eines Unterschieds der Reflexionskraft oder einer Strahlengangdifferenz detektiert, sondern durch eine Modifizierung der Polarisation des Lichts, das sie erzeugen bzw. abstrahlen.
Eine Schicht aus doppelbrechendem Material des Rotator- oder Viertelwellenlängentyps wird auf der Oberseite 201 des Trägers gebildet und so geätzt, dass man Positionierungsbezugselemente in Form von voneinander beabstandeten Bereichen 227 erhält.
Wenn ein einfallender gemäß einer ersten Richtung polarisierter Lichtstrahl einen Bereich 227 aus doppelbrechendem Material erreicht und ihn durchquert oder dort reflektiert wird, wird seine Polarisationsrichtung durch Rotation modifiziert. Hingegen behält ein polarisierter Strahl, der das nackte Glas des Trägers 200 erreicht, seine Polarisation nach der Reflexion unverändert bei.
Die Positionierungsbezugselemente können also detektiert werden, indem man in das optische Positionierungssystem der Auslesevorrichtung eine Bauteil einführt, das die ursprüngliche oder modifizierte Polarisationsrichtung selektiert. Dieses Bauteil ist zum Beispiel ein Analysator.
Vorteilhafterweise werden die Positionierungsbezugselemente "unsichtbar", indem man den Analysator neutralisiert oder eliminiert.
Ebenso wie in den vorangehenden Beispielen wird das Substrat mit einer funktionellen Schicht 210 überzogen. Es kann ebenfalls, wie oben beschrieben, mit einer Zwischenschicht versehen werden.
GENANNTE DOKUMENTE

(1) "Photothermal spectroscopy methods for chemical analysis", S.E. Bialkowski, Bd. 137 in chemical analysis: a serie of monographs on analytical chemistry and ist applications, Wiley.
(2) J. Appl. Phys. Lett. 36, 130 (1979),
(3) US-A-4 299 494.
(4) Fotiou et Morris, Appl. Spectrosc. 40, 704 (1986)".
(5) US-A-5 646 411
(6) "La puce ADN: un multiréacteur de paillasse" ("Der DNA-Chip : ein Labortisch-Reaktor") von M. Bellis und P. Casellas, in Médecine/Sciences, Nr. 11, Bd. 13, 1997, Seiten 1317 bis 1324
(7) "DNA sequencing by hybridization – a megasequencing method and diagnostic tool ?" von A.D. Mirzabekov in TIBTECH, Bd. 12, Januar 1994, Seiten 27–32, Elsevier Science.
(8) "DNA chips: An array possibilities" von A. Marshall und J. Hodgson in Nature Biotechnology, Bd. 16, Januar 1998, S. 27–31.
W(9)O-A-98 01533
(10) US-A-5 721 435
W(11)O-98/28623
W(12)O-98/38490
(13) EP-A-0 640 826.

Claims

Vorrichtung zum Auslesen eines Biochips in Echtzeit, eine Vielzahl von Erkennungszonen (110) und eine Vielzahl von optischen Positionsbezugselementen (122, 124, 124a, 221, 222, 223, 225, 227) umfassend, wobei die Erkennungszonen DNA- oder RNA-Fragmente enthalten und bezüglich der optischen Positionsbezugselemente festgelegte Plätze einnehmen, und die Vorrichtung dabei umfasst: – einen optischen Kopf (20), fähig ein einfallendes Licht auf den Biochip zu projizieren, – Relativverschiebungseinrichtungen (14 und/oder 24) des Kopfs und des genannten Biochips, die eine Abtastung des Biochips ermöglichen und makroskopische (großmaßstäbliche) Verschiebungseinrichtungen (14) sowie mikroskopische (kleinmaßstäbliche) Verschiebungseinrichtungen (24) umfassen, – ein Analysesystem genanntes erstes optisches System (40), dem optischen Kopf zugeordnet, um ein aus den Erkennungszonen stammendes Licht wenigstens auf einen ersten elektrooptischen Sensor (42) zu projizieren, – ein Positionierungssystem genanntes zweites optisches System (60), dem optischen Kopf zugeordnet, um ein von wenigstens einem Positionsbezugselement stammendes Licht auf wenigstens einen zweiten elektrooptischen Sensor (62) zu projizieren, und – Nachführungseinrichtungen (70) der Verschiebungseinrichtungen des genannten optischen Kopfs, um die Verschiebungseinrichtungen in Abhängigkeit von elektrischen Signalen des elektrooptischen Sensors des optischen Positionierungssystems (62) zu steuern, wobei die Nachführungseinrichtungen (70) mit den mikroskopischen Verschiebungseinrichtungen (24) verbunden sind, dadurch gekennzeichnet, dass der optische Kopf (20) eine Fokussierlinse (22) und wenigstens einen Stellantrieb (24) zur axialen und/oder lateralen Fokussierverschiebung der Linse (22) und ein drittes dem optischen Kopf (20) zugeordnetes optisches System (80) zur Projektion eines von der Reflexion des auf dem Biochip einfallenden Lichts stammenden Lichts auf einen dritten elektrooptischen Sensor sowie mit dem Stellantrieb (24) verbundene Nachführungseinrichtungen (70) zur Steuerung der Fokussierverschiebung der Linse umfasst.
Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das optische Analysesystem (40) ein konfokales optisches System ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der erste elektrooptische Sensor, der ein von den in den Erkennungszonen vorhandenen Zielmolekülen abgestrahltes Licht empfängt, empfindlich ist für ein Fluoreszenzlicht, ein Reflexionslicht, ein Licht zur Detektion von Hybridisierung durch Veränderung der Masse, der Dicke und/oder des Index, und/oder ein für photothermische Effekte charakteristisches Licht.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der erste elektrooptische Sensor (42) mit dem ersten optischen System durch eine optische Faser (47) optisch verbunden ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das erste und das zweite optische System mit dem optischen Kopf mit Hilfe eines Strahlteilers bzw. dichroitischen Plättchens (32) optisch verbunden sind.
Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein einziges optisches System, welches das erste und das zweite optische System einschließt, und wenigstens einen für das erste und das zweite optische System gemeinsamen elektrooptischen Sensor umfasst, wobei der gemeinsame optische Sensor das von den Molekularerkennungszonen stammende Licht und das von wenigstens einem optischen Positionsbezugselement stammende Licht empfängt und mit den Abtastungs-Nachführungseinrichtungen des optischen Kopfs verbunden ist.
Vorrichtung zur Echtzeit-Auslesung eines Biochips mit einer Vielzahl von Erkennungszonen (110) und einer Vielzahl von optischen Positionsbezugselementen (122, 124, 124a, 221, 222, 223, 225, 227), wobei die Erkennungszonen DNA- oder RNA-Fragmente enthalten und in Bezug auf die optischen Positionsbezugselemente festgelegte Plätze einnehmen und die Vorrichtung dabei umfasst: – einen optischen Kopf (20), fähig ein einfallendes Licht auf den Biochip zu projizieren, – Relativverschiebungseinrichtungen (14 und/oder 24) des Kopfs und des genannten Biochips, die eine Abtastung des Biochips ermöglichen und makroskopische (großmaßstäbliche) Verschiebungseinrichtungen (14) und mikroskopische (kleinmaßstäbliche) Verschiebungseinrichtungen (24), – ein Analysesystem genanntes erstes optisches System (40), dem optischen Kopf zugeordnet, um ein aus den Erkennungszonen stammendes Licht wenigstens auf einen ersten elektrooptischen Sensor (42) zu projizieren, – ein Positionierungssystem genanntes zweites optisches System (60), dem optischen Kopf zugeordnet, um ein von wenigstens einem Positionsbezugselement stammendes Licht auf wenigstens einen zweiten elektrooptischen Sensor (62) zu projizieren, und – Nachführungseinrichtungen (70) der Verschiebungseinrichtungen des genannten optischen Kopfs, um die Verschiebungseinrichtungen in Abhängigkeit von elektrischen Signalen des elektrooptischen Sensors des optischen Positionierungssystems (62) zu steuern, wobei die Nachführungseinrichtungen (70) mit den mikroskopischen Verschiebungseinrichtungen (24) verbunden sind, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein einziges, das erste und das zweite optische System einschließendes optisches System und einen für das erste und das zweite optische System gemeinsamen elektrooptischen Sensor umfasst, wobei der gemeinsame optische Sensor das von den Molekularerkennungszonen stammende Licht und das von wenigstens einem optischen Positionsbezugselement stammende Licht empfängt und mit den Abtastungs-Nachführungseinrichtungen des optischen Kopfs verbunden ist.
Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das optische Analysesystem (40) ein konfokales optisches System ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass der erste elektrooptische Sensor, der ein von den in den Erkennungszonen vorhandenen Zielmolekülen abgestrahltes Licht empfängt, empfindlich ist für ein Fluoreszenzlicht, ein Reflexionslicht, ein Licht zur Detektion von Hybridisierung durch Veränderung der Masse, der Dicke und/oder des Index, und/oder ein für photothermische Effekte charakteristisches Licht.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass der erste elektrooptische Sensor (42) mit dem ersten optischen System durch eine optische Faser (47) optisch verbunden ist.
Biochip mit einer Vielzahl von Erkennungszonen (110) und einer Vielzahl von optischen Positionsbezugselementen (122, 124, 124a, 221, 122, 223, 225, 227), dadurch gekennzeichnet, dass die Molekularerkennungszonen den optischen Positionsbezugselementen ganz oder teilweise überlagert sind, so dass sie diese Bezugselemente ganz oder teilweise überdecken.
Biochip nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Positionsbezugselemente durchlässig sind für wenigstens ein Fluoreszenzlicht, abgestrahlt von den Erkennungszonen als Reaktion auf ein einfallendes Ausleselicht.
Biochip nach einem der Ansprüche 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Molekularerkennungszonen in Bezug auf die optischen Positionsbezugselemente bestimmte Plätze einnehmen.
Biochip nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass jeder Molekularerkennungszone jeweils ein optisches Bezugselement (124, 124a) zugeordnet ist.
Biochip nach einem der Ansprüche 11 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Molekularerkennungszonen (110) zeilen- und spaltenförmig angeordnet sind und dass jeder Molekularerkennungszeile und/oder -spalte wenigstens ein optisches Bezugselement (124) zugeordnet ist.
Biochip nach einem der Ansprüche 11 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die optischen Bezugselemente Bereiche umfassen, die fähig sind, ein einfallendes Licht zu reflektieren, wobei ein Prozentsatz reflektierten Lichts kleiner als 50 % und vorzugsweise kleiner als 5 % ist.
Biochip nach einem der Ansprüche 11 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die optischen Bezugselemente Bereiche mit einer strukturierten Oberfläche umfassen, fähig eine Phasenverschiebung bei einem einfallenden Licht einzuführen.
Biochip nach einem der Ansprüche 11 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die optischen Bezugselemente sich längs von Erkennungszonen-Reihen erstreckende Positionierungsbahnen aus einem streuenden oder fluoreszierenden Licht und in diesen Positionierungsbahnen vorgesehene reflektierende Bereiche umfassen.
Biochip nach einem der Ansprüche 11 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die optischen Bezugselemente schwach reflektierende Bahnen (122) mit einem Reflexionskoeffizienten von 50 % und vorzugsweise 5 % umfassen, die sich längs von Reihen von Erkennungszonen (110) erstrecken, wobei die Bahnen lokal nichtreflektierende Bereiche (124) aufweisen.
Biochip nach einem der Ansprüche 11 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass benachbarte Bereiche der Positionsbezugselemente jeweils eine Differenz des optischen Wegs des einfallenden Lichts aufweisen.
Biochip nach einem der Ansprüche 11 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die benachbarten Positionsbezugselemente (221, 222) jeweils aus Materialien mit unterschiedlichen niedrigen Reflexionsgraden von weniger als 50 % und vorzugsweise weniger als 5 % sind.
Biochip nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass die benachbarten Bereiche der Positionsbezugselemente jeweils unterschiedliche physikalische Dicken aufweisen.
Biochip nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass die benachbarten Bereiche der Positionsbezugselemente unterschiedliche Dotierungen aufweisen.
Biochip nach einem der Ansprüche 11 bis 23, der zwischen den Positionsbezugselementen und einer Garnitur bzw. Ausstattung der Erkennungszonen eine Zwischenschicht (226) umfasst, wobei der Index und der Reflexionsgrad der genannten Zwischenschicht so gewählt wird, dass sie einen dichroitischen Spiegel bildet.
Biochip nach einem der Ansprüche 11 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass der Reflexionsgrad der Positionsbezugselemente und/oder einer Grenzfläche zwischen den Erkennungszonen und den Positionsbezugselementen zwischen 1 und 10% enthalten ist für einen Lichtstrahl, der den Biochip auf einer sogenannten Rückseite erreicht, die einer mit den Erkennungsmolekülen ausgestatteten Seite entgegengesetzt ist.
Biochip nach einem der Ansprüche 11 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass der Reflexionsgrad der Positionsbezugselemente und/oder einer Grenzfläche zwischen einem Ausstattungsmaterial der Erkennungszonen und den Positionsbezugselementen zwischen 1 und 100% enthalten ist für einen Lichtstrahl, der den Biochip auf einer mit Ausstattungsmaterial überzogenen (vorderen) Seite erreicht.
Biochip nach einem der Ansprüche 11 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Positionsbezugselemente Bereiche (227) mit doppelbrechendem Material umfassen, welche die Polarisation eines polarisierten einfallenden Ausleselichts modifizieren können.
Biochip nach einem der Ansprüche 11 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass die Molekularerkennungszonen eine transparente Haftschicht (211) aufweisen.
Biochip nach einem der Ansprüche 11 bis 28, dadurch gekennzeichnet, dass die Erkennungszonen mit Reagenzien ausgestattet sind, ausgewählt unter chemischen oder biologischen Reagenzien wie etwa DNA-Sonden, Antikörpern, Antigenen.
Verfahren zum Auslesen eines Biochips nach einem der Ansprüche 11 bis 29 mit Hilfe einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6.
Verfahren zum Auslesen eines Biochips nach einem der Ansprüche 11 bis 20 mit Hilfe einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 7 bis 10.