DE10038080A1

DE10038080A1 - Verfahren und Vorrichtung zum ortsaufgelösten fluoreszenzoptischen Nachweis von auf einer Oberfläche eines planaren Trägers immobilisierten Substanzen

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Publication number: DE10038080A1
Application number: DE2000138080
Authority: DE
Inventors: Norbert Leclerc; Hans-Joerg Grill; Andreas Schuetz; Lothar Prix
Original assignee: SL MICROTEST WISSENSCHAFTLICHE
Current assignee: SL MICROTEST WISSENSCHAFTLICHE
Priority date: 2000-08-04
Filing date: 2000-08-04
Publication date: 2002-02-21

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zum ortsaufgelösten fluoreszenzoptischen Nachweis von auf einer Oberfläche eines Biochips immobilisierten Substanzen. Die Erfindung betrifft insbesondere einen Fluoreszenzscanner 10 mit einem Pulslaser 11, der einen Anregungslichtstrahl 12 aussendet, welcher auf die Oberfläche eines Biochips 15 fokussiert wird. Die Oberfläche des Biochips 15 wird abgetastet und das von der Oberfläche emittierte Fluoreszenzlicht mittels eines Detektors 25 ortsaufgelöst gemessen. Durch zeitliche Korrelation der einzelnen Anregungsimpulse und der entsprechenden Fluoreszenzlichtimpulse kann das detektierte Fluoreszenzsignal effektiv von Reflexionen der Oberfläche des Biochips und/oder von Streulichtanteilen separiert werden. Damit können sehr schwache Fluoreszenzsignale mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung gemessen werden.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zum ortsaufgelösten fluores zenzoptischen Nachweis von auf einer Oberfläche eines planaren Trägers immobilisierten Substanzen.

Das Erkennen bestimmter genetischer Informationen ist eine elementare molekularbiologi sche Aufgabenstellung, zu deren Lösung bereits eine große Zahl unterschiedlichster Metho den vorgeschlagen wurde. Kann eine gesuchte genetische Information auf bestimmte Nu kleinsäuresequenzen (im folgenden als Targetsequenzen oder Targets bezeichnet) zurück geführt werden, benutzt man in vielen Fällen sogenannte Oligonukleotidsonden, deren Nu kleinsäuresequenzen zu den Targetsequenzen komplementär sind. Aufgrund ihrer Komple mentarität können die Oligonukleotidsonden und die Targetsequenzen spezifisch hybridisie ren, so daß man die gesuchten Targetsequenzen in einem Pool umfangreicher und komple xer genetischer Informationen identifizieren und qualitativ und/oder quantitativ analysieren kann.

Klassische Anwendungen dieser Art sind Northern- und Southern-Blots, sowie die in-situ Hybridisierung. Dazu werden die Proben in der Regel zweckgerecht vorbereitet und mit Hilfe definierter Oligonukleotidsonden untersucht. Bei herkömmlichen Anwendungen dieser Art sind üblicherweise die Oligonukleotidsonden markiert und können so, abhängig von der gewählten Markierung, detektiert werden. Dies ist erforderlich, um probengebundene Son den, d. h. Sonden, die spezifisch an Targetsequenzen hybridisiert haben, erkennen zu kön nen. Zur Markierung von Oligonukleotidsonden stehen dem Fachmann verschiedenste Methoden zur Verfügung.

Zur Markierung der Sonden werden Substanzen, sog. Marker, eingesetzt, die mit Hilfe ge eigneter Nachweismethoden identifiziert werden können. Weit verbreitet sind insbesondere radioaktive Marker, Bio- oder Chemilumineszenzmarker, sowie Fluoreszenzmarker.

Dabei haben insbesondere Fluoreszenzmethoden in der chemischen und biologischen Analytik und Diagnostik einen hohen Stellenwert. Es handelt sich dabei um eine sehr nach weisstarke Methode, die ohne Radioaktivität und, falls erforderlich, ohne toxische Substan zen auskommt. Die als Marker verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe sind verglichen mit Radioisotopen bei entsprechender Lagerung praktisch unbegrenzt haltbar. Es existieren heute empfindliche Detektionssysteme, die schon den Nachweis einzelner fluoreszierender Mole küle ermöglichen. Außerdem existiert eine Vielfalt unterschiedlichster Fluoreszenzfarbstoffe, so daß für die meisten Wellenlängenbereiche im sichtbaren Spektrum, aber auch im angren zenden ultravioletten und infraroten Spektralbereich auf geeignete Fluoreszenzmarker zu rückgegriffen werden kann. Häufig können bei einer Messung sogar mehrere Fluoreszenz farbstoffe mit unterschiedlichen Anregungs- und/oder Emissionswellenlängen parallel ver wendet werden.

Gegenüber den als Chemilumineszenzsonden eingesetzten Enzymmarkern haben Fluores zenzfarbstoffe den Vorteil, daß die Messung direkt nach Einführung des Markers erfolgen kann. Enzym- oder Proteinmarker (beispielsweise der häufig eingesetzte Bio tin/Streptavedin-Komplex) benötigen dagegen einen weiteren Inkubationsschritt, in welchem der Enzymmarker eingeführt und die Substratlösung zugegeben wird.

Bei den oben erwähnten klassischen Hybridisierungsmethoden ist die Zahl der unterschiedli chen Sonden, die in Verbindung mit ein und derselben Probe eingesetzt werden können, begrenzt. Um die Sonden nämlich unterscheiden zu können, sind unterschiedliche, d. h. nicht interferierende Markierungen und in der Folge auch unterschiedliche Detektionssysteme erforderlich. Der damit verbundene Aufwand stößt spätestens bei Multi-Parameter-Analysen an die Grenzen der Praktikabilität.

Entscheidende Vorteile bieten in dieser Hinsicht Testanordnungen mit immobilisierten Oligo nukleotidsonden, d. h. Sonden, die an einen festen Träger fixiert sind. Um bei derartigen Systemen eine Bindung von Probe und Sonde erkennen zu können, wird in diesen Fällen meist die Probe und nicht die Sonde markiert. Unter einem festen Träger versteht man dabei ein Material mit starrer oder halbstarrer Oberfläche. Bei derartigen Trägern kann es sich beispielsweise um Partikel, Stränge, insbesondere Faserbündel, sphärische Körper, wie Kugeln oder Kügelchen (sogenannte "beads"), Fällungsprodukte, Gele, Blätter, Röhren, Behältnisse, Kapillarröhrchen, Scheiben, Folien oder Platten handeln. Am weitesten ver breitet sind inzwischen jedoch planare, d. h. ebene Träger.

Soll eine Probe mittels mehrerer Sonden mit unterschiedlicher Spezifität untersucht werden, so werden diese Sonden üblicherweise auf einem gemeinsamen Träger so angeordnet, daß jede Sondenart, also beispielsweise eine bestimmte Oligonukleotidsonde mit bekannter Sequenz, einem bestimmten Feld eines zweidimensionalen Feldmusters (allgemein als "Array" bezeichnet) auf dem Träger zugeordnet wird. Die Feststellung, ob und/oder gegebe nenfalls in welchem Maße die markierte Probe an ein bestimmtes Feld bindet, erlaubt Rück schlüsse auf die zur Sonde dieses Feldes komplementäre Targetsequenz der Probe und gegebenenfalls auf deren Konzentration.

Durch fortschreitende Miniaturisierung konnten die Felder mittlerweile wesentlich verkleinert werden, so daß man heute eine Vielzahl verfahrens- und meßtechnisch unterscheidbare Felder, also auch eine Vielzahl unterscheidbarer Sonden auf einem einzelnen Träger anord nen kann. Obwohl Glasträger im molekularbiologischen Bereich für diese Zwecke noch am weitesten verbreitet sind, werden die planaren Träger in Anlehnung an die Halbleitertechno logie auch als "Chips", insbesondere als Biochips, Genchips usw. bezeichnet. Die Sonden können in sehr hoher Dichte an den Träger gebunden und mehrere Sonden einer Sondenart in einem miniaturisierten Feld angeordnet werden. Heute können bereits Chips mit bis zu 40.000 unterschiedlichen molekularen Sonden pro cm² hergestellt werden.

Vor allem hat die Anwendung photolithographischer Fabrikationstechniken aus der Halblei tertechnologie zu entscheidenden Fortschritten bei der Herstellung solcher Chips geführt. Das Prinzip basiert auf einer lichtgesteuerten chemischen Festphasensynthese, bei der photolithographische Masken die Felder abbilden (vgl. beispielsweise Fodor et al. "Light directed, spatially addressable parallel chemical synthesis", Science, vol. 251, 767-773 (1991)). Dieses Verfahren ist insbesondere dann von Vorteil, wenn die Sonden auf dem Träger in-situ aus einzelnen Bausteinen, beispielsweise Nukleotiden, aufgebaut werden sollen. So kann ein bestimmter Baustein gezielt an die im Aufbau befindlichen Sonden be stimmter Felder angefügt werden, während die Sonden der übrigen Felder unberührt blei ben. Dies gelingt mit photolithographischen Masken, die Licht zur lichtgesteuerten chemi schen Synthese nur auf diejenigen Felder abbilden, an die der Baustein angefügt werden soll. Beispielsweise kann der Lichteinfall die Abspaltung lichtempfindlicher Schutzgruppen bewirken, wodurch eine reaktive Gruppe genau an derjenigen Stelle der im Aufbau befindli chen Sonden freigesetzt wird, an die der Baustein angefügt werden soll. Da ein zuletzt an gefügter Baustein in der Regel eine gebundene Schutzgruppe einbringt und dadurch die um einen Baustein erweiterten Sonden wieder schützt, wird an eine aktivierte Sonde lediglich ein einziger Baustein angefügt. Aus dem gleichen Grund stehen die während eines Zyklus um einen Baustein erweiterten Sonden gleichermaßen wie die in diesem Zyklus nicht erweiter ten Sonden als zunächst geschützte Gesamtheit aller Sonden einer neuen gezielten Aktivierung durch eine passende Maske für die Anfügung eines weiteren Baustein in einem neuen Zyklus zur Verfügung. Derartige Verfahren werden ausführlich in den internationalen Pa tentanmeldungen WO 90/15070, WO 91/07087, WO 92/10092, WO 92/10587, WO 92/10588 und in dem U.S.-Patent 5,143,854 beschrieben. Ein anderes in-situ Verfahren zur Herstel lung von sog. DNA Microarrays, das von der Firma Rosetta Inpharmatics, Inc., unter der Bezeichnung FlexJet angeboten wird, basiert auf geeigneten Modifikationen des Druckpro zesses von Farb-Tintenstrahldruckern.

Andere Chips weisen wiederum Sonden auf, die nicht in-situ synthetisiert, sondern in vor gefertigter Form auf den Träger aufgebracht werden. Entsprechende Arrays aus Biomole külen zur Sequenzanalyse von Polynukleotiden wurden bereits von E. Southern in der inter nationalen Patentanmeldung WO 89/10977 beschrieben. Biomolekulare Arrays eignen sich für eine Vielzahl von Anwendungen, angefangen von der Sequenzierung von DNA über das DNA-Fingerprinting bis zu Anwendungen in der medizinischen Diagnostik. Inzwischen wer den schon kommerzielle Biochips mit einer Vielzahl verschiedener cDNAs zur Hybridisierung angeboten. Bei diesen cDNAs handelt es sich beispielsweise um Nukleinsäuresequenzen mit Längen von etwa 200 bis 600 Basenpaaren (bp), die mittels genspezifischer Primer amplifiziert werden, deren Identität durch Teilsequenzierung überprüft wird und die dann gezielt an bekannten Plätzen beispielsweise auf einer Nylonmembran angebracht werden.

Werden die fluoreszenzmarkierten Proben mit auf einem planaren Chip immobilisierten Sonden in Kontakt gebracht, kann es auf einzelnen Feldern zu einer Kopplung, beispielswei se einer Hybridisierung, mit komplementären Sonden kommen. In Fällen, in denen eine Fluoreszenzmarkierung der Proben nicht zweckmäßig ist, kann auch nach Bindung der Proben an die Sonden der Chip mit geeigneten fluoreszenzmarkierten Rezeptoren in Kon takt gebracht werden. In beiden Fällen werden Fluoreszenzfarbstoffe auf denjenigen Feld elementen immobilisiert, an denen eine Bindung zwischen Sonden und Proben stattgefun den hat. Wird der Chip dann mit Licht einer geeigneten Wellenlänge bestrahlt, so werden die Fluoreszenzfarbstoffe angeregt und Licht wird emittiert. Das resultierende Muster aus hellen und dunklen Feldelementen auf dem planaren Träger wird aufgezeichnet. Informationen über die Probe kann man also dadurch erhalten, daß man das Hell/Dunkel-Muster mit dem bekannten Muster der an die Trägeroberfläche fixierten biologischen Sonden vergleicht.

Die fortschreitende Miniaturisierung hat zu einer großen Anzahl von Feldelementen auf einem einzelnen planaren Träger geführt, die bei kommerziellen Anwendungen in kurzer Zeit sehr zuverlässig vermessen werden müssen. Zum ortsaufgelösten fluoreszenzoptischen Nachweis von auf einer Oberfläche eines planaren Trägers immobilisierten Substanzen werden heute hauptsächlich Laser eingesetzt, bei denen die Feldelemente durch einen intensiven Laserstrahl mit geringem Durchmesser abgetastet werden. Ein entsprechender Fluoreszenzscanner wird von der Firma Hewlett-Packard für die Auswertung von Biochips der Firma Affymetrix hergestellt und ist in den U.S.-Patenten 5,837,475 und 5,945,679 de taillierter beschrieben. Er arbeitet bei einer Wellenlänge von 488 nm und die kleinsten meß baren Strukturen liegen im Bereich von 20 µm. Der Scanner wird zur Auswertung von Chips bei der Expressionsanalyse (Rattengenom U34), zum Genotyping (HuSNP) und zur Krank heitsüberwachung (Krebs, CYP450, p53, HIV) eingesetzt. Die entsprechenden kommerziell erhältlichen Chips erlauben aber keine Qualitätskontrolle, d. h. die Aussage über die Richtig keit der Meßergebnisse muß vom Nutzer anhand einer Plausibilitätsbetrachtung durchge führt werden. Eine Quantifizierung ist nicht vorgesehen. Die Chips zeichnen sich aber durch eine sehr hohe Informationsdichte von bis zu 40.000 Oligonukleotiden/cm² aus. Als Träger dienen modifizierte Glasoberflächen.

Neben der Ortsauflösung ist es insbesondere wichtig, das Fluoreszenzlicht möglichst effektiv zum Detektor zu leiten und Hintergrundsignale und Streulicht weitgehend auszublenden. Dazu werden bereits sogenannte Laserscanner mit konfokaler Optik verwendet, die mit konfokalen Blenden, sog. "Pinholes", im Detektions- und gegebenenfalls auch im Anre gungsstrahlengang ausgerüstet sind. Als Anregungslichtquelle werden üblicherweise Laser und als Detektoren Photomultiplier oder empfindliche Dioden eingesetzt. Laser ermöglichen wegen ihrer hohen lokalen Anregungsenergie sehr kurze Meßzeiten und sind daher die bevorzugten Anregungslichtquellen. Durch die konfokale Optik ist gewährleistet, daß ledig lich Fluoreszenzlicht aus der Ebene der Chipoberfläche zum Photomultiplier gelangt, wäh rend Fluoreszenz- oder Streulicht aus darüber oder darunterliegenden Ebenen durch die Pinholes ausgeblendet wird. So wird beispielsweise in De Saizieu, A. et al. "Bacterial tran script imaging by hybridization of total RNA to oligonucleotide arrays", Nature Biotechnology 16, 45-48 (1998) ein System zur Transkriptionskontrolle von Bakteriengenen (Hemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae) beschrieben, bei dem zur Fluoreszenzanalyse ein konfokales Mikroskop verwendet wird.

Das Abtasten (Scannen) der Probe kann auf unterschiedliche Weise erfolgen: Entweder über das Anregungs- und Detektionssystem bei feststehendem planaren Träger, beispiels weise durch Ablenken des Anregungsstrahls, oder der planare Träger wird bei feststehendem Anregungs- und Detektionssystem bewegt. Auch kombinierte Verfahren sind möglich. So kann man beispielsweise den planaren Träger in einer Richtung und den Anregungsla serstrahl in einer dazu senkrechten Richtung bewegen, um die Trägeroberfläche zweidimen sional abzutasten.

Eine weitere Möglichkeit stellen zweidimensionale Detektoren, wie beispielsweise CCD- Kameras dar, die in einzelnen Meßvorgängen ein zweidimensionales Bild der Probe erzeu gen. Ein Abtasten ist dabei nicht notwendig. In diesen Fällen können ebenfalls Laser, aber auch Lampen mit entsprechenden Filtern als Anregungsquelle verwendet werden. Da das Bild in einem Schritt aufgenommen wird, kann man bei diesen Methoden lange Meßzeiten in Kauf nehmen, die bei einem scannenden Meßprozeß aufgrund der sequentiellen Datenauf nahme nicht toleriert werden können. In Guschin, D. et al. "Manual Manufacturing of Oligo nucleotide, DNA and Protein Microchips", Anal. Biochem. 250, 203-211 (1997) wird ein Biochip beschrieben, bei dem DNA oder Proteine auf winzigen Gelpads immobilisiert wer den, die zuvor auf einen Glasträger aufgebracht wurden. Bis zu 10.000 dieser Pads befinden sich auf einem einzigen Träger. Das System wird eingesetzt, um die schnelle Identifizierung von Tuberkuloseerregern zu ermöglichen und so Stämme die gegen bestimmte Antibiotika resistent sind zu identifizieren. Dazu werden Fluoreszenzmarker wie Fluoreszein oder Texas Red verwendet, die mit einem speziellen Mehrfarben-Epifluoreszenzmikroskop mit einem 4 × 4 mm Bildfeld detektiert werden.

Die bekannten Fluoreszenzdetektionssysteme für Biochips weisen jedoch Nachteile auf. Gerade bei hochminiaturisierten Biochips, die sich durch eine große Anzahl Feldelementen von einigen 10 µm Durchmesser auszeichnen, ist eine hohe Sensitivität und Ortsauflösung bei der Fluoreszenzmessung erforderlich. Dies ist mit herkömmlichen Systemen nur be grenzt möglich, da sich beispielsweise Streulicht, das durch Ramanverschiebung bei länge ren Wellenlängen als das einfallende Anregungslicht auftritt, mit herkömmlichen Filteranord nungen nicht oder nur unzureichend von dem zu messenden Fluoreszenzlicht unterschieden werden kann. Sind die fluoreszenzoptisch nachzuweisenden Substanzen auf metallischen oder metallisierten Trägern (z. B. Gold) immobilisiert, so können zudem starke Reflexionen des Anregungslichtes auftreten, die von dem im Detektionssystem angeordneten Filterein heiten nicht vollständig ausgefiltert werden können.

Die maximal erreichbare Sensitivität ist daher durch einen Hintergrund an gestreutem oder reflektiertem Anregungslicht und durch unspezifische Fluoreszenzstrahlung, beispielsweise aus einer über dem planaren Träger befindlichen Flüssigkeit begrenzt.

Der vorliegenden Erfindung liegt daher das technische Problem zugrunde, ein Verfahren und eine Vorrichtung zum ortsaufgelösten fluoreszenzoptischen Nachweis von auf einer Oberflä che eines planaren Träger immobilisierten Substanzen bereitzustellen, die bei Gewährlei stung einer hohen Ortsauflösung den unspezifischen Strahlungshintergrund weitgehend eliminiert. Das erfindungsgemäße Verfahren und die erfindungsgemäße Vorrichtung sollen sich insbesondere zur Auswertung von Biochips eignen.

Gelöst wird dieses Problem durch Bereitstellung des Verfahrens gemäß Anspruch 1, sowie der Vorrichtung gemäß Anspruch 13.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demnach ein Verfahren zum ortsaufgelösten fluoreszenzoptischen Nachweis von auf einer Oberfläche eines planaren Trägers immobili sierten Substanzen, wobei man einen Anregungslichtstrahl in Form einer Serie von kurzen Lichtimpulsen auf einen Meßbereich mit definierter Größe auf der Oberfläche des Trägers einstrahlt und jeweils zwischen zwei aufeinanderfolgenden Lichtimpulsen Fluoreszenzlicht detektiert, das von in dem Meßbereich befindlichen immobilisierten Substanzen ausgestrahlt wird und den Anregungslichtstrahl und den Träger relativ zueinander bewegt, bis ein be stimmtes (ein- oder zweidimensionales) Areal der Oberfläche des Träger abgetastet ist. Das Abtasten und die Fluoreszenzmessung können sequentiell erfolgen, so daß man nach der Messung eines Meßbereichs den Anregungsstrahl auf einer anderen Stelle des planaren Trägers positioniert. Diese Stelle wird dann ebenfalls durch Einstrahlen einer Serie von kurzen Lichtimpulsen und Detektion der zwischen den Lichtimpulsen emittierten Fluores zenzstrahlung vermessen.

Bevorzugt wird jedoch gleichzeitig abgetastet und gemessen. Werden beispielsweise Träger und Anregungsstrahl mit einer Relativgeschwindigkeit von 1 mm/s gegeneinander bewegt, so entspricht ein Meßintervall von 1 ms einer Ortsauflösung von 1 µm. Bei Verwendung eines Lasers mit einer typischen Pulsfrequenz von 50 MHz können innerhalb eines Meßin tervalls 50.000 Einzelmessung durchgeführt und aufintegriert werden.

Wenn man sowohl die Relativposition von Anregungslichtstrahl und Träger zueinander, wie auch die in der jeweiligen Position gemessene Fluoreszenzintensität registriert, digitalisiert und in einem Computer speichert, kann man die gemessenen Fluoreszenzintensitäten bei spielsweise auf einem Display als zweidimensionales Bild der Trägeroberfläche graphisch darstellen.

Unter immobilisierten Substanzen sind im vorliegenden Zusammenhang insbesondere die üblicherweise auf Biochips oder Genchips immobilisierten biologischen Sonden, beispiels weise Oligonukleotid-Sonden, zu verstehen. Bei Immunoassays kann man beispielsweise die an der Oberfläche des Trägers fixierten biologischen Sonden markieren, um z. B. Aussa gen über die Gesamtzahl möglicher Bindungsplätze für mit einem weiteren Fluoreszenzfarb stoff markierte Antikörper machen zu können. Aus dem Verhältnis von Fluoreszenzstrahlung der fixierten Bindungsstellen zur Fluoreszenzstrahlung der gebundenen Antikörper kann man dann Aussagen über die Besetzungsdichte der Bindungsstellen machen.

Üblicherweise sind jedoch die Proben fluoreszenzmarkiert, so daß der Begriff "immobilisierte Substanzen" im vorliegenden Zusammenhang auch die an die Sonden, beispielsweise durch Hybridisierung, gebundenen Proben bzw. den Komplex aus fixierten Sonden und daran gebundene Proben umfasst. Dabei bedeutet "fluoreszenzmarkierte Probe" nicht notwendi gerweise, daß die Probe selbst mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert ist, sondern bedeu tet ganz allgemein, daß eine Bindung der Probe an die an der Oberfläche fixierte Sonde zu einer Änderung der Fluoreszenzeigenschaften des Gesamtkomplexes aus Sonde und daran gebundener Probe führt. Beispielsweise kann eine Bindung einer entsprechend markierten Probe an eine Sonde auch dazu führen, daß Fluoreszenzlicht, welches von einer unbesetz ten Sonde emittiert wird, durch Binden eines Probenmoleküls gequencht wird.

Ein wesentliches Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß Anre gungslicht nicht kontinuierlich, sondern in Form von kurzen Lichtimpulsen emittiert wird. Entsprechend wird auch das Fluoreszenzlicht in Form kurzer Lichtimpulse emittiert. Erfin dungsgemäß wird nun vorgeschlagen, das Fluoreszenzlicht nicht kontinuierlich, sondern zeitlich korreliert jeweils zwischen zwei aufeinanderfolgenden Lichtimpulsen zu detektieren. Beispielsweise kann die gepulste Anregungslichtquelle mit den Lichtimpulsen korrelierte Triggersignale zum Detektor senden. Jedes Triggersignal erzeugt ein zum Triggersignal zeitlich verzögertes Meßintervall ("Gate") in welchem Fluoreszenzlicht detektiert wird. Durch eine Zeitverzögerung zwischen Triggersignal und Meßintervall die etwa in der Größenordnung der Dauer des Anregungspulses liegt, ist es möglich, Anregungslicht und Fluoreszenz licht nicht nur spektral mit Hilfe von geeigneten Filtern, sondern auch zeitlich zu unterschei den. Dies erlaubt insbesondere ramanverschobenes Streulicht und starke, durch die Filter nicht vollständige blockierte Reflexionen vom eigentlichen Fluoreszenzsignal zu trennen. Die Dauer des Anregungslichtimpulses sollte kürzer als die Fluoreszenzlebensdauer der Fluo reszenzmarker sein, so daß zu Beginn des Meßintervalls noch ein möglichst hohes Fluores zenzsignal vorhanden ist. Typischerweise hat der Anregungslichtimpuls eine Dauer von 1 ns oder weniger. Bevor der nächste Anregungslichtimpuls ausgesandt wird, ist das Meßintervall beendet. Zur Verbesserung des Signal/Rauschverhältnisses kann man das zwischen den Lichtimpulsen detektierte Fluoreszenzlicht digitalisieren und aufintegrieren.

Bevorzugt wird man auch bei dem erfindungsgemäßen Verfahren geeignete Filteranordnun gen zur Ausblendung des Anregungslichtes, beispielsweise Langpaßfilter, im Detektionssy stem anordnen. Ebenso können im Anregungssystem schmalbandige Filter vorgesehen sein, die lediglich Licht der gewünschten Anregungswellenlänge hindurchlassen. Durch die Kombination spezieller Filter mit der zeitaufgelösten Fluoreszenzdetektion erreicht man ein sehr niedriges Niveau an Hintergrundstrahlung und eine entsprechend hohe Sensitivität der Fluoreszenzmessung.

Vorteilhaft wird man das Fluoreszenzlicht zwischen zwei aufeinanderfolgenden Lichtimpul sen zeitaufgelöst detektieren. So kann man nicht nur die Gesamtintensität der zwischen zwei Lichtimpulsen emittierten Fluoreszenzstrahlung messen, sondern erhält aus dem Abkling verhalten der Fluoreszenzstrahlung zusätzliche Informationen. Beispielsweise kann man durch Auswertung der Abklingkonstante (als im wesentlichen der Fluoreszenzlebensdauer) verifizieren, daß die detektierte Fluoreszenzstrahlung tatsächlich von einem bestimmten Fluoreszenzfarbstoff emittiert wird. Ebenso kann man aus Änderungen der Fluoreszenzle bensdauer Informationen über die molekulare Umgebung des Fluoreszenzfarbstoffs erhal ten. Wenn zwei oder mehr Fluoreszenzfarbstoffe simultan detektiert werden, macht sich dies auch in einer Änderung des Fluoreszenzabklingverhaltens bemerkbar. Mit kommerziell erhältlichen numerischen Fit-Verfahren lassen sich die Abklingkurven von zwei oder mehr Farbstoffen an ein gemessenes Fluoreszenzsignal anpassen, so daß man beispielsweise auch ohne spektroskopische Detektionsverfahren Aussagen über die Anteile der einzelnen Fluoreszenzfarbstoffe machen kann.

Besonders bevorzugt wird man das Fluoreszenzlicht durch zeitkorreliertes Zählen einzelner Photonen, beispielsweise mit Hilfe eines Photomultipliers oder eines "Single Photon Avalan che Detectors" registrieren. Die jeweils zwischen einzelnen Lichtimpulsen detektierten Si gnale können beispielsweise mit Hilfe eines Boxcar-Averagers integriert werden.

Besonders bevorzugt wird man das Fluoreszenzlicht konfokal detektieren. Dabei wird eine konfokale Blende im Detektionsstrahlengang mit Hilfe eines optischen Abbildungssystems auf den vom Anregungslichtstrahl beleuchteten Meßbereich abgebildet. Die konfokale Blen de ist im wesentlichen ein Pinhole mit sehr geringem Durchmesser, so daß Fluoreszenzlicht, welches nicht exakt aus der Ebene des Meßbereiches stammt, ausgeblendet wird. Bevor zugt wird man auch den Anregungslichtstrahl konfokal auf die Oberfläche des Trägers fo kussieren. Durch die Kombination von konfokalem Prinzip mit der Zeitauflösung gewährlei stet das erfindungsgemäße Verfahren eine besonders hohe Empfindlichkeit bei gleichzeitig hoher räumlicher Auflösung. Diese hohe Sensitivität und Ortsauflösung wird auch bei Mes sungen auf reflektierten Oberflächen, wie Metalloberflächen, aufrechterhalten.

Durch die hohe erreichbare Auflösung und die hohe Empfindlichkeit können kleinere Feld elemente (Spots) in größerer Dichte auf die Oberfläche des planaren Trägers aufgebracht werden. Aufgrund des konfokalen Meßprinzips können auch dreidimensionale Strukturen durch Veränderung des Fokus abgetastet und rechnerisch ausgewertet werden. Da bei konfokaler Messung und zeitaufgelöster Fluoreszenzdetektion Fluoreszenzlicht lediglich aus einem sehr kleinen Raumbereich detektiert wird, eignet sich das erfindungsgemäße Verfah ren auch zur Kontrolle der verwendeten Trägermaterialien, Beschichtungen und Reagenzien in Bezug auf Eigenfluoreszenz und Reinheit. Außerdem läßt sich das System als selbstfo kussierende Anregungs- und Detektionsoptik ausbilden, so daß beim Abtasten eines plana ren Trägers etwaige Unebenheiten oder eine nicht vollkommen horizontale Ausrichtung des Trägers automatisch korrigiert werden können. Da in der eigentlichen Messung Fluores zenzlicht aus den den Träger bedeckenden flüssigen Reagenzien effektiv ausgeblendet werden kann, sind mit dem erfindungsgemäßen Verfahren Messungen unmittelbar nach oder sogar während der Hybridisierung möglich, ohne daß vor der Messung Waschschritte durchgeführt werden müssen.

Bevorzugt weist der durch den fokussierten Anregungslichtstrahl definierte Meßbereich auf der Oberfläche des Trägers einen Durchmesser von 1 bis 20 µm_FWHM (Full Width Half Maximum) auf. Zur Erzeugung von derart kleinen Meßspots sind Laser aufgrund der hohen Par allelität ihrer Strahlung besonders gut geeignet.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist für die Messung von Biochips optimiert, so daß man bevorzugt einen Träger verwendet, auf dem die immobilisierten Substanzen in Form eines zweidimensionalen Musters angeordnet sind, wobei man den Anregungslichtstrahl und/oder den Träger so relativ zueinander bewegt, daß die Elemente des zweidimensionalen Musters sequentiell abgetastet werden. So kann man beispielsweise die Oberfläche des Trägers durch Ablenken des Anregungslichtstrahls abtasten und/oder durch Verschieben des Trä gers in einer zu der Oberfläche parallelen Ebene. Man kann außerdem durch Verwendung unterschiedlicher Fluoreszenzfarbstoffe "mehrdimensionale" Messungen durchführen. Bei spielsweise kann man Fluoreszenzfarbstoffe einsetzen, die im Bereich der Anregungslicht wellenlänge überlappende Absorptionsbanden aufweisen, aber bei unterscheidbaren Wel lenlängen fluoreszieren. Durch Verwendung geeigneter Filter und/oder dichroitischer Strahl teiler im Detektionssystem lassen sich dann die Fluoreszenzsignale unterscheiden. Auch eine spektral aufgelöste Detektion des Fluoreszenzsignals ist möglich. Die Messung kann prinzipiell mit Anregungslicht einer definierten Wellenlänge durchgeführt werden. Bei Ver wendung von mehreren unterschiedlichen Fluoreszenzmarkern wird man jedoch bevorzugt Anregungslicht mit mehreren definierten Wellenlängen einstrahlen, die an das Absorptions verhalten der verwendeten Farbstoffe angepaßt sind. "Mehrdimensionale Messungen" sind auch möglich, wenn man, wie oben erwähnt, Farbstoffe mit unterschiedlichem Abklingver halten einsetzt. Selbstverständlich sind auch Kombinationen aus diesen Meßprinzipien möglich.

Prinzipiell können alle Fluoreszenzfarbstoffe verwendet werden, die kovalent, adsorptiv oder durch andere Wechselwirkungen mit der zu markierenden Substanz gekoppelt werden kön nen. In der Praxis ist man lediglich durch die Stabilität des Farbstoffes und die verfügbaren Anregungslaserlichtquellen begrenzt. Auch interkalierende Farbstoffe oder Farbstoffe die spontan an DNA oder Proteine binden wie PicoGreen, SYTO 61 oder Ethidiumbromid sind einsetzbar, des weiteren Lanthanoidkomplexe, Quantendots oder Micellen. Bevorzugte bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Farbstoffe sind Cy2, FITC, Eosin, BCECF, Haematoporphyrin, Acridine Red, Texas red, Cy3, Cy5, Ultralite und Cy7.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch eine Vorrichtung zum ortsaufgelösten fluoreszenzoptischen Nachweis von auf einer Oberfläche eines planaren Trägers immobilisierten Substanzen mit Anregungsmitteln zum Einstrahlen eines Anregungslichtstrahls in Form einer Serie von kurzen Lichtimpulsen auf einen definierten Meßbereich auf der Ober fläche des Trägers, Detektionsmitteln zum zeitaufgelösten Detektieren von aus dem Meßbe reich emittierten Fluoreszenzlicht zwischen zwei aufeinanderfolgenden Lichtimpulsen, Mitteln zur zeitlichen Korrelation der Anregungs- und Detektionsmittel, und Steuerungsmitteln zur Steuerung der Relativposition von Anregungslichtstrahl und Träger.

Vorteilhaft umfassen die Anregungsmittel wenigstens einen gepulsten Laser. Die Steue rungseinheit des gepulsten Lasers kann Triggersignale zu einem Controller übermitteln, der durch ein gegenüber den Triggerimpulsen zeitlich verschobenes Gatesignal die Messung des Fluoreszenzlichtes auslöst. Besonders bevorzugt ist der gepulste Laser ein Diodenlaser, so daß gegenüber anderen Lasersystemen eine besonders kostengünstige Meßanordnung realisiert werden kann.

Die Anregungsmittel umfassen bevorzugt eine konfokale Optik zur Fokussierung des Anre gungslichtstrahls auf der Oberfläche des Trägers.

Vorteilhaft umfassen die Detektionsmittel wenigstens einen lichtempfindlichen Sensor mit schneller Antwortzeit. Die Detektionsmittel können aber auch wenigstens zwei Sensoren umfassen, denen Mittel zur spektralen Zerlegung des Fluoreszenzlichtes vorgeschaltet sind. Bevorzugt sind bei einer spektralen Auswertung des Fluoreszenzlichtes mehrere Sensoren vorgesehen, beispielsweise ein zeilenartig angeordnetes Diodenarray oder ein Zeilen-CCD- Chip. Besonders bevorzugt ist der Sensor eine Photodiode, insbesondere eine Lawinen- Photodiode, ein Phototransistor oder ein Sekundärelektronenvervielfacher (Photomultiplier).

Vorzugsweise umfassen die Detektionsmittel eine konfokale Optik zur Abbildung von aus dem Meßbereich emittierten Fluoreszenzlicht auf den Sensor, so daß lediglich Fluoreszenz licht aus einer schmalen Schicht der Trägeroberfläche auf den Detektor fällt. Die konfokale Optik kann beispielsweise in einem Epifluoreszenzmikroskop integriert sein oder es wird zumindest ein Mikroskopobjektiv zur Abbildung verwendet.

Falls man den Träger, also beispielsweise den Biochip stationär hält, wird vorzugsweise der Anregungslichtstrahl abgelenkt. Dazu können als Steuerungsmittel bewegliche Spiegel, beispielsweise sog. Laserscan-Spiegel oder akustooptische Deflektoren verwendet werden. Im Fall einer stationären Optik wird der Träger in einer zur Chipoberfläche parallelen Ebene verschoben. Dazu können unterschiedlichste Betätigungseinrichtungen, die eine präzise reproduzierbare zweidimensionale Verschiebung des Trägers erlauben, herangezogen werden. Beispielsweise kann der Träger auf einem xy-Kreuztisch angeordnet sein, der durch Schrittmotoren bewegt werden kann. Die Steuerung der Schrittmotoren kann über einen Computer erfolgen. Die Position des Anregungslichtstrahls kann bei bekannter Schrittlänge durch elektronisches Zählen der Einzelschritte des Motor bestimmt werden. Bei bekannter Verschiebegeschwindigkeit von Träger und Anregungsstrahl gegeneinander, kann die Meß dauer in eine Ortsbestimmung umgerechnet werden. Um eine Akkumulation von Einzelfeh lern im Laufe einer Messung zu verhindern, können auf dem Träger Markierungen zur opti schen Kontrolle der Absolutposition des Trägers vorgesehen sein. Vorteilhaft ist auch eine Einrichtung zur automatischen Fokussierung des Anregungslichtes vorgesehen. Die immobi lisierten Substanzen sind bevorzugt in einem zweidimensionalen Muster (einem sog. Array) auf dem Träger angeordnet.

Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Auswertung von Biochips. Die Biochips weisen an einer planaren Trägeroberfläche immobili sierte Substanzen auf, wobei diese immobilisierten Substanzen an der Oberfläche fixierte biologische Sonden und/oder an die Sonden gebundene Proben sein können. Dabei können die Sonden, die Proben oder die Sonden und die Proben fluoreszenzmarkiert sein. Als Trä germaterial können folgende Stoffe verwendet werden: Glas (Standardglas, Pyrexglas, Quarzglas), Kunststoffe hoher Reinheit bzw. geringer Eigenfluoreszenz (wie Polyolefine, PE, PP, Polymethylpenten, Polystyrol, PMMA, Polycarbonat, Teflon), Metalle (wie Gold, Chrom, Kupfer, Titan, Silizium), oxidische Materialien bzw. Beschichtungen (Keramiken, aluminium dotiertes Zinkoxid (TCO), Silica, Aluminiumoxid), Membranen (wie Polysacharide, Polycar bonat, Nation), dreidimensionale Strukturen (etwa Gele z. B. Polyacrylamid, Agarose, Kera miken) oder auch Formteile aus obigen Materialien wie Mikrotiterplatten, Röhrchen und Dipsticks. Für eine bessere Haftung, die Reduzierung unspezifischer Bindung oder für eine kovalente Ankopplung der biochemischen oder biologischen Sonden kann das Aufbringen einer Zwischenschicht oder eine Voraktivierung der Oberfläche notwendig sein, z. B. durch Silane (Alkylsilane, Epoxysilane, Aminosilane, Carboxysilane), Polymere (Polysaccaride, Polyethylenglycol, Polystyrol, polyfluorierte Kohlenwasserstoffe, Polyolefine, Polypeptide), Alkylthiole, derivatisierte Alkylthiole, Lipide, Lipid-Doppelschichten oder Langmuir-Blodgett Membranen. Das Aufbringen der Sonden auf die Oberfläche erfolgt durch Pipettieren, Dis pensieren, Drucken, Stempeln oder in situ Synthese (z. B. photolithographische Techniken). Es werden bevorzugt verschieden Sonden in einem zweidimensionalen Muster auf die Oberfläche aufgebracht. Jeder Sonde kann dann eine eindeutige Position auf der Oberfläche zugeordnet werden. Die Ankopplung der biochemisch oder biologischen Sonden kann ko valent, adsorptiv oder über physikalisch/chemische Wechselwirkungen der Sonden mit der Oberfläche erfolgen. Es können alle bekannten Techniken eingesetzt werden. Als Sonden werden bevorzugt verwendet: Nukleinsäuren und Oligonukleinsäuren (einzel- und/oder doppelsträngige DNA, RNA, PNA, LNA in Reinform oder auch in Kombinationen), Antikörper (humane, tierische, polyklonale, monoklonale, rekombinante, FAB-Fragmente, synthetische), Proteine (etwa Allergene, Inhibitoren, Rezeptoren), Enzyme (etwa Peroxidasen, Alkalische- Phosphatasen, Glukose-Oxidase, Nukleasen), kleine Moleküle (Haptene): Pestizide, Hor mone, Antibiotika, Pharmaka, Farbstoffe, synthetische Rezeptoren oder Rezeptorliganden. Besonders bevorzugt handelt es sich bei den Sonden um Nukleinsäuren, insbesondere Oligonukleotide.

Darüber hinaus eignet sich die erfindungsgemäße Vorrichtung für vielfältige Aufgaben in der Qualitätskontrolle. Aufgrund des konfokalen Meßprinzips eignet sich die Vorrichtung bei spielsweise zur Auswahl einer geeigneten Oberfläche mit geringer Eigenfluoreszenz, zur Kontrolle der Reinheit der Oberfläche oder zur Kontrolle der Oberflächenrauhigkeit, wobei die Auflösung im wesentlichen dem Durchmesser des Laserfokus entspricht. Ferner können mehrere Fluoreszenzfarbstoffe eingesetzt werden, die unterschiedliche Anregungs- und/oder Emissionswellenlänge und/oder ein anderes Abklingverhalten aufweisen.

Die vorliegende Erfindung wird im folgenden unter Bezugnahme auf in den beigefügten Zeichnungen dargestellte Ausführungsbeispiele ausführlicher beschrieben. In den Zeichnun gen zeigt:

Fig. 1 einen schematischen Aufbau eines erfindungsgemäßen Fluoreszenzscanners für Biochips;

Fig. 2 den zeitlichen Verlauf von zwei aufeinanderfolgenden Anregungslichtimpulsen und des durch den ersten Anregungslichtimpuls erzeugten Fluoreszenzsi gnals;

Fig. 3 ein Ablaufschema des erfindungsgemäßen Verfahrens;

Fig. 4 ein Diagramm zur Hintergrundfluoreszenz verschiedener Trägermaterialien;

Fig. 5 ein Diagramm zur Fluoreszenz oberhalb, auf und unterhalb der Oberfläche eines Trägermaterials;

Fig. 6 ein Diagramm zum Fluoreszenzprofil eines mit Goldspots beschichteten Gla strägers;

Fig. 7 eine Auswertung von Hybridisierungsexperimenten auf einem DNA. Chip unter stringenten Bedingungen;

Fig. 8 eine hochaufgelöste Fluoreszenzmessung eines DNA-Chips;

Fig. 9 eine Auswertung von Hybridisierungsexperimenten auf einem DNA. Chip unter weniger stringenten Bedingungen;

Fig. 10 ein Diagramm zum dynamischen Meßbereich und zur Linearität des erfin dungsgemäßen Fluoreszenzscanners; und

Fig. 11 ein Diagramm zur Nachweisgrenze des erfindungsgemäßen Fluoreszenz scanners bei Hybridsierungsmessungen von DNA-Chips.

In Fig. 1 ist als eine bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung zum ortsaufgelösten fluoreszenzoptischen Nachweis von auf der Oberfläche eines planaren Trägers immobilisierten Substanzen ein Fluoreszenzscanner 10 dargestellt.

Der Fluoreszenzscanner 10 weist einen mit einer Frequenz f von 50 MHz gepulsten Diodenlaser 11 auf, der einen Anregungslichtstrahl 12 aussendet, welcher über einen dichroitischen Strahlteiler 13 und ein Mikroskopobjektiv 14 auf die Oberfläche eines Biochips 15 fokussiert wird. Im Anregungsstrahlengang 12 ist ein Raumfilter 16 angeordnet. Der Raumfilter 16 besteht aus einer Sammellinse 17, die das im wesentlichen parallele Licht des Diodenlasers 11 auf ein Pinhole 18 fokussiert. Das aus dem Pinhole 18 austretende diver gente Lichtbündel wird durch die Sammellinse 19 wieder in einen parallelen Lichtstrahl mit sehr geringer Divergenz umgewandelt. Auf dem Biochip 15 befinden sich fluoreszenzmar kierte Sonden, die durch den Lichtstrahl 12 angeregt werden. Das von den Fluoreszenzson den emittierte Fluoreszenzlicht wird wiederum durch das Mikroskopobjektiv 14 gesammelt und zu einem Emissionslichtstrahl 20 gebündelt. Die Strahlengänge des Anregungs- und des Fluoreszenzlichts werden am dichroitische Strahlteiler 13 geteilt. Während das vom Laser kommende kurzwelligere Anregungslicht 12 am Strahlteiler 13 im wesentlichen reflek tiert wird, transmittiert der Strahlteiler 13 das vom Träger 15 ausgehende langwelligere Fluoreszenzlicht 20. Dadurch ist es möglich, dasselbe Mikroskopobjektiv 14 sowohl für das Anregungslicht als auch für das Fluoreszenzlicht zu verwenden. Das Fluoreszenzlicht 20 durchläuft einen als Langpaß oder als auf die Fluoreszenzwellenlänge abgestimmten Band paß ausgebildeten Emissionsfilter 21, der reflektierte oder gestreute Anteile des Anregungs lichtes 12 herausfiltert. Über einen Spiegel 22 wird das emittierte Fluoreszenzlicht 20 zu einer Sammellinse 23 geleitet, die den Strahl auf ein als konfokale Blende ausgebildetes Pinhole 24 fokussiert. Unmittelbar nach dem Pinhole 24 ist ein Detektor 25 angeordnet, beispielsweise ein Single Photon Avalange Detektor. Der Detektor 25 wandelt das gemes sene Fluoreszenzlicht in ein elektrisches Signal um, das über eine Leitung 26 zu einem Korrelator 27, etwa einem Single Photon Counter und Boxcar-Avarager, übertragen wird, der zeitkorreliertes Zählen einzelner Photonen ermöglicht. Die Zeitkorrelation des gemessenen Fluoreszenzsignals erfolgt über eine Triggerleitung 28, über welche der Diodenlaser 11 mit jedem emittierten Laserpuls ein Triggersignal an den Korrelator 27 sendet. Das Fluores zenzsignal wird mit einer Zeitauflösung von 350 ps erfaßt und über eine Datenleitung 29 an einen Computer 30 übermittelt und dort gespeichert, ausgewertet und gegebenenfalls gra phisch dargestellt.

Der Biochip 15 ist auf einem xy-Verschiebetisch 31 angeordnet, der von Schrittmotoren 32 angetrieben wird. Die Steuerung der Schrittmotoren 32 erfolgt über eine Leitung 33 durch den Computer 30. Der Verschiebetisch 31 ist sowohl in der Zeichenebene der Fig. 1 in der durch den Doppelpfeil angedeuteten Richtung, als auch in einer zur Zeichenebene senk rechten Richtung verschiebbar.

In Fig. 2 ist das Prinzip der zeitkorrelierten Fluoreszenzdetektion näher erläutert. Dargestellt ist der zeitliche Verlauf der Intensität von zwei Anregungslaserpulsen L und dem durch den ersten der beiden Pulse hervorgerufenen Fluoreszenzsignal in willkürlichen Einheiten (arbi trary units, au). Der Übersichtlichkeit halber sind die Intensitäten der Laserpulse und des Fluoreszenzlichtes unterschiedlich skaliert, so daß sie im Diagramm ungefähr gleiche abso lute Höhe besitzen. Die horizontale Zeitskala ist in Fig. 2 in Nanosekunden (ns) dargestellt.

Man erkennt zwei aufeinanderfolgende Laserpulse L des von dem Diodenlaser 11 der Fig. 1 emittierten Anregungslichtes. Bei einer Pulsfrequenz f von 50 MHz folgen die Anregungspul se einander im Abstand von 1/f = 20 ns. Zwischen den Anregungspulsen L wird während eines Meßintervalls Δtm von ca. 10 bis 15 ns Fluoreszenzlicht detektiert. Die Pulsdauer des Lasers liegt bei weniger als einer Nanosekunde, während die im dargestellten Beispiel ein gesetzte Fluoreszenzsonde Rodamin eine Fluoreszenzlebensdauer von 3,2 ns besitzt. Mit der Anstiegsflanke des Laserpulses wird ein Triggersignal ausgesandt. Wird das Fluores zenzsignal erst nach einer Verzögerung Δt von 1 bis 2 ns nach dem Triggersignal gemes sen, so ist die Intensität des Anregungspulses bei Beginn der Fluoreszenzmessung weitge hend abgeklungen. Dadurch wird eine zeitliche Diskriminierung von Anregungs- und Fluoreszenzlicht ermöglicht. Es können daher auch starke Reflexe, die vom Emissionsfilter 21 nicht vollständig ausgeblendet werden, oder auch ramanverschobenes Streulicht, welches den dichroitischen Strahlteiler 13 und den Emissionsfilter 21 passieren kann, vom eigentlich interessierenden Fluoreszenzsignal unterschieden werden. Wird zusätzlich zur zeitlichen Korrelation des Fluoreszenzsignals mit den einzelnen Anregungspulsen eine zeitaufgelöste Messung des Fluoreszenzsignals durchgeführt, so können aus dem Abklingverhalten des Fluoreszenzsignals weitere Informationen gewonnen werden. Werden beispielsweise zwei Sonden mit unterschiedlicher Fluoreszenzlebensdauer eingesetzt, so kann man aus dem Abklingverhalten Rückschlüsse auf die relativen Anteile der beiden Sonden ziehen.

In Fig. 3 ist ein prinzipielles Ablaufschema des erfindungsgemäßen Verfahrens dargestellt. Zunächst wird der Chip 15 mit Hilfe des xy-Verschiebetischs 31 so positioniert, daß der Anregungslaserstrahl 12 auf den ersten Meßpunkt fokussiert ist (vergl. Fig. 1). Ein erster Laserpuls (i = 1) mit einer Pulsbreite von weniger als einer Nanosekunde regt die im Fokus des Anregungslichtstrahls befindlichen Fluoreszenzsonden zu Emission von Fluoreszenzlicht an, das nach einer Verzögerung Δt von ca. 2 ns nach dem Laserpuls während eines Meßin tervalls Δtm von ca. 15 ns zeitaufgelöst detektiert wird. Pro Meßpunkt der Chipoberfläche wird eine bestimmte Anzahl i_max Einzelmessungen durchgeführt. Bei einer Pulsrepetitionsrate des Lasers von 50 MHz können beispielsweise i_max = 5000 Einzelmessungen pro Meßpunkt innerhalb von 100 µs durchgeführt werden. Die i_max zwischen zwei Anregungspulsen gemes senen Fluoreszenzsignale werden dann zur Verbesserung des Signal-/Rauschverhältnisses aufintegriert und gemittelt. Wenn die vorgegebene Zahl von Einzelmessungen an einem Meßpunkt erreicht ist, kann der Verschiebetisch 31 um ein bestimmtes Inkrement Δx und/oder Δy (beispielsweise 1 µm) bewegt werden, so daß sich der Fokus des Anregungsla serstrahls nun an einer anderen Stelle auf der Oberfläche des Biochips befindet. Dieser Zyklus wird solange wiederholt bis der gewünschte zweidimensionale Bereich des Biochips abgetastet ist.

Es ist aber auch möglich, die i_max Einzelmessungen durchzuführen, während der Ver schiebetische kontinuierlich bewegt wird. Δx und/oder Δy entsprechen dann der erreichbaren Auflösungen. Beispielsweise kann - mit den obigen Zahlenwerten zu Pulsfrequenz und Anzahl der aufzuintegrierenden Einzelmessungen - bei einer Abtastgeschwindigkeit von 10 mm/s eine Auflösung von 1 µm realisiert werden.

Beispiele 1. Qualitätskontrolle Hintergrundbestimmung und Reinheitskontrolle

Für die empfindliche Messung von Biochips ist es vorteilhaft, wenn das Trägermaterial eine möglichst geringe Eigenfluoreszenz an der Oberfläche aufweist. Mit dem erfindungsgemä ßen Fluoreszenzscanner, wie er im Zusammenhang mit Fig. 1 näher beschrieben wurde, läßt sich die Beschaffenheit von Trägeroberflächen sehr gut kontrollieren. In Fig. 4 sind die mit dem erfindungsgemäßen Fluoreszenzscanner gemessenen Hintergrundsignale ver schiedener Materialien dargestellt. Aufgetragen ist die relative Fluoreszenzintensität bezo gen auf Glas (= 1.00). Materialien, deren Eigenfluoreszenz in der Größenordnung von Glas oder darunter liegt, sind als Träger für Biochips besonders geeignet.

Ein Vorteil des konfokalen Meßprinzips des erfindungsgemäßen Fluoreszenzscanners ist es, daß nur das Fluoreszenzlicht eines kleinen Raumausschnittes (beispielsweise mit einer Tiefe von 10-20 µm) detektiert wird. Dies ermöglicht es, in transparenten Materialien ein Tiefen profil der Fluoreszenz aufzunehmen bzw. das Material dreidimensional zu durchleuchten. Auf diese Weise läßt sich genau nachvollziehen, ob die gemessenen Fluoreszenzsignale aus dem Trägermaterial selbst stammen oder ob es sich um Verunreinigungen auf der Oberfläche handelt. In Fig. 5 sind Messungen der Fluoreszenzintensität I (in willkürlichen Einheiten) aus drei Bereichen (Luft L, Oberfläche O und dem Inneren I des Materials) darge stellt. Die Verunreinigungen auf der Oberfläche sind deutlich zu erkennen. Diese sind nicht photostabil und bleichen bei andauernder Belichtung aus.

2. Messung von reflektierenden Oberflächen

Für viele Anwendungen (beispielsweise Oligo-SAMs auf Gold oder elektrisch adressierbare Biochips) werden metallische Trägermaterialien wie z. B. Gold benötigt. Die Messung auf diesen Oberflächen ist bei vielen Scannern nicht oder nur durch ein aufwendiges Filtersy stem möglich, da glatte Metalloberflächen das Anregungslicht reflektieren und so sehr hohe Hintergrundsignale erzeugt werden. Bei Messungen mit dem erfindungsgemäßen Fluores zenzscanner ist es durch zeitdiskriminierte Messungen möglich, diese Hintergrundsignale zeitlich auszublenden. Damit können hochempfindliche Fluoreszenzmessungen auf Metall oberflächen bei sehr niedrigem Hintergrund durchgeführt werden. In Fig. 6 ist die mit einem erfindungsgemäßen Scanner gemessene Fluoreszenz (in willkürlichen Einheiten) einer Pyrex-Glasoberfläche dargestellt, auf die 100 µm große Goldquadrate aufgebracht wurden. Wird die Oberfläche direkt gemessen (Grenzschicht Gold/Luft bzw. Glas/Luft), zeigen die Gold beschichteten Stellen ein niedrigeres Signal als das umgebende Glas.

3. Hybridisierungsexperimente 3.1 200 µm Spots

Vier 13-mer Capture-Sonden aus dem Ki-ras Gen mit Wildtyp und 3 verschiedenen Mutatio nen in Kodon 12 und 13 (Gly 12 wt AGC TGG TGG CGT A; Asp 12 AGC TGA TGG CGT A; Asp 13 TGG TGA CGT AGG C; Val 12 AGC TGT TGG CGT A; Mutationen unterstrichen) wurden jeweils als 200 µm Spots an Oberflächen gekoppelt. Nach stringenter Hybridisierung einer 24mer Cy5 Probe mit einer zu Asp 12 komplementären Sequenz (60 min bei 37°C in 6 × SSPE Puffer mit 0.1% Tween 20) wurde die Oberfläche stringent gewaschen (2 × SSPE Puffer mit 0,1% Tween 20). Nach Scannen der Oberfläche mit dem erfindungsgemäßen Fluoreszenzscanner wurde die Diskriminierung zwischen Perfect Match (Val 12) und Mis matches ausgewertet. Das Ergebnis (Mittelwert und Standardabweichung aus jeweils 3 Einzelmessungen) ist in Fig. 7 dargestellt

3.2 Messung ohne Waschschritt

Mit den Chips aus dem Beispiel 3.1. wurde eine Messung direkt nach einer Stunde Hybridi sierung mit 40 µL 10 pM 24mer-Cy5-Sonde, ohne weitere Waschritte oder Wechsel der Hybridisierungslösung durchgeführt. Durch das konfokale Meßprinzip ist eine effektive Aus blendung der Moleküle in Lösung möglich. Der Anstieg des Backgrounds ist < 1%. Ab einer Cy5 Sondenkonzentration von 10^-11 M ist kein Anstieg des Backgrounds mehr zu erkennen.

3.3 10 µm Spots

Auch sehr kleine Spots lassen sich mit dem erfindungsgemäßen Fluoreszenzscanner detek tieren und räumlich auflösen. In Fig. 8 ist die Fluoreszenzintensität entlang einer Linie (Breite 1 Pixel = 1 µm) durch ein Array eines 18-mer-Oligos (Sequenz des Perfect Matches (PM): 5'TATTCAGGCTGGGGGCTG-3') nach Hybridisierung mit einer 55-mer-Cy5-Probe dargestellt. Die Spots haben einen Durchmesser von ca. 10 µm und einen Mittenabstand von 50 µm. An den steilen Flanken in Fig. 8 ist die sehr gute Auflösung des Scanners bei Verwendung eines 100x/1.25 Ölobjektivs zu sehen. Die optische Auflösung ist im darge stellten Beispiel besser als 3 µm (90%/10%).

3.4 SH-modifizierte Oligonukleotide auf Goldoberflächen

Eine Glasoberfläche wurde mit 100 µm großen Quadraten aus Gold beschichtet. Drei Re gionen der Oberfläche wurden mit 3 verschiedenen SH-modifizierten 18-meren (Sequenz des Perfect Matches (PM): 5'TATTCAGGCTGGGGGCTG-3') derivatisiert. Es wurde mit einer Cy5-Sonde hybridisiert und niedrig stringent gewaschen (0.2 × SSCT). In Fig. 9 sind die Mittelwerte und Standardabweichungen aus jeweils 5 Einzelmessungen für Perfect Match (PM), ein Missmatch (1 MM) und 2 Missmatches (2 MM) dargestellt. Die relativ star ken Schwankungen der Meßwerte wurden in diesem Beispiel durch eine inhomogene Deri vatisierung der Goldoberfläche verursacht.

4. Dynamischer Bereich

Für die Genauigkeit und Zuverlässigkeit der Fluoreszenzmessungen ist die Dynamik und Linearität des Meßbereiches von entscheidender Bedeutung. Bei der Messung von Biochips mit immobilisierten Reagenzien wird der Meßbereich durch drei Parameter bestimmt: (1) der unteren Nachweisgrenze des Gerätes, (2) dem Meßbereich des Gerätes und (3) der maxi male Bindungskapazität der einzelnen Reagenzienspots. Um den Meßbereich des Gesamt systems zu testen wurde ein DNA-Chip hergestellt, bei dem eine maximale Belegung der Spotoberflächen mit einem 18-mer Oligo gewährleistet war. Der Spotdurchmesser betrug ca. 200 µm. Dieser Chip wurde mit steigenden Konzentrationen an Cy5-markiertem Oligo hybri disiert und nach einem Waschschritt vermessen. Das Ergebnis ist in Fig. 10 dargestellt. Die Detektionseinheit hat einen dynamischen Bereich von 4 Größenordnungen. Dieser kann durch das Zwischenschalten von Abschwächungsfiltern (Meßwerte "Filter 1" und "Filter 2" in Fig. 10) erweitert werden, bis schließlich die maximale Sättigung des Spots erreicht ist. Anstelle des Einsatzes von Filtern kann man den Meßbereich aber auch elektronisch erwei tern, beispielsweise durch Abschwächen der Empfindlichkeit des Detektors. Das Gesamtsy stem (Detektor und Biochip) verfügt somit über einen Meßbereich von ca. 4-5 Größenord nungen. Eine Linearität über 3 bis 4 Größenordnungen ist dabei je nach Filterwahl sicherge stellt. Die Standardabweichung der Messung liegt innerhalb der dargestellten Meßpunkte (der Variationskoeffizient liegt zwischen 1 und 6% bei jeweils 3 Einzelmessungen). Mit "Blank" ist in Fig. 10 eine Vergleichsmessung ohne hybridisierte Fluoreszenzprobe be zeichnet.

5. Empfindlichkeit

Die Nachweisgrenze des Gesamtsystems (Scanner und Hybridisierung) wurde mit einem Biochip bestimmt, auf dem ein 18-mer Oligo in 10 µm Spots aufgetragen war. Es wurde mit steigenden Konzentrationen einer Cy5-Probe hybridisiert. 2 µL der Probenlösung wurden auf den Chip aufpipettiert und 1 h inkubiert. Aus den in Fig. 11 dargestellten Resultaten (BG ist Intensität des Hintergrundsignals) ergibt sich eine Nachweisgrenze für dieses Testformat von ca. 10^-18 mol absolut. Damit liegt die erreichbare untere Nachweisgrenze des erfin dungsgemäßen Fluoreszenzscanners Fall unterhalb von 10^-18 mol.

Claims

1. Verfahren zum ortsaufgelösten fluoreszenzoptischen Nachweis von auf einer Ober fläche eines planaren Trägers immobilisierten Substanzen, wobei man

a) einen Anregungslichtstrahl in Form einer Serie von kurzen Lichtimpulsen auf einen Meßbereich mit definierter Größe auf der Oberfläche des Trägers ein strahlt und jeweils zwischen zwei aufeinanderfolgenden Lichtimpulsen Fluo reszenzlicht detektiert, das von in dem Meßbereich befindlichen immobilisier ten Substanzen ausgestrahlt wird,
b) den Anregungslichtstrahl und den Träger relativ zueinander bewegt,

und man die Schritte (a) und (b) solange wiederholt bis ein bestimmtes Areal der Oberfläche des Trägers abgetastet ist.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Fluoreszenz licht zeitaufgelöst detektiert.

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das Fluoreszenz licht durch zeitkorreliertes Zählen einzelner Photonen registriert.

4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man das Fluoreszenzlicht konfokal detektiert.

5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man das Fluoreszenzlicht wellenlängenabhängig detektiert.

6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man den Anregungslichtstrahl konfokal auf die Oberfläche des Trägers fokussiert.

7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß der durch den Anregungslichtstrahl definierte Meßbereich auf der Oberfläche des Trä gers eine Durchmesser von 1 bis 20 µm (FWHM) aufweist.

8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Träger verwendet, auf dem die immobilisierten Substanzen in Form eines zweidimensionalen Musters angeordnet sind, wobei man im Schritt (b) den Anre gungslichtstrahl und/oder den Träger so zueinander bewegt, daß die Elemente des zweidimensionalen Musters sequentiell abgetastet werden.

9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man die Oberfläche des Trägers durch Ablenken des Anregungslichtstrahls abtastet.

10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man die Oberfläche des Trägers durch Verschieben des Trägers in einer zu der Oberflä che parallelen Ebene abtastet.

11. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß man Anregungslicht einer definierten Wellenlänge einstrahlt.

12. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß man Anregungslicht mit mehreren definierten Wellenlängen einstrahlt.

13. Vorrichtung zum ortsaufgelösten fluoreszenzoptischen Nachweis von auf einer Ober fläche eines planaren Trägers immobilisierten Substanzen, mit
Anregungsmitteln zum Einstrahlen eines Anregungslichtstrahls in Form einer Serie von kurzen Lichtimpulsen auf einen definierten Meßbereich auf der Oberfläche des Trägers,
Detektionsmitteln zum zeitaufgelösten Detektieren von aus dem Meßbereich emittiertem Fluoreszenzlicht zwischen zwei aufeinanderfolgenden Lichtimpulsen,
Mitteln zur zeitlichen Korrelation der Anregungs- und Detektionsmittel, und
Steuerungsmittel zur Steuerung der Relativposition von Anregungsstrahl und Träger.

14. Vorrichtung gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Anregungsmittel wenigstens einen gepulsten Laser umfassen.

15. Vorrichtung gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß der gepulste Laser ein Diodenlaser ist.

16. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Anregungsmittel eine konfokale Optik zur Fokussierung des Anregungslichtstrahls auf der Oberfläche des Trägers umfassen.

17. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 13 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Detektionsmittel wenigstens einen lichtempfindlichen Sensor mit schneller Ant wortzeit umfassen.

18. Vorrichtung gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Detektionsmittel wenigstens zwei Sensoren umfassen, denen Mittel zur spektralen Zerlegung des Fluoreszenzlichtes vorgeschaltet sind.

19. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 13 oder 18, dadurch gekennzeichnet, daß der Sensor eine Photodiode, insbesondere eine Lawinen-Photodiode, ein Phototran sistor oder ein Sekundärelektronenvervielfacher (Photomultiplier) ist.

20. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 17 bis 19 dadurch gekennzeichnet, daß die Detektionsmittel eine konfokale Optik zur Abbildung von aus dem Meßbereich emit tiertem Fluoreszenzlicht auf dem Sensor umfassen.

21. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 13 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Steuerungsmittel bewegliche Spiegel und/oder akustooptische Deflektoren zur Ablenkung des Anregungslichtstrahls umfassen.

22. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 13 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Steuerungsmittel eine Betätigungseinrichtung zur zweidimensionalen Verschie bung des Trägers umfassen.

23. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 13 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß eine Einrichtung zur automatischen Fokussierung des Anregungslichtstrahls vorge sehen ist.

24. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 13 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß die immobilisierten Substanzen in einem zweidimensionalen Muster auf dem Träger angeordnet sind.

25. Verwendung der Vorrichtung nach einem der Ansprüche 13 bis 24 zur Auswertung von Biochips, welche an einer planaren Trägeroberfläche immobilisierte Substanzen aufweisen, wobei die immobilisierten Substanzen fixierte biologische Sonden und/oder an die Sonden gebundene Proben sind.

26. Verwendung nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Son den um Nukleinsäuren, insbesondere Oligonukleotide handelt.

27. Verwendung nach einem der Ansprüche 25 oder 26, dadurch gekennzeichnet, daß die immobilisierten Substanzen fluoreszenzmarkiert sind.

28. Verwendung gemäß Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß man wenigstens zwei unterschiedliche Fluoreszenzmarker verwendet, die sich in Fluoreszenzwellen länge und/oder Fluoreszenzabklingkonstante unterscheiden.