WO2002046756A1 - Kit und verfahren zur multianalytbestimmung, mit vorkehrungen zur ortsaufgelösten referenzierung einer anregungslichtintensitaet - Google Patents

Kit und verfahren zur multianalytbestimmung, mit vorkehrungen zur ortsaufgelösten referenzierung einer anregungslichtintensitaet Download PDF

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WO2002046756A1
WO2002046756A1 PCT/EP2001/012787 EP0112787W WO0246756A1 WO 2002046756 A1 WO2002046756 A1 WO 2002046756A1 EP 0112787 W EP0112787 W EP 0112787W WO 0246756 A1 WO0246756 A1 WO 0246756A1
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PCT/EP2001/012787
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Andreas P. Abel
Eveline SCHÜRMANN-MADER
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Zeptosens Ag
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
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    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
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    • G01N2035/00099—Characterised by type of test elements
    • G01N2035/00158—Elements containing microarrays, i.e. "biochip"

Definitions

  • the invention relates to various embodiments of a kit for the simultaneous qualitative and / or quantitative detection of a large number of analytes, comprising
  • At least one array of biological or biochemical or synthetic recognition elements immobilized on the sensor platform in discrete measurement areas (d) directly or via an adhesion promoter layer for the specific recognition and / or binding of said analytes and / or specific interaction with said analytes,
  • a passivation layer composed of compounds which are "chemically neutral” with respect to the analytes or a passivated adhesion-promoting layer with a surface which is “chemically neutral” with respect to the analytes between the measurement areas, luminescence-labeled molecules being associated with the passivation layer or the passivated adhesion-promoting layer in a distribution which is as homogeneous as possible via the sensor platform
  • the invention also relates to various embodiments of a kit for the simultaneous qualitative and / or quantitative detection of a large number of analytes, comprising
  • luminescence-marked molecules are associated with layer (g) applied to the sensor platform in a distribution that is as homogeneous as possible via the sensor platform, which serve for spatially resolved referencing of the excitation light intensity available in the measurement areas or in their vicinity.
  • the invention also relates to methods carried out with the kits according to the invention for the detection of one or more analytes and their use.
  • microtiter plates For the determination of a large number of analytes, above all methods are widespread in which the detection of different analytes in so-called microtiter plates takes place in discrete sample containers or "wells" of these plates.
  • the most widespread are plates with a grid of 8 x 12 wells on a base area of typically approx. 8 cm x 12 cm, a volume of a few hundred microliters being required to fill an individual well.
  • US Pat. No. 5,747,274 describes measurement arrangements and methods for the early detection of a heart attack by the determination of a plurality of at least three heart attack markers, the determination of these markers being able to take place in individual or in a common sample container, in the latter case following the description given a single sample container is designed as a continuous flow channel, the boundary surface of which, for example, forms a membrane on which antibodies for the three different markers are immobilized.
  • a single sample container is designed as a continuous flow channel, the boundary surface of which, for example, forms a membrane on which antibodies for the three different markers are immobilized.
  • no geometrical information about the size of the measuring surfaces is given.
  • a light wave is coupled into an optical waveguide which is surrounded by optically thinner media, ie media with a lower refractive index, it is guided by total reflection at the interfaces of the wave-guiding layer.
  • a fraction of the electromagnetic energy enters the optically thinner media. This proportion is known as the evanescent or cross-damped field.
  • the strength of the evanescent field is very much dependent on the thickness of the waveguiding layer itself and on the ratio of the refractive indices of the waveguiding layer and the media surrounding it.
  • thin waveguides that is to say layer thicknesses of the same or a lower thickness than the wavelength to be guided, discrete modes of the guided light can be distinguished.
  • Such methods have the advantage that the interaction with the analyte is limited to the depth of penetration of the evanescent field into the adjacent medium, on the order of a few hundred nanometers, and interference signals from the depth of the medium can be largely avoided.
  • the first proposed measurement arrangements of this type were based on multimodal, self-supporting single-layer waveguides, such as fibers or platelets made of transparent plastic or glass, with thicknesses from a few hundred micrometers to several millimeters. Planar thin-film waveguides have been proposed to improve sensitivity and, at the same time, simplify mass production.
  • a planar thin-film waveguide consists of a three-layer system: carrier material (b), waveguiding layer (a), superstrate (or sample to be examined), the waveguiding layer having the highest refractive index. Additional intermediate layers can improve the effect of the planar waveguide.
  • luminescence denotes the spontaneous emission of photons in the ultraviolet to infrared range after optical or non-optical, such as, for example, electrical or chemical or biochemical or thermal excitation.
  • chemiluminescence, bioluminescence, electroluminescence and in particular fluorescence and phosphorescence are included under the term “luminescence”.
  • luminescence-based methods appear to be more suitable than methods based on a change in the effective refractive index (such as grating coupler sensors or methods based on surface plasmon resonance) due to the greater selectivity of signal generation.
  • the luminescence excitation is limited to the depth of penetration of the evanescent field into the optically thinner medium, i.e. to the immediate vicinity of the wave-guiding region with a depth of penetration of the order of a few hundred nanometers into the medium. This principle is called evanescent luminescence excitation.
  • WO 95/33197 describes a method in which the excitation light is coupled into the waveguiding film as a diffractive optical element via a relief grating.
  • the surface of the sensor platform is brought into contact with a sample containing the analyte, and the isotropically illuminated luminescence in the penetration depth of the evanescent field of luminescent substances is measured by means of suitable measuring devices, such as photodiodes, photomultipliers or CCD cameras. It is also possible to decouple and measure the portion of the evanescently excited radiation fed back into the waveguide via a diffractive optical element, for example a grating. This method is described for example in WO 95/33198.
  • spatially separated measuring ranges or “discrete measuring ranges” in the sense of the present invention is defined in more detail in the following section for a precise description of the invention.
  • US 5525466 and US 5738992 describe an optical sensor based on fluorescence excitation in the evanescent field of a self-supporting multimode waveguide, preferably of a fiber-optic type.
  • the excitation light is coupled in and the fluorescent light fed back into the multimode waveguide is coupled out via coupling in and out of the end face.
  • the fluorescence signal detected here for the analyte detection results on the basis of the functional principle of such multimode waveguides as a single integral value for the entire surface interacting with the sample.
  • fluorescent reference materials are co-immobilized on the sensor surface in addition to the biochemical or biological detection elements for the specific detection and binding of an analyte to be detected.
  • WO 97/35181 describes methods for the simultaneous determination of one or more analytes in that "well" patches formed in a waveguide are formed with different detection elements, which are contacted with a sample solution containing one or more analytes.
  • solutions with defined analyte concentrations are simultaneously added to other wells with similar patches.
  • 3 wells for measurement with calibration solutions of low and high analyte concentration as well as the current sample
  • discrete and immobilized detection elements that differ from patch to patch are used simultaneously Determination of several analytes presented. There are no indications of spatially resolved referencing.
  • hl Analytical Chemistry, Vol. 71 (1999), 3846 - 3852 also presents a multianalyt assay for the simultaneous determination of three different analytes.
  • Bacillus globigii, MS2 bacteriophages and "Staphylococcal enderotoxin B" are used as examples of analytes from the groups bacteria, viruses and proteins that are to be determined at the same time.
  • Antibodies against these analytes are placed in two rows (channels) parallel to each other on a ) Waveguide serving glass plate were immobilized.
  • a flow cell with flow channels crossed to the immobilized rows of recognition elements is placed on the glass plate.
  • the sandwich immunoassays are carried out with sequential addition of washing solution (buffer), sample with one or more analytes, washing solution (buffer), tracer antibody (individually or as a cocktail) and washing solution (buffer).
  • the locally measured fluorescence intensities are corrected by subtracting the background signal observed next to the measuring fields.
  • this arrangement also does not allow an entire series of measurements for the simultaneous determination of several analytes, together with the necessary calibrations, but requires either the use of several different sensor platforms or repetitive, sequential measurements on a platform with interim regeneration, which is only possible to a limited extent in many cases, especially in the case of hnmunoassays ,
  • the invention relates to a kit for the simultaneous qualitative and / or quantitative detection of a large number of analytes, comprising
  • a sensor platform at least one array of biological or biochemical or synthetic recognition elements immobilized on the sensor platform in discrete measurement areas (d) directly or via an adhesion promoter layer for the specific recognition and / or binding of said analytes and / or specific interaction with said analytes,
  • a passivation layer composed of compounds which are "chemically neutral” with respect to the analytes or a passivated adhesion-promoting layer with a surface which is “chemically neutral” with respect to the analytes between the measurement areas, luminescence-labeled molecules being associated with the passivation layer or the passivated adhesion-promoting layer in a distribution that is as homogeneous as possible via the sensor platform which serve for spatially resolved referencing of the excitation light intensity available in the measurement areas or in their vicinity.
  • this passivation layer will generally only be located in the areas between the measurement areas (d). If the luminescence-labeled molecules mentioned for the spatially resolved referencing of the available excitation light intensity ("referencing label") to the "chemically neutral” compounds (see below) from which the passivation layer is formed are bound before their application, these "referencing labels” are consequently included in the The "referencing labels” can also be applied to the sensor platform in a separate step before the passivation layer is applied, in this case, and in particular if the "" referencing labels "are part of an adhesion promoting layer or after they have been applied, but before the biological or biochemical or synthetic recognition elements are applied to the sensor platform, they will also be located in the areas of the discrete measurement areas (for the analyte detection). - The requirements for the spectral properties of the "referencing label”, in particular for the latter case, are explained below.
  • the invention also relates to a kit for the simultaneous qualitative and / or quantitative detection of a large number of analytes, comprising - a sensor platform
  • kit according to the invention it is possible in multianalyt assays for the simultaneous determination of several analytes in a sample to achieve a sensitivity and reproducibility which is similar to that in a corresponding number of individual assays for the detection of individual analytes.
  • the compounds which are "chemically neutral" with respect to the analytes are selected from the groups consisting of albumin, in particular bovine serum albumin or human serum albumin, casein, non-specific, polyclonal or monoclonal, foreign or empirically unspecific antibodies for the analyte or analytes to be detected (in particular for hnmunoassays), detergents - such as, for example, Tween 20 -, fragmented natural or synthetic DNA that does not hybridize with polynucleotides to be analyzed, such as an extract of herring or salmon sperm (especially for polynucleotide hybridization assays), or also uncharged but hydrophilic polymers, such as polyethylene glycols or dextrans.
  • albumin in particular bovine serum albumin or human serum albumin
  • casein non-specific, polyclonal or monoclonal, foreign or empirically unspecific antibodies for the analyte or analytes to be detected
  • detergents - such as,
  • the luminescence-labeled molecules distributed as homogeneously as possible therein can be, for example, luminescence-labeled derivatives of the above-mentioned compounds, which are mixed with the corresponding unlabeled compounds before application to the sensor platform.
  • the linkage of said unlabelled “chemically neutral” compounds with corresponding luminescence labels to form the luminescence-labeled derivatives can be covalent in nature or based, for example, on electrostatic, ionic, hydrophobic or hydrophilic or van der Waals interactions.
  • the luminescence labels can also, without Generation of luminescence-labeled derivatives with which said “chemically neutral” compounds are mixed before this mixture is applied to the sensor platform to produce the passivation layer.
  • the “referencing labels” can also be applied in a separate step before the passivation layer is applied.
  • the choice of the proportion of luminescence labels in the passivation layer can be adapted to the amount of luminescence signals to be expected in an analyte detection method to be carried out with the kit according to the invention, for example in order to impair the Avoid detection sensitivity for an analyte, for example due to excessive luminescence signals from the passivation layer. If the "referencing label" is applied separately, similar requirements apply.
  • the passivation layer is “stable” under the conditions of an analyte detection to be carried out with the kit according to the invention, ie that there is in particular no measurable leakage of luminescence labels into a sample or reagent liquid that may have been brought into contact with the sensor platform in an assay comes, and that the luminescence label of the passivation layer has a sufficiently high thermal and photochemical stability, so that there is no measurable signal loss of the generated signals for spatially resolved referencing, at least during the duration of an analyte detection.
  • said immobilized biological or biochemical or synthetic recognition elements are selected from the group consisting of nucleic acids (for example DNA, RNA, oligonucleotides) and nucleic acid analogs (for example PNA), mono- or polyclonal antibodies, peptides, enzymes, Aptamers, synthetic peptide structures, soluble, membrane-bound and isolated from a membrane Proteins, such as receptors, their ligands, antigens for antibodies, "histidine tag components" and their complexing partners, cavities generated by chemical synthesis for the absorption of molecular hnprints, etc. are formed. It is also provided that whole cells, cell components, cell membranes or their fragments are applied as biological or biochemical or synthetic recognition elements.
  • the analyte detection is based on the determination of the change in one or more luminescences.
  • a possible embodiment is characterized in that the excitation light is irradiated by one or more light sources in an incident light arrangement.
  • the material of the sensor platform that is in contact with the measuring regions is transparent or absorbent within a depth of at least 200 nm from the measuring regions with at least one excitation wavelength.
  • excitation light is irradiated by one or more light sources in a transmission light arrangement.
  • the material of the sensor platform is transparent at at least one excitation wavelength.
  • a preferred embodiment of a kit according to the invention is characterized in that the sensor platform is designed as an optical waveguide, which is preferably essentially planar.
  • the sensor platform preferably comprises a material from the group consisting of silicates, e.g. B. glass or quartz, transparent thermoplastic or sprayable plastic, for example polycarbonate, polyimide, acrylates, in particular polymethyl methacrylate, or polystyrenes is formed.
  • a particularly preferred embodiment of a kit according to the invention is characterized in that the sensor platform has an optical thin-film waveguide with a layer (a) transparent at at least one excitation wavelength on a at least this excitation wavelength also comprises transparent layer (b) with a lower refractive index than layer (a).
  • the excitation light from one or more light sources is coupled into the optical waveguide by means of a method which is selected from the group consisting of end face coupling, coupling via attached optical fibers as light guides, Prism coupling, grating coupling or evanescent coupling by overlapping the evanescent field of said optical waveguide with the evanescent field of a further waveguide which is brought into near-field contact is formed.
  • the aim should be to avoid the generation of reflections of the excitation light radiated in as far as possible, since these generally lead to an increase in background signals, essentially disadvantageously.
  • the occurrence of reflections is to be expected in principle each time the excitation light passes through optical interfaces to media with different refractive indices. It is therefore advantageous if the excitation light from one or more light sources is coupled into the optical waveguide by means of an optical coupling element in contact therewith, which is selected from the group of optical fibers as light guides, prisms, optionally via a liquid that adjusts the refractive index, and grid couplers.
  • kits according to the invention are particularly preferred, which is characterized in that the excitation light from one or more light sources is coupled into the layer (a) by means of one or more grating structures (c) modulated in the layer (a).
  • Suitable geometrical arrangements of such lattice structures for a sensor platform as part of a kit according to the invention are again, for example, in the patents US 5,822,472, US 5,959,292 and US 6,078,705 and in the patent applications WO 96/35940, WO 97/37211, WO 98/08077, WO 99/58963 , PCT / EP 00/04869 and PCT / EP 00/07529 and are also part of the present invention as an integral part of a kit according to the invention.
  • the sensor platform comprises uniform, unmodulated regions of the layer (a), which are preferably arranged in the direction of propagation of the excitation light coupled in via a grating structure (c) and guided in the layer (a).
  • lattice structures (c) can be used to couple excitation light to the measuring areas (d) and / or to couple luminescent light fed back into layer (a).
  • the sensor platform will therefore comprise a plurality of lattice structures (c) of the same or different periods with, if appropriate, adjoining uniform, unmodulated regions of the layer (a) on a common, continuous substrate.
  • a suitable excitation light via a grating structure (c) to which an unmodulated area of the layer (a) is directed in the direction of propagation of the light that is coupled in and guided in the layer (a).
  • a grating structure (c) to which an unmodulated area of the layer (a) is directed in the direction of propagation of the light that is coupled in and guided in the layer (a).
  • this is advantageously followed by a further lattice structure with a further array of measurement areas located behind it, etc.
  • the light guided in layer (a) is in each case coupled out again.
  • each array of measurement areas following in the direction of propagation of the coupled excitation light is assigned a grating structure (c) specific to this array for decoupling this excitation light, wherein the grating structures can be formed specifically for individual arrays perpendicular to the direction of propagation of the coupled excitation light or can also be can extend over the entire sensor platform in this direction.
  • the coupling-in grating of an array following in the direction of propagation of an excitation light guided in the layer (a) of a sensor platform serves as coupling-out grating for the excitation light coupled in on the coupling-in grating of the array preceding in said direction of propagation.
  • the sensor platform comprises a superimposition of 2 or more grating structures of different periodicity with parallel or non-parallel, preferably non-parallel alignment of the grating lines , which is used for coupling excitation light of different wavelengths, the grating lines in the case of 2 superimposed grating structures preferably being oriented perpendicular to one another.
  • the subdivision of the sensor platform into areas with lattice structures and adjoining unmodulated areas means that the space required for a single array of measurement areas between successive lattice structures (including at least one assigned lattice structure) cannot fall below a certain minimum, which the current technical possibilities for producing the lattice structures and for coupling in a suitable excitation light bundle are of the order of magnitude of approximately 0.1 mm 2 to 1 mm 2 . It is therefore particularly advantageous for arrangements in which a large number of small-area arrays is desired if a lattice structure (c) or a superposition of a plurality of lattice structures in layer (a) is modulated essentially over the entire area of the sensor platform.
  • optically or mechanically recognizable markings are applied to the sensor platform to facilitate adjustment in an optical system and / or for connection to sample containers as part of an analytical system.
  • a further embodiment of the arrangement according to the invention is that between the optically transparent layers (a) and (b) and in contact with layer (a) there is another optically transparent layer (b ') with a lower refractive index than that of layer (a ) and a thickness of 5 nm - 10000 nm, preferably of 10 nm - 1000 nm.
  • the simplest form of immobilization of the biological or biochemical or synthetic recognition elements consists in physical adsorption, for example as a result of hydrophobic interactions between the recognition elements and the base plate.
  • these interactions can be greatly changed in their extent by the composition of the medium and its physicochemical properties, such as polarity and ionic strength.
  • the adhesion of the recognition elements after purely adsorptive immobilization on the surface is often inadequate.
  • the adhesiveness is improved in that an adhesion-promoting layer (f) is applied to the sensor platform for immobilizing biological or biochemical or synthetic recognition elements.
  • the adhesion-promoting layer can also serve, in particular in the case of biological or biochemical recognition elements to be immobilized, to improve the "biocompatibility" of their surroundings, ie to maintain the binding capacity compared to their natural biological or biochemical surroundings, and in particular to avoid denaturation. It is preferred that the adhesion promoting layer (f) has a thickness of less than 200 nm, preferably less than 20 nm. A large number of materials are suitable for producing the adhesion-promoting layer.
  • the adhesion promoting layer (f) comprise one or more chemical compounds from the groups comprising silanes, functionalized silanes, epoxies, functionalized, charged or polar polymers and "self-organized passive or functionalized mono- or multilayers".
  • the adhesion-promoting layer can additionally comprise “referencing labels” associated with it for spatially resolved referencing of an available excitation light intensity, these “referencing labels” together and, if appropriate, to the mentioned components of the adhesive layer can be bound or applied in a separate step.
  • kits according to the invention are immobilized in spatially separated measuring areas (d). These spatially separated measuring areas (d) can be generated by spatially selective application of biological or biochemical or synthetic detection elements on the sensor platform. A large number of known processes are suitable for the application.
  • one or more methods from the group of methods used by "inkjet spotting", mechanical spotting by means of pen, pen or capillary, "micro.” are used to apply the biological or biochemical or synthetic recognition elements to the sensor platform contact printing ", fluidic contacting of the measuring areas with the biological or biochemical or synthetic recognition elements by their supply in parallel or crossed microchannels under the influence of pressure differences or electrical or electromagnetic potentials" as well as photochemical and photolithographic immobilization processes.
  • a further special embodiment of the kit according to the invention is that the density of the detection elements immobilized in discrete measurement areas for the detection of different analytes on different measurement areas is selected such that the luminescence signals when detecting different analytes are of the same order of magnitude in a common array, that is to say that if necessary the associated calibration curves for the analyte determinations to be carried out simultaneously can be recorded without changing the electronic or optoelectronic system settings.
  • kits according to the invention are characterized in that arrays of measurement areas are divided into segments of one or more measurement areas for determining analytes and areas between these measurement areas or additional measurement areas for the purpose of additional physical referencing, such as the influence of changes in external ones Parameters such as temperature and for the purpose of referencing the influence additional physical-chemical parameters, such as non-specific binding to the sensor platform of components of an applied sample.
  • two or more arrays it is advantageous for two or more arrays to have a similar geometric arrangement of measurement areas and / or segments of measurement areas for the determination of similar ones Have analytes on these arrays.
  • one or more arrays comprise segments of two or more measurement areas with biological or biochemical or synthetic recognition elements of the same type within the segment for analyte determination or referencing.
  • the kit according to the invention with a large number of measuring ranges in discrete arrays, a large number of which in turn can be arranged on a common sensor platform offers the possibility of using relatively small amounts of sample solutions, reagents or, if appropriate, calibration solutions on one and the same platform, under largely identical conditions, many types of duplications or multiple executions of the same measurements can be carried out. In this way, for example, statistical data can be generated in a single measurement, for which a large number of individual measurements with a correspondingly longer overall measurement time and a higher consumption of sample and reagent quantities are conventionally required. It is preferred that 2 or more identical measurement areas are provided within a segment or array for the detection of each analyte or for referencing.
  • said identical measuring ranges can be going row or column or diagonals of an array or segment of measurement areas.
  • the referencing aspects can relate to physical or physico-chemical parameters of the sensor platform, such as local differences in the excitation light intensity (see also below), as well as influences of the sample, such as its pH, ionic strength, refractive index, temperature etc.
  • said identical measuring ranges are arranged statistically within an array or segment of measuring ranges.
  • the kit according to the invention can comprise a very large number of individual measuring ranges. It is preferred that up to 100,000 measuring ranges are arranged in a 2-dimensional arrangement and that a single measuring range occupies an area of 0.001-6 mm 2 . Preferably, more than 100, more preferably more than 1000, even more preferably more than 10,000 measuring ranges are arranged on a sensor platform as part of the kit according to the invention.
  • Another object of the invention is an embodiment of the kit according to the invention, in which the upper side of the sensor platform with the measurement areas generated thereon is brought together with another body above the optically transparent layer (a) in such a way that one or more is present between the sensor platform as the base plate and said body spatial cutouts for generating one or more sample containers fluidly sealed against one another are produced, in each of which there are one or more measuring areas or segments or arrays of measuring areas.
  • sample containers are designed as flow cells that are fluidically sealed from one another, each with at least one inlet and at least one outlet and, if appropriate, additionally leads at least one outlet of each flow cell into a reservoir that is fluidly connected to this flow cell and that emerges from the flow cell Absorbs liquid.
  • the optionally additionally available reservoir for receiving liquid emerging from the flow cell is designed as a recess in the outer wall of the body brought together with the sensor platform as the base plate.
  • the optionally additionally available reservoir for receiving liquid emerging from the flow cell is designed as a recess in the outer wall of the body brought together with the sensor platform as the base plate.
  • the spatial recesses between the sensor platform as the base plate and the body brought together with it are various technical options.
  • recesses it is also possible for recesses to be formed in the sensor platform in order to generate the spatial recesses between the sensor platform as the base plate and the body brought together with it.
  • a further embodiment consists in that recesses are formed in said body in order to produce the recesses between the base plate and the body brought together therewith. It is preferred for this embodiment that the base plate is essentially planar.
  • the body to be brought together with the base plate for producing the array of flow cells can consist of a single workpiece.
  • Another embodiment consists in that the body brought together with the base plate is composed of several parts, the joined components of said body preferably forming an irreversibly joined unit.
  • the body brought together with the base plate comprises auxiliary measures which facilitate the joining together of said body and the base plate.
  • the arrangement preferably comprises a multiplicity, ie 2 to 2000 sample containers, preferably 2 to 400, particularly preferably 2 to 100 sample containers.
  • the sample containers are open on the side of the body which is brought together with the sensor platform as the base plate and is opposite the measurement areas.
  • the grid (sequence in rows and / or columns) of the sample containers corresponds to the grid of the wells of a standard microtiter plate.
  • Another embodiment of the arrangement of sample containers as part of the kit according to the invention is characterized in that it is closed by an additional closure, for example a film, membrane or a cover plate.
  • the receptivity of the flow cells can be varied within a wide range, so that the volume of each sample container is typically 0.1 ⁇ l - 1000 ⁇ l, preferably 1 ⁇ l - 20 ⁇ l.
  • the internal volumes of different flow cells of an arrangement can be the same or different.
  • the depth of the recesses between the sensor platform as the base plate and the body joined therewith is 1 to 1000 ⁇ m, particularly preferably 20 to 200 ⁇ m.
  • the size of the recesses of an array can be uniform or different and the base areas can have any, preferably rectangular or polygonal or other geometry.
  • the lateral dimensions of the base areas can be varied within a wide range, typically the base areas of the recesses between the grand plate and the body joined therewith each being 0.1 mm 2 - 200 mm 2 , preferably 1 mm 2 - 100 mm 2 .
  • the corners of the bases are rounded. Rounded corners have a favorable effect on the flow profile and facilitate the removal of any gas bubbles that may have formed from the flow cells or prevent their formation.
  • multi-channel pipettors can be used for manual or automatic reagent application, in which the individual pipettes are arranged in one- or two-dimensional arrays, provided that the arrangement of sample containers as part of the kit according to the invention includes the inlets in the has the appropriate grid.
  • the grid (sequence in rows and columns) of the arrangement therefore preferably corresponds to the grid of the wells of standard microtiter plates.
  • An arrangement of 8 x 12 wells with a (center-to-center) spacing of approx. 9 mm has been established as an industrial standard. Smaller arrays with, for example, 3, 6, 12, 24 and 48 are compatible with this Wells equidistant. It is also possible to combine several arrangements of sample containers according to the invention with such smaller arrays of flow cells in such a way that the individual inlets of said flow cells are arranged in an integral multiple of the distance of approximately 9 mm.
  • plates with 384 and 1536 wells, an integral multiple of 96 wells on the same footprint with a correspondingly reduced well spacing, have also been used, which should also be referred to as standard microtiter plates.
  • the outer basic dimensions of the arrangement of sample containers, as part of the kit according to the invention preferably correspond to the basic dimensions of these standard microtiter plates.
  • Another object of the invention is an arrangement of, for example, 2 to 8 sample containers as part of the kit according to the invention, with the properties mentioned above, in a column or, for example, 2 to 12 sample containers in a row, which on the other side with a carrier ("meta carrier") with the Dimensions of standard microtiter plates are combined in such a way that the grid (sequence in rows or columns) of the inflows of the sample containers corresponds to the grid of the wells of a standard microtiter plate.
  • a carrier metal carrier
  • the grid (sequence in rows or columns) of the inflows of the flow cells corresponds to the grid of the wells of a standard microtiter plate, i. H. corresponds to an integer multiple of 9 mm (corresponding to 96-well plate) or 4.5 mm (corresponding to 384-well plate, see above) or 2.25 mm (corresponding to 1536-well plate, see above).
  • the arrangement of sample containers can of course also be designed in a different grid.
  • the materials for the body brought together with the sensor platform as the base plate and any additional cover plate that may be used must meet the requirements for the planned use of the arrangement.
  • these requirements relate to chemical and physical resistance, for example against acidic or basic media, salts, alcohols or detergents as components of aqueous solutions, or formamide, temperature resistance (for example between -30 ° C and 100 ° C) , thermal expansion coefficients of the base plate and the body brought together therewith as similar as possible, optical properties (eg freedom from fluorescence, reflectivity), mechanical workability etc.
  • the material of the body brought together with the base plate and an optional additional closure from the same Group how the material of the "meta carrier" is selected.
  • the components mentioned can each consist of a uniform material and also comprise a mixture or layer-by-layer or lateral connection of different materials, the materials being able to replace one another.
  • the precautions for spatially resolved referencing of the excitation light intensity available in the measurement areas or in their surroundings comprise averaging over several spatially resolved reference signals.
  • excitation light intensities that do not vary statistically, but systematically, in the form of a gradient that is present over certain distances, it can be advantageous if an interpolation is made to the expected value of the excitation light intensity of a measuring range lying between different regions for spatially resolved referencing.
  • kits according to the invention relate to precautions to calibrate luminescence signals recorded in the presence of one or more analytes.
  • said precautions for calibrating luminescence generated as a result of the binding of one or more analytes or as a result of the specific interaction with one or more analytes include the addition of calibration solutions with known concentrations of the analytes to be detected to a predetermined number of arrays. For example, it is possible that 8-12 arrays of a sensor platform are provided for calibration purposes. With the large number of measuring ranges on a sensor platform, the kit according to the invention enables a further possibility of calibration that has not been described previously.
  • the invention therefore furthermore relates to a kit which is characterized in that in one or more arrays there are in each case a plurality of measurement areas with biological or biochemical or synthetic recognition elements immobilized there in a different, controlled density for the detection of an analyte common to these measurement areas. It is particularly preferred that with known concentration dependency of the binding signals between an analyte and its biological or biochemical or synthetic recognition elements and a sufficiently large "variation" of these recognition elements immobilized in different controlled densities in different measurement areas of an array by adding a single calibration solution to this array a calibration curve can be created for this analyte.
  • Another object of the invention is the use of a kit according to one of the abovementioned embodiments in an analytical system for determining one or more luminescences.
  • Another object of the invention is an analytical system with any embodiment of the kit according to the invention, characterized in that it additionally comprises at least one detector for detecting one or more luminescence from the grating waveguide structure.
  • the invention in particular relates to an analytical system for determining one or more luminescences
  • At least one detector for detecting the light emanating from one or more measuring ranges (d) on the sensor platform.
  • a possible embodiment of the analytical system is characterized in that the excitation light is irradiated to the measurement areas in an incident light or transmission light arrangement.
  • the detection of the luminescent light is carried out in such a way that the luminescent light coupled out from a grating structure (c) or (c ') is also detected by the detector.
  • a preferred embodiment of the analytical system according to the invention is characterized in that the excitation light emitted by the at least one excitation light source is essentially parallel and at the resonance angle for coupling into the optically transparent layer (a) onto a grating structure (c) modulated in layer (a) ) is irradiated.
  • the excitation light is expanded by at least one light source with an expansion optic to form an essentially parallel beam and, at the resonance angle, for coupling into the optically transparent layer (a) to a large-area grating structure (c) modulated in layer (a) ) is irradiated.
  • a large number of further suitable analytical systems with a kit according to the invention as a component thereof are described, for example, in the patents US Pat. No. 5,822,472, US Pat. No. 5,959,292 and US Pat. No.
  • the analytical system according to the invention additionally comprises feed access means in order to bring the one or more samples into contact with the measurement areas on the sensor platform.
  • Another object of the invention is a method for the simultaneous qualitative and / or quantitative detection of a large number of analytes using a kit according to one of the abovementioned embodiments, characterized in that for spatially resolved referencing of the measurement areas (d) on the sensor platform, as part of the kit , or in the vicinity of the excitation light intensity available, the luminescence signals of luminescence-marked molecules distributed as homogeneously as possible over the sensor platform, which are associated with a passivation layer or passivated adhesion-promoting layer applied to said sensor platform, to minimize non-specific binding between the measurement areas, are determined.
  • the invention also relates to a method for the simultaneous qualitative and / or quantitative detection of a large number of analytes using a kit according to one of the abovementioned embodiments, characterized in that for spatially resolved referencing of the measurement areas (d) on the sensor platform as part of the kit , or in the vicinity of these excitation light intensities available, the luminescence signals of luminescence-marked molecules distributed as homogeneously as possible over the sensor platform, which are associated with a thin layer (g) applied to said sensor platform, are determined.
  • the quantitative and / or qualitative detection of said large number of analytes can include the use of one or more signal-generating components as labels, which can be selected from the grapple, which is used, for example, by luminescence labels, in particular luminescent intercalators or "molecular beacons", absorption labels, mass labels, in particular metal colloids or plastic beads, spin labels, such as ESR or NMR labels, radioactive labels are formed.
  • luminescence labels in particular luminescent intercalators or "molecular beacons”
  • absorption labels mass labels, in particular metal colloids or plastic beads
  • spin labels such as ESR or NMR labels
  • the spatially resolved referencing of the excitation light available in the vicinity of the measuring ranges and / or an analyte detection possibly based on absorption and / or luminescence detection may be based on the use of labels with the same or different absorption and / or luminescence wavelength.
  • the analyte detection be based on determining the change in one or more luminescences. It is advantageous if the luminescence-labeled molecules (“reference label”) distributed as homogeneously as possible in the passivation layer and the luminescence label (“detection label”) used to detect one or more analytes can be excited at different wavelengths and preferably also emit at different wavelengths. It is particularly preferred if the absorption and luminescence spectra of the "referencing label” and "detection label” used overlap as little as possible, ideally not at all.
  • Another preferred embodiment for certain applications is characterized in that the "referencing label” and “detection label” can be excited at the same wavelength, but emit at different wavelengths.
  • a possible embodiment is characterized in that the excitation light is irradiated by one or more light sources in an incident light arrangement.
  • excitation light is irradiated by one or more light sources in a transmission light arrangement.
  • a preferred object of the invention is an embodiment of the method according to the invention, which is characterized in that the sensor platform as one optical waveguide is formed, which is preferably essentially planar, and that the excitation light from one or more light sources is coupled into the optical waveguide by means of a method which is selected from the Grappe, which comprises end face coupling, coupling via attached optical fibers as light guides, Prism coupling, grating coupling or evanescent coupling by overlapping the evanescent field of said optical waveguide with the evanescent field of a further waveguide that is brought into close-field contact is formed.
  • the Grappe which comprises end face coupling, coupling via attached optical fibers as light guides, Prism coupling, grating coupling or evanescent coupling by overlapping the evanescent field of said optical waveguide with the evanescent field of a further waveguide that is brought into close-field contact is formed.
  • the excitation light from one or more light sources is coupled into the optical waveguide by means of an optical coupling element in contact with it.
  • an optical coupling element which is selected from the group of optical fibers as light guides, prisms, optionally via a refractive index-adjusting liquid, and grating couplers.
  • Such an embodiment of the method according to the invention is particularly preferred, which is characterized in that the sensor platform has an optical thin-film waveguide with a layer (a) transparent at at least one excitation wavelength on a layer (b) which is also transparent at at least this excitation wavelength and has a lower refractive index than layer ( a) and that the excitation light from one or more light sources is coupled into the layer (a) by means of one or more grating structures (c) modulated in the layer (a).
  • This embodiment of the method can be carried out in such a way that one or more liquid samples to be examined for said analytes are brought into contact with the measurement areas on the sensor platform, one or more luminescences generated in the near field of layer (a) from those with said sample or said Samples brought into contact with measurement areas, as a result of the binding of one or more analytes to the biological or biochemical or synthetic recognition elements immobilized in said measurement areas or the interaction between said analytes and said immobilized recognition elements, and if necessary additionally in a spatially resolved manner the measurement areas or available excitation light intensity is referenced in their environment. It is preferred that (1) the isotropically emitted luminescence or (2) the luminescence or luminescence of both components (1) and (2) coupled into the optically transparent layer (a) and coupled out via lattice structures (c) are measured simultaneously.
  • luminescent dyes or luminescent nanoparticles which can be excited and emit at a wavelength between 300 nm and 1100 nm, are used as luminescent labels to generate the luminescences of the “reference label” and the “detection label”.
  • the "detection label" is bound to the analyte or in a competitive assay to an analog of the analyte or in a multi-stage assay to one of the binding partners of the immobilized biological or biochemical or synthetic recognition elements or to the biological or biochemical or synthetic recognition elements ,
  • Another embodiment of the method is characterized in that a second or even more "detection label" with the same or different excitation wavelength as the first "detection label” and the same or different emission wavelength is used.
  • the second or even more “detection label” can be excited at the same wavelength as the first luminescent dye, but emit at other wavelengths.
  • a variant of the method consists in that charge or optical energy transfer from a first luminescent dye serving as donor to a second luminescent dye serving as acceptor is used to detect the analyte.
  • Another possible embodiment of the method is that the extent of the quenching of one or more luminescences is determined. Another embodiment of the method is characterized in that, in addition to the determination of one or more luminescences, changes in the effective refractive index on the measurement areas are determined.
  • a further development of the method is characterized in that the one or more luminescences and / or determinations of light signals are carried out polarization-selectively at the excitation wavelength.
  • the one or more luminescences are measured with a different polarization than that of the excitation light.
  • a preferred embodiment of the method according to the invention is characterized in that the density of the detection elements immobilized in discrete measurement areas for the detection of different analytes on different measurement areas is selected such that the luminescence signals when detecting different analytes in a common array are of the same order of magnitude, that is to say that the The associated calibration curves for the analyte determinations to be carried out simultaneously can be recorded without changing the electronic or optoelectronic system settings.
  • a further development of the method is characterized in that arrays of measurement areas are divided into segments of one or more measurement areas for the determination of analytes and areas between these measurement areas or additional measurement areas for the purpose of additional physical referencing, such as the influence of changes in external parameters, for example the temperature, and for purposes of reference the influence of additional physico-chemical parameters, such as, for example, non-specific binding to the sensor platform of components of an applied sample.
  • Non-specific binding components of an applied sample can be, for example, the one or more analytes themselves, detection reagents added to the sample for analyte detection, for example secondary, luminescence-labeled antibodies in a sandwich immunoassay, or components of the sample matrix, especially if the sample medium is, for example is a body fluid and the sample has not been subjected to any further cleaning steps.
  • the areas provided for this purpose can be determined on a sensor platform to determine the non-specific binding For example, “have been passivated”, ie coated with a “chemically neutral” compound with respect to the analyte, as described above as a measure to reduce non-specific binding.
  • the method according to the invention offers the particular advantage that no provision of additional measuring ranges is required for this form of physico-chemical referencing, but this form of referencing can be carried out directly on the basis of the luminescence signals generated with the passivation layer between the measuring ranges (for analyte detection).
  • the spatially resolved determination of the available excitation light intensity (before carrying out the analyte detection) and the analyte detection (due to the resulting luminescence intensities of the "detection labels” used) are preferably carried out sequentially
  • the corresponding luminescence intensities of the different labels can also essentially or at least not overlapping absorption spectra essentially simultaneously (ie without intermediate assay work steps such as sample addition etc., only using the corresponding different light sources and / or excitation and emission filter sets ) can be determined.
  • Such an embodiment of the method according to the invention is advantageous for such applications, in which one or more measuring ranges of a segment or an array are assigned to the determination of the same analyte and whose immobilized biological or biochemical recognition elements have different affinities for said analyte.
  • the recognition elements are expediently selected such that their affinities for different, (bio) chemically similar analytes change in different, characteristic ways.
  • the identity of the analyte can then be determined from the totality of the signals from different measurement areas with different detection elements for a single analyte, in a manner comparable to a fingerprint.
  • two or more arrays have a similar geometric arrangement of measurement areas and / or segments of measurement areas for the determination of similar analytes on these arrays.
  • one or more arrays comprise segments of two or more measuring ranges with biological or biochemical or synthetic recognition elements of the same type within the segment for analyte determination or referencing.
  • the method according to the invention with a kit according to the invention with a large number of measuring ranges in discrete arrays, of which in turn a large number can be arranged on a common sensor platform offers the possibility of using one and the same using relatively small amounts of sample solutions, reagents or calibration solutions Platform, under largely identical conditions, many types of duplications or multiple executions of similar measurements can be carried out. For example, statistical data can thus be generated in a single measurement, for which a large number of individual measurements with a correspondingly longer overall measurement time and higher consumption of sample and reagent quantities are conventionally required. It is preferred that two or more identical measuring ranges are provided within a segment or array for the detection of each analyte or for the reference range.
  • said identical measurement areas can be arranged in a continuous row or column or diagonals of an array or segment of measurement areas.
  • the referencing aspects can relate to physical or physico-chemical parameters of the sensor platform, such as local differences in the light intensity (see also below), as well Influences of the sample, such as its pH, ionic strength, refractive index, temperature etc.
  • said identical measuring ranges are arranged statistically within an array or segment of measuring ranges.
  • the spatially resolved referencing range of the excitation light intensity available in the measurement areas or in their surroundings comprises averaging over a plurality of spatially resolved reference signals.
  • excitation light intensities that do not vary statistically but systematically in the form of a gradient that is present over certain distances it can be advantageous if an interpolation is made to the expected value of the excitation light intensity of a measuring range lying between different areas for spatially resolved referencing.
  • the one or more samples and the detection reagents to be used in the detection method can be added sequentially in several steps. It is preferred that the one or more samples are pre-incubated with a mixture of the various detection reagents for determining the analytes to be detected in said samples and these mixtures are then fed to the arrays provided on the sensor platform in a single addition step.
  • a preferred embodiment of the method according to the invention is characterized in that the concentration of the detection reagents, such as, for example, secondary detection antibodies and / or luminescence labels and optionally additional luminescence-labeled detection reagents in a sandwich immunoassay, is selected such that the luminescence signals upon detection of different analytes in a common one Arrays are of the same order of magnitude, that is to say that the associated calibration curves for the analyte determinations to be carried out simultaneously can be recorded without changing the electronic or optoelectronic system settings.
  • the concentration of the detection reagents such as, for example, secondary detection antibodies and / or luminescence labels and optionally additional luminescence-labeled detection reagents in a sandwich immunoassay
  • Another object of an embodiment of the method according to the invention is that the calibration of luminescences generated as a result of the binding of one or more analytes or as a result of the specific interaction with one or more analytes includes the addition of one or more calibration solutions with known concentrations of said analytes to be determined to the same or different measuring ranges or segments of measuring ranges or arrays of measuring ranges on a sensor platform, to which the one or more samples to be examined are fed in the same or a separate addition step ,
  • Another preferred embodiment of the method is characterized in that the calibration of luminescence generated as a result of the binding of one or more analytes or as a result of the specific interaction with one or more analytes, the comparison of the luminescence intensities after the addition of an unknown and a control sample, such as, for example "wild type” DNA sample and a "mutant DNA” sample. It is possible that the unknown sample and the control sample are added to different arrays.
  • Another variant of this method is characterized in that the unknown sample and the control sample are added sequentially to the same array.
  • a regeneration step is generally necessary between the addition of the unknown sample and the control sample, i.e. the dissociation of recognition element-analyte complexes formed after the addition of the first sample, followed by the removal of the dissociated analyte molecules from the sample containers before the addition of the second sample can take place.
  • several samples on the same array of measurement areas can be examined for their analytes in sequential form.
  • Another possible embodiment of the method is that the unknown sample and the control sample are mixed and then the mixture is fed to one or more arrays of a sensor platform.
  • a further development of the method according to the invention is characterized in that the analytes to be detected in the unknown and the control sample are detected by means of luminescence labels of different excitation and / or luminescence wavelength for the unknown and the control sample.
  • the detection is carried out using two or more luminescence labels with different excitation and / or luminescence wavelengths.
  • the kit according to the invention with the large number of measuring ranges on a sensor platform opens up the possibility of a simplified form of calibration for the qualitative and / or quantitative determination of one or more analytes on one or more arrays.
  • this new form of calibration of the signals of a sensor platform according to the invention the addition of only a single calibration solution is necessary.
  • Part of the invention is a method according to one of the abovementioned embodiments for the simultaneous or sequential, quantitative or qualitative determination of one or more analytes from the Grappe of antibodies or antigens, receptors or ligands, chelators or "histidine tag components", oligonucleotides, DNA or RNA strands, DNA or RNA analogs, enzymes, enzyme cofactors or inhibitors, lectins and carbohydrates.
  • Possible embodiments of the method are also characterized in that the samples to be examined naturally occurring body fluids such as blood, serum, plasma, lymph or urine or egg yolk or optically cloudy liquids or tissue fluids or surface water or soil or plant extracts or bio or Synthesis process broths or from biological tissue parts or from cell cultures or extracts.
  • body fluids such as blood, serum, plasma, lymph or urine or egg yolk or optically cloudy liquids or tissue fluids or surface water or soil or plant extracts or bio or Synthesis process broths or from biological tissue parts or from cell cultures or extracts.
  • the invention furthermore relates to the use of a kit according to the invention and / or an analytical system according to the invention and / or a method according to the invention for quantitative or qualitative analyzes for determining chemical, biochemical or biological analytes in screening processes in pharmaceutical research, combinatorial chemistry, clinical and preclinical Development, real-time binding studies and the determination of kinetic parameters in affinity screening and research, qualitative and quantitative analyte determinations, in particular for DNA and RNA analysis, for the preparation of toxicity studies and for the determination of gene or protein expression profiles as well as for the detection of antibodies, antigens, pathogens or bacteria in pharmaceutical product development and research, human and veterinary diagnostics, agrochemical product development and research, symptomatic and presymptomatic plant diagnostics, for patient stratification in pharmaceutical product development and for therapeutic drug selection, for the detection of pathogens, pollutants and pathogens, especially of salmonella, prions, viruses and bacteria, in food and environmental analysis.
  • a sensor platform with the outer dimensions of 57 mm width (parallel to the grid lines of a grid structure (c) modulated in layer (a) of the sensor platform) x 14 mm length (perpendicular to the grid structures) x 0.7 mm thickness is used on its surface
  • a plate made of polycarbonate with recesses open in the direction of the sensor platform with the internal dimensions 5 mm width x 7 mm length x 0.15 mm height 6 microflow cells can be generated in the grid of a partial column of a classic MikiOtiter plate (grid 9 mm).
  • the polycarbonate plate can be glued to the sensor platform in such a way that the recesses are then sealed against one another.
  • This polycarbonate plate is constructed in such a way that it can be combined with a carrier ("meta carrier”) with the grand dimensions of standard microtiter plates in such a way that the grid (sequence in rows or columns) of the inflows of the flow cells corresponds to the grid of the wells of a standard microtiter plate.
  • a carrier metal carrier
  • the substrate is a pair of coupling-in and coupling-out gratings with grating lines running parallel to the width of the sensor platform (318 nm period) of 12 + / - 3 nm grating depth, the grating lines being formed over the entire width of the sensor platform, the distance between the two successive grids is 9 mm, the length of the individual grating structures (parallel to the length of the sensor platform) is 0.5 mm, the distance between the on
  • the coupling and decoupling grids of a pair of gratings are selected such that the excitation light can be coupled in within the area of the sample containers after combining the sensor platform with the polycarbonate plate described above, while the coupling takes place outside the area of the sample containers.
  • the wave-guiding, optically transparent layer (a) from Ta 2 O 5 on the optically tra Nparent layer (b)
  • sample containers formed by the sensor platform and the polycarbonate plate combined therewith point to the limitation opposite the sensor platform.
  • flat tapered openings so that the sample containers can be filled or emptied by pressing in standardized, commercially available pipette tips made of polypropylene.
  • the sensor platforms are cleaned with chloroform in an ultrasound device and chemically activated with poly-L-lysine, according to known standard protocols (step 1).
  • step 2 as a luminescent label for the later spatially resolved referencing, monofunctional fluorescent dye (FluorX TM (10 nM in 10 mM carbonate buffer, pH 9.2) is incubated for 2 hours with the activated surface of the sensor platform.
  • the FluorX TM dye is the NHS ester of carboxyfluorescein, with an extended linker arm, binds to the primary aminographs of poly-L-lysine under mild conditions, followed by washing with distilled water and drying the surface by centrifugation.
  • cDNAs are applied as biological detection elements in a concentration of 0.1 ⁇ g / ⁇ l in 10 mM carbonate buffer (pH 9.2) to the poly-L-lysine surface using a commercial spotter (GMS 417 Arrayer, Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) and incubated overnight (array of 10 x 10 spots; spot diameter 100 ⁇ m, center-to-center distance 375 ⁇ m). It is then washed with distilled water and the surface is dried by centrifugation. The binding of the cDNA's to the poly-L-lysine surface is adsorptive in nature or takes place via electrostatic interactions. An impairment of the binding capacity of the surface for cDNA, due to the previously applied fluorophores for the spatially resolved reference, is not found.
  • Passivation of the surface (step 4): To largely prevent unspecific interactions with the analytes to be detected or other components of a sample to be applied, ie to produce a surface that is “chemically neutral” to the analytes outside the measuring ranges, the surface is cleaned using a standard method (M. Schena. "DNA Microarrays - A Practical Approach", Oxford University Press, New York, (1999) 131) with sodium borohydrate. This passivation or deactivation method can also be used for adhesion-promoting layers with functionalized silanes, e.g. B. Reactive aldehyde or epoxy groups. The surface can additionally be passivated by applying a further passivation layer to minimize non-specific binding, as explained in the detailed description of the invention.
  • the polycarbonate plate described is applied to the sensor platform prepared in such a way that the individual sample containers are fluid-tightly sealed against one another and the cDNA array generated, with the associated coupling-in grid (c), is located within one of the 6 sample containers.
  • RNA is isolated from tissue (ie a large number of different RNA strands of unknown sequence and concentration), and Cy5-labeled cDNA (ie one.) Is used by means of reverse transcriptase and oligo dT primers with Cy5-dUTP corresponding multitude of different cDNA strands of unknown sequence and concentration).
  • the Cy5-labeled cDNA is dissolved in 30 ⁇ l of a solution with a sodium citrate buffer.
  • the buffer stock solution (“20 x SSC” (Standard sodium citrate)) is a solution of 3 M NaCl / 600 mM sodium acetate at pH 7.5, from which the remaining buffer solutions are prepared by appropriate dilution ("1 x SSC” corresponding to 150 mM NaCl / 15 mM sodium citrate, pH 7.5).
  • the cDNA prepared in hybridization buffer (“4 x SSC", 50% formamide, 1% Tween20) is filled into a sample container with an array of discrete measurement areas with immobilized cDNA's on a sensor platform, according to Example 1A, for a period of 16 hours to enable the hybridization of cDNAs as analytes in this sample with complementary sequences of cDNAs (“capture probes”) immobilized in the measurement areas.
  • the hybridization strand is subjected to "stringent conditions” (for example elevated temperature just a little below the melting point of the respective DNA, here at 42 ° C). Then, in order to increase the selectivity, “stringent washing” is also carried out: first in “1 x SSC” /0.1% SDS for 7 minutes, at 65 ° C., then in “0.1 x SSC” /0.1% SDS (“sodium dodecyl sulfate ”) at 65 ° C and then twice for 7 minutes each in" 0.1 x SSC “at 65 ° C. Under increasingly" stringent washing conditions "it is to be understood that the dissociation of hybrids from incompletely complementary cDNA sequences decreases with decreasing Concentration of positive ions of the buffer and with decreasing detergent concentration promoted and thus the selectivity of the process is further increased.
  • stringent conditions for example elevated temperature just a little below the melting point of the respective DNA, here at 42 ° C.
  • the sensor platform with the polycarbonate plate joined to it is inserted into a “meta carrier” as described above (Example 1A) and then for determining the luminescence intensities from the measurement areas, in particular as a result of Cy5-labeled cDNAs bound there used as analyte and for the spatially resolved determination of the available excitation light intensity in an analytical system according to the invention (example IC) and measured.
  • the sample container is filled with hybridization buffer ("4 x SSC", 50% formamide, 1% Tween20 TM) during the measurement.
  • the excitation light beam path of the optical system used for this example, as part of an analytical system according to the invention enables the sequential, or with suitably precise pre-adjustment of the optical system and suitable physical parameters (in particular coupling angles for the respective excitation wavelengths) of the sensor platform used, even simultaneous irradiation and coupling excitation light of different wavelengths into the waveguiding layer (a) of a sensor platform according to the invention via its coupling grating.
  • the excitation light is expanded, using a lens system with a cylindrical lens or a suitable diffractive optical element and one or more additional diaphragms, to form a beam bundle of slit-shaped cross section (perpendicular to the optical axis), the extent of which in the radiation cross section on the sensor platform, parallel to its grating lines, corresponds almost completely to the section of the coupling grating located within a sample container.
  • An essential part of the excitation light beam path is a multifaceted prism, as an example for an optical component with several discrete facets for beam deflection.
  • the coupling angle for excitation light of 492 nm is approximately + 18.2 ° and of 635 nm approximately -10 ° (with air as the medium above the coupling grid).
  • the multifaceted prism is designed in such a way that with suitable alignment of the lasers emitting at 492 nm or 635 nm as excitation light sources to different entry facets of this prism, the light emerging from the exit facet fulfills the coupling conditions for both wavelengths and no measurable beam offset between the excitation light beams of the two different wavelengths occurs on the coupling grid (c) of the sensor platform. This enables coupling at the different wavelengths without changing the positioning of the sensor platform.
  • Different interference filters can be positioned between the two halves of the tandem lens, in a substantially parallel part (i.e. less than 10 ° divergent or convergent) of the emission beam path, for detecting the light coming from the sensor platform at different wavelengths.
  • the "referencing label” (FluorX TM, fluorescence maximum at 520 nm) applied to the sensor platform is excited at 492 nm, and its fluorescence is determined using an interference filter with maximum transmission in the range between 500 and 550 nm.
  • the "detection labels” (Cy5, fluorescence maximum at 667 nm) are excited with the aid of a laser diode at 635 nm.
  • An interference filter with a maximum transmission of 650 to 700 nm is used for the corresponding fluorescence determination.
  • the fluorescence measurements at the two different wavelengths are carried out sequentially, with the arrangement being adjusted at the start of each wavelength to the maximum coupling at the corresponding wavelength.
  • simultaneous excitation of both fluorescences at different excitation wavelengths is also possible, so that only a change of the filters in the emission beam path is required to determine the different fluorescences.
  • the emission light from all measurement areas located within a sample container is recorded in a recording of the CCD camera.
  • the mean signal intensity from the measuring areas (spots) for binding and for the detection of analyte molecules on the basis of a potentially generated fluorescence from “detection label” is determined with the aid of an image analysis software.
  • the raw data from the individual pixels of the camera represent a two-dimensional matrix of digitized measurement values, with the measured intensity as the measurement value of an individual pixel corresponding to the area on the sensor platform imaged on it.
  • a two-dimensional (coordinate) network is first placed over the image points (pixel values) in such a way that each spot falls into an individual two-dimensional network element.
  • Each spot is assigned an "evaluation area” (AOI) that can be geometrically adapted as well as possible.
  • AOIs can have any geometric shape, for example circular.
  • the location of the individual AOIs is individualized as a function of the signal intensity of the individual by the image analysis software Pixels adapted and optimized, depending on the user's specifications, the initially set radius of the AOIs can be retained or the shape and size of the fluorescent spots can be readjusted For each spot, for example, the arithmetic mean of the pixel values (signal intensities) within a selected AOI is determined.
  • the background signals are determined from the measured signal intensities between the spots. For this purpose, for example, a group of further circles, which are concentric with a circular spot in question but have a larger radius, can be determined. Of course, the radii of these concentric circles must be chosen smaller than the distances between adjacent spots. For the background determination, for example, the area between the AOI and the first concentric circle can then be discarded and the area between this first concentric and a second subsequent concentric circle of larger radius can be defined as the area (AOI) for the background signal determination. It is also possible to define AOIs between adjacent spots, preferably in the middle between them, as AOIs for background signal determination.
  • the mean background signal intensity can then be determined in an analogous manner as above, for example as the arithmetic mean of the pixel values (signal intensities) within an AOI selected for this purpose.
  • the mean net signal intensity can be determined as the difference between the local mean gross and the local mean background signal intensity.
  • the mean gross signal intensity of each spot at the second wavelength is determined for the determination and normalization of the light intensities.
  • AOIs are defined in a similar way as above.
  • the AOIs for referencing a specific measuring range can, for example, be selected from the ranges between this spot and the next neighboring spots or they can also be identical to the AOI of the relevant spot for the analyte detection.
  • the absorption and emission spectra of the "referencing" and “detection labels” should not overlap, or only as little as possible, in order to falsify the fluorescence measurements from the areas of the spots, for example due to energy transfer between the fluorophores of different excitation and emission wavelengths minimize.
  • the arithmetic mean of the pixel values (signal intensities) within this AOI is again determined as the mean gross signal intensity of each defined AOI for reference.
  • the quotient is formed from the local average intensity of an AOI for the referencing range and, for example, the arithmetic mean of all such AOIs of the examined array.
  • This local correction factor is then used to multiply the average net signal intensity of the AOI of the associated measuring range (spots), as calculated above. In this way, the calculated net signal intensities for the AOIs of all spots in the array are corrected.
  • the sensor platforms are first cleaned with isopropanol, then with concentrated H SO 4 , 2.5% ammonium peroxodisulfate in an ultrasound device and then incubated with 0.5 mM dodecyl monophosphate (ammonium salt) for 2 hours at room temperature. the solution being constantly stirred.
  • a self-assembly forms a homogeneous, hydrophobic surface (step 1).
  • step 2 8 different (primary) antibodies (against the interleukins IL # 1 to IL # 8) are in a concentration of 50-150 ⁇ g / ml in phosphate buffered saline (pH 7.4), which are also suitable additives for Preservation of the functionality of the immobilized proteins contains, applied by means of an inkjet spotter and dried. The diameter of the spots, with a distance (centram to centram) of 0.35 mm, is on average 0.15 mm. Eight different antibodies for the detection of cytokines, especially different hiterleukins, are used in 20 rows of a single array with a total of 160 spots. In order to obtain statistical assay reproducibility data from each individual measurement for each sample to be supplied, 20 measurement areas are generated per array with the same hiterleukin antibodies as biological detection elements.
  • step 3 to later enable the spatially resolved determination of the excitation light intensity and at the same time to largely prevent non-specific interactions with the analytes to be detected or other components of a sample to be applied, i.e.
  • the surface of the spotted chip with 3% BSA in PBS buffer pH 7.4, which additionally contains BSA labeled with Cy7 (Amersham Pharmacia) is incubated for one hour at room temperature a fluorescent passivation layer forms in the unoccupied areas of the sensor platform, in which no specific detection elements were immobilized in the previous step 2.
  • the polycarbonate plate described is applied to the sensor platform prepared in such a way that the individual sample containers are fluid-tightly sealed off from one another and the protein microarrays with the associated coupling grids (c) are each located within one of the 6 sample containers.
  • the format of a sandwich assay is selected for the specific detection of the cytokines to be detected.
  • each of the 6 individual calibration solutions are filled into one of the 6 flow cells on the sensor platform and incubated for a further 2 hours at 37 ° C with the respective array on the sensor platform, so that the complexes formed in the pre-incubation step from the respective interleukins are specific secondary, biotinylated anti-interleukin antibodies and Cy-5 labeled streptavidin can bind to the primary anti-interleukin antibodies immobilized in the discrete measurement areas (spots).
  • the flow cells are washed with buffer (phosphate-buffered saline with an addition of 0.1% serum albumin and 0.05% Tween20).
  • buffer phosphate-buffered saline with an addition of 0.1% serum albumin and 0.05% Tween20.
  • the sensor platform with the polycarbonate plate assembled with it is inserted into a "meta carrier" as described above (Example 1A) and, after a further 15-minute incubation period (for equilibration at room temperature) in buffer, into an analytical system according to the invention (see example IC or 2C) used and measured.
  • a metal carrier as described above (Example 1A) and, after a further 15-minute incubation period (for equilibration at room temperature) in buffer, into an analytical system according to the invention (see example IC or 2C) used and measured.
  • Example IC An analytical system as described in Example IC is used.
  • the coupling angle for excitation light of 635 nm is approximately -10 ° (with air as the medium above the coupling grating).
  • the arrangement is adjusted for maximum coupling at the excitation wavelength of 635 nm common for “detection label” and “referencing label”.
  • the fluorescence measurements are then carried out sequentially at the two different emission wavelengths, only a change of the filters mentioned in the emission beam path being necessary between the measurements at the different emission wavelengths.
  • the emission light from all measurement areas located within a sample container is recorded in a recording of the CCD camera. From the recordings of the 6 arrays in the 6 discrete sample containers, to which different calibration solutions have been added, calibration curves (referenced to the local excitation intensity) can then be created for the detection of all 8 hiterleukins (see below).
  • the mean signal intensity from the measurement areas (spots) for binding and for the detection of analyte molecules on the basis of a potentially generated fluorescence from “detection labels” (in this example Cy5, with fluorescence maximum near 670 nm) is determined with the aid of an image analysis software.
  • the raw data from the individual pixels of the camera represent a two-dimensional matrix of digitized measurement values, with the measured intensity as the measurement value of an individual pixel corresponding to the area on the sensor platform imaged on it.
  • a two-dimensional (coordinate) network is first placed over the image points (pixel values) in such a way that each spot falls into an individual two-dimensional network element.
  • Each spot is assigned an "evaluation area” (AOI) that can be geometrically adapted as well as possible.
  • AOIs can have any geometric shape, for example circular.
  • the location of the individual AOIs is determined individually by the image analysis software as a function of the signal intensity of the individual pixels adapted and optimized.
  • the initially set radius of the AOIs can be retained or the shape and size of the fluorescent spots can be readjusted.
  • the arithmetic mean of the pixel values (signal intensities) within a selected AOI is determined as the average gross signal intensity of each spot.
  • the background signals are determined from the measured signal intensities at the wavelength of the emission of the "detection label” (670 nm) between the spots.
  • a prerequisite for a correct determination of the background signal is that in the selected areas on the sensor platform (which are covered with the fluorescent "passivation layer") there is no contribution to fluorescence at the emission wavelength of the "detection label”.
  • the areas for determining the background signals for example, a group of further circles which are concentric with a circular spot in question but have a larger radius
  • the radii of these concentric circles must be chosen smaller than the distances between adjacent spots, for example the area between the AOI and the first concentric circle can be rejected and the The area between this first concentric and a second subsequent concentric circle of larger radius can be defined as the area (AOI) for determining the background signal.
  • AOI area between adjacent spots, preferably in the middle between them, as AOIs for background signal determination.
  • the mean background signal intensity can then be determined in an analogous manner as above, for example as the arithmetic mean of the pixel values (signal intensities) within an AOI selected for this purpose.
  • the mean net signal intensity can be determined as the difference between the local mean gross and the local mean background signal intensity.
  • the mean gross signal intensity between individual spots is analogous to the previously described determination. tion of the background signal, but now determined at the second emission wavelength of 780 nm.
  • the arithmetic mean of the pixel values (signal intensities) within this AOI is again determined as the average gross signal intensity of each defined AOI for reference.
  • the quotient is formed from the local average intensity of an AOI for the referencing range and, for example, the arithmetic mean of all such AOIs of the examined array.
  • This local correction factor is then used to multiply the average net signal intensity of the AOI of the associated measuring range (spots), as calculated above. In this way, the calculated net signal intensities for the AOIs of all spots in the array are corrected.

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Abstract

Die Erfindung betrifft verschiedene Ausführungsformen eines Kits zum gleichzeitigen qualitativen und/oder quantitativen Nachweis einer Vielzahl von analyten, umfassend: eine Sensorplattform; mindestens ein Array von in diskreten Messbereichen (d) direkt, oder über eine Haftvermittlungsschicht, auf der Sensorplattform immobilisierten biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselementen zur spezifischen Erkennung und/oder Bindung besagter Analyten und/oder spezifischen Wechselwirkung mit besagten Analyten; eine Passivierungsschicht aus gegenüber den Analyten 'chemisch neutralen' Verbindungen oder einer passivierten Haftvermittlungsschicht mit einer gegenüber den Analyten ' chemisch neutralen' Oberfläche zwischen den Messbereichen, wobei mit der Passivierungsschicht oder der passivierten Haftvermittlungsschicht in einer möglichst homogenen Verteilung über die Sensorplattform lumineszenzmarkierte Moleküle assoziiert sind, welche der ortsaufgelösten Referenzierung der in den Messbereichen oder in deren Umgebung verfügbaren Anregungslichtintensität dienen. Die Erfindung betrifft ausserdem verschiedene Ausführungsformen eines Kits zum Gleichzeitigen qualitativen und/oder quantitativen Nachweis einer Vielzahl von Analyten, umfassend: eine Sensorplattform; eine auf der Sensorplattform aufgebrachte dünne Schicht (g); mindestens ein Array von in diskreten Messbereichen (d) direkt, oder über eine Haftvermittlungschicht, auf der Schicht (g) immobilisierten biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselementen zur spezifischen Erkennung und/oder Bindung besagter Analyten und/oder spezifischen Wechselwirkung mit besagten Analyten; eine Passivierungschicht aus gegenüber den Analyten 'chemisch neutralen' Verbindungen oder einer passivierten Haftvermittlungsschicht mit einer gegenüber den Analyten ' chemisch neutralen' Oberfläche zwischen den Messbereichen, wobei mit auf der Sensorplattform aufgebrachten Schicht (g) in einer möglichst homogenen Verteilung über die Sensorplattform lumineszenzmarkierte Moleküle assoziiert sind, welche der ortsaufgelösten Referenzierung der in den Messbereichen oder in deren Umgebung verfügbaren Anregungslichtintensität dienen. Die Erfindung betrifft auch mit den erfindugnsgemässen Kits durchgeführte Verfahren zum Nachweis eines oder mehrerer Analyten und deren Verwendung.

Description

IT UND VERFAHREN ZUR MULTIANALYTBESTIMMUNG, MIT VORKEHRUNGEN ZUR ORTSAUFGELOES TEN REFERENZIERUNG EINER ANREGUNGSLICHTINTENSITAET
Die Erfindung betrifft verschiedene Ausführungsformen eines Kits zum gleichzeitigen qualitativen und / oder quantitativen Nachweis einer Vielzahl von Analyten, umfassend
- eine Sensorplattform
- mindestens ein Array von in diskreten Messbereichen (d) direkt, oder über eine Haftvermittlungsschicht, auf der Sensorplattform immobilisierten biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselementen zur spezifischen Erkennung und / oder Bindung besagter Analyten und / oder spezifischen Wechselwirkung mit besagten Analyten,
- eine Passivierungsschicht aus gegenüber den Analyten "chemisch neutralen" Verbindungen oder einer passivierten Haftvermittlungsschicht mit einer gegenüber den Analyten „chemisch neutralen" Oberfläche zwischen den Messbereichen, wobei mit der Passivierungsschicht oder der passivierten Haftvermittlungsschicht in einer möglichst homogenen Verteilung über die Sensorplattfor lumineszenzmarkierte Moleküle assoziiert sind, welche der ortsaufgelösten Referenzierung der in den Messbereichen oder in deren Umgebung verfügbaren Anregungslichtintensitat dienen. Die Erfindung betrifft ausserdem verschiedene Ausführungsformen eines Kits zum gleichzeitigen qualitativen und / oder quantitativen Nachweis einer Vielzahl von Analyten, umfassend
- eine Sensorplattform
- eine auf der Sensorplattform aufgebrachte dünne Schicht (g)
- mindestens ein Array von in diskreten Messbereichen (d) direkt, oder über eine Haftvermittlungsschicht, auf der Schicht (g) immobilisierten biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselementen zur spezifischen Erkennung und / oder Bindung besagter Analyten und / oder spezifischen Wechselwirkung, mit besagten Analyten,
- eine Passivierungsschicht aus gegenüber den Analyten "chemisch neutralen" Verbindungen oder einer passivierten Haftvermittlungsschicht mit einer gegenüber den Analyten „chemisch neutralen" Oberfläche zwischen den Messbereichen, wobei mit auf der Sensorplattform aufgebrachten Schicht (g) in einer möglichst homogenen Verteilung über die Sensorplattform lumineszenzmarkierte Moleküle assoziiert sind, welche der ortsaufgelösten Referenzierung der in den Messbereichen oder in deren Umgebung verfügbaren Anregungslichtintensitat dienen.
Die Erfindung betrifft auch mit den erfindungsgemässen Kits durchgeführte Verfahren zum Nachweis eines oder mehrerer Analyten und deren Verwendung.
Zur Bestimmung einer Vielzahl von Analyten sind gegenwärtig vor allem Verfahren verbreitet, in denen in sogenannten Mikrotiterplatten der Nachweis unterschiedlicher Analyten in diskreten Probenbehältnissen oder "Wells" dieser Platten erfolgt. Am weitesten verbreitet sind dabei Platten mit einem Raster von 8 x 12 Wells auf einer Grundfläche von typischerweise ca. 8 cm x 12 cm, wobei zur Füllung eines einzelnen Wells ein Volumen von einigen hundert Mikrolitern erforderlich ist. Für zahlreiche Anwendungen wäre es jedoch wünschenswert, mehrere Analyten in einem einzigen Probenbehältnis, unter Einsatz eines möglichst kleinen Probenvolumens gleichzeitig zu bestimmen.
In der US-P 5,747,274 werden Messanordnungen und Verfahren zur Früherkennung eines Herzinfarkts, durch die Bestimmung mehrerer von mindestens drei Herzinfarktmarkern beschrieben, wobei die Bestimmung dieser Marker in individuellen oder in einem gemeinsamen Probenbehältnis erfolgen kann, wobei im letzteren Falle, der gegebenen Beschreibung folgend, ein einziges Probenbehältnis als ein durchgehender Flusskanal ausgebildet ist, dessen eine Begrenzungsfläche beispielsweise eine Membran bildet, auf der Antikörper für die drei verschiedenen Marker immobilisert sind. Es gibt jedoch keine Hinweise auf eine Bereitstellung von mehreren derartigen Probenbehältnissen oder Flusskanälen auf einem gemeinsamen Träger. Ausserdem werden keine geometrischen Angaben über die Grossen der Messflächen gegeben.
hi den WO 84/01031, US-P 5,807,755, US-P 5,837,551 und US-P 5,432,099 wird die Immobilisierung für den Analyten spezifischer Erkennungselemente in Form kleiner "Spots" mit teilweise deutlich unter 1 mm2 Fläche auf festen Trägern vorgeschlagen, um durch Bindung eines nur kleinen Teils vorhandener Analytmoleküle eine nur von der Inkubationszeit abhängige, aber - in Abwesenheit eines kontinuierlichen Flusses - vom absoluten Probenvolumen im wesentlichen unabhängige Konzentrationsbestimmung des Analyten vornehmen zu können. Die in den zugehörigen Ausführungsbeispielen beschriebenen Messanordnungen beruhen auf Fluoreszenznachweisen in konventionellen Mikro- titerplatten. Dabei werden auch Anordnungen beschrieben, in denen Spots von bis zu drei unterschiedlichen fluoreszenzmarkierten Antikörpern in einem gemeinsamen Mikrotiter- plattenwell ausgemessen werden. Den in diesen Patentschriften dargelegten theoretischen Überlegungen folgend, wäre eine Minimierung der Spotgrösse wünschenswert. Limitierend wirke jedoch die minimale Signalhöhe, die vom Untergrundsignal unterschieden werden könne.
Zur Erreichung tieferer Nachweisgrenzen sind in den vergangenen Jahren zahlreiche Messanordnungen entwickelt worden, in denen der Nachweis des Analyten auf dessen Wechselwirkung mit dem evaneszenten Feld beruht, welches mit der Lichtleitung in einem optischen Wellenleiter verbunden ist, wobei auf der Oberfläche des Wellenleiters biochemische oder biologische Erkennungselemente zur spezifischen Erkennung und Bindung der Analyt- moleküle immobilisiert sind.
Koppelt man eine Lichtwelle in einen optischen Wellenleiter ein, der von optisch dünneren Medien, d.h. Medien mit niedrigerem Brechungsindex umgeben ist, so wird sie durch Totalreflexion an den Grenzflächen der wellenleitenden Schicht geführt. In die optisch dünneren Medien tritt dabei ein Bruchteil der elektromagnetischen Energie ein. Diesen Anteil bezeichnet man als evaneszentes oder quergedämpftes Feld. Die Stärke des evaneszenten Feldes ist sehr stark abhängig von der Dicke der wellenleitenden Schicht selbst sowie vom Verhältnis der Brechungsindices der wellenleitenden Schicht und der sie umgebenden Medien. Bei dünnen Wellenleitern, d. h. Schichtdicken von derselben oder niedrigerer Dicke als der zu führenden Wellenlänge, können diskrete Moden des geleiteten Lichts unterschieden werden. Derartige Verfahren haben den Vorteil, dass die Wechselwirkung mit dem Analyten auf die Eindringtiefe des evaneszenten Feldes ins angrenzende Medium, in der Grössenordnung von einigen hundert Nanometern, beschränkt ist und Störsignale aus der Tiefe des Mediums weitgehend vermieden werden können. Die ersten vorgeschlagenen derartigen Messanordnungen beruhten auf hocnmultimodalen, selbsttragenden Einschichtwellenleitern, wie beispielsweise Fasern oder Plättchen aus transparentem Kunststoff oder Glas, mit Stärken von einigen hundert Mikrometern bis zu mehreren Millimetern. Zur Verbesserung der Empfindlichkeit und gleichzeitig einfacheren Herstellung in Massenfabrikation wurden planare Dünnschichtwellenleiter vorgeschlagen. Ein planarer Dünnschichtwellenleiter besteht im einfachsten Fall aus einem Dreischichtsystem: Trägermaterial (b), wellenleitende Schicht (a), Superstrat ( bzw. zu untersuchende Probe), wobei die wellenleitende Schicht den höchsten Brechungsindex besitzt. Zusätzliche Zwischenschichten können die Wirkung des planaren Wellenleiters noch verbessern.
Es sind verschiedene Verfahren für die Einkopplung von Anregungslicht in einen planaren Wellenleiter bekannt. Die am frühesten benutzten Verfahren beruhten auf Stirnflächen- kopplung oder Prismenkopplung, wobei zur Verminderung von Reflexionen infolge von Luftspalten im allgemeinen eine Flüssigkeit zwischen Prisma und Wellenleiter aufgebracht wird. Diese beiden Methoden sind vor allem in Verbindung mit Wellenleitern relativ grosser Schichtdicke, d. h. insbesondere selbsttragenden Wellenleitern, sowie bei einem Brechungsindex des Wellenleiters von deutlich unter 2 geeignet. Zur Einkopplung von Anregungslicht in sehr dünne, hochbrechende wellenleitende Schichten ist demgegenüber die Verwendung von Koppelgittern eine wesentlich elegantere Methode.
Mit dem Begriff "Lumineszenz" wird in dieser Anmeldung die spontane Emission von Photonen im ultravioletten bis infraroten Bereich nach optischer oder nichtoptischer, wie beispielsweise elektrischer oder chemischer oder biochemischer oder thermischer Anregung, bezeichnet. Beispielsweise sind Chemilummeszenz, Biolumineszenz, Elektrolumines- zenz und insbesondere Fluoreszenz und Phosphoreszenz unter dem Begriff "Lumineszenz" mit eingeschlossen.
Zur Erreichung sehr tiefer Nachweisgrenzen erscheinen lumineszenz-basierende Methoden aufgrund grösserer Selektivität der Signalerzeugung besser geeignet als solche Methoden, welche auf einer Änderung des effektiven Brechungsindex beruhen (wie beispielsweise Gitterkoppler-Sensoren oder Verfahren basierend auf Oberflächenplasmonenresonanz). Dabei ist die Lumineszenzanregung auf die Eindringtiefe des evaneszenten Feldes in das optisch dünnere Medium, also auf die unmittelbare Umgebung des wellenleitenden Bereichs mit einer Eindringtiefe in der Grössenordnung von einigen hundert Nanometern ins Medium beschränkt. Dieses Prinzip wird evaneszente Lumineszenzanregung genannt. Mittels hochbrechender Dünnschichtwellenleiter, in Kombination mit Lumineszenzde- tektion, basierend auf einem nur einige hundert Nanometer dünnen wellenleitenden Film auf einem transparenten Trägermaterial, konnte in den letzten Jahren die Empfindlichkeit deutlich gesteigert werden. Beispielsweise wird in der WO 95/33197 eine Methode beschrieben, in der das Anregungslicht über ein Reliefgitter als diffraktives optisches Element in den wellenleitenden Film eingekoppelt wird. Die Oberfläche der Sensorplattform wird mit einer den Analyten enthaltenden Probe in Kontakt gebracht, und die isotrop angestrahlte Lumineszenz in der Eindringtiefe des evaneszenten Feldes befindlicher lumineszenzfähiger Substanzen wird mittels geeigneter Messvorrichtungen, wie zum Beispiel Photodioden, Photomultiplier oder CCD-Kameras, gemessen. Es ist auch möglich, den in den Wellenleiter rückgekoppelten Anteil der evaneszent angeregten Strahlung über ein diffraktives optisches Element, zum Beispiel ein Gitter, auszukoppeln und zu messen. Diese Methode ist zum Beispiel in der WO 95/33198 beschrieben.
Ein Nachteil aller oben im Stand der Technik, insbesondere in der WO 95/33197 und der WO 95/33198, beschriebenen Verfahren zur Detektion evaneszent angeregter Lumineszenz mit Dünnschichtwellenleitern liegt jedoch darin, dass auf der als homogener Film ausgebildeten Sensorplattform jeweils nur eine Probe analysiert werden kann. Um weitere Messungen auf derselben Sensorplattform durchführen zu können, sind jedesmal aufwendige Wasch- bzw. Reinigungsschritte notwendig. Dies gilt insbesonders, wenn ein von der ersten Messung verschiedener Analyt detektiert werden soll. Im Falle eines hnmunoassays bedeutet dies im allgemeinen, dass die gesamte immobilisierte Schicht auf der Sensorplattform ausgetauscht oder gleich eine neue Sensorplattform als ganzes verwendet werden muss. Insbesondere können also keine gleichzeitigen Bestimmungen mehrerer Analyten durchgeführt werden.
Zur gleichzeitigen oder aufeinanderfolgenden Durchführung von ausschliesslich lumineszenzbasierenden Mehrfachmessungen mit im wesentlichen monomodalen, planaren anorganischen Wellenleitern sind, z. B. in der WO 96/35940, Vorrichtungen (Arrays) bekannt geworden, in denen auf einer Sensorplattform wenigstens zwei getrennte wellenleitende Bereiche angeordnet sind, die getrennt mit Anregungslicht beaufschlagt werden. Die Aufteilung der Sensorplattform in getrennte wellenleitende Bereiche hat allerdings nachteilig zur Folge, dass der Platzbedarf für diskrete Messbereiche, in diskreten wellenleitenden Bereichen auf der gemeinsamen Sensorplattform relativ gross ist und daher nur eine verhältnismässige geringe Dichte unterschiedlicher Messbereiche (oder sogenannter "features") erreicht werden kann.
Die Verwendung des Begriffs "räumlich getrennter Messbereiche" oder "diskreter Messbereiche" im Sinne der vorliegenden Erfindung wird im nachfolgenden Abschnitt zur genauen Beschreibung der Erfindung genauer definiert.
hl der US 5525466 und US 5738992 wird ein optischer Sensor, basierend auf Fluoreszenzanregung im evaneszenten Feld eines selbstragender Multimode- Wellenleiters, vorzugsweise faseroptischer Art, beschrieben. Einkopplung von Anregungslicht und Auskopplung von in den Multimode- Wellenleiter rückgekoppeltem Fluoreszenzlicht erfolgen über Stirnflächenein- und -auskopplung. Das dabei detektierte Fluoreszenzsignal zum Analytnachweis ergibt sich aufgrund des Funktionsprinzips solcher Multimode- Wellenleiter als ein einziger integraler Wert für die ganze mit der Probe wechselwirkende Fläche. Vorwiegend zur Normalisierung der Signale, beispielweise zur Berücksichtigung von signalverändernden Oberflächendefekten, sind auf der Sensoroberfläche neben den biochemischen oder biologischen Erkennungselementen zur spezifischen Erkennung und Bindung eines nachzuweisenden Analyten fluoreszente Referenzmaterialien co-immobilisiert. Aufgrund des zugrunde liegenden Sensorprinzips ist jedoch keine ortsaufgelöste, sondern nur eine auf den einzelnen, integralen Messwert wirkende Normalisierung möglich. Folglich kann auch der Nachweis unterschiedlicher Analyten nur mittels Verwendung von Labein unterschiedlicher Anregungswellenlängen oder sequentiell, nach Entfernung vorangehend gebundener Analyten erfolgen. Aus diesen Gründen erscheinen diese Anordnungen, zusammen mit dem beschriebenen Referenzierungsverfahren, für den gleichzeitigen Nachweis einer Vielzahl von Analyten gar nicht oder nur wenig geeignet.
In der WO 97/35181 werden Verfahren zur gleichzeitigen Bestimmung einer oder mehrerer Analyten beschrieben, indem in einem Wellenleiter ausgebildeten "Well" Patches mit unterschiedlichen Erkennungselementen ausgebildet sind, welche mit einer einen oder mehreren Analyten enthaltenden Probenlösung kontaktiert werden. Zu Kalibrationszwecken werden gleichzeitig Lösungen mit definierten Analytkonzentrationen in weitere Wells mit gleichartigen Patches gegeben. Als Beispiel werden je 3 Wells (zur Messung mit Kalibrationslösun- gen niedriger und hoher Analytkonzentration sowie der aktuellen Probe) mit diskreten und von Patch zu Patch verschiedenen immobilisierten Erkennungselementen zur gleichzeitigen Bestimmung mehrerer Analyten vorgestellt. Hinweise auf ortsaufgelöste Referenzierungen werden nicht gegeben.
In Analytical Chemistry, Vol. 71 (1999), 4344 - 4352 wird ein Multianalyt-hnmunoassay auf einem Silicium-Nitrid- Wellenleiter vorgestellt. Es werden bis zu drei Analyten gleichzeitig, auf drei kanalförmig ausgebildeten Erkennungsbereichen (Messbereichen) mit jeweils unterschiedlichen biologischen Erkennungselementen, beschrieben. Analyten und Tracer- Antikörper werden als Mischung in eine die drei Messfelder überdeckende Proben- zelle gegeben. Der Background wird jeweils zuvor mit einer spezifisch dafür hergestellten Lösung ohne Analyt gemessen. Aus der Beschreibung ist nicht ersichtlich, ob die Back- ground-Bestimmung ortsaufgelöst oder summarisch für die verschiedenen Messbereiche durchgeführt wird. Da eine Regenerierung der Sensorplattform nicht vorgenommen wird, müssen zur Erstellung einer Kalibrationskurve eine Vielzahl von Einzelmessungen mit immer wieder neuen Sensorplattformen durchgeführt werden. Dieses, durch die nur geringe Anzahl von Messfeldern auf einer Sensorplattform sowie durch das Assay-Design bedingte Vorgehen, ist als nachteilig anzusehen, da die Genauigkeit durch die Verwendung unterschiedlicher Sensorplattformen verringert wird und die Dauer des Verfahrens sich deutlich verlängert.
hl Analytical Chemistry , Vol. 71 (1999), 3846 - 3852 wird ebenfalls ein Multianalyt-Assay zur gleichzeitigen Bestimmung dreier verschiedener Analyten vorgestellt. Als Beispiel gleichzeitig zu bestimmender Analyten aus den Gruppen Bakterien, Viren und Proteine werden Bacillus globigii, MS2-Bakteriophagen und "Staphylococcal enderotoxin B" benutzt, wobei in jeweils zwei zueinander parallelen Reihen (Kanälen) Antikörper gegen diese Analyten auf einem als (selbstragendem Multimode-) Wellenleiter dienendem Glasplättchen immobilisiert wurden. In dem nachfolgend beschriebenen Multianalyt-Assay wird eine Flusszelle mit zu den immobilisierten Reihen von Erkennungselementen gekreuzten Fliesskanälen auf das Glasplättchen aufgesetzt. Die Sandwich-Immunoassays werden unter sequentieller Zugabe von Waschlösung (Puffer), Probe mit einem oder mehreren Analyten, Waschlösung (Puffer), Tracer- Antikörper (einzeln oder als Cocktail) und Waschlösung (Puffer) durchgeführt. Die lokal gemessenen Fluoreszenzintensitäten werden korrigiert mittels Subtraktion des neben den Messfeldern beobachteten Hintergrundsignals. Hinweise auf eine Berücksichtigung lokaler Variationen der Anregungslichtintensitat werden auch hier nicht gegeben. Auch diese Anordnung ermöglicht jedoch nicht, eine ganze Messreihe zur gleichzeitigen Bestimmung mehrerer Analyten, zusammen mit den notwendigen Kalibrationen, durchzuführen, sondern erfordert dafür entweder die Verwendung mehrerer verschiedener Sensorplattformen oder repetitive, sequentielle Messungen auf einer Plattform mit zwischenzeitlicher Regenerierung, was besonders im Falle von hnmunoassays in vielen Fällen nur in begrenztem Umfang möglich ist.
hl BioTechniques 27 (1999), 778 - 788 wird eine Anordnung von 96 Wells mit jeweils 4 Arrays aus 36 Spots (d.h. insgesamt 144 Spots pro Well) auf der Grundfläche einer Stan- dard-Mikrotiterplatte (ca. 8 cm x 12 cm), zur Entwicklung von ELISA's (Enzyme-Linked hnmunosorbent Assays) basierend auf Mikroarrays, vorgestellt. Für Zwecke der Positionierung sowie der Kontrolle der Wirksamkeit der eingesetzten Reagentien beim enzyma- tischen Detektionsschritt des Assays mittels Zugabe von fluoreszentem "Alkaline phosphatase Substrate" (ELF®) werden von den 6x6 Arrays jeweils eine Reihe und eine Spalte für "biotinylierte B SA-Marker" reserviert. - Diese Anordnung deutet zwar eine Möglichkeit zu einer deutlichen Erhöhung des Durchsatzes mit klassischen Assays (ELISA's) an, die demonstrierte Empfindlichkeit (13.4 ng/ml rabbit IgG) erscheint jedoch unbefriedigend.
Zusammenfassend ist festzustellen, dass bis jetzt keine gemeinsame Lösung der folgenden Aufgabenstellungen bereitgestellt wurde, die für einen schnellen hochempfindlichen gleichzeitigen Nachweis einer Vielzahl von (d. h. drei oder mehr) Analyten bestehen:
- Gleichzeitige Bestimmung mehrerer Analyten auf einer Sensorplattform mit Nachweisgrenzen im pikomolaren Bereich
- Möglichst einfache Assay-Durchführung zur Minimierung der Anforderungen an die Fluidik (z. B. durch gleichzeitige Zugabe von Mischungen aus einer Probe mit mehreren nachzuweisenden Analyten und mehreren Tracer-Molekülen) Örtlich aufgelöste Referenzierang zwecks Berücksichtigung von örtlichen Variationen der Anregungslichtintensitat
- Gegebenenfalls gleichzeitige Durchführung von Kalibrationsmessungen auf derselben Sensorplattform.
Gegenstand der Erfindung ist ein Kit zum gleichzeitigen qualitativen und / oder quantitativen Nachweis einer Vielzahl von Analyten, umfassend
- eine Sensorplattform - mindestens ein Array von in diskreten Messbereichen (d) direkt, oder über eine Haftvermittlungsschicht, auf der Sensorplattform immobilisierten biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselementen zur spezifischen Erkennung und / oder Bindung besagter Analyten und / oder spezifischen Wechselwirkung mit besagten Analyten,
- eine Passivierungsschicht aus gegenüber den Analyten "chemisch neutralen" Verbindungen oder einer passivierten Haftvermittlungsschicht mit einer gegenüber den Analyten „chemisch neutralen" Oberfläche zwischen den Messbereichen, wobei mit der Passivierungsschicht oder der passivierten Haftvermittlungsschicht in einer möglichst homogenen Verteilung über die Sensorplattform lumineszenzmarkierte Moleküle assoziiert sind, welche der ortsaufgelösten Referenzierung der in den Messbereichen oder in deren Umgebung verfügbaren Anregungslichtintensitat dienen.
Im Falle einer nach Aufbringung einer Passivierungsschicht nach Aufbringung der biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselemente in diskreten Messbereichen (d) wird sich diese Passivierungsschicht im allgemeinen nur in den Bereichen zwischen den Messbereichen (d) befinden. Sofern die genannten lumineszenzmarkierten Moleküle für die ortsaufgelöste Referenzierung der verfügbaren Anregungslichtintensitat („Referenzierungslabel") an die „chemisch neutralen" Verbindungen (siehe unten), aus denen die Passivierungsschicht erzugt wird, vor deren Aufbringung gebunden sind, werden diese „Referenzierungslabel" folglich in den Bereichen zwischen den Messbereichen (d) lokalisiert sein. Die „Referenzierungslabel" können aber auch in einem separaten Schritt auf die Sensorplattform, vor Aufbringung der Passivierungsschicht, aufgebracht werden, hl diesem Fall, und insbesondere wenn die „"Referenzierungslabel" als Bestandteil einer Haftvermittlungsschicht oder nach deren Aufbringung, aber vor Aufbringung der biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselemente auf die Sensorplattform aufgebracht werden, werden sie auch in den Bereichen der diskreten Messbereiche (für den Analytnachweis) lokalisiert sein. - Die Anforderungen an die spektralen Eigenschaften der „Referenzierungslabel", insbesondere für den letztgenannten Fall, werden weiter unten erläutert.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Kit zum gleichzeitigen qualitativen und / oder quantitativen Nachweis einer Vielzahl von Analyten, umfassend - eine Sensorplattform
- eine auf der Sensorplattform aufgebrachte dünne Schicht (g)
- mindestens ein Array von in diskreten Messbereichen (d) direkt, oder über eine Haftvermittlungsschicht, auf der Schicht (g) immobilisierten biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselementen zur spezifischen Erkennung und / oder Bindung besagter Analyten und / oder spezifischen Wechselwirkung mit besagten Analyten, eine Passivierungsschicht aus gegenüber den Analyten "chemisch neutralen" Verbindungen oder einer passivierten Haftvermittlungsschicht mit einer gegenüber den Analyten „chemisch neutralen" Oberfläche zwischen den Messbereichen, wobei mit auf der Sensorplattform aufgebrachten Schicht (g) in einer möglichst homogenen Verteilung über die Sensorplattform lumineszenzmarkierte Moleküle assoziiert sind, welche der ortsaufgelösten Referenzierung der in den Messbereichen oder in deren Umgebung verfügbaren Anregungslichtintensitat dienen.
Mit der ersten und zweiten Form eines erfindungsgemässen Kits und deren weiteren erfindungsgemässen Ausführungsformen, welche nachfolgend beschrieben werden, kann die beschriebene Problemstellung gelöst werden. Überraschend wurde dabei festgestellt, dass es, unter Verwendung eines erfindungsgemässen Kits, möglich ist, in Multianalyt- Assays, zur gleichzeitigen Bestimmung mehrerer Analyten in einer Probe, eine ähnlich hohe Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit zu erzielen wie bisher in einer entsprechenden Anzahl von Einzelassays zum Nachweis der individuellen Analyten.
Es wird bevorzugt, dass die gegenüber den Analyten "chemisch neutralen" Verbindungen ausgewählt sind aus den Gruppen, die von Albuminen, insbesondere Rinderserumalbumin oder Humanserumalbumin, Casein, unspezifischen, polyklonalen oder monoklonalen, artfremden oder empirisch für den oder die nachzweisenden Analyten unspezifischen Antikörpern (insbesondere für hnmunoassays), Detergentien - wie beispielsweise Tween 20 -, nicht mit zu analysierenden Polynukleotiden hybridisierender, fragmentierter natürlicher oder synthetischer DNA, wie beispielsweise ein Extrakt von Herings- oder Lachssperma (insbesondere für Polynukleotid-Hybridisierungsassays), oder auch ungeladenen, aber hydrophilen Polymeren, wie beispielsweise Polyethylenglycole oder Dextrane, gebildet werden. Innerhalb der mit diesen Verbindungen nach deren Aufbringung auf die Sensorplattform erzeugten Passivierungsschicht können die möglichst homogen darin verteilten lumineszenzmarkierten Moleküle beispielsweise lumineszenzmarkierte Derivate der oben genannten Verbindungen sein, welche mit den entsprechenden unmarkierten Verbindungen vor der Aufbringung auf die Sensorplattform gemischt werden. Dabei kann die Verknüpfung besagter unmarkierter „chemisch neutraler" Verbindungen mit entsprechenden Lumineszenz- labeln zur Bildung der lumineszenzmarkierten Derivate kovalenter Natur sein oder beispielsweise auf elektrostatischen, ionischen, hydrophoben oder hydrophilen oder van-der- Waals-Wechselwirkungen beruhen. Die Lumineszenzlabel können auch, ohne Erzeugung lumineszenzmarkierter Derivate, mit den besagten „chemisch neutralen" Verbindungen gemischt werden, bevor diese Mischung zur Erzeugung der Passivierungsschicht auf die Sensorplattform aufgebracht wird. Die „Referenzierungslabel" können auch in einem separaten Schritt vor Aufbringung der Passivierungsschicht aufgebracht werden. Die Wahl des Anteils von Lumineszenzlabehi in der Passivierunggschicht kann dabei angepasst werden an die Höhe zu erwartender Lumineszenzsignale in einem mit dem erfindungsgemässen Kit auszuführenden Analytnachweisverfahren, um beispielsweise eine Beeinträchtigung der Nachweisempfindlichkeit für einen Analyten, z.B. aufgrund zu starker Lumineszenzsignale aus der Passivierungsschicht, zu vermeiden. Im Falle einer separaten Aufbringung der „Referenzierungslabel" gelten gleichartige Anforderungen.
Wesentlich ist, dass die Passivierungsschicht unter den Bedingungen eines mit dem erfindungsgemässen Kit auszuführenden Analytnachweises „stabil" ist, d.h., dass es insbesondere zu keinem messbaren Austreten von Lumineszenzlabeln in eine gegebenenfalls in einem Assay mit der Sensorplattform in Kontakt gebrachte Proben- oder Reagentienflüs- sigkeit kommt, und dass die Lumineszenzlabel der Passivierungsschicht eine ausreichend hohe thermische und photochemische Stabilität besitzen, so dass es zumindest während der Dauer eines Analytnachweises zu keinem messbaren Signalverlust der erzeugten Signale zur ortsaufgelösten Referenzierung kommt.
Weiterhin wird bevorzugt, dass besagte immobilisierten biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselemente ausgewählt sind aus der Gruppe, die von Nukleinsäuren (beispielsweise DNA, RNA, Oligonukleotiden) und Nukleinsäureanalogen (z. B. PNA), mono- oder polyklonalen Antikörpern, Peptiden, Enzymen, Aptameren, synthetischen Peptidstrukturen, löslichen, membrangebundenen und aus einer Membran isolierten Proteinen, wie beispielsweise Rezeptoren, deren Liganden, Antigenen für Antikörper, "Histidin-Tag-Komponenten" und deren Komplexbildungspartnern, durch chemische Synthese erzeugten Kavitäten zur Aufnahme molekularer hnprints, etc. gebildet wird. Es ist auch vorgesehen, dass als biologische oder biochemische oder synthetische Erkennungselemente ganze Zellen, Zellbestandteile, Zellmembranen oder deren Fragmente aufgebracht werden.
Ausserdem wird bevorzugt, dass der Analytnachweis auf der Bestimmung der Änderung einer oder mehrerer Lumineszenzen beruht.
Eine mögliche Ausführungsform ist dadurch gekennzeichnet, dass das Anregungslicht von einer oder mehreren Lichtquellen in einer Auflichtanordnung eingestrahlt wird.
Für zahlreiche Ausführungsformen wird bevorzugt, dass das mit den Messbereichen in Kontakt stehende Material der Sensorplattform innerhalb einer Tiefe von mindestens 200 nm von den Messbereichen bei mindestens einer Anregungswellenlänge transparent oder absorbierend ist.
Andere Ausführungsformen sind dadurch gekennzeichnet, dass das Anregungslicht von einer oder mehreren Lichtquellen in einer Transmissionslichtanordnung eingestrahlt wird.
Vielfach ist es von Vorteil, wenn das Material der Sensorplattform bei mindestens einer Anregungswellenlänge transparent ist.
Eine bevorzugte Ausführungsform eines erfindungsgemässen Kits ist dadurch gekennzeichnet, dass die Sensorplattform als ein optischer Wellenleiter ausgebildet ist, welcher vorzugsweise im wesentlichen planar ist. Dabei umfasst die Sensorplattform vorzugsweise ein Material aus der Gruppe, die von Silikaten, z. B. Glas oder Quarz, transparenten thermoplastischen oder spritzbaren Kunststoff, beispielsweise Polycarbonat, Polyimid, Acrylaten, insbesondere Polymethylmethacrylat, oder Polystyrolen gebildet wird.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform eines erfindungsgemässen Kits ist dadurch gekennzeichnet, dass die Sensorplattform einen optischen Dünnschichtwellenleiter mit einer bei mindestens einer Anregungswellenlänge transparenten Schicht (a) auf einer bei min- destens dieser Anregungswellenlänge ebenfalls transparenten Schicht (b) mit niedrigerem Brechungsindex als Schicht (a) umfasst.
Verschiedene Ausführungsformen derartiger Sensorplattformen und Verfahren zum Nachweis einer oder mehrerer Analyten unter Verwendung solcher Sensorplattformen sind ausführlich beispielsweise in den Patenten US 5,822,472, US 5,959,292 und US 6,078,705 sowie in den Patentanmeldungen WO 96/35940, WO 97/37211, WO 98/08077, WO 99/58963, PCT/EP 00/04869 und PCT/EP 00/07529 beschrieben und sind als integraler Bestandteil eines erfindungsgemässen Kits ebenfalls Bestandteil der vorliegenden Erfindung
Für einen erfindungsgemässen Kit mit einem optischen Wellenleiter als Sensorplattform wird bevorzugt, dass das Anregungslicht von einer oder mehrerer Lichtquellen eingekoppelt wird in den optischen Wellenleiter mittels eines Verfahrens, welches ausgewählt ist aus der Gruppe, die von Stirnflächenkopplung, Einkopplung über angebrachte optische Fasern als Lichtleiter, Prismenkopplung, Gitterkopplung oder evaneszenter Kopplung durch Überlappung des evaneszenten Feldes besagten optischen Wellenleiters mit dem evaneszenten Feld eines weiteren, damit in Nahfeldkontakt gebrachten Wellenleiters gebildet wird.
Generell ist es anzustreben, die Erzeugung von Reflexionen eingestrahlten Anregungslichts weitestmöglich zu vermeiden, da diese im allgemeinen im wesentlichen nachteilig zu einer Erhöhung von Hintergrundsignalen führen. Beispielsweise ist mit dem Auftreten von Reflexionen prinzipiell jeweils beim Durchgang des Anregungslichts durch optische Grenzflächen zu Medien mit unterschiedlichen Brechungsindices zu rechnen. Daher ist es von Vorteil, wenn die Einkopplung des Anregungslichts von einer oder mehreren Lichtquellen in den optischen Wellenleiter mittels eines damit in Kontakt stehenden optischen Koppelelements erfolgt, welches ausgewählt ist aus der Gruppe von optischen Fasern als Lichtleiter, Prismen, gegebenenfalls über eine brechungsindexanpassende Flüssigkeit, und Gitter- kopplern.
Besonders bevorzugt wird eine Ausführungsform des erfindungsgemässen Kits, welche dadurch gekennzeichnet ist, dass das Anregungslicht von einer oder mehreren Lichtquellen in die Schicht (a) mittels einer oder mehrerer in der Schicht (a) modulierten Gitterstrukturen (c) eingekoppelt wird. Geeignete geometrische Anordnungen solcher Gitterstrukturen für eine Sensorplattform als Teil eines erfindungsgemässen Kits sind wiederum beispielsweise in den Patenten US 5,822,472, US 5,959,292 und US 6,078,705 sowie in den Patentanmeldungen WO 96/35940, WO 97/37211, WO 98/08077, WO 99/58963, PCT/EP 00/04869 und PCT/EP 00/07529 beschrieben und sind als integraler Bestandteil eines erfindungsgemässen Kits ebenfalls Bestandteil der vorliegenden Erfindung.
Für eine Vielzahl von Ausführungsformen wird bevorzugt, dass die Sensorplattform gleichförmige, unmodulierte Bereiche der Schicht (a) umfasst, welche vorzugsweise in Ausbreitungsrichtung des über eine Gitterstruktur (c) eingekoppelten und in der Schicht (a) geführten Anregungslichts angeordnet sind.
Generell gilt, dass Gitterstrukturen (c) der Einkopplung von Anregungslicht zu den Messbereichen (d) und / oder der Auskopplung von in die Schicht (a) rückgekoppeltem Lumineszenzlicht dienen können. In genereller Form wird die Sensorplattform daher eine Vielzahl von Gitterstrukturen (c) gleicher oder unterschiedlicher Periode mit gegebenenfalls daran anschliessenden gleichförmigen, unmodulierten Bereichen der Schicht (a) auf einem gemeinsamen, durchgehenden Substrat umfassen.
In den Assay- Applikationen mit einem erfindungsgemässen Kit ist es im allgemeinen vorteilhaft, ein geeignetes Anregungslicht über eine Gitterstruktur (c) einzukoppeln, an welche sich in Ausbreitungsrichtung des eingekoppelten und in der Schicht (a) geführten Lichts ein unmodulierter Bereich der Schicht (a) mit einer darauf befindlichen Vielzahl von Messbereichen in einem Array anschliesst, auf denen der Nachweis der verschiedenen Analyten erfolgt. Daran wird sich in der Ausbreitungsrichtung des geführten Lichts vorteilhaft eine weitere Gitterstruktur mit einem dahinter befindlichen weiteren Array von Messbereichen anschliesst etc. Nach Durchlaufen eines unmodulierten Bereichs wird das in der Schicht (a) geführte Licht jeweils wieder ausgekoppelt. In der zur Ausbreitungsrichtung des geführten Lichts senkrechten Richtung (d.h. parallel zu den Gitterlinien) werden sich weitere Arrays von Messbereichen anschliessen. Daher wird bevorzugt, dass jedem in Ausbreitungsrichtung des eingekoppelten Anregungslichts nachfolgenden Array von Messbereichen eine für dieses Array spezifische Gitterstruktur (c) zur Auskopplung dieses Anregungslichts zugeordnet ist, wobei senkrecht zur Ausbreitungsrichtung des eingekoppelten Anregungslichts die Gitterstrakturen spezifisch für einzelne Arrays ausgebildet sein können oder sich auch über die ganze Sensorplattform in dieser Richtung erstrecken können. Dieses bedeutet also, dass das Einkoppelgitter eines in Ausbreitungsrichtung eines in der Schicht (a) einer Sensorplattform geführten Anregungslichts nachfolgenden Arrays als Auskoppelgitter für das am Einkoppelgitter des in besagter Ausbreitungsrichtung vorangehenden Arrays eingekoppelte Anregungslicht dient.
Für bestimmte Anwendungen, beispielsweise für den Einsatz von 2 oder mehr Lumines- zenzlabeln mit unterschiedlichen Anregungswellenlängen, ist es von Vorteil, wenn die Sensorplattform eine Überlagerung von 2 oder mehreren Gitterstrukturen unterschiedlicher Periodizität mit zueinander paralleler oder nicht paralleler, vorzugsweise nicht paralleler Ausrichtung der Gitterlinien umfasst, welche der Einkopplung von Anregungslicht unterschiedlicher Wellenlänge dient, wobei im Falle von 2 überlagerten Gitterstrukturen deren Gitterlinien vorzugsweise senkrecht zueinander ausgerichtet sind.
Die Unterteilung der Sensorplattform in Bereiche mit darin ausgebildeten Gitterstrukturen und sich darin anschliessenden unmodulierten Bereichen bedeutet für die Anwendung, dass der Platzbedarf für ein einzelnes Array von Messbereichen zwischen aufeinander folgenden Gitterstrukturen (einschliesslich von mindestens einer zugeordneten Gitterstruktur) ein gewisses Minimum nicht unterschreiten kann, welches bei den gegenwärtigen technischen Möglichkeiten zur Erzeugung der Gitterstrukturen sowie zur Einkopplung eines geeigneten Anregungslichtbündels in der Grössenordnung von etwa 0.1 mm2 bis 1 mm2 liegt. Daher ist es insbesondere für Anordnungen, in denen eine Vielzahl jeweils kleinflächiger Arrays erwünscht ist, von Vorteil, wenn eine Gitterstruktur (c) oder eine Überlagerung mehrerer Gitterstrukturen in der Schicht (a) im wesentlichen über die gesamte Fläche der Sensorplattform moduliert ist.
In einer Weiterentwicklung wird bevorzugt, dass auf der Sensorplattform optisch oder mechanisch erkennbare Markierungen zur Erleichterung der Justierung in einem optischen System und / oder zur Verbindung mit Probenbehältnissen als Teil eines analytischen Systems aufgebracht sind.
Sofern eine Eigenfluoreszenz der Schicht (b) nicht auszuschliessen ist, insbesondere wenn diese aus einem Kunststoff wie beispielsweise Polycarbonat besteht, oder auch um den Einfluss der Oberflächenrauhigkeit der Schicht (b) auf die Lichtleitung in der Schicht (a) zu vermindern, kann es von Vorteil sein, wenn zwischen den Schichten (a) und (b) eine Zwischenschicht aufgebracht ist. Daher besteht eine weitere Ausführungsform der erfindungsgemässen Anordnung darin, dass sich zwischen den optisch transparenten Schichten (a) und (b) und in Kontakt mit Schicht (a) eine weitere optisch transparente Schicht (b') mit niedrigerem Brechungsindex als dem der Schicht (a) und einer Stärke von 5 nm - 10000 nm, vorzugsweise von 10 nm - 1000 nm, befindet.
Die einfachste Form der Immobilisierung der biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselemente besteht in physikalischer Adsorption, beispielsweise infolge hydrophober Wechselwirkungen zwischen den Erkennungselementen und der Grundplatte. Diese Wechselwirkungen können jedoch durch die Zusammensetzung des Mediums und dessen physikalisch-chemische Eigenschaften, wie beispielsweise Polarität und Ionenstärke, in ihrem Ausmass stark verändert werden. Insbesondere im Falle sequentieller Zugabe verschiedener Reagentien in einem mehrstufigen Assay ist das Haftvermögen der Erkennungselemente nach rein adsorptiver Immobilisierung auf der Oberfläche oft unzureichend. In einer bevorzugten Form des erfindungsgemässen Kits wird das Haftvermögen dadurch verbessert, dass zur Immobilisierung biologischer oder biochemischer oder synthetischer Erkennungselemente auf der Sensorplattform eine Haftvermittlungsschicht (f) aufgebracht ist. Die Haftvermittlungsschicht kann dabei auch, insbesondere im Falle zu immobilisierender biologischer oder biochemischer Erkennungselemente, der Verbesserung der "Biokompatibilität" von deren Umgebung dienen, d.h. der Erhaltung der Bindungsfähigkeit, im Vergleich zu deren natürlicher biologischer oder biochemischer Umgebung, und insbesondere der Vermeidung einer Denaturierung. Es wird bevorzugt, dass die Haftvermittlungsschicht (f) eine Stärke von weniger als 200 nm, vorzugsweise von weniger als 20 nm, hat. Für die Herstellung der Haftvermittlungsschicht eignen sich eine Vielzahl von Materialien. Ohne jegliche Einschränkung wird bevorzugt, dass die Haftvermittlungsschicht (f) eine oder mehrere chemische Verbindungen aus den Gruppen umfasst, die Silane, funktionalisierte Silane, Epoxide, funktionalisierte, geladene oder polare Polymere und "selbstorganisierte passive oder funktionalisierte Mono- oder Mehrfachschichten" umfassen. Die Haftvermittlungsschicht kann zusätzlich mit ihr assoziierte „Referenzierungslabel" zur ortsaufgelösten Referenzierung einer verfügbaren Anregungslichtintensitat umfassen, wobei diese „Referenzierungslabel" zusammen und gegebenenfalls an die genannten Komponenten der Haftvermittlungsschicht gebunden oder in einem separaten Schritt aufgebracht werden können.
Ein weiterer wesentlicher Aspekt des erfindungsgemässen Kits ist, dass die biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselemente in räumlich getrennten Messbereichen (d) immobilisiert sind. Diese räumlich getrennten Messbereiche (d) können durch räumlich selektive Aufbringung von biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselementen auf der Sensorplattform erzeugt werden. Für die Aufbringung eignen sich eine Vielzahl bekannter Verfahren. Ohne Beschränkung der Allgemeinheit wird bevorzugt, dass zur Aufbringung der biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselemente auf der Sensorplattform eines oder mehrere Verfahren verwendet werden aus der Gruppe von Verfahren, die von "InkJet spotting", mechanischem Spotting mittels Stift, Feder oder Kapillare, "micro contact printing", fluidischer Kontaktierung der Messbereiche mit den biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselementen durch deren Zufuhr in parallelen oder gekreuzten Mikrokanälen, unter Einwirkung von Druckunterschieden oder elektrischen oder elektromagnetischen Potentialen" sowie photochemischen und photolithographischen Immobilisierungsverfahren gebildet werden.
Eine weitere spezielle Ausführungsform des erfindungsgemässen Kits besteht darin, dass die Dichte der in diskreten Messbereichen immobilisierten Erkennungselemente zum Nachweis unterschiedlicher Analyten auf unterschiedlichen Messbereichen so ausgewählt ist, dass die Lumineszenzsignale beim Nachweis verschiedener Analyten in einem gemeinsamen Array von gleicher Grössenordnung sind, d.h., dass gegebenenfalls die zugehörigen Kalibrationskurven für die gleichzeitig durchzuführenden Analytbestimmungen ohne eine Änderung der elektronischen oder optoelektronischen Systemeinstellungen aufgenommen werden können.
Eine andere vorteilhafte Variante des erfindungsgemässen Kits ist dadurch gekenzeichnet, dass Arrays von Messbreichen aufgeteilt sind in Segmente von ein oder mehrereren Messbereichen zur Bestimmung von Analyten und Bereichen zwischen diesen Messbereichen oder zusätzlichen Messbereichen zu Zwecken einer zusätzlichen physikalischen Referenzierung, wie beispielsweise des Einflusses von Änderungen äusserer Parameter, wie beispielsweise der Temperatur, sowie zu Zwecken der Referenzierung des Einflusses zusätzlicher physikalisch-chemischer Parameter, wie beispielsweise unspezifischer Bindung an die Sensorplattform von Bestandteilen einer aufgebrachten Probe.
Für bestimmte Anwendungen, in denen beispielsweise Fragen der Reproduzierbarkeit der Ergebnisse mit einer Vielzahl von Arrays auf einer gemeinsamen Sensorplattform im Vordergrund stehen, ist es vorteilhaft, dass zwei oder mehr Arrays eine gleichartige geometrische Anordnung von Messbereichen und / oder Segmenten von Messbereichen für die Bestimmung gleichartiger Analyten auf diesen Arrays aufweisen.
Ebenfalls vor allem zur Untersuchung der Reproduzierbarkeit von Messungen auf verschiedenen Messbereichen kann es vorteilhaft sein, wenn ein oder mehrere Arrays Segmente von zwei oder mehr Messbereichen mit innerhalb des Segments gleichartigen biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselementen zur Analytbestimmung oder Referenzierung umfassen.
In anderen Applikationen ist es wesentlich, die Einflüsse systematischer Fehler auf die Ergebnisse zu minimieren, wie sich diese beispielsweise durch eine Replikation gleichartiger Strukturen auf einer gemeinsamen Sensorplattform ergeben können. Beispielsweise hierfür kann es von Vorteil sein, dass zwei oder mehr Arrays eine unterschiedliche geometrische Anordnung von Messbereichen und / oder Segmenten von Messbereichen für die Bestimmung gleichartiger Analyten auf diesen Arrays aufweisen.
Der erfindungsgemässe Kit mit einer Vielzahl von Messbereichen in diskreten Arrays, von denen ihrerseits eine Vielzahl auf einer gemeinsamen Sensorplattform angeordnet sein kann, bietet die Möglichkeit, dass unter Einsatz relativ geringer Mengen von Probelösungen, Reagentien oder gegebenenfalls Kalibrationslösungen auf ein- und derselben Plattform, unter weitestgehend identischen Bedingungen, auch viele Arten von Duplikationen oder Mehrfachausführungen gleichartiger Messungen durchgeführt werden können. Damit können beispielsweise in einer einzigen Messung statistische Daten erzeugt werden, wofür herkömmlicherweise eine Vielzahl von Einzelmessungen mit entsprechend längerer Gesamt-Messzeit und höherem Verbrauch an Proben- und Reagentienmengen erforderlich sind. Es wird bevorzugt, dass für den Nachweis jedes Analyten oder zur Referenzierung jeweils 2 oder mehr identische Messbereiche innerhalb eines Segments oder Arrays vorgesehen sind. Dabei können beispielsweise besagte identische Messbereiche in einer durch- gehenden Reihe oder Spalte oder Diagonalen eines Arrays oder Segments von Messbereichen angeordnet sein. Die Aspekte der Referenzierung können physikalische oder physikalisch-chemische Parameter der Sensorplattform betreffen, wie beispielsweise lokale Unterschiede der Anregungslichtintensitat (siehe hierzu auch weiter unten), als auch Einflüsse der Probe, wie beispielsweise deren pH, Ionenstärke, Brechungsindex, Temperatur etc.
Für andere Applikationen kann es aber auch vorteilhaft sein, wenn besagte identische Messbereiche statistisch innerhalb eines Arrays oder Segments von Messbereichen angeordnet sind.
Der erfindungsgemässe Kit kann eine sehr grosse Anzahl einzelner Messbereiche umfassen. Es wird bevorzugt, dass in einer 2-dimensionalen Anordnung bis zu 100000 Messbereiche angeordnet sind und ein einzelner Messbereich eine Fläche von 0.001 - 6 mm2 einnimmt. Bevorzugt sind auf einer Sensorplattform als Bestandteil des erfindungsgemässen Kits mehr als 100, stärker bevorzugt mehr als 1000, noch mehr bevorzugt mehr als 10000 Messbereiche angeordnet.
Weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Ausführungsform des erfindungsgemässen Kits, in der die Oberseite der Sensorplattform mit den darauf erzeugten Messbereichen über der optisch transparenten Schicht (a) mit einem weiteren Körper derart zusammengebracht ist, dass zwischen der Sensorplattform als Grundplatte und besagtem Körper eine oder mehrere räumliche Aussparungen zur Erzeugung eines oder mehrerer gegeneinander fluidisch abgedichteter Probenbehältnisse erzeugt werden, in denen jeweils ein oder mehrere Messbereiche oder Segmente oder Arrays von Messbereichen liegen.
Eine dabei bevorzugte Ausführungsform ist dadurch gekennzeichnet, dass die Probenbehältnisse als gegeneinander fluidisch abgedichtete Flusszellen mit jeweils mindestens einem Zulauf und mindestens einem Ablauf ausgebildet sind und gegebenenfalls zusätzlich mindestens ein Ablauf jeder Flusszelle in ein mit dieser Flusszelle fluidisch verbundenes Reservoir führt, welches aus der Flusszelle austretende Flüssigkeit aufnimmt.
Vorteilhafterweise ist dabei das gegebenenfalls zusätzlich vorhandene Reservoir zur Aufnahme aus der Flusszelle austretender Flüssigkeit als eine Vertiefung in der Aussenwand des mit der Sensorplattform als Grundplatte zusammengebrachten Körpers ausgebildet. Für die Erzeugung der räumlichen Aussparungen zwischen der Sensorplattform als Grundplatte und dem damit zusammengebrachten Körper gibt es dabei verschiedene technische Möglichkeiten. In einer möglichen Anordnung sind auf der Sensorplattform als Grundplatte räumliche Strukturen im Raster des Arrays der zu erzeugenden Flusszellen ausgebildet. Diese Strukturen auf der Grundplatte können beispielsweise die Wände oder Teile der Wände, wie beispielsweise Sockel, zwischen den neben- und hintereinander angeordneten Flusszellen bilden, welche durch Zusammenbringen der Grundplatte mit einem entsprechend geformten Körper erzeugt werden. Um das Array von Flusszellen zu erzeugen, ist es auch möglich, dass zur Erzeugung der räumlichen Aussparungen zwischen der Sensorplattform als Grundplatte und dem damit zusammengebrachten Körper Ausnehmungen in der Sensorplattform ausgebildet sind.
Eine weitere Ausführungsform besteht darin, dass zur Erzeugung der Aussparungen zwischen der Grundplatte und dem damit zusammengebrachten Körper Ausnehmungen in besagtem Körper ausgebildet sind. Für diese Ausführungsform wird bevorzugt, dass die Grundplatte im wesentlichen planar ist.
Der mit der Gundplatte zusammenzubringende Körper zur Erzeugung des Arrays von Flusszellen kann aus einem einzigen Werkstück bestehen. Eine andere Ausführungsform besteht darin, dass der mit der Grundplatte zusammengebrachte Körper aus mehreren Teilen zusammengesetzt ist, wobei die zusammengefügten Bestandteile besagten Körpers vorzugsweise eine irreversibel zusammengefügte Einheit bilden.
Es wird bevorzugt, dass der mit der Grundplatte zusammengebrachte Körper hilfs- weiseVorkehrungen umfasst, welche das Zusammenfügen besagten Körpers und der Grundplatte erleichtern.
Die Anordnung umfasst vorzugsweise eine Vielzahl, d. h. 2 - 2000 Probenbehältnissen, bevorzugt 2 - 400, besonders bevorzugt 2 - 100 Probenbehältnissen. Beispielsweise für Anwendungen, in denen die Zugabe der Proben und / oder zusätzlicher Reagentien direkt durch einen Dispenser erfolgen soll, wird bevorzugt, dass die Probenbehältnisse auf der den Messbereichen gegenüberliegenden Seite des mit der Sensorplattform als Grundplatte zusammengebrachten Körpers offen sind. Bevorzugt wird, dass das Raster (Aufeinanderfolge in Zeilen und / oder Spalten) der Probenbehältnisse dem Raster der Wells einer Standardmikrotiterplatte entspricht.
Eine weitere Ausführungsform der Anordnung von Probenbehältnissen als Teil des erfindungsgemässen Kits ist dadurch gekennzeichnet, dass sie durch einen zusätzlichen Abschluss, beispielsweise eine Folie, Membran oder eine Deckplatte, abgeschlossen wird.
Durch Variation der Grundflächen und der Tiefe der Ausnehmungen kann die Aufnahmefähigkeit der Flusszellen in einem weiten Bereich variiert werden, so dass das hmen- volumen jedes Probenbehältnisses typischerweise 0.1 μl - 1000 μl, bevorzugt 1 μl - 20 μl beträgt. Dabei können die Innenvolumina verschiedener Flusszellen einer Anordnung gleich oder unterschiedlich sein.
Es wird bevorzugt, dass die Tiefe der Ausnehmungen zwischen der Sensorplattform als Grundplatte und dem damit zusammengefügten Körper 1 - 1000 μm, besonders bevorzugt 20 - 200 μm beträgt. Die Grosse der Ausnehmungen eines Arrays kann einheitlich oder unterschiedlich sein und die Grundfllächen können beliebige, vorzugsweise rechteck- oder polygonförmige oder auch andere Geometrie haben. Ebenso können die lateralen Abmessungen der Grundflächen in einem weiten Bereich variiert werden, wobei typischerweise die Grundflächen der Ausnehmungen zwischen der Grandplatte und dem damit zusammengefügten Körpers jeweils 0.1 mm2 - 200 mm2, bevorzugt 1 mm2 - 100 mm2 betragen. Es wird bevorzugt, dass die Ecken der Grundflächen abgerundet sind. Abgerundete Ecken wirken sich günstig auf das Strömungsprofil aus und erleichtern die Entfernung eventuell gebildeter Gasblasen aus den Flusszellen bzw. verhindern deren Entstehen.
Für die gleichzeitige Proben- oder Reagentienzugabe zu einer Vielzahl von Probenbehältnissen können Multikanalpipettoren für manuelle oder automatische Reagentienapplikation verwendet werden, bei denen die individuellen Pipetten in ein- oder zweidimensionalen Arrays angeordnet sind, sofern die Anordnung von Probenbehältnissen als Teil des erfindungsgemässen Kits die Zuläufe in dem entsprechenden Raster aufweist. Bevorzugt entspricht daher das Raster (Aufeinanderfolge in Zeilen und Spalten) der Anordnung dem Raster der Wells von Standardmikrotiterplatten. Als industrieller Standard ist dabei eine Anordnung von 8 x 12 Wells mit einem (Zentrum-zu-Zentrum) Abstand von ca. 9 mm etabliert. Hiermit kompatibel sind kleinere Arrays mit beispielsweise 3, 6, 12, 24 und 48 Wells in gleichem Abstand. Es können auch mehrere erfindungsgemässe Anordnungen von Probenbehältnissen mit solchen kleineren Arrays von Flusszellen derart zusammengefügt werden, dass die einzelnen Zuläufe besagter Flusszellen in einem ganzzahligen Vielfachen des Abstands von ca. 9 mm angeordnet sind.
Seit einiger Zeit werden auch Platten mit 384 und 1536 Wells, als ganzzahligem Vielfachen von 96 Wells auf gleicher Grundfläche mit ensprechend reduziertem Wellabstand, verwendet, welche ebenfalls als Standardmikrotiterplatten bezeichnet werden sollen. Durch die Anpassung des Rasters der Probenbehältnisse der erfindungsgemässen Anordnung, mit den Zu- und Abläufen jedes Probenbehältnisses, an diese Standards können eine Vielzahl kommerziell eingeführter und erhältlicher Labor-Pipettoren und -Roboter für die Probenzugabe verwendet werden.
Bevorzugt entsprechen die äusseren Grundabmessungen der Anordnung von Probenbehältnissen, als Teil des erfindungsgemässen Kits, den Grundabmessungen dieser Standard- Mikrotiterplatten.
Weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Anordnung von beispielsweise 2 bis 8 Probenbehältnissen als Teil des erfindungsgemässen Kits, mit den vorgängig genannten Eigenschaften, in einer Spalte oder beispielsweise 2 bis 12 Probenbehältnissen in einer Zeile, welche ihrereseits mit einem Träger ("Metaträger") mit den Abmessungen von Standardmikrotiterplatten derart zusammengefügt werden, dass das Raster (Aufeinanderfolge in Zeilen oder Spalten) der Zuläufe der Probenbehältnisse dem Raster der Wells einer Standardmikrotiterplatte entspricht.
Es können auch mehrere solche Spalten oder Zeilen von Probenbehältnissen mit einem einzigen derartigen Metaträger so zusammengefügt werden, dass das Raster (Aufeinanderfolge in Zeilen oder Spalten) der Zuläufe der Flusszellen dem Raster der Wells einer Standardmikrotiterplatte, d. h. einem ganzzahligen Vielfachen von 9 mm (entsprechend 96- Well-Platte) oder von 4.5 mm (entsprechend 384-Well-Platte, siehe oben) oder von 2.25 mm (entsprechend 1536-Well-Platte, siehe oben) entspricht.
Die Anordnung von Probenbehältnissen kann jedoch selbstverständlich auch in einem anderen Raster ausgebildet sein. Die Materialien für den mit der Sensorplattform als Grundplatte zusammengebrachten Körper und einer gegebenenfalls verwendeten zusätzlichen Deckplatte müssen den Anforderungen für den jeweils geplanten Einsatz der Anordnung genügen. In Abhängigkeit von der spezifischen Applikation betreffen diese Anforderungen chemische und physikalische Beständigkeit, zum Beispiel gegen saure oder basische Medien, Salze, Alkohole oder Detergentien als Bestandteile von wässrigen Lösungen, oder Formamid, Temperaturbeständigkeit (zum Beispiel zwischen -30°C und 100°C), möglichst ähnliche thermische Ausdehnungskoeffizienten von Grundplatte und damit zusammengebrachtem Körper, optische Eigenschaften (z. B. Fluoreszenzfreiheit, Reflexionsvermögen), mechanische Bearbeitbar- keit etc. Es wird bevorzugt, dass das Material des mit der Grundplatte zusammgebrachten Körpers sowie eines optionalen zusätzlichen Abschlusses aus derselben Gruppe wie das Material des "Metaträgers" ausgewählt ist. Dabei können die genannten Komponenten (mit der Sensorplattforai als Grundplatte zusammengefügter Körper, Deckplatte) jeweils aus einem einheitlichen Material bestehen als auch eine Mischung oder schichtweise oder laterale Zusammenfügung verschiedener Materialien umfassen, wobei die Materialien sich gegenseitig ersetzen können.
Es ist vorgesehen, dass die Vorkehrungen zur ortsaufgelösten Referenzierung der in den Messbereichen oder in deren Umgebung verfügbaren Anregungslichtintensitat eine Durchschnittsbildung über mehrere ortsaufgelöste Referenzsignale umfassen. Im Falle von nicht statistisch, sondern systematisch variierender Anregungslichtintensitäten in Form eines über bestimmte Entfernungen vorliegenden Gradienten kann es vorteilhaft sein, wenn auf den zu erwartenden Wert der Anregungslichtintensitat eines zwischen verschiedenen Bereichen zur ortsaufgelösten Referenzierung liegenden Messbereichs interpoliert wird.
Ein weiteres wesentliches Merkmal des erfindungsgemässen Kits betrifft Vorkehrungen, um in Anwesenheit einer oder mehrerer Analyten erfasste Lumineszenzsignale zu kalibrieren. Eine mögliche Ausführungsform besteht darin, dass besagte Vorkehrungen zur Kalibration von infolge der Bindung eines oder mehrerer Analyten oder infolge der spezifischen Wechselwirkung mit einem oder mehreren Analyten erzeugten Lumineszenzen die Zugabe von Kalibrationslösungen mit bekannten Konzentrationen der nachzuweisenden Analyten auf eine vorbestimmte Anzahl von Arrays umfassen. Beispielsweise ist es möglich, dass 8 - 12 Arrays einer Sensorplattform für Kalibrationszwecke vorgesehen sind. Mit der Vielzahl von Messbereichen auf einer Sensorplattform ermöglicht der erfindungsgemässe Kit eine weitere, bislang nicht beschriebene Möglichkeit der Kalibration. Diese besteht darin, dass es im wesentlichen nicht notwendig ist, eine Vielzahl von Kalibrationslösungen mit unterschiedlichen, bekannten Konzentrationen auf ein oder mehrere Arrays zu geben, sondern in den für Kalibrationszwecke vorgesehenen Messbereichen die zum Analytnachweis eingesetzten biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselemente in bekannter, aber unterschiedlicher lokaler Konzentration zu immobilisieren. Ebenso wie durch Zugabe verschiedener Kalibrationslösungen unterschiedlicher Analytkonzentrationen auf ein Array mit Erkennungselementen in einer einzelnen konstanten Immobilisierungsdichte eine Kalibrationskurve generiert werden kann, ist es prinzipiell möglich, eine solche Standardkurve, welche die Bindungsaktivität und Häufigkeit der Bindungsereignisse zwischen einem Analyten und seinen Nachweiselementen widerspiegelt, durch Zugabe einer einzigen Kalibrationslösung auf ein Array mit Erkennungselementen in einer unterschiedlichen Immobilisierungsdichte zu erzeugen. Wesentlich für die Durchführbarkeit dieser, vereinfachten Art der Kalibration ist, dass das Bindungsverhalten zwischen einem Analyten und seinen Erkennungselementen genau bekannt ist, und dass die Variation, d.h. die Spannbreite zwischen niedrigster und höchster hnmobilisierangsdichte in den für einen Analyten vorgesehenen Messbereichen zur Kalibration ausreichend ist, um den gesamten für die Analytdetektion vorgesehenen Arbeitsbereich eines Assays abzudecken.
Daher ist weiterer Gegenstand der Erfindung ein Kit, welcher dadurch gekennzeichnet ist, dass in einem oder mehreren Arrays jeweils mehrere Messbereiche mit dort in einer unterschiedlichen, kontrollierten Dichte immobilisierten biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselementen zum Nachweis eines für diese Messbereiche gemeinsamen Analyten vorgesehen sind. Dabei wird besonders bevorzugt, dass bei bekannter Konzentrationsabhängigkeit der Bindungssignale zwischen einem Analyten und seinen biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselementen und einer ausreichend grossen "Variation" dieser in unterschiedlicher kontrollierter Dichte in verschiedenen Messbereichen eines Arrays immobilisierten Erkennungselemente bereits mittels Zugabe einer einzigen Kalibrationslösung zu diesem Array eine Kalibrationskurve für diesen Analyten erstellt werden kann. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung eines Kits nach einer der genannten Ausführangsformen in einem analytischen System zur Bestimmung einer oder mehrerer Lumineszenzen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein analytisches System mit einer beliebigen Ausführangsform des erfindungsgemässen Kits, dadurch gekennzeichnet, dass es zusätzlich mindestens einen Detektor zur Erfassung einer oder mehrerer Lumineszenzen von der Gitter- Wellenleiter-Struktur umfasst.
Inbesondere Gegenstand der Erfindung ist ein analytisches System zur Bestimmung einer oder mehrerer Lumineszenzen, mit
- mindestens einer Anregungslichtquelle
- einem erfindugsgemässen Kit sowie
- mindestens einem Detektor zur Erfassung des von einem oder mehreren Messbereichen (d) auf der Sensorplattform ausgehenden Lichts.
Eine mögliche Ausführangsform des analytisches System ist dadurch gekennzeichnet, dass das Anregungslicht in einer Auflicht- oder Transmissionslichtanordnung zu den Messbereichen eingestrahlt wird.
Es wird bevorzugt, dass die Detektion des Lumineszenzlichts derart erfolgt, dass das von einer Gitterstruktur (c) oder (c') ausgekoppelte Lumineszenzlicht vom Detektor mit erfasst wird.
Eine bevorzugte Ausführangsform des erfindungsgemässen analytischen Systems ist dadurch gekennzeichnet, dass das von der mindestens einen Anregungslichtquelle ausgesandte Anregungslicht im wesentlichen parallel ist und unter dem Resonanzwinkel zur Einkopplung in die optisch transparente Schicht (a) auf eine in der Schicht (a) modulierte Gitterstruktur (c) eingestrahlt wird.
Eine Möglichkeit besteht darin, dass das Anregungslicht von mindestens einer Lichtquelle mit einer Aufweitungsoptik zu einem im wesentlichen parallelen Strahlenbündel aufgeweitet wird und unter dem Resonanzwinkel zur Einkopplung in die optisch transparente Schicht (a) auf eine grossflächige in der Schicht (a) modulierte Gitterstraktur (c) eingestrahlt wird. Eine Vielzahl weiterer geeigneter analytischer Systeme mit einem erfindungsgemässen Kit als deren Bestandteil sind beispielsweise in den Patenten US 5,822,472, US 5,959,292 und US 6,078,705 sowie in den Patentanmeldungen WO 96/35940, WO 97/37211, WO 98/08077, WO 99/58963, PCT EP 00/04869 und PCT/EP 00/07529 beschrieben und in Ausführangsformen mit einem erfindungsgemässen Kit ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Es wird weiterhin bevorzugt, dass das erfindungsgemässe analytische System zusätzlich Zuführangsmittel umfasst, um die eine oder mehrere Proben mit den Messbereichen auf der Sensorplattform in Kontakt zu bringen.
Eine Weiterentwicklung des analytischen Systems ist dadurch gekennzeichnet, dass Behältnisse für Reagentien vorgesehen sind, welche während des Verfahrens zum Nachweis des einen oder mehrerer Analyten benetzt und mit den Messbereichen in Kontakt gebracht werden
Weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum gleichzeitigen qualitativen und / oder quantitativen Nachweis einer Vielzahl von Analyten mit einem Kit nach einer der genannten Ausführangsformen, dadurch gekennzeichnet, dass zur ortsaufgelösten Referenzierung der in den Messbereichen (d) auf der Sensorplattform, als Bestandteil des Kits, oder in der Umgebung dieser Messbereiche verfügbaren Anregungslichtintensitat die Lumineszenzsignale von möglichst homogen über die Sensorplattform verteilten lumineszenzmarkierten Molekülen, welche mit einer auf besagter Sensorplattform aufgebrachten Passivierungsschicht oder passivierten Haftvermittlungsschicht, zur Minimierung unspezifischer Bindung zwischen den Messbereichen, assozziiert sind, bestimmt werden.
Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls ein Verfahren zum gleichzeitigen qualitativen und / oder quantitativen Nachweis einer Vielzahl von Analyten mit einem Kit nach einer der genannten Ausführangsformen, dadurch gekennzeichnet, dass zur ortsaufgelösten Referenzierung der in den Messbereichen (d) auf der Sensorplattform, als Bestandteil des Kits, oder in der Umgebung dieser Messbereiche verfügbaren Anregungslichtintensitat die Lumineszenzsignale von möglichst homogen über die Sensorplattform verteilten lumineszenzmarkierten Molekülen, welche mit einer auf besagter Sensorplattform aufgebrachten dünnen Schicht (g) assoziiert sind, bestimmt werden. Dabei kann der quantitative und / oder qualitative Nachweis besagter Vielzahl von Analyten die Verwendung einer oder mehrerer signalgebender Komponenten als Label umfassen, welche ausgewählt sein können aus der Grappe, die von beispielsweise Lumineszenzlabeln, insbesondere lumineszenten Interkalatoren oder "molecular beacons", Absorptionslabeln, Massenlabeln, insbesondere Metallkolloiden oder Plastikbeads, Spin-Labeln, wie ESR- oder NMR-Labeln, radioaktiven Labein gebildet wird.
Im Rahmen des erfindungsgemässen Verfahrens ist es nöglich, dass die ortaufgelöste Referenzierung des in der Umgebung der Messbereiche verfügbaren Anregungslichts und / oder ein gegebenfalls auf Absorptions- und / oder Lumineszenznachweis beruhender Analytnachweis auf Einsatz von Labels mit gleicher oder unterschiedlicher Absorptionsund / oder Lumineszenzwellenlänge beruhen.
Es wird bevorzugt, dass der Analytnachweis auf der Bestimmung der Änderung einer oder mehrerer Lumineszenzen beruht. Dabei ist es vorteilhaft, wenn die möglichst homogen in der Passivierungsschicht verteilten lumineszenzmarkierten Moleküle („Referenzierungslabel") und zum Nachweis eines oder mehrerer Analyten eingesetzte Lumineszenzlabel („Nachweislabel") bei unterschiedlichen Wellenlängen angeregt werden können und vorzugsweise auch bei unterschiedlichen Wellenlängen emittieren. Besonders bevorzugt wird, wenn die Absorptions- und Lumineszenzspektren der verwendeten „Referenzierungslabel" und „Nachweislabel" möglichst wenig, im Idealfall gar nicht überlappen.
Eine andere bevorzugte Ausführungsform für bestimmte Anwendungen ist dadurch gekennzeichnet, dass die „Referenzierungslabel" und „Nachweislabel" bei der gleichen Wellenlänge angeregt werden können, aber bei unterschiedlichen Wellenlängen emittieren.
Eine mögliche Ausführangsform ist dadurch gekennzeichnet, dass das Anregungslicht von einer oder mehreren Lichtquellen in einer Auflichtanordnung eingestrahlt wird.
Andere Ausführangsformen sind dadurch gekennzeichnet, dass das Anregungslicht von einer oder mehreren Lichtquellen in einer Transmissionslichtanordnung eingestrahlt wird.
Ein bevorzugter Gegenstand der Erfindung ist eine Ausführangsform des erfindungsgemässen Verfahrens, welche dadurch gekennzeichnet ist, dass die Sensorplattform als ein optischer Wellenleiter ausgebildet ist, welcher vorzugsweise im wesentlichen planar ist, und dass das Anregungslicht von einer oder mehrerer Lichtquellen eingekoppelt wird in den optischen Wellenleiter mittels eines Verfahrens, welches ausgewählt ist aus der Grappe, die von Stirnflächenkopplung, Einkopplung über angebrachte optische Fasern als Lichtleiter, Prismenkopplung, Gitterkopplung oder evaneszenter Kopplung durch Überlappung des evaneszenten Feldes besagten optischen Wellenleiters mit dem evaneszenten Feld eines weiteren, damit in Nahfeldkontakt gebrachten Wellenleiters gebildet wird.
Bevorzugt wird dabei, dass die Einkopplung des Anregungslichts von einer oder mehreren Lichtquellen in den optischen Wellenleiter mittels eines damit in Kontakt stehenden optischen Koppelelements erfolgt,. welches ausgewählt ist aus der Gruppe von optischen Fasern als Lichtleiter, Prismen, gegebenenfalls über eine brechungsindexanpassende Flüssigkeit, und Gitterkopplern.
Besonders bevorzugt wird eine solche Ausführangsform des erfindungsgemässen Verfahrens, welche dadurch gekennzeichnet ist, dass die Sensorplattform einen optischen Dünnschichtwellenleiter mit einer bei mindestens einer Anregungswellenlänge transparenten Schicht (a) auf einer bei mindestens dieser Anregungswellenlänge ebenfalls transparenten Schicht (b) mit niedrigerem Brechungsindex als Schicht (a) umfasst und dass das Anregungslicht von einer oder mehreren Lichtquellen in die Schicht (a) mittels einer oder mehrerer in der Schicht (a) modulierten Gitterstrukturen (c) eingekoppelt wird.
Diese Ausführangsform des Verfahrens kann derart durchgeführt werden, dass eine oder mehrere auf besagte Analyten zu untersuchende flüssige Proben mit den Messbereichen auf der Sensorplattform in Kontakt gebracht werden, eine oder mehrere im Nahfeld der Schicht (a) erzeugte Lumineszenzen aus den mit besagter Probe oder besagten Proben in Kontakt gebrachten Messbereichen, als Folge der Bindung eines oder mehrerer Analyten an die in besagten Messbereichen immobilisierten biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselemente oder der Wechselwirkung zwischen besagten Analyten und besagten immobilisierten Erkennungselementen, gemessen werden und gegebenenfalls zusätzlich in ortsaufgelöster Weise die in besagten Messbereichen oder in deren Umgebung verfügbare Anregungslichtintensitat referenziert wird. Es wird bevorzugt, dass (1) die isotrop abgestrahlte Lumineszenz oder (2) in die optisch transparente Schicht (a) eingekoppelte und über Gitterstrakturen (c) ausgekoppelte Lumineszenz oder Lumineszenzen beider Anteile (1) und (2) gleichzeitig gemessen werden.
Bestandteil des erfindungsgemässen Verfahrens ist, dass zur Erzeugung der Lumineszenzen der „Referenzierungslabel" und der „Nachweislabel" Lumineszenzfarbstoffe oder lumines- zente Nanopartikel als Lumineszenzlabel verwendet werden, die bei einer Wellenlänge zwischen 300 nm und 1100 nm angeregt werden können und emittieren.
Es wird bevorzugt, dass das „Nachweislabel" an den Analyten oder in einem kompetitiven Assay an einen Analogen des Analyten oder in einem mehrstufigen Assay an einen der Bindungspartner der immobilisierten biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselemente oder an die biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselemente gebunden ist.
Eine andere Ausführangsform des Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass ein zweites oder noch weitere „Nachweislabel" mit gleicher oder unterschiedlicher Anregungswellenlänge wie das erste „Nachweislabel" und gleicher oder unterschiedlicher Emissionswellenlänge verwendet werden.
Dabei wird bevorzugt, dass das zweite oder noch weitere „Nachweislabel" bei der gleichen Wellenlänge wie der erste Lumineszenzfarbstoff angeregt werden kann, aber bei anderen Wellenlängen emittieren.
Insbesondere ist von Vorteil, wenn die Anregungsspektren und Emissionsspektren der zum Analytnachweis eingesetzten Lumineszenzfarbstoffe nur wenig oder gar nicht überlappen.
Eine Variante des Verfahrens besteht darin, dass zum Nachweis des Analyten Ladungsoder optischer Energietransfer von einem als Donor dienenden ersten Lumineszenzfarbstoff zu einem als Akzeptor dienenden zweiten Lumineszenzfarbstoff verwendet wird.
Eine andere mögliche Ausführangsform des Verfahrens besteht darin, dass das Ausmass der Löschung ("Quenching") einer oder mehrerer Lumineszenzen bestimmt wird. Eine weitere Ausführangsform des Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass neben der Bestimmung einer oder mehrerer Lumineszenzen Änderungen des effektiven Brechungsindex auf den Messbereichen bestimmt werden.
Eine Weiterentwicklung des Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass die einen oder mehreren Lumineszenzen und / oder Bestimmungen von Lichtsignalen bei der Anregungswellenlänge polarisationsselektiv vorgenommen werden.
Es wird bevorzugt, dass die einen oder mehreren Lumineszenzen bei einer anderen Polarisation als der des Anregungslichts gemessen werden.
Eine bevorzugte Ausführangsform des erfindungsgemässen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass die Dichte der in diskreten Messbereichen immobilisierten Erkennungselemente zum Nachweis unterschiedlicher Analyten auf unterschiedlichen Messbereichen so ausgewählt ist, dass die Lumineszenzsignale beim Nachweis verschiedener Analyten in einem gemeinsamen Array von gleicher Grössenordnung sind, d.h., dass die zugehörigen Kalibrationskurven für die gleichzeitig durchzuführenden Analytbestimmungen ohne eine Änderung der elektronischen oder optoelektronischen Systemeinstellungen aufgenommen werden können.
Eine Weiterentwicklung des Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass Arrays von Messbereichen aufgeteilt sind in Segmente von ein oder mehrereren Messbereichen zur Bestimmung von Analyten und Bereichen zwischen diesen Messbereichen oder zusätzlichen Messbereichen zu Zwecken einer zusätzlichen physikahschen Referenzierung, wie des Einflusses von Änderungen äusserer Parameter, wie beispielsweise der Temperatur, sowie zu Zwek- ken der Referenzierang des Einflusses zusätzlicher physikalisch-chemischer Parameter, wie beispielsweise unspezifischer Bindung an die Sensorplattform von Bestandteilen einer aufgebrachten Probe. Unspezifische bindende Bestandteile einer aufgebrachten Probe können dabei beispielsweise die einen oder mehreren Analyten selbst, zum Analytnachweis zur Probe hinzugefügte Nachweisreagentien, z.B. sekundäre, lumineszenzmarkierte Antikörper in einem Sandwich-hnmunoassay, oder auch Bestandteile der Probenmatrix sein, insbesondere wenn es sich bei dem Probenmedium beispielsweise um eine Körperflüssigkeit handelt und die Probe keinen weiteren Reinigungsschritten unterzogen wurde. Zur Bestimmung der unspezifischen Bindung können die dafür vorgesehenen Bereiche auf einer Sensorplattform beispielsweise „passiviert worden" sein, d.h. mit einer gegenüber dem Analyten „chemisch neutralen" Verbindung beschichtet sein, wie vorangehend beschrieben als Massnahme zur Herabsetzung unspezifischer Bindung. Hierfür bietet das erfindungsgemässe Verfahren den besonderen Vorteil, dass für diese Form der physikalisch-chemischen Referenzierang keine Bereitstellung zusätzlicher Messbereiche erforderlich ist, sondern diese Form der Referenzierung direkt basierend auf den mit der Passivierungsschicht zwischen den Messbereichen (zum Analytnachweis) erzeugten Lummeszensignalen erfolgen kann. Im Falle gleicher oder stark überlappender Absorptions- und Emissionsspektren von „Referenzierungslabeln" und „Nachweislabeln" erfolgen die ortsaufgelöste Bestimmung der verfügbaren Anregungslichtintensitat (vor Durchführung des Analytnachweises) und der Analytnachweis (aufgrund der resultierenden Lumineszenzintensitäten der eingesetzten „Nachweislabel") vorzugsweise sequentiell. Im Falle wenig oder im Idealfall gar nicht überlappender Absorptions- und Emissionsspektren können die entsprechenden Lumineszenzintensitäten der verschiedenen Label auch im wesentlichen gleichzeitig (d.h. ohne zwischenzeitliche Assay- Arbeitsschritte wie Probenzugabe etc., lediglich unter Verwendung der entsprechenden unterschiedlichen Lichtquellen und / oder Anregungs- und Emissions-Filtersätze) bestimmt werden.
Für bestimmte Anwendungen, beispielsweise beim Nachweis niedermolekularer Verbindungen in der hnmunoanalytik oder beim Nachweis von Einzelpunktmutationen in der Nukleinsäurenanalytik, ist eine Kreuzreaktivität zu den (bio)chemisch ähnlichsten Verwandten des betreffenden Analyten kaum auszuschliessen. Für derartige Anwendungen ist eine solche Ausführangsform des erfindungsgemässen Verfahrens vorteilhaft, in der ein oder mehrere Messbereiche eines Segments oder eines Arrays der Bestimmung desselben Analyten zugeordnet sind und deren immobiliserte biologische oder biochemische Erkennungselemente unterschiedlich hohe Affinitäten zu besagtem Analyten aufweisen. Die Erkennungselemente sind dabei zweckmässigerweise so ausgewählt, dass sich ihre Affinitäten zu verschiedenen, einander (bio)chemisch ähnlichen Analyten in unterschiedlicher, charakteristischer Weise ändern. Aus der Gesamtheit der Signale von verschiedenen Messbereichen mit unterschiedlichen Erkennungselementen für einen einzelnen Analyten lässt sich dann, in vergleichbarer Weise zu einem Fingerabdruck, die Identität des Analyten bestimmen.
Für andere spezifische Anwendungen, in denen beispielsweise Fragen der Reproduzierbarkeit der Ergebnisse mit einer Vielzahl von Arrays auf einer gemeinsamen Sensorplattform im Vordergrand stehen, ist es vorteilhaft, dass zwei oder mehr Arrays eine gleichartige geometrische Anordnung von Messbereichen und / oder Segmenten von Messbereichen für die Bestimmung gleichartiger Analyten auf diesen Arrays aufweisen.
Ebenfalls vor allem zur Untersuchung der Reproduzierbarkeit von Messungen auf verschiedenen Messbereichen kann es vorteilhaft sein, wenn ein oder mehrere Arrays Segmente von zwei oder mehr Messbereichen mit innerhalb des Segments gleichartigen biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselementen zur Analytbestimmung oder Referenzierang umfassen.
In anderen Applikationen ist es wesentlich, die Einflüsse systematischer Fehler auf die Ergebnisse zu minimieren, wie sich diese beispielsweise durch eine Replikation gleichartiger Strukturen auf einer gemeinsamen Sensorplattform ergeben können. Beispielsweise hierfür kann es von Vorteil sein, dass zwei oder mehr Arrays eine unterschiedliche geometrische Anordnung von Messbereichen und / oder Segmenten von Messbereichen für die Bestimmung gleichartiger Analyten auf diesen Arrays aufweisen.
Das erfindungsgemässe Verfahren mit einem erfindungsgemässem Kit mit einer Vielzahl von Messbereichen in diskreten Arrays, von denen ihrerseits eine Vielzahl auf einer gemeinsamen Sensorplattform angeordnet sein kann, bietet die Möglichkeit, dass unter Einsatz relativ geringer Mengen von Probelösungen, Reagentien oder Kalibrationslösungen auf ein- und derselben Plattform, unter weitestgehend identischen Bedingungen, auch viele Arten von Duplikationen oder Mehrfachausführungen gleichartiger Messungen durchgeführt werden können. Damit können beispielsweise in einer einzigen Messung statistische Daten erzeugt werden, wofür herkömmlicherweise eine Vielzahl von Einzelmessungen mit entsprechend längerer Gesamt-Messzeit und höherem Verbrauch an Proben- und Reagentien- mengen erforderlich sind. Es wird bevorzugt, dass für den Nachweis jedes Analyten oder zur Referenzierang jeweils 2 oder mehr identische Messbereiche innerhalb eines Segments oder Arrays vorgesehen sind. Dabei können beispielsweise besagte identische Messbereiche in einer durchgehenden Reihe oder Spalte oder Diagonalen eines Arrays oder Segments von Messbereichen angeordnet sein. Die Aspekte der Referenzierung können physikalische oder physikalisch-chemische Parameter der Sensorplattform betreffen, wie beispielsweise lokale Unterschiede der Amegungslichtintensität (siehe hierzu auch weiter unten), als auch Einflüsse der Probe, wie beispielsweise deren pH, Ionenstärke, Brechungsindex, Temperatur etc.
Für andere Applikationen kann es aber auch vorteilhaft sein, wenn besagte identische Messbereiche statistisch innerhalb eines Arrays oder Segments von Messbereichen angeordnet sind.
Weiterhin wird bevorzugt, dass die ortsaufgelöste Referenzierang der in den Messbereichen oder in deren Umgebung verfügbaren Anregungslichtintensitat eine Durchschnittsbildung über mehrere ortsaufgelöste Referenzsignale umfasst. Im Falle von nicht statistisch, sondern systematisch variierender Anregungslichtintensitäten in Form eines über bestimmte Entfernungen vorliegenden Gradienten kann es vorteilhaft sein, wenn auf den zu erwartenden Wert der Anregungslichtintensitat eines zwischen verschiedenen Bereichen zur ortsaufgelösten Referenzierang liegenden Messbereichs interpoliert wird.
Die Zugabe der einen oder mehreren Proben und der im Nachweisverfahren einzusetzenden Nachweisreagentien kann sequentiell in mehreren Schritten erfolgen. Es wird bevorzugt, dass die eine oder mehreren Proben mit einer Mischung aus den verschiedenen Nachweisreagentien zur Bestimmung der in besagten Proben nachzuweisenden Analyten vorinkubiert werden und diese Mischungen dann in einem einzigen Zugabeschritt den dafür vorgesehenen Arrays auf der Sensorplattform zugeführt werden.
Eine bevorzugte Ausführangsform des erfindungsgemässen Verfahrens zeichnet sich dadurch aus, dass die Konzentration der Nachweisreagentien, wie beispielsweise sekundärer Nachweisantikörper und / oder Lumineszenzlabel und optional zusätzlicher lumineszenzmarkierter Nachweisreagentien in einem Sandwich-Immunoassay, so ausgewählt ist, dass die Lumineszenzsignale beim Nachweis verschiedener Analyten in einem gemeinsamen Array von gleicher Grössenordnung sind, d.h., dass die zugehörigen Kalibrationskurven für die gleichzeitig durchzuführenden Analytbestimmungen ohne eine Änderung der elektronischen oder optoelektronischen Systemeinstellungen aufgenommen werden können.
Weiterer Gegenstand einer erfindungsgemässen Ausführangsform des Verfahrens ist, dass die Kalibration von infolge der Bindung eines oder mehrerer Analyten oder infolge der spezifischen Wechselwirkung mit einem oder mehreren Analyten erzeugten Lumineszenzen die Zugabe von einer oder mehreren Kalibrationslösungen mit bekannten Konzentrationen besagter zu bestimmender Analyten auf die gleichen oder andere Messbereiche oder Segmente von Messbereichen oder Arrays von Messbereichen auf einer Sensorplattform umfasst, denen im gleichen oder einem separaten Zugabeschritt die eine oder die mehreren zu untersuchenden Proben zugeführt werden.
Eine andere bevorzugte Ausführangsform des Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass die Kalibration von infolge der Bindung eines oder mehrerer Analyten oder infolge der spezifischen Wechselwirkung mit einem oder mehreren Analyten erzeugten Lumineszenzen den Vergleich der Lumineszenzintensitäten nach Zugabe einer unbekannten und einer Kontroll-Probe, wie beispielsweise einer "wild type"-DNA-Probe und einer "mutant DNA"- Probe, umfasst. Es ist dabei möglich, dass die Zugabe der unbekannten Probe und der Kontrollprobe zu unterschiedlichen Arrays erfolgt.
Eine andere Variante dieses Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass die Zugabe der unbekannten Probe und der Kontrollprobe sequentiell zu dem gleichen Array erfolgt. Bei dieser Ausführangsform ist im allgemeinen zwischen der Zugabe der unbekannten Probe und der Kontrollprobe ein Regenerierangsschritt notwendig, d.h. die Dissoziation von nach Zugabe der ersten Probe gebildeten Erkennungselement- Analyt-Komplexen, gefolgt von der Entfernung der dissoziierten Analytmoleküle aus den Probenbehältnissen, bevor die Zugabe der zweiten Probe erfolgen kann. In ähnlicher Weise können in sequentieller Form auch mehrere Proben auf demselben Array von Messbereichen auf ihre Analyten untersucht werden.
Eine andere mögliche Ausführangsform des Verfahrens besteht darin, dass die unbekannte Probe und die Kontrollprobe gemischt werden und dann die Mischung einem oder mehreren Arrays einer Sensorplattform zugeführt wird.
Eine Weiterentwicklung des erfindungsgemässen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass die Detektion der in der unbekannten und der Kontrollprobe nachzuweisenden Analyten mittels Lumineszenzlabels von unterschiedlicher Anregungs- und / oder Lumineszenzwellenlänge für die unbekannte und die Kontrollprobe erfolgt. Beispielsweise wird bevorzugt, dass zur Bestimmung von Analyten aus verschiedenen Gruppen der Nachweis unter Verwendung von zwei oder mehr Lumineszenzlabeln mit unterschiedlichen Anregungs- und / oder Lumineszenzwellenlängen erfolgt.
Wie vorangehend beschrieben, eröffnet der erfindungsgemässe Kit mit der grossen Anzahl von Messbereichen auf einer Sensorplattform die Möglichkeit einer vereinfachten Form der Kalibration zur qualitativen und / oder quantitativen Bestimmung eines oder mehrere Analyten auf einem oder mehreren Arrays. Im besten Fall ist bei dieser neuen, erfindungsgemässen Form der Kalibration der Signale einer Sensorplattform die Zugabe nur einer einzigen Kalibrationslösung erforderlich, hi dieser Weiterentwicklung des erfindungsgemässen Verfahrens wird daher bevorzugt, dass in einem oder mehreren Arrays jeweils mehrere Messbereiche mit dort in einer unterschiedlichen, kontrollierten Dichte immobilisierten biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselementen zum Nachweis eines für diese Messbereiche gemeinsamen Analyten vorgesehen sind. Diese Weiterentwicklung des Verfahrens zeichnet sich dadurch aus, dass bei bekannter Konzentrationsabhängigkeit der Bindungssignale zwischen einem Analyten und seinen biologischen oder biochemischen oder synthtischen Erkennungselementen und einer ausreichend grossen "Variation" dieser in unterschiedlicher kontrollierter Dichte in verschiedenen Messbereichen eines Arrays immobilisierten Erkennungselemente bereits mittels Zugabe einer einzigen Kalibrationslösung zu diesem Array eine Kalibrationskurve für diesen Analyten erstellt werden kann.
Bestandteil der Erfindung ist ein Verfahren nach einer der vorgenannten Ausführangsformen zur gleichzeitigen oder sequentiellen, quantitativen oder qualitativen Bestimmung eines oder mehrerer Analyten aus der Grappe von Antikörpern oder Antigenen, Rezeptoren oder Liganden, Chelatoren oder "Histidin-tag-Komponenten", Oligonukleotiden, DNA- oder RNA-Strängen, DNA- oder RNA- Analoga, Enzymen, Enzymcofaktoren oder Inhibitoren, Lektinen und Kohlehydraten.
Mögliche Ausführangsformen des Verfahrens sind auch dadurch gekennzeichnet, dass die zu untersuchenden Proben natürlich vorkommende Körperflüssigkeiten wie Blut, Serum, Plasma, Lymphe oder Urin oder Eigelb oder optisch trübe Flüssigkeiten oder Gewebeflüssigkeiten oder Oberflächenwasser oder Boden- oder Pflanzenextrakte oder Bio- oder Syntheseprozessbrühen oder aus biologischen Gewebeteilen oder aus Zellkulturen oder - extrakten entnommen sind.
Weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung eines erfindungsgemässen Kits und / oder eines erfindungsgemässen analytischen Systems und / oder eines erfindungsgemässen Verfahrens für quantitative oder qualitative Analysen zur Bestimmung chemischer, biochemischer oder biologischer Analyten in Screeningverfahren in der Pharmaforschung, der Kombinatorischen Chemie, der Klinischen und Präklinischen Entwicklung, zu Echtzeitbin- dungsstudien und zur Bestimmung kinetischer Parameter im Affinitätsscreening und in der Forschung, zu qualitativen und quantitativen Analytbestimmungen, insbesondere für die DNA- und RNA- Analytik, für die Erstellung von Toxizitätsstudien sowie für die Bestimmung von Gen- oder Protein-Expressionsprofilen sowie zum Nachweis von Antikörpern, Antigenen, Pathogenen oder Bakterien in der pharmazeutischen Protduktentwicklung und - forschung, der Human- und Veterinärdiagnostik, der Agrochemischen Produktentwicklung und -forschung, der symptomatischen und präsymptomatischen Pflanzendiagnostik, zur Patientenstratifikation in der pharmazeutischen Produktentwicklung und für die therapeutische Medikamentenauswahl, zum Nachweis von Pathogenen, Schadstoffen und Erregern, insbesondere von Salmonellen, Prionen, Viren und Bakterien, in der Lebensmittel- und Umweltanalytik.
Die nachfolgenden Ausführungsbeispiele erläutern die Erfindung beispielhaft.
Beispiel 1:
1A; Sensorplattform
Es wird eine Sensorplattform mit den äusseren Abmessungen 57 mm Breite (parallel zu den Gitterlinien einer in der Schicht (a) der Sensorplattform modulierten Gitterstraktur (c)) x 14 mm Länge (senkrecht zu den Gitterstrakturen) x 0.7 mm Dicke verwendet, auf deren Fläche durch Kombination mit einer Platte aus Polycarbonat mit in Richtung der Sensorplattform offenen Ausnehmungen mit den Innendimensionen 5 mm Breite x 7 mm Länge x 0.15 mm Höhe 6 Mikroflusszellen im Raster einer Teilspalte einer klassischen MikiOtiterplatte (Raster 9 mm) erzeugt werden können. Die Polycarbonat-Platte kann mit der Sensorplattform derart verklebt werden, dass danach die Ausnehmungen gegeneinander dicht ver- schliessend abgedichtet sind. Diese Polycarbonat-Platte ist derart konstruiert, dass sie mit einem Träger ("Metaträger") mit den Grandabmessungen von Standardmikrotiterplatten derart zusammengefügt werden kann, dass das Raster (Aufeinanderfolge in Zeilen oder Spalten) der Zuläufe der Flusszellen dem Raster der Wells einer Standardmikrotiterplatte entspricht.
Das Substratmaterial (optisch transparente Schicht (b) besteht aus AF 45 Glas (Brechungsindex n = 1.52 bei 633 nm). Im Substrat ist ein Paar von Ein- und Auskoppelgittern mit parallel zur Breite der Sensorplattform verlaufenden Gitterlinien (318 nm Periode) von 12 +/- 3 nm Gittertiefe ausgeprägt, wobei die Gitterlinien über die gesamte Breite der Sensorplattform ausgeprägt sind. Der Abstand zwischen den beiden aufeinanderfolgenden Gittern beträgt 9 mm, die Länge der einzelnen Gitterstrakturen (parallel zur Länge der Sensorplattform) 0.5 mm. Der Abstand zwischen dem Ein- und Auskoppelgitter eines Gitterpaares ist so gewählt, dass die Einkopplung des Anregungslichts jeweils innerhalb des Bereichs der Probenbehältnisse, nach Kombination der Sensorplattform mit der oben beschriebenen Polycarbonatplatte, erfolgen kann, während die Auskopplung ausserhalb des Bereichs der Probenbehältnisse erfolgt. Die wellenleitende, optisch transparente Schicht (a) aus Ta2O5 auf der optisch transparenten Schicht (b) hat einen Brechungsindex von 2.15 bei 633 nm (Schichtdicke 150 nm).
Die von der Sensorplattform und der damit kombinierten Polycarbonatplatte gebildeten Probenbehältnisse weisen auf den der Sensorplattform gegenüberliegenden Begrenzungs- flächen konisch ausgebohrte Öffnungen auf, so dass eine Befüllung oder Entleerang der Probenbehältnisse durch Einpressen von standardisierten, kommerziell erhältlichen Pipettenspitzen aus Polypropylen erfolgen kann.
Zur Vorbereitung auf die Immobilisierung der biochemischen oder biologischen oder synthetischen Erkennungselemente wird die Sensorplattformen mit Chloroform im Ultraschallgerät gereinigt und mit Poly-L-Lysin, entsprechend bekannten Standardprotokollen, chemisch aktiviert (Schritt 1).
Jjn nächsten Schritt (Schitt 2) wird, als Lumineszenzlabel für die spätere ortsaufgelöste Referenzierang, monofunktioneller Fluoreszenzfarbstoff (FluorX™ (10 nM in 10 mM Carbonatpuffer, pH 9.2) 2 Stunden lang mit der aktivierten Oberfläche der Sensorplattform inkubiert. Der FluorX™ Farbstoff ist der NHS -Ester von Carboxyfluorescein, mit einem erweiterten Linkerarm, und bindet unter milden Bedingungen an die primären Aminograp- pen des Poly-L-Lysins. Anschliessend wird mit destilliertem Wasser gewaschen und die Oberfläche durch Zentrifugation getrocknet.
Erzeugung diskreter Messbereiche (Schritt 3): Als biologische Erkennungselemente werden cDNA's in einer Konzentration von 0.1 μg/μl in 10 mM Carbonatpuffer (pH 9.2) auf die Poly-L-Lysin-Oberfläche mit einem kommerziellen Spotter aufgebracht (GMS 417 Arrayer, Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) und über Nacht inkubiert (Array von 10 x 10 Spots; Spotdurchmesser 100 μm, Zentram-zu-Zentram Abstand 375 μm). Anschliessend wird mit destilliertem Wasser gewaschen und die Oberfläche durch Zentrifugation getrocknet. Die Bindung der cDNA's an die Poly-L-Lysin-Oberfläche ist adsorptiver Natur bzw. erfolgt über elektrostatische Wechselwirkungen. Eine Beeinträchtigung der Bindungskapazität der Oberfläche für cDNA, infolge der zuvor aufgebrachten Fluorophore für die ortsaufgelöste Referenzierang, wird nicht festgestellt.
Passivierung der Oberfläche (Schritt 4): Zur weitestgehenden Unterbindung von unspezifischen Wechselwirkungen mit den nachzuweisenden Analyten oder anderer Bestandteile einer aufzubringenden Probe, d.h. zur Erzeugung einer gegenüber den Analyten ausserhalb der Messbereiche „chemisch neutralen" Oberfläche, wird die Oberfläche nach einem Standardverfahren (M. Schena. „DNA Microarrays - A Practical Approach", Oxford University Press, New York, (1999) 131) mit Natriumborhydrat reduziert. Dieses Passivie- rungs- bzw. Deaktivierangsverfahren ist auch anwendbar für Gaftvermittlungsschichten mit funktionalisierten Silanen, z. B. Reaktiven Aldehyd- oder Epoxygrappen. Die Oberfläche kann zusätzlich durch Aufgabe einer weiteren Passivierungsschicht, zur Minimierang unspezifischer Bindung, weiter passiviert werden, wie in der ausführlichen Beschreibung der Erfindung erläutert.
Auf die so vorbereitete Sensorplattform wird die beschriebene Polycarbonatplatte so aufgebracht, dass die einzelnen Probenbehältnisse gegeneinander fluidisch dicht verschliessend abgeschlossen sind und das erzeugte cDNA- Array mit dem zugehörigen Einkoppelgittern (c) sich innerhalb eines der 6 Probenbehältnisse befindet.
1B: Hybridisierung mit Cy5-markierter cDNA
Für die Untersuchung der Genexpression wird die vollständige Poly A+-RNA aus Gewebe isoliert (d.h. eine Vielzahl unterschiedlicher RNA-Stränge unbekannter Sequenz und Konzentration), und mittels Reverser Transkriptase und oligo dT Primern mit Cy5-dUTP wird Cy5-markierte cDNA (d.h. eine entsprechende Vielzahl unterschiedlicher cDNA-Stränge unbekannter Sequenz und Konzentration), hergestellt.
Die Cy5-markierte cDNA ist in 30 μl einer Lösung mit einem Natriumcitratpuffer gelöst. Die Puffer-Stammlösung („20 x SSC" (Standard sodium citrate)) ist eine Lösung von 3 M NaCl / 600 mM Natriumacetat bei pH 7.5, woraus die übrigen Pufferlösungen durch entsprechende Verdünnung hergestellt werden („1 x SSC" entsprechend 150 mM NaCl / 15 mM Natrimcitrat, pH 7.5). Die hergestellte cDNA in Hybridisierungspuffer („4 x SSC", 50 % Formamid, 1% Tween20 ) wird in ein Probenbehältnis mit einem Array aus diskreten Messbereichen mit immobilisierten cDNA's auf einer Sensorplattform, entsprechend Beispiel 1A, gefüllt, um für einen Zeitraum von 16 Stunden die Hybridisierang von cDNA's als Analyten in dieser Probe mit komplementären Sequenzen von in den Messbereichen immobilisierten cDNA's („capture probes") zu ermöglichen. Um eine möglichst hohe Spezifizität bei der Hybridisierang zu erreichen, d.h. Hybridisierung zwischen nicht vollständig komplementären Strängen oder sogar vollständig unspezifische Hybridisierang weitestmöglich zu verhindern, wird der Hybridisierang unter „stringenten Bedingungen" (beispielsweise erhöhter Temperatur nur wenig unterhalb Schmelzpunktes der jeweiligen DNA, hier bei 42°C) durchgeführt. Anschliessend wird zur Steigerung der Selektivität zusätzlich „stringent gewaschen": zunächst 7 Minuten lang in „1 x SSC" /0.1% SDS, bei 65 °C, dann 7 Minuten lang in „0.1 x SSC" /0.1% SDS („sodium dodecyl sulfate") bei 65 °C und anschliessend zweimal jeweils 7 Minuten lang in „0.1 x SSC" bei 65 °C. Unter zunehmend „stringenten Waschbedingungen" ist dabei zu verstehen, dass die Dissoziation von Hybriden aus nicht vollständig komplementären cDNA-Sequenzen mit abnehmender Konzentration positiver Ionen des Puffers und mit abnehmender Detergentien- Konzentration gefördert und somit die Selektivität des Verfahrens weiter erhöht wird.
Nach Abschluss des Hybridisierangsschritts und der beschriebenen nachfolgenden Waschschritte wird die Sensorplattform mit der damit zusammengefügten Polycarbonatplatte in einen „Metaträger", wie vorangehend beschrieben (Beispiel 1 A) eingefügt und dann zur Bestimmung der Lumineszenzintensitäten aus den Messbereichen, inbesondere infolge dort gebundener Cy5-markierter cDNA's als Analyten, sowie zur ortsaufgelösten Bestimmung der verfügbaren Anregungslichtintensitat in ein erfindungsgemässes analytisches System (Beispiel IC) eingesetzt und vermessen. Das Probenbehältnis ist wähend der Messung mit Hybridisierangspuffer („4 x SSC", 50 % Formamid, 1% Tween20™) gefüllt.
IC; Analytisches System und Messverfahren zum Nachweis eines oder mehrerer Analyten
Der Anregungslicht-Strahlengang des für dieses Beispiel benutzen optischen Systems, als Bestandteil eines erfindungsgemässen analytischen Systems, ermöglicht die sequentielle, oder bei geeignet genauer Vorjustierang des optischen Systems und geeigneten physikalischen Parametern (insbesondere Koppelwinkeln für die jeweiligen Anregungswellenlängen) der benutzten Sensorplattform, sogar gleichzeitige Einstrahlung und Einkopplung von Anregungslicht verschiedener Wellenlängen in die wellenleitende Schicht (a) einer erfindungsgemässe Sensorplattform über deren Einkoppelgitter. Das Anregungslicht wird, unter Verwendung eines Linsensystems mit einer Zylinderlinse oder eines geeigneten diffraktiven optischen Elements sowie einer oder mehrerer zusätzlicher Blenden, zu einem Strahlbündel spaltförmigen Querschnitts (senkrecht zur optischen Achse) aufgeweitet, dessen Ausdehnung im Einstrahlungsquerschnitt auf der Sensorplattform, parallel zu deren Gitterlinien, nahezu vollständig dem innerhalb eines Probenbehältnisses befindlichen Abschnitt des Einkoppelgitters entspricht.
Wesentlicher Bestandteil des Anregungslicht-Strahlenganges ist ein Multifacettenprisma, als Beispiel für eine optische Komponente mit mehreren diskreten Facetten zur Strahlurnlenkung.
Für die Schicht- und Gitterparameter der in Beispiel 1 A beschriebenen Sensorplattform beträgt der Einkoppelwinkel für Anregungslicht von 492 nm etwa + 18.2° und von 635 nm etwa -10° (mit Luft als Medium über dem Koppelgitter). Das Multifacettenprisma ist so gestaltet, dass bei geeigneter Ausrichtung der bei 492 nm bzw. 635 nm emittierenden Laser als Anregungslichtquellen auf unterschiedliche Eintrittsfacetten dieses Prismas das aus der Austrittsfacette austretende Licht die Einkoppelbedingung für beide Wellenlängen erfüllt und kein messbarer Strahlversatz zwischen den Anregungslichtstrahlen der beiden unterschiedlichen Wellenlängen auf dem Einkoppelgitter (c) der Sensorplattform auftritt. Dieses ermöglicht eine Einkopplung bei den unterschiedlichen Wellenlängen ohne Veränderung der Positionierung der Sensorplattform.
Von der Sensorplattform abgestrahltes Licht aus dem Bereich der Messfläche innerhalb eines Probenbehältnisses auf der Sensorplattform (Gesichtsfeld ca. 6 mm x 8 mm) wird mit einem Tandem-Objektiv gesammelt und auf eine CCD-Kamera mit einem CCD-Chip (aktive Räche ca. 5 mm x 7 mm mit 512 x 766 Pixeln, Pixelgrösse 9 μm) fokussiert. Je nach Einstellung des Abiildungssystems ermöglicht dieses eine Ortsauflösung von ca. 10 μm bis 20 μm.
Zwischen den beiden Hälften des Tandem-Objektivs, in einem im wesentlichen parallelen Teil (d.h. weniger als 10° divergenten oder konvergenten) Teil des Emissionsstrahlenganges können unterschiedliche Interferenzfilter, zur Erfassung des von der Sensorplattform ausgehenden Lichts bei unterschiedlichen Wellenlängen, positioniert werden.
Die Anregung der auf der Sensorplattform aufgebrachten „Referenzierungslabel" (FluorX™, Fluoreszenzmaximum bei 520 nm) erfolgt bei 492 nm, die Bestimmun von deren Fluoreszenz unter Verwendung eines Interferenzfilters mit maximaler Transmission im Bereich zwischen 500 und 550 nm. Die „Nachweislabel" (Cy5, Fluoreszenzmaximum bei 667 nm) werden mithilfe einer Laserdiode bei 635 nm angeregt; für die entsprechende Fluoreszenzbestimmung wird ein Interferenzfilter mit maximaler Transmission von 650 bis 700 nm verwendet.
Die Fluoreszenzmessungen bei den beiden unterschiedlichen Wellenlängen werden in diesem Beispiel sequentiell durchgeführt, wobei zu Beginn jeder Wellenlönge die Anordnung jeweils auf maximale Einkopplung bei der entsprechenden Wellenlänge justiert wird. Wie oben beschrieben, ist bei einer entsprechend genauen Vorjustierang des Systems jedoch auch die gleichzeitige Anregung beider Fluoreszenzen bei unterschiedlichen Anregungswellenlängen möglich, so dass dass zur Bestimmung der unterschiedlichen Fluoreszenzen lediglich ein Wechsel der Filter im Emissionsstrahlengang erforderlich ist. Dabei wird jeweils in einer Aufnahme der CCD-Kamera das Emissionslicht von allen innerhalb eines Probenbehältnisses gelegenen Messbereichen erfasst.
1D: Bearbeitung und Referenzierung der Messdaten
(i) Bestimmung der Signalintensitäten aus den Messbereichen (Spots)
Die mittlere Signalintensität aus den Messbereichen (Spots) zur Bindung und zum Nachweis von Analytmolekülen anhand einer potentiell erzeugten Fluoreszenz von „Nachweislabel" (in diesem Beispiel Cy5), wird mithilfe einer Bildanalyse-Software bestimmt.
Die Rohdaten von den einzelnen Pixeln der Kamera stellen eine zweidimensionale Matrix digitalisierter Messwerte dar, mit der gemessenen Intensität als Messwert eines einzelnen Pixels entsprechend der auf ihn abgebildeten Fläche auf der Sensorplattform. Für die Auswertung der Daten wird zunächst manuell ein zweidimensionales (Koordinaten-) Netz über die Bildpunkte (Pixelwerte) gelegt derart, dass jeder Spot in ein individuelles zweidimensionales Netzelement fällt. Darin wird jedem Spot ein geometrisch möglichst gut anzupassender „Auswertebereich" (area of interest, AOI) zugeordnet. Diese AOIs können eine beliebige geometrische Form haben, beispielsweise kreisförmig sein. Durch die Bildanalysesoftware wird der Ort der einzelnen AOIs individuell als Funktion der Signalintensität der einzelnen Pixel angepasst und optimiert. Dabei kann, abhängig von der Vorgabe des Benutzers, der zu Beginn eingestellte Radius der AOIs erhalten bleiben oder der Form und Grosse der fluoreszierenden Spots neu angepasst werden. Als mittlere Brattosignalintensität eines jeden Spots wird beispielsweise das arithmetische Mittel der Pixelwerte (Signalintensitäten) innerhalb eines gewählten AOIs bestimmt.
Die Hintergrandsignale werden bestimmt aus den gemessenen Signalintensitäten zwischen den Spots. Dazu kann beispielsweise eine Schar weiterer Kreise, welche konzentrisch sind mit einem betreffenden kreisförmigen Spot, aber grösseren Radius besitzen, bestimmt werden. Selbstverständlich müssen die Radien dieser konzentrischen Kreise kleiner als die Abstände zwischen benachbarteb Spots gewählt werden. Für die Hintergrundbestimmung kann dann beispielsweise der Bereich zwischen dem AOI und dem ersten konzentrischen Kreis verworfen und der Bereich zwischen diesem ersten konzentrischen und einem zweiten nachfolgenden konzentrischen Kreis grösseren Radius als Bereich (AOI) zur Hintergrundssignalbestimmung festgelegt werden. Es ist auch möglich, AOIs zwischen benachbarten Spots, vorzugsweise in der Mitte zwischen ihnen, als AOIs zur Hintergrandsignalbestimmung zu definieren. Daraus kann dann in analoger Weise wie oben die mittlere Hintergrandsignal- intensität beispielsweise als das arithmetische Mittel der Pixelwerte (Signalintensitäten) innerhalb eines hierfür gewählten AOIs bestimmt werden. Die mittlere Nettosignalintensität kann als Differenz zwischen der lokalen mittleren Brutto- und der lokalen mittleren Hinter- grandsignalintensität bestimmt werden.
(ii) Bestimmung der Fluoreszenzintensitäten aus ausgewiesenen Bereichen für die ortsaufgelöste Referenzierung der Anregungslichtintensitat mithilfe von „Referenzierungslaheln "
Für die Bestimmung und Normalisierang der Lichtintensitäten wird die mittlere Brutto- signalintensität eines jeden Spots bei der zweiten Wellenlänge bestimmt. Dazu werden in ähnlicher Weise wie oben AOIs festgelegt. Die AOIs zur Referenzierang eines bestimmten Messbereichs können beispielsweise aus den Bereichen zwischen diesem Spot und den nächsten benachbarten Spots gewählt werden oder auch identisch mit dem AOI des betreffenden Spots für den Analytnachweis sein. Im letzteren Fall sollten die Absorptions- und Emissionsspektren der „Referenzierungs-" und der „Nachweislabel" nicht oder nur möglichst wenig überlappen, um eine Verfälschung der Fluoreszenzmessungen aus den Bereichen der Spots, beispielsweise durch Energietransfer zwischen den Fluorophoren unterschiedlicher Anregungs- und Emissionswellenlängen, zu minimieren. Als mittlere Brattosignalintensität eines jeden festgelegten AOIs zur Referenzierang wird beispielsweise wiederum das arithmetische Mittel der Pixelwerte (Signalintensitäten) innerhalb dieses AOIs bestimmt.
(in) Referenzierung der gemessenen Signalintensitäten bei der Wellenlänge des „Nachweislabels "
Als lokaler Korrekturfaktor zur ortsaufgelösten Referenzierang der verfügbaren Anregungslichtintensitat wird der Quotient aus der lokalen durchschnittlichen Intensität eines AOIs für die Referenzierang und beispielsweise dem arithmetischen Mittel aller derartiger AOIs des untersuchten Arrays gebildet. Mit diesem lokalen Korrekturfaktor wird dann die wie oben berechnete mittlere Nettosignalintensität des AOIs des zugehörigen Messbereichs (Spots) multipliziert. Auf diese Weise werden die berechneten Nettosignalintensitäten für die AOIs aller Spots des Arrays korrigiert.
Beispiel 2:
2A; Sensorplattform Es wird eine gleichartige Sensorplattform wie in Beispiel 1 A beschrieben verwendet.
Zur Vorbereitung auf die hnmobilisierang der biochemischen oder biologischen oder synthetischen Erkennungselemente wird die Sensorplattformen zuerst mit Isopropanaol, dann mit konzentierter H SO4, 2.5% Ammoniumperoxodisulfat im Ultraschallgerät ge-reinigt und anschliessend mit 0.5 mM Dodecylmonophosphat (Ammoniumsalz) 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert, wobei die Lösung ständig gerührt wird. Dabei bildet sich mittels „Self-Assembly" eine homogene, hydrophobe Oberfläche (Schritt 1).
Erzeugung diskreter Messbereiche (Schritt 2): 8 verschiedene (primäre) Antikörper (gegen die Interleukine IL#1 bis IL#8) werden in einer Konzentration von 50-150 μg/ml in phosphatgepufferter Salzlösung (pH 7.4), die zusätzlich geeignete Additive zum Erhalt der Funktionalität der immobilisierten Proteine enthält, mittels eines Inkjet-Spotters aufgetragen und getrocknet. Der Durchmesser der Spots, mit einem Abstand (Zentram-zu-Zentram) von 0.35 mm, beträgt im Mittel 0.15 mm. Acht verschiedene Antikörper zur Erkennung von Zytokinen, im speziellen von unterschiedlichen hiterleukinen, werden in jeweils 20 Reihen eines Einzelarrays mit insgesamt 160 Spots verwendet. Um aus jeder Einzelmessung pro zuzuführender Probe zugleich bereits Daten zur statistischen Assayreproduzierbarkeit zu erhalten, werden pro Array jeweils 20 Messbereiche mit gleichen hiterleukin- Antikörpern als biologische Erkennungselemente erzeugt.
Es werden 6 derartige Arrays gleicher Geometrie auf der Sensorplattform im Raster von 9 mm (in einer Spalte angeordnet) erzeugt.
Im nächsten Schritt (Schitt 3) wird zur späteren Ermöglichung der ortsaufgelösten Bestimmung der Anregungslichtintensitat und gleichzeitig zur weitestgehenden Unterbindung von unspezifischen Wechselwirkungen mit den nachzuweisenden Analyten oder anderer Bestandteile einer aufzubringenden Probe, d.h. zur Erzeugung einer gegenüber den Analyten ausserhalb der Messbereiche „chemisch neutralen" Oberfläche, die Oberfläche des bespotteten Chips mit 3% BSA in PBS-Puffer pH 7.4, welches zusätzlich mit Cy7 (Amersham Pharmacia) markiertes BSA enthält, eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Dadurch bildet sich in den unbesetzten Bereichen der Sensorplattform, in denen im vorangegangenen Schritt 2 keine spezifischen Erkennunsgelemente immobilisiert wurden, eine fluoreszenzfähige Passivierungsschicht aus.
Auf die so vorbereitete Sensorplattform wird die beschriebene Polycarbonatplatte so aufgebracht, dass die einzelnen Probenbehältnisse gegeneinander fluidisch dicht abgeschlossen sind und die erzeugten Protein-Micro-Arrays mit dem zugehörigen Einkoppelgittern (c) sich jeweils innerhalb eines der 6 Probenbehältnisse befinden.
2B: Assavdurchftihrung
Zur spezifischen Erkennung der nachzuweisenden Zytokine wird das Format eines Sandwich- Assays gewählt. Für die gewählten Zytokine ( terleukine IL#1 bis U#8) werden 6 Kalibrationslösungen, welche jedes der 8 hiterleukine in gleicher Konzentration in PBS- Puffer pH 7.4 mit einem Zusatz von 0.1% Serumalbumin und 0.05% Tween20 enthalten (Interleukinmengen 0, 50, 125, 250, 500,1000 pg/ml), hergestellt. Dann werden die indi- viduellen Konzentrationslösungen mit einem Gemisch, bestehend aus den entsprechenden (8 verschiedenen) spezifischen biotinylierten sekundären anti-Interleukin- Antikörpern (jeweils 1-2-nanomolar) sowie Cy5-markiertem Streptavidin (5-15 nM) eine Stunde lang bei 37°C vorinkubiert. Dann werden je 50 μl der 6 individuellen Kalibrationslösungen in jeweils eine der 6 Flusszellen auf der Sensorplattform gefüllt und für weitere 2 Stunden bei 37°C mit dem jeweiligen Array auf der Sensorplattform inkubiert, so dass die im Vorinkubationsschritt gebildeten Komplexe aus den jeweiligen Interleukinen, spezifischen sekundären, biotinylierten anti-Interleukin- Antikörpern und Cy-5 markiertem Streptavidin an die in den diskreten Messbereichen (Spots) immobilisierten primären anti-Interleukin- Antikörper binden können.
Nach Abschluss des Bindungsschrittes werden die Flusszellen mit Puffer (phosphatgepufferte Salzlösung mit einem Zusatz von 0.1% Serumalbumin und 0.05% Tween20) gewaschen.
Danach wird die Sensorplattform mit der damit zusammengefügten Polycarbonatplatte in einen „Metaträger", wie vorangehend beschrieben (Beispiel 1 A) eingefügt und, nach einer weiteren 15-minütigen Inkubationszeit (zur Equilibrierang bei Raumtemperatur) in Puffer, in ein erfindungsgemässes analytisches System (siehe Beispiel IC bzw. 2C) eingesetzt und vermessen.
2C: Analytisches System und Messverfahren zum Nachweis eines oder mehrerer Analyten sowie zur ortsaugelösten Referenzierung der Anregungslichtintensitat
Es wird ein analytisches System verwendet, wie es in Beispiel IC beschrieben wurde.
Für die Schicht- und Gitterparameter der in Beispiel 2A beschriebenen Sensoφlattform beträgt der Einkoppelwinkel für Anregungslicht von 635 nm etwa -10° (mit Luft als Medium über dem Koppelgitter).
Sowohl die Anregung der auf der Sensoφlattform aufgebrachten „Referenzierungslabel" (Cy7), als auch der Nachweislabel" (Cy5, Fluoreszenzmaximum bei 667 nm) erfolgt bei 635 nm, die Bestimmung von deren Fluoreszenz unter Verwendung von hiterferenzfiltersn mit maximaler Transmission im Bereich von 670 nm („Nachweislabel") beziehungsweise 780 nm („Referenzierungslabel").
Zu Beginn der Messung wird die Anordnung auf maximale Einkopplung bei der für „Nachweislabel" und „Referenzierungslabel" gemeinsamen Anregungswellenlänge von 635 nm justiert. Dann werden sequentiell die Fluoreszenzmessungen bei den beiden unterschiedlichen Emissionsellenlängen durchgeführt, wobei zwischen den Messungen bei den unterschiedlichen Emissionswellenlängen lediglich ein Wechsel der genannten Filter im Emissionsstrahlengang erforderlich ist. Dabei wird jeweils in einer Aufnahme der CCD-Kamera das Emissionslicht von allen innerhalb eines Probenbehältnisses gelegenen Messbereichen erfasst. Aus den Aufnahmen der 6 Arrays in den 6 diskreten Probenbehältnissen, denen unterschiedliche Kalibrationslösungen zugeführt wurden, können dann (auf die lokale Anregungsintensität referenzierte) Kalibrationskurven zum Nachweis aller 8 hiterleukine erstellt werden (siehe unten).
2D; Bearbeitung und Referenzierung der Messdaten
(i) Bestimmung der Signalintensitäten aus den Messbereichen (Spots)mü Hife von „Nachweislabeln "
Die mittlere Signalintensität aus den Messbereichen (Spots) zur Bindung und zum Nachweis von Analytmolekülen anhand einer potentiell erzeugten Fluoreszenz von „Nachweislabeln" (in diesem Beispiel Cy5, mit Fluoreszenzmaximum nahe 670 nm), wird mithilfe einer Bildanalyse-Software bestimmt.
Die Rohdaten von den einzelnen Pixeln der Kamera stellen eine zweidimensionale Matrix digitalisierter Messwerte dar, mit der gemessenen Intensität als Messwert eines einzelnen Pixels entsprechend der auf ihn abgebildeten Fläche auf der Sensorplattform. Für die Auswertung der Daten wird zunächst manuell ein zweidimensionales (Koordinaten-) Netz über die Bildpunkte (Pixelwerte) gelegt derart, dass jeder Spot in ein individuelles zweidimensionales Netzelement fällt. Darin wird jedem Spot ein geometrisch möglichst gut anzupassender „Auswertebereich" (area of interest, AOI) zugeordnet. Diese AOIs können eine beliebige geometrische Form haben, beispielsweise kreisförmig sein. Durch die Bildanalysesoftware wird der Ort der einzelnen AOIs individuell als Funktion der Signalintensität der einzelnen Pixel angepasst und optimiert. Dabei kann, abhängig von der Vorgabe des Benutzers, der zu Beginn eingestellte Radius der AOIs erhalten bleiben oder der Form und Grosse der fluoreszierenden Spots neu angepasst werden. Als mittlere Bruttosignalintensität eines jeden Spots wird beispielsweise das arithmetische Mittel der Pixelwerte (Signalintensitäten) innerhalb eines gewählten AOIs bestimmt.
Die Hintergrandsignale werden bestimmt aus den gemessenen Signalintensitäten bei der Wellenlänge der Emission des „Nachweislabels" (670 nm) zwischen den Spots. Voraussetzung für eine korrekte Bestimmung des Hintergrandsignals ist dabei, dass in den dazu ausgewählten Bereichen auf der Sensoφlattform (welche bedeckt sind mit der fluoreszenten „Passivierungsschicht") kein Beitrag zu einer Fluoreszenz bei der Emissionswellenlänge des „Nachweislabels" erfolgt. Für die geometrische Festlegung der Bereiche zur Bestimmung der Hintergrandsignale kann beispielsweise eine Schar weiterer Kreise, welche konzentrisch sind mit einem betreffenden kreisförmigen Spot, aber grösseren Radius besitzen, bestimmt werden. Selbstverständlich müssen die Radien dieser konzentrischen Kreise kleiner als die Abstände zwischen benachbarteb Spots gewählt werden. Für die Hintergrundbestimmung kann dann beispielsweise der Bereich zwischen dem AOI und dem ersten konzentrischen Kreis verworfen und der Bereich zwischen diesem ersten konzentrischen und einem zweiten nachfolgenden konzentrischen Kreis grösseren Radius als Bereich (AOI) zur Hintergrand- signalbestimmung festgelegt werden. Es ist auch möglich, AOIs zwischen benachbarten Spots, vorzugsweise in der Mitte zwischen ihnen, als AOIs zur Hintergrundsignalbestimmung zu definieren. Daraus kann dann in analoger Weise wie oben die mittlere Hintergrundsignalintensität beispielsweise als das arithmetische Mittel der Pixelwerte (Signalintensitäten) innerhalb eines hierfür gewählten AOIs bestimmt werden. Die mittlere Nettosignalintensität kann als Differenz zwischen der lokalen mittleren Brutto- und der lokalen mittleren Hintergrandsignalintensität bestimmt werden.
(ii) Bestimmung der Fluoreszenzintensitäten aus ausgewiesenen Bereichen für die ortsaufgelöste Referenzierung der Anregungslichtintensitat mithilfe von „Referenzierungslabeln "
Für die Ermittlung und Normalisierung der Anregungslichtintensitäten wird die mittlere Bruttosignalintensität zwischen einzelnen Spots analog zur zuvor beschriebenen Bestim- mung des Hintergrandsignals, aber nun bei der zweiten Emissionswellenlänge von 780 nm bestimmt. Als mittlere Bruttosignalintensität eines jeden festgelegten AOIs zur Referenzierang wird beispielsweise wiederum das arithmetische Mittel der Pixelwerte (Signalintensitäten) innerhalb dieses AOIs bestimmt.
(iii) Referenzierung der gemessenen Signalintensitäten bei der Wellenlänge des „Nachweislabels "
Als lokaler Korrekturfaktor zur ortsaufgelösten Referenzierung der verfügbaren Anregungslichtintensitat wird der Quotient aus der lokalen durchschnittlichen Intensität eines AOIs für die Referenzierang und beispielsweise dem arithmetischen Mittel aller derartiger AOIs des untersuchten Arrays gebildet. Mit diesem lokalen Korrekturfaktor wird dann die wie oben berechnete mittlere Nettosignalintensität des AOIs des zugehörigen Messbereichs (Spots) multipliziert. Auf diese Weise werden die berechneten Nettosignalintensitäten für die AOIs aller Spots des Arrays korrigiert.

Claims

Patentansprüche
1. Kit zum gleichzeitigen qualitativen und / oder quantitativen Nachweis einer Vielzahl von Analyten, umfassend
- eine Sensoφlattform
- mindestens ein Array von in diskreten Messbereichen (d) direkt, oder über eine Haftvermittlungsschicht, auf der Sensoφlattform immobilisierten biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselementen zur spezifischen Erkennung und / oder Bindung besagter Analyten und / oder spezifischen Wechselwirkung mit besagten Analyten,
- eine Passivierungsschicht aus gegenüber den Analyten "chemisch neutralen" Verbindungen oder einer passivierten Haftvermittlungsschicht mit einer gegenüber den Analyten „chemisch neutralen" Oberfläche zwischen den Messbereichen, wobei mit der Passivierungsschicht oder der passivierten Haftvermittlungsschicht in einer möglichst homogenen Verteilung über die Sensoφlattform lumineszenzmarkierte Moleküle assoziiert sind, welche der ortsaufgelösten Referenzierung der in den Messbereichen oder in deren Umgebung verfügbaren Anregungslichtintensitat dienen.
2. Kit zum gleichzeitigen qualitativen und / oder quantitativen Nachweis einer Vielzahl von Analyten, umfassend
- eine Sensoφlattform
- eine auf der Sensoφlattform aufgebrachte dünne Schicht (g)
- mindestens ein Array von in diskreten Messbereichen (d) direkt, oder über eine Haftvermittlungsschicht, auf der Schicht (g) immobilisierten biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselementen zur spezifischen Erkennung und / oder Bindung besagter Analyten und / oder spezifischen Wechselwirkung mit besagten Analyten,
- eine Passivierungsschicht aus gegenüber den Analyten "chemisch neutralen" Verbindungen oder einer passivierten Haftvermittlungsschicht mit einer gegenüber den Analyten „chemisch neutralen" Oberfläche zwischen den Messbereichen, wobei mit auf der Sensoφlattform aufgebrachten Schicht (g) in einer möglichst homogenen Verteilung über die Sensoφlattform lumineszenzmarkierte Moleküle assoziiert sind, welche der ortsaufgelösten Referenzierang der in den Messbereichen oder in deren Umgebung verfügbaren Amegungslichtintensität dienen.
3. Kit nach einem der Ansprüche 1 - 2, dadurch gekennzeichnet, dass die gegenüber den Analyten "chemisch neutralen" Verbindungen ausgewählt sind aus den Gruppen, die von Albuminen, insbesondere Rinderseramalbumin oder Humanserumalbumin, Casein, unspezifischen, polyklonalen oder monoklonalen, artfremden oder empirisch für den oder die nachzweisenden Analyten unspezifischen Antiköφern (insbesondere für hnmunoassays), Detergentien - wie beispielsweise Tween 20 -, nicht mit zu analysierenden Polynukleotiden hybridisierender, fragmentierter natürlicher oder synthetischer DNA, wie beispielsweise ein Extrakt von Herings- oder Lachssperma (insbesondere für Polynukleotid-Hybridisierangsassays), oder auch ungeladenen, aber hydrophilen Polymeren, wie beispielsweise Polyethylenglycole oder Dextrane, gebildet werden.
4. Kit nach einem der Ansprüche 1 - 3, dadurch gekennzeichnet, dass die besagten immobilisierten biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselemente ausgewählt sind aus der Gruppe, die von Nukleinsäuren (beispielsweise DNA, RNA, Oligonukleotiden) und Nukleinsäureanalogen (z. B. PNA), mono- oder polyklonalen Antiköφern, Peptiden, Enzymen, Aptameren, synthetischen Peptid- strukturen, löslichen, membrangebundenen und aus einer Membran isolierten Proteinen, wie beispielsweise Rezeptoren, deren Liganden, Antigenen für Antiköφer, "Histidin- Tag-Komponenten" und deren Komplexbildungspartnern, durch chemische Synthese erzeugten Kavitäten zur Aufnahme molekularer hnprints, etc. gebildet wird.
5. Kit nach einem der Ansprüche 1 - 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Analytnachweis auf der Bestimmung der Änderung einer oder mehrerer Lumineszenzen beruht.
6. Kit nach einem der Ansprüche 1 - 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Anregungslicht in einer Auflichtanordnung eingestrahlt wird.
7. Kit nach einem der Ansprüche 1 - 6, dadurch gekennzeichnet, dass das mit den Messbereichen in Kontakt stehende Material der Sensoφlattform innerhalb einer Tiefe von mindestens 200 nm von den Messbereichen bei mindestens einer Anregungswellenlänge transparent oder absorbierend ist.
8. Kit nach einem der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Anregungslicht in einer Trans issionslichtanordnung eingestrahlt wird.
9. Kit nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Material der Sensoφlattform bei mindestens einer Anregungswellenlänge transparent ist.
10. Kit nach einem der Ansprüche 1 - 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Sensoφlattform als ein optischer Wellenleiter ausgebildet ist, welcher vorzugsweise im wesentlichen . planar ist.
11. Kit nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Sensoφlattform ein optisch transparentes Material aus der Grappe umfasst, die von Silikaten, z. B. Glas oder Quarz, transparenten thermoplastischen oder spritzbaren Kunststoff, beispielsweise Poly- carbonat, Polyimid, Acrylaten, insbesondere Polymethylmethacrylat, oder Polystyrolen gebildet wird.
12. Kit nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Sensoφlattform einen optischen Dünnschichtwellenleiter mit einer bei mindestens einer Anregungswellenlänge transparenten Schicht (a) auf einer bei mindestens dieser Anregungswellenlänge ebenfalls transparenten Schicht (b) mit niedrigerem Brechungsindex als Schicht (a) umfasst.
13. Kit nach einem der Ansprüche 10 - 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Anregungslicht von einer oder mehrerer Lichtquellen eingekoppelt wird in den optischen Wellenleiter mittels eines Verfahrens, welches ausgewählt ist aus der Grappe, die von Stirnflächenkopplung, Einkopplung über angebrachte optische Fasern als Lichtleiter, Prismenkopplung, Gitterkopplung oder evaneszenter Kopplung durch Überlappung des evaneszenten Feldes besagten optischen Wellenleiters mit dem evaneszenten Feld eines weiteren, damit in Nahfeldkontakt gebrachten Wellenleiters gebildet wird.
14. Kit nach einem der Ansprüche 10 - 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Einkopplung des Anregungslichts von einer oder mehreren Lichtquellen in den optischen Wellenleiter mittels eines damit in Kontakt stehenden optischen Koppelelements erfolgt, welches ausgewählt ist aus der Grappe von optischen Fasern als Lichtleiter, Prismen, gegebenenfalls über eine brechungsindexanpassende Flüssigkeit, und Gitterkopplern.
15. Kit nach Ansprach 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Anregungslicht von einer oder mehreren Lichtquellen in die Schicht (a) mittels einer oder mehrerer in der Schicht (a) modulierten Gitterstrakturen (c) eingekoppelt wird.
16. Kit nach Ansprach 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Sensoφlattform gleichförmige, unmodulierte Bereiche der Schicht (a) umfasst, welche vorzugsweise in Ausbreitungsrichtung des über eine Gitterstruktur (c) eingekoppelten und in der Schicht (a) geführten Anregungslichts angeordnet sind.
17. Kit nach einem der Ansprüche 15 - 16, dadurch gekennzeichnet, dass Gitterstrakturen (c) der Einkopplung von Anregungslicht zu den Messbereichen (d) und / oder der Auskopplung von in die Schicht (a) rückgekoppeltem Lumineszenzlicht dienen.
18. Kit nach einem der Ansprüche 15 - 17, dadurch gekennzeichnet, das die Sensoφlattform eine Vielzahl von Gitterstrukturen (c) gleicher oder unterschiedlicher Periode mit gegebenenfalls daran anschliessenden gleichförmigen, unmodulierten Bereichen der Schicht (a) auf einem gemeinsamen, durchgehenden Substrat umfasst.
19. Kit nach einem der Ansprüche 15 - 18, dadurch gekennzeichnet, dass jedem in Ausbreitungsrichtung des eingekoppelten Anregungslichts nachfolgenden Array von Messbereichen eine für dieses Array spezifische Gitterstraktur (c) zur Auskopplung dieses Anregungslichts zugeordnet ist, wobei senkrecht zur Ausbreitungsrichtung des eingekoppelten Anregungslichts die Gitterstrakturen spezifisch für einzelne Arrays ausgebildet sein können oder sich auch über die ganze Sensoφlattform in dieser Richtung erstrecken können.
20. Kit nach einem der Ansprüche 15 - 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Sensoφlattform eine Überlagerung von 2 oder mehreren Gitterstrakturen unterschiedlicher Perio- dizität mit zueinander paralleler oder nicht paralleler, vorzugsweise nicht paralleler Ausrichtung der Gitterlinien umfasst, welche der Einkopplung von Anregungslicht unterschiedlicher Wellenlänge dient, wobei im Falle von 2 überlagerten Gitterstrakturen deren Gitterlinien vorzugsweise senkrecht zueinander ausgerichtet sind.
21. Kit nach einem der Ansprüche 15 - 20, dadurch gekennzeichnet, dass eine Gitterstraktur (c) oder eine Überlagerung mehrerer Gitterstrukturen in der Schicht (a) im wesentlichen über die gesamte Fläche der Sensoφlattform moduliert ist.
22. Kit nach einem der Ansprüche 1 - 21, dadurch gekennzeichnet, dass auf der Sensoφlattform optisch oder mechanisch erkennbare Markierungen zur Erleichterung der Justierung in einem optischen System und / oder zur Verbindung mit Probenbehältnissen als Teil eines analytischen Systems aufgebracht sind.
23. Kit nach einem der Ansprüche 12 - 22, dadurch gekennzeichnet, dass sich zwischen den optisch transparenten Schichten (a) und (b) und in Kontakt mit Schicht (a) eine weitere optisch transparente Schicht (b') mit niedrigerem Brechungsindex als dem der Schicht (a) und einer Stärke von 5 nm - 10 000 nm, vorzugsweise von 10 nm - 1000 nm, befindet.
24. Kit nach einem der Ansprüche 1 - 22, dadurch gekennzeichnet, dass zur Immobilisierung der biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselemente in den diskreten Messbereichen auf der Sensoφlattform eine Haftvermittlungsschicht (f) mit einer Stärke von vorzugsweise weniger als 200 nm, besonders bevorzugt von weniger als 20 nm aufgebracht ist, und dass die Haftvermittlungsschicht (f) vorzugsweise eine chemische Verbindung aus den Gruppen umfasst, die Silane, funktionalisierte Silane, Epoxide, funktionalisierte, geladene oder polare Polymere und "selbstorganisierte passive oder funktionalisierte Mono- oder Mehrfachschichten" umfassen.
25. Kit nach einem der Ansprüche 1 - 24, dadurch gekennzeichnet, dass räumlich getrennte Messbereiche (d) durch räumlich selektive Aufbringung von biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselementen auf besagter Sensoφlattform erzeugt werden, vorzugsweise unter Verwendung eines oder mehrerer Verfahren aus der Grappe von Verfahren, die von "InkJet spotting", mechanischem Spotting mittels Stift, Feder oder Kapillare, "micro contact printing", fluidischer Kontaktierang der Messbereiche mit den biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselementen durch deren Zufuhr in parallelen oder gekreuzten Mikrokanälen, unter Einwirkung von Drackunterschieden oder elektrischen oder elektromagnetischen Potentialen" sowie photochemischen oder photolithographischen Immobilisierungsverfahren gebildet - werden.
26. Kit nach einem der Ansprüche 1 - 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Dichte der in diskreten Messbereichen immobilisierten Erkennungselemente zum Nachweis unterschiedlicher Analyten auf unterschiedlichen Messbereichen so ausgewählt ist, dass die Signale beim Nachweis verschiedener Analyten in einem gemeinsamen Array von gleicher Grössenordnung sind, d.h., dass gegebenenfalls die zugehörigen Kalibrationskur- ven für die gleichzeitig durchzuführenden Analytbestimmungen ohne eine Änderung der elektronischen oder optoelektronischen Systemeinstellungen aufgenommen werden können.
27. Kit nach einem der Ansprüche 1 - 26, dadurch gekenzeichnet, dass Arrays von Messbereichen aufgeteilt sind in Segmente von ein oder mehrereren Messbereichen zur Bestimmung von Analyten und Bereichen zwischen diesen Messbereichen oder zusätzlichen Messbereichen zu Zwecken einer zusätzlichen physikalischen Referenzierang, wie beispielsweise des Einflusses von Änderungen äusserer Parameter, wie beispielsweise der Temperatur, sowie zu Zwecken der Referenzierang des Einflusses zusätzlicher physikalisch-chemischer Parameter, wie beispielsweise unspezifischer Bindung an die Sensorplattform von Bestandteilen einer aufgebrachten Probe.
28. Kit nach einem der Ansprüche 1 - 27, dadurch gekennzeichnet, dass in einer 2- dimensionalen Anordnung bis zu 100 000 Messbereiche angeordnet sind und ein einzelner Messbereich eine Fläche von 0.001 - 6 mm2 einnimmt.
29. Kit nach einem der Ansprüche 1 - 28, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberseite der Sensoφlattform mit den darauf erzeugten Messbereichen über der optisch transparenten Schicht (a) mit einem weiteren Köφer derart zusammengebracht ist, dass zwischen der Sensoφlattform als Grandplatte und besagtem Köφer eine oder mehrere räumliche Aussparungen zur Erzeugung eines oder mehrerer gegeneinander fluidisch abgedichteter Probenbehältnisse erzeugt werden, in denen jeweils ein oder mehrere Messbereiche oder Segmente oder Arrays von Messbereichen liegen.
30. Kit mit einer Anordnung von Probenbehältnissen gemäss Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass die Probenbehältnisse als gegeneinander fluidisch abgedichtete Flusszellen mit jeweils mindestens einem Zulauf und mindestens einem Ablauf ausgebildet sind und gegebenenfalls zusätzlich mindestens ein Ablauf jeder Flusszelle in ein mit dieser Flusszelle fluidisch verbundenes Reservoir führt, welches aus der Flusszelle austretende Flüssigkeit aufnimmt.
31. Kit nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass die Probenbehältnisse auf der den Messbereichen gegenüberliegenden Seite des mit der Sensoφlattform als Grundplatte zusammengebrachten Köφers offen sind.
32. Kit nach einem der Ansprüche 29 - 31, dadurch gekennzeichnet, dass die Anordnung von Probenbehältnissen 2 - 2000, vorzugsweise 2 - 400, besonders bevorzugt 2 - 100 einzelne Probenbehältnisse umfasst.
33. Kit nach einem der Ansprüche 29 - 32, dadurch gekennzeichnet, dass das Raster (Aufeinanderfolge in Zeilen und / oder Spalten) der Probenbehältnisse dem Raster der Wells einer Standardmikrotiteφlatte entspricht.
34. Kit nach einem der Ansprüche 1 - 33, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich Vorkehrungen zur Kalibration von infolge der Bindung eines oder mehrerer Analyten oder infolge der spezifischen Wechselwirkung mit einem oder mehreren Analyten erzeugten Lumineszenzen die Zugabe von Kalibrationslösungen mit bekannten Konzentrationen der nachzuweisenden Analyten auf eine vorbestimmte Anzahl von Arrays umfassen.
35. Kit nach einem der Ansprüche 1 - 34, dadurch gekennzeichnet, dass in einem oder mehreren Arrays jeweils mehrere Messbereiche mit dort in einer unterschiedlichen, kontrollierten Dichte immobilisierten biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselementen zum Nachweis eines für diese Messbereiche gemeinsamen Analyten vorgesehen sind.
36. Kit nach Ansprach 35, dadurch gekennzeichnet, dass bei bekannter Konzentrationsabhängigkeit der Bindungssignale zwischen einem Analyten und seinen biologischen oder biochemischen oder synthtischen Erkennungselementen und einer ausreichend grossen "Variation" dieser in unterschiedlicher kontrollierter Dichte in verschiedenen Messbereichen eines Arrays immobilisierten Erkennungselemente bereits mittels Zugabe einer einzigen Kalibrationslösung zu diesem Array eine Kalibrationskurve für diesen Analyten erstellt werden kann.
37. Verwendung eines Kits nach einem der Ansprüche 1 - 36 in einem analytischen System zur Bestimmung einer oder mehrerer Lumineszenzen.
38 .Verfahren zum gleichzeitigen qualitativen und / oder quantitativen Nachweis einer Vielzahl von Analyten mit einem Kit nach einem der Ansprüche 1 - 36, dadurch gekennzeichnet, dass zur ortsaufgelösten Referenzierang der in den Messbereichen (d) auf der Sensoφlattform, als Bestandteil des Kits, oder in der Umgebung dieser Messbereiche verfügbaren Anregungslichtintensitat die Lumineszenzsignale von möglichst homogen über die Sensoφlattform verteilten lumineszenzmarkierten Molekülen, welche mit einer auf besagter Sensoφlattform aufgebrachten Passivierungsschicht oder passivierten Haftvermittlungsschicht, zur Minimierang unspezifischer Bindung zwischen den Messbereichen, assozziiert sind, bestimmt werden.
39. Verfahren zum gleichzeitigen qualitativen und / oder quantitativen Nachweis einer Vielzahl von Analyten mit einem Kit nach einem der Ansprüche 2 - 36, dadurch gekennzeichnet, dass zur ortsaufgelösten Referenzierung der in den Messbereichen (d) auf der Sensoφlattform, als Bestandteil des Kits, oder in der Umgebung dieser Messbereiche verfügbaren Anregungslichtintensitat die Lumineszenzsignale von möglichst homogen über die Sensoφlattform verteilten lumineszenzmarkierten Molekülen, welche mit einer auf besagter Sensoφlattform aufgebrachten dünnen Schicht (g) assoziiert sind, bestimmt werden.
40. Verfahren nach einem der Ansprüche 38 - 39, dadurch gekennzeichnet, dass der quantitative und / oder qualitative Nachweis besagter Vielzahl von Analyten die Verwendung einer oder mehrerer signalgebender Komponenten als Label umfasst, welche ausgewählt sein können aus der Grappe, die von beispielsweise Lumineszenzlabeln, insbesondere lumineszenten Interkalatoren oder "molecular beacons", Absoφtionslabeln, Massen- labein, insbesondere Metallkolloiden oder Plastikbeads, Spin-Labeln, wie ESR- oder NMR-Labeln, radioaktiven Labein gebildet wird.
41. Verfahren nach Ansprach 40, dadurch gekennzeichnet, dass die Referenzierung der in den Messbereichen oder in deren Umgebung verfügbaren Anregungslichtintensitat und / oder ein gegebenfalls auf Absoφtions- und / oder Lumineszenznachweis beruhender Analytnachweis auf Einsatz von Labels mit gleicher oder unterschiedlicher Absoφtions- und / oder Lumineszenzwellenlänge beruhen.
42. Verfahren nach einem der Ansprüche 40 - 41, dadurch gekennzeichnet, dass der Analytnachweis auf der Bestimmung der Änderung einer oder mehrerer Lumineszenzen beruht.
43. Verfahren nach einem der Ansprüche 38 - 42, dadurch gekennzeichnet, dass das Anregungslicht in einer Auflichtanordnung eingestrahlt wird.
44. Verfahren nach einem der Ansprüche 48 - 42, dadurch gekennzeichnet, dass das Anregungslicht in einer Transmissionslichtanordnung eingestrahlt wird.
45. Verfahren nach einem der Ansprüche 38 - 44, dadurch gekennzeichnet, dass die Sensorplattform als ein optischer Wellenleiter ausgebildet ist, welcher vorzugsweise im wesentlichen planar ist, und dass das Anregungslicht von einer oder mehrerer Lichtquellen eingekoppelt wird in den optischen Wellenleiter mittels eines Verfahrens, welches ausgewählt ist aus der Gruppe, die von Stirnflächenkopplung, Einkopplung über angebrachte optische Fasern als Lichtleiter, Prismenkopplung, Gitterkopplung oder evaneszenter Kopplung durch Überlappung des evaneszenten Feldes besagten optischen Wellenleiters mit dem evaneszenten Feld eines weiteren, damit in Nahfeldkontakt gebrachten Wellenleiters gebildet wird.
46. Verfahren nach Ansprach 45, dadurch gekennzeichnet, dass die Einkopplung des Anregungslichts von einer oder mehreren Lichtquellen in den optischen Wellenleiter mittels eines damit in Kontakt stehenden optischen Koppelelements erfolgt, welches ausgewählt ist aus der Grappe von optischen Fasern als Lichtleiter, Prismen, gegebenenfalls über eine brechungsindexanpassende Flüssigkeit, und Gitterkopplern.
47. Verfahren nach Ansprach 45, dadurch gekennzeichnet, dass die Sensoφlattform einen optischen Dünnschichtwellenleiter mit einer bei mindestens einer Anregungswellenlänge transparenten Schicht (a) auf einer bei mindestens dieser Anregungswellenlänge ebenfalls transparenten Schicht (b) mit niedrigerem Brechungsindex als Schicht (a) umfasst und dass das Anregungslicht von einer oder mehreren Lichtquellen in die Schicht (a) mittels einer oder mehrerer in der Schicht (a) modulierten Gitterstrakturen (c) eingekoppelt wird.
48. Verfahren nach Ansprach 47, dadurch gekennzeichnet, dass eine oder mehrere auf besagte Analyten zu untersuchende flüssige Proben mit den Messbereichen auf der Sensorplattform in Kontakt gebracht werden, eine oder mehrere im Nahfeld der Schicht (a) erzeugte Lumineszenzen aus den mit besagter Probe oder besagten Proben in Kontakt gebrachten Messbereichen, als Folge der Bindung eines oder mehrerer Analyten an die in besagten Messbereichen immobilisierten biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselemente oder der Wechselwirkung zwischen besagten Analyten und besagten immobilisierten Erkennungselementen, gemessen werden und gegebenenfalls zusätzlich in ortsaufgelöster Weise die in besagten Messbereichen oder in deren Umgebung verfügbare Anregungslichtintensitat referenziert wird.
49. Verfahren nach einem der Ansprüche 47 - 48, dadurch gekennzeichnet, dass (1) die isotrop abgestrahlte Lumineszenz oder (2) in die optisch transparente Schicht (a) eingekoppelte und über Gitterstrakturen (c) ausgekoppelte Lumineszenz oder Lumineszenzen beider Anteile (1) und (2) gleichzeitig gemessen werden.
50. Verfahren nach einem der Ansprüche 38 - 49, dadurch gekennzeichnet, dass zur Erzeugung der Lumineszenzen der „Referenzierungslabel" und der „Nachweislabel" Lumineszenzfarbstoffe oder lumineszente Nanopartikel als Lumineszenzlabel verwendet werden, die bei einer Wellenlänge zwischen 300 nm und 1100 nm angeregt werden können und emittieren.
51. Verfahren nach Ansprach 50, dadurch gekennzeichnet, dass das „Nachweislabel" an den Analyten öder in einem kompetitiven Assay an einen Analogen des Analyten oder in einem mehrstufigen Assay an einen der Bindungspartner der immobilisierten biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselementen oder an die biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselemente gebunden ist.
52. Verfahren nach einem der Anspräche 50 - 51, dadurch gekennzeichnet, dass ein zweites oder noch weitere „Nachweislabel" mit gleicher oder unterschiedlicher Anregungswellenlänge wie das erste „Nachweislabel" und gleicher oder unterschiedlicher Emissionswellenlänge verwendet werden
53. Verfahren nach einem der Ansprüche 41 - 52, dadurch gekennzeichnet, dass die einen oder mehreren Lumineszenzen und / oder Bestimmungen von Lichtsignalen bei der Anregungswellenlänge polarisationsselektiv vorgenommen werden, wobei vorzugsweise die einen oder mehreren Lumineszenzen bei einer anderen Polarisation als der des Anregungslichts gemessen werden.
54. Verfahren nach einem der Anspräche 42 - 53, dadurch gekennzeichnet, dass neben der Bestimmung einer oder mehrerer Lumineszenzen Änderungen des effektiven Brechungindex auf den Messbereichen bestimmt werden.
55. Verfahren nach einem der Anspräche 38 - 54, dadurch gekennzeichnet, dass die Dichte der in diskreten Messbereichen immobilisierten Erkennungselemente zum Nachweis unterschiedlicher Analyten auf unterschiedlichen Messbereichen so ausgewählt ist, dass die Signale beim Nachweis verschiedener Analyten in einem gemeinsamen Array von gleicher Grössenordnung sind, d.h., dass die zugehörigen Kalibrationskurven für die gleichzeitig durchzuführenden Analytbestimmungen ohne eine Änderung der elektronischen oder optoelektronischen Systemeinstellungen aufgenommen werden können.
56. Verfahren nach einem der Anspräche 38 - 55, dadurch gekennzeichnet, dass Arrays von Messbreichen aufgeteilt sind in Segmente von ein oder mehrereren Messbereichen zur Bestimmung von Analyten und Bereichen zwischen diesen Messbereichen oder zusätzlichen Messbereichen zu Zwecken der physikalischen Referenzierang, wie beispielsweise der in den Messbereichen verfügbaren Anregungslichtintensitat oder des Einflusses von Änderungen äusserer Parameter, wie beispielsweise der Temperatur, sowie zu Zwecken der Referenzierang des Einflusses zusätzlicher physikalisch-chemischer Parameter, wie beispielsweise unspezifischer Bindung an die Sensoφlattform von Bestandteilen einer aufgebrachten Probe.
57. Verfahren nach einem der Anspräche 38 - 56, dadurch gekennzeichnet, dass ein oder mehrere Messbereiche eines Segments oder eines Arrays der Bestimmung desselben Analyten zugeordnet sind und deren immobilisierte biologische oder biochemische oder synthetische Erkennungselemente unterschiedlich hohe Affinitäten zu besagtem Analyten aufweisen.
58. Verfahren nach einem der Anspräche 38 - 57, dadurch gekennzeichnet, dass die eine oder mehreren Proben mit einer Mischung aus den verschiedenen Nachweisreagentien zur Bestimmung der in besagten Proben nachzuweisenden Analyten vorinkubiert werden und diese Mischungen dann in einem einzigen Zugabeschritt den dafür vorgesehenen Arrays auf der Sensoφlattform zugeführt werden.
59. Verfahren nach einem der Anspräche 38 - 58, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration der Nachweisreagentien, wie beispielsweise sekundärer Nachweisanti- köφer und / oder Label und optional zusätzlicher labelmarkierter Nachweisreagentien in einem Sandwich-hnmunoassay, so ausgewählt ist, dass die Signale beim Nachweis verschiedener Analyten in einem gemeinsamen Array von gleicher Grössenordnung sind, d.h., dass die zugehörigen Kalibrationskurven für die gleichzeitig durchzuführenden Analytbestimmungen ohne eine Änderung der elektronischen oder optoelektronischen Systemeinstellungen aufgenommen werden können.
60. Verfahren nach einem der Anspräche 38 - 59, dadurch gekennzeichnet, dass die Kalibration von infolge der Bindung eines oder mehrerer Analyten oder infolge der spezifischen Wechselwirkung mit einem oder mehreren Analyten erzeugten Lumineszenzen die Zugabe von einer oder mehreren Kalibrationslösungen mit bekannten Konzentrationen besagter zu bestimmender Analyten auf die gleichen oder andere Messbereiche oder Segmente von Messbereichen oder Arrays von Messbereichen auf einer Sensoφlattform umfasst, denen im gleichen oder einem separaten Zugabeschritt die eine oder die mehreren zu untersuchenden Proben zugeführt werden.
61. Verfahren nach einem der Anspräche 38 - 59, dadurch gekennzeichnet, dass die Kalibration von infolge der Bindung eines oder mehrerer Analyten oder infolge der spezifischen Wechselwirkung mit einem oder mehreren Analyten im Nahfeld der Schicht (a) erzeugten Lumineszenzen den Vergleich der Lumineszenzintensitäten nach Zugabe einer unbekannten und einer Kontroll-Probe, wie beispielsweise einer "wild type"-DNA-Probe und einer "mutant DNA"-Probe, umfasst.
62. Verfahren nach Ansprach 61, dadurch gekennzeichnet, dass die Zugabe der unbekannten Probe und der Kontrollprobe zu unterschiedlichen Arrays erfolgt.
63. Verfahren nach Ansprach 61, dadurch gekennzeichnet, dass die Zugabe der unbekannten Probe und der Kontrollprobe sequentiell zu dem gleichen Array erfolgt.
64. Verfahren nach Ansprach 63, dadurch gekennzeichnet, dass die unbekannte Probe und die Kontrollprobe gemischt werden und dann die Mischung einem oder mehreren Arrays einer Sensoφlattform zugeführt wird.
67. Verfahren nach einem der Anspräche 61 - 65, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektion der in der unbekannten und der Kontrollprobe nachzuweisenden Analyten mittels Lumineszenzlabels von unterschiedlicher Anregungs- und / oder Lumineszenzwellenlänge für die unbekannte und die Kontrollprobe erfolgt.
66. Verfahren nach einem der Ansprüche 38 - 65, dadurch gekennzeichnet, dass in einem oder mehreren Arrays jeweils mehrere Messbereiche mit dort in einer unterschiedlichen, kontrollierten Dichte immobilisierten biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselementen zum Nachweis eines für diese Messbereiche gemeinsamen Analyten vorgesehen sind.
67. Verfahren nach Ansprach 66, dadurch gekennzeichnet, dass bei bekannter Konzentrationsabhängigkeit der Bindungssignale zwischen einem Analyten und seinen biologischen oder biochemischen oder synthtischen Erkennungselementen und einer ausreichend grossen "Variation" dieser in unterschiedlicher kontrollierter Dichte in verschiedenen Messbereichen eines Arrays immobilisierten Erkennungselemente bereits mittels Zugabe einer einzigen Kalibrationslösung zu diesem Array eine Kalibrationskurve für diesen Analyten erstellt werden kann.
68. Verfahren nach einem der Anspräche 38 - 67 zur gleichzeitigen oder sequentiellen, quantitativen oder qualitativen Bestimmung eines oder mehrerer Analyten aus der Grappe von Antiköφern oder Antigenen, Rezeptoren oder Liganden, Chelatoren oder "Histidin-tag-Komponenten", Oligonukleotiden, DNA- oder RNA-Strängen, DNA- oder RNA- Analoga, Enzymen, Enymcofaktoren oder Inhibitoren, Lektinen und Kohlehydraten.
69. Verfahren nach einem der Anspräche 38 - 68, dadurch gekennzeichnet, dass die zu untersuchenden Proben natürlich vorkommende Köφerflüssigkeiten wie Blut, Serum, Plasma, Lymphe oder Urin oder Eigelb oder optisch trübe Flüssigkeiten oder Gewebeflüssigkeiten oder Oberflächenwasser oder Boden- oder Pflanzenextrakte oder Bio- oder Syntheseprozessbrühen oder aus biologischen Gewebeteilen oder aus Zellkulturen oder -extrakten entnommen sind.
70. Verwendung eines Kits nach einem der Ansprüche 1 - 36 und / oder eines Verfahrens nach einem der Anspräche 38 - 69 für quantitative oder qualitative Analysen zur Bestimmung chemischer, biochemischer oder biologischer Analyten in Screeningverfahren in der Pharmaforschung, der Kombinatorischen Chemie, der Klinischen und Präklinischen Entwicklung, zu Echtzeitbindungsstudien und zur Bestimmung kinetischer Parameter im Affinitätsscreening und in der Forschung, zu qualitativen und quantitativen Analytbestimmungen, insbesondere für die DNA- und RNA- Analytik, für die Erstellung von Toxizitätsstudien sowie für die Bestimmung von Gen- oder Protein-Expressionsprofilen sowie zum Nachweis von Antiköφern, Antigenen, Pathogenen oder Bakterien in der pharmazeutischen Protduktentwicklung und -forschung, der Human- und Veterinärdiagnostik, der Agrochemischen Produktentwicklung und -forschung, der symptomatischen und präsymptomatischen Pflanzendiagnostik, zur Patientenstratifikation in der pharmazeutischen Produktentwicklung und für die therapeutische Medikamentenauswahl, zum Nachweis von Pathogenen, Schadstoffen und Erregern, insbesondere von Salmonellen, Prionen, Viren und Bakterien, in der Lebensmittel- und Umweltanalytik.
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