EP1373875A2 - Optische struktur zur multi-photonen-anregung und deren verwendung - Google Patents

Optische struktur zur multi-photonen-anregung und deren verwendung

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EP1373875A2
EP1373875A2 EP02727426A EP02727426A EP1373875A2 EP 1373875 A2 EP1373875 A2 EP 1373875A2 EP 02727426 A EP02727426 A EP 02727426A EP 02727426 A EP02727426 A EP 02727426A EP 1373875 A2 EP1373875 A2 EP 1373875A2
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EP
European Patent Office
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layer
excitation
optical structure
optical
photon
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP02727426A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Gert L. Duveneck
Martin A. Bopp
Michael Pawlak
Markus Ehrat
Gerd Marowsky
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Bayer AG
Original Assignee
Zeptosens AG
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Filing date
Publication date
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    • G02B6/12—Light guides; Structural details of arrangements comprising light guides and other optical elements, e.g. couplings of the optical waveguide type of the integrated circuit kind
    • G02B2006/12083—Constructional arrangements
    • G02B2006/12107—Grating

Definitions

  • the invention relates to a variable embodiment of an optical structure, comprising an optical waveguide, with a wave-guiding layer (a) that is transparent with at least one excitation wavelength, characterized in that the intensity of a coupling-in layer (a) and in the layer (a ) guided excitation light on the layer (a) and in the layer (a) is sufficiently high to be on the surface of the layer (a) 'or at a distance of less than 200 nm from the layer (a), luminescent and / or to excite photoreactive molecules by means of multi-photon excitation, preferably 2-photon excitation.
  • Preferred embodiments are those which enable linear or areal multi-photon excitation along the excitation light guided in layer (a).
  • the invention also relates to various embodiments of optical systems and analytical systems with an excitation light source and an inventive design of an optical structure and methods based thereon, in particular for luminescence excitation and for luminescence detection of one or more analytes by means of multi-photon excitation, and their use.
  • the aim of the present invention is to provide optical structures and optical methods which can be carried out in a simple manner, in order to on this structure or at a distance of less than about 200 nm, to enable multi-photon excitation of luminescent and / or photoreactive molecules.
  • a “multi-photon excitation” is understood to mean that a molecule (or a molecular group) absorbs several photons of an irradiated excitation wavelength before it (they) changes from the resulting excited state into another state, in particular the one ground state returns.
  • the result of such a multi-photon excitation can be a luminescence, in particular fluorescence, emitted on returning to the basic state with a shorter wavelength than the irradiated excitation wavelength.
  • it can also consist in overcoming the activation energy for the transition to a photoreactive state. This photoreactive state can lead to the formation of molecular bonds to other molecules or molecular complexes (e.g.
  • one-photon excitation means that a molecule is excited by the absorption of a single photon in said excited state.
  • molecular group such as a fluorescence label as part of a fluorescence-labeled molecule
  • an analyte present in a sample can be detected with high selectivity and sensitivity.
  • Many known detection methods are based on the determination of one or more luminescences in the presence of the analyte.
  • the term “luminescence” denotes the spontaneous emission of photons in the ultraviolet to infrared range after optical or non-optical, such as for example electrical or chemical or biochemical or thermal excitation.
  • chemiluminescence, bioluminescence, electroluminescence and in particular fluorescence and phosphorescence are included under the term “luminescence”.
  • optical transparency of a material is used in the following in the sense that the transparency of this material is required at at least one excitation wavelength. With a longer or shorter wavelength, this material can also be absorbent.
  • WO 95/33197 describes a method in which the excitation light is coupled into the waveguiding film as a diffractive optical element via a relief grating.
  • the surface of the sensor platform is brought into contact with a sample containing the analyte, and the isotropically emitted luminescence in the penetration depth of the evanescent field of luminescent substances is measured by means of suitable measuring devices such as photodiodes, photomultipliers or CCD cameras. It is also possible to decouple and measure the portion of the evanescently excited radiation fed back into the waveguide via a diffractive optical element, for example a grating. This method is described for example in WO 95/33198.
  • devices for the simultaneous or successive execution of exclusively luminescence-based multiple measurements with essentially monomodal, planar inorganic waveguides, e.g. B. WO 96/35940, devices (arrays) are known in which at least two separate waveguiding areas are arranged on a sensor platform, which are separately irradiated with excitation light.
  • the division of the sensor platform into separate wave-guiding areas has the disadvantage that the space required for discrete measurement areas in discrete wave-guiding areas on the common sensor platform is relatively large and therefore only achieves a relatively low density of different measurement fields (or so-called "features”) can be.
  • Arrays with a very high feature density are known based on simple glass or microscope plates, without additional waveguiding layers.
  • US 5445934 (Affymax Technologies) describes and claims arrays of oligonucleotides with a density of more than 1000 features per square centimeter.
  • the excitation and reading of such arrays is based on classic optical arrangements and methods.
  • the entire array can be illuminated simultaneously with an expanded excitation light bundle, which, however, leads to a relatively low sensitivity, since the excitation is not limited to the interacting surface and because the scattered light component is also relatively large and scattered light or background fluorescent light from the glass substrate also in the areas is generated in which there are no oligonucleotides immobilized for binding the analyte.
  • a co-pending application (PCT / EP 00/04869) describes a sensor platform with a layer waveguide, comprising an optically transparent layer (a) on a second layer (b) with a lower refractive index than layer (a) and one in the optically transparent one Layer (a) modulated lattice structure (c) with measurement areas generated thereon.
  • the parameters in particular the grating depth, after coupling excitation light to the measurement areas and the associated luminescence excitation in the near field of layer (a), the luminescence light fed back into layer (a) can be used over the shortest distances, i.e. a few hundred micrometers are completely decoupled and thus prevented from spreading further in the waveguiding layer (a).
  • Luminescent dyes the spectral distance between the excitation and emission wavelength (Stokes shift) is relatively small, typically between 20 nm and 50 nm. Some luminescent dyes are known which have a large Stokes shift, up to about 300 nm, such as some lanthanide - complexes. However, they generally have a relatively low quantum yield and / or photostability.
  • Excitation intensity densities on the order of at least 20 MW / cm 2 are required.
  • intensity densities have been achieved and described, for example, with pulsed high-power lasers in confocal microscopic arrangements, as for example in US 5034613 with a laser focus diameter of less than one micrometer in the focal plane of the microscope.
  • the intensity of an excitation light coupled into the layer (a) and guided in the layer (a) on the layer (a) and in the layer (a) is sufficiently high to be to excite the surface of layer (a) or molecules located at a distance of less than 200 nm from layer (a) by means of multi-photon excitation for luminescence.
  • an optical structure according to the invention designed as a planar thin-film waveguide, with a layer (a) which is transparent at at least one excitation wavelength on a layer (b) 'which is also transparent at at least this excitation wavelength and has a lower refractive index than layer (a) and at least one grating structure (c) modulated in layer (a), it could surprisingly be shown that the intensity of an excitation light radiated under the resonance angle for coupling into layer (a) on layer (a) and in layer (a) even along the entire path of propagation of the excitation light in layer (a) is sufficiently high to enable 2-photon excitation of immobilized luminescent molecules on layer (a) along this path of propagation in line and even area. This can be done by 2- Such a high luminescence that it can be seen with the naked eye even in ambient light.
  • the present invention enables simultaneous 2-photon luminescence excitation and -Observation in macroscopic dimensions, i.e. over lengths of millimeters to centimeters and on areas from square millimeters to square centimeters.
  • the requirements for the pulse energies of the excitation light sources can be significantly reduced during a single pulse, which means that the use of longer-pulse lasers (e.g. picosecond or even nanosecond lasers instead of femtosecond lasers) or even of continuously emitting (cw) lasers for multi-photon luminescence excitation with an optical structure according to the invention is possible.
  • a significant advantage of luminescence excitation, in particular for analyte detection with the aid of surface-bound detection elements for the analyte, by means of multi-photon excitation in the evanescent field of a waveguide, in comparison to classic excitation by means of single-photon absorption, is that the selectivity of the excitation increases significantly with increasing Distance from the high refractive index waveguide surface.
  • optical devices according to the invention are suitable Structures for use in a variety of different technical fields, also outside of bioanalytics, for example for the investigation of photophysical or photochemical properties, especially new materials, under the influence of high excitation light intensities.
  • photoreactive molecules or groups of molecules within the stated very small distance from the waveguiding layer of the structure (z direction) by means of multi-photon excitation, preferably 2-photon excitation chemical reactions are stimulated.
  • These can consist in the formation of chemical bonds to neighboring molecules, for example with the result of a photopolymerization, with which spatial structures with dimensions of molecular size in the z direction can be produced in a simple manner, or in the selective, near-surface breaking of molecular bonds on a macroscopic Base area from which, for example, new simplified methods for mass spectrometry, in particular MALDI / TOF-MS (matrix-assisted laser desorption / ionization time-of-flight mass spectrometry) as well as for molecular separations result as a new, optical chromatography method.
  • MALDI / TOF-MS matrix-assisted laser desorption / ionization time-of-flight mass spectrometry
  • the first object of the invention is an optical structure comprising an optical waveguide with a waveguiding layer (a) which is transparent at at least one excitation wavelength, characterized in that the intensity of a layer which is coupled into the layer (a) and guided in the layer (a) Excitation light on layer (a) is sufficiently high to excite molecules or molecular groups on the surface of layer (a) or at a distance of less than 200 nm from layer (a) by means of multi-photon excitation.
  • Said optical waveguide is preferably an optical thin-film waveguide with a wave-guiding layer (a) transparent to at least one excitation wavelength on at least one Excitation wavelength also transparent layer (b) with a lower refractive index than layer (a).
  • a group of embodiments of the optical structure according to the invention is characterized in that the molecules excited on the surface of layer (a) or at a distance of less than 200 nm from layer (a) by multi-photon excitation are photoreactive , ie chemically reactive molecules or molecular groups after light excitation.
  • These photoreactive molecules can be, for example, so-called photo-initiators, which trigger a photopolymerization when a suitable, typically short-wave excitation light (eg UV light) is irradiated.
  • This particular embodiment is thus characterized in that photopolymerization is triggered by the multi-photon excitation of said photoreactive molecules on the layer (a) or at a distance of less than 200 nm from the layer (a).
  • polymer structures of very small lateral dimensions in the order of magnitude of micrometers can also be produced or “ are written "(by lateral movement of the optical structure with respect to the irradiated excitation light).
  • Another embodiment of an optical structure according to the invention is characterized by the fact that the multi-photon excitation of said photoreactive molecules on the layer (a) or at a distance of less than 200 nm from the layer (a) results in a photodissociation, ie splitting of a bis to the multi-photon excitation of the existing molecule or molecular complex on the layer (a) or at a distance of less than 200 nm from the layer (a).
  • photoreactive molecules are part of a molecular matrix for embedding molecules of higher molecular weight, in particular natural and artificial polymers or biological molecules such as proteins, polypeptides and nucleic acids.
  • the optical structure is a sample carrier for mass spectrometry, preferably for MALDI / TOF-MS (matrix-assisted laser desorption / ionization time-of-flight mass spectrometry) ,
  • Another preferred embodiment is an optical structure, comprising an optical thin-film waveguide, with a waveguiding layer (a) which is transparent at at least one excitation wavelength on a layer (b) which is also transparent at at least this excitation wavelength and has a lower refractive index than layer (a), characterized in that the intensity of an excitation light coupled into the layer (a) and guided in the layer (a) on the layer (a) and in the layer (a) is sufficiently high to be on the surface of the layer (a) or to excite molecules at a distance of less than 200 nm from layer (a) by means of multi-photon excitation for luminescence.
  • the coupling of excitation light into layer (a) can take place via one or more optical coupling elements from the group consisting of prism couplers, evanescent couplers with matched optical waveguides with overlapping evanescent fields, end face couplers with in front of an end face of the waveguiding layer arranged focusing lenses, preferably cylindrical lenses, and grating couplers is formed.
  • optical coupling elements from the group consisting of prism couplers, evanescent couplers with matched optical waveguides with overlapping evanescent fields, end face couplers with in front of an end face of the waveguiding layer arranged focusing lenses, preferably cylindrical lenses, and grating couplers is formed.
  • the excitation light is coupled into the layer (a) via a grating structure (c) modulated in the layer (a).
  • the optical structure is a planar thin-film waveguide structure.
  • an embodiment of the optical structure according to the invention comprising a planar thin-film waveguide, with a layer (a) which is transparent at at least one excitation wavelength, on a layer (b) which is likewise transparent at at least this excitation wavelength and has a lower refractive index than layer (a) and at least one a grating structure (c) modulated in layer (a), which is characterized in that the intensity of an excitation light radiated under the resonance angle for coupling into layer (a) on layer (a) and in layer (a) at least in the region the lattice structure (c) is sufficiently high to excite molecules located on the surface of the layer (a) or at a distance of less than 200 nm from the layer (a) by means of multi-photon excitation.
  • the multi-photon excitation is preferably a 2-photon excitation.
  • Those embodiments are particularly advantageous which line-like multi-photon excitation of on the surface of the layer (a) or at a distance of enable molecules less than 200 nm to layer (a) along a distance of at least 5 mm, calculated from the point at which the excitation light is coupled into layer (a).
  • the excitation light bundle is preferably expanded parallel to the grating lines.
  • an optical structure according to the invention simultaneously excites two-dimensional multi-photon excitation of molecules located on the surface of layer (a) or at a distance of less than 200 nm from layer (a) over an area of at least 1 mm 2 , more preferably on an area of at least 10 mm 2 , even more preferably on an area of at least 1 em 2 .
  • the very large surface-bound or near-surface excitation intensity is useful for a large number of different applications, in particular in biosensor technology, as will be explained in more detail later, but also in communications and (tele) communication technology.
  • the structure comprises uniform, unmodulated regions of the layer (a), which are preferably arranged in the direction of propagation of the excitation light coupled in via a grating structure (c) and guided in the layer (a).
  • the structure can be designed in such a way that it comprises a plurality of lattice structures (c) of the same or different period with optionally adjoining uniform, unmodulated regions of the layer (a) on a common, continuous substrate.
  • excitation light of different wavelengths For certain applications, it is desirable to use excitation light of different wavelengths simultaneously or sequentially for the same optical structure. It can then be advantageous if this comprises an overlay of 2 or more grating structures of different periodicity with mutually parallel or non-parallel, preferably non-parallel alignment of the grating lines, which serves to couple excitation light of different wavelengths, in the case of 2 superimposed grating structures Grid lines are preferably aligned perpendicular to each other.
  • the extent of the propagation losses of a mode guided in an optically wave-guiding layer (a) is determined to a large extent by the surface roughness of an underlying carrier layer and by absorption by chromophores which may be present in this carrier layer, which additionally increases the risk of excitation of luminescence which is undesirable for many applications in this carrier layer, by penetration of the evanescent field of the mode carried in layer (a). Furthermore, thermal stresses may occur as a result of different coefficients of thermal expansion of the optically transparent layers (a) and (b).
  • a chemically sensitive, optically transparent layer (b) provided that it consists, for example, of a transparent thermoplastic, it is desirable to prevent solvents, which could attack the layer (b), from penetrating through the optically transparent layer (a). to prevent existing micropores.
  • Intermediate layers can perform a variety of tasks: reducing the surface roughness under layer (a), reducing the penetration of the evanescent field of light guided in layer (a) into the one or more layers below, improving the adhesion of layer (a) on the one or more layers below, reduction of thermally induced stresses within the waveguide structure, chemical isolation of the optically transparent layer (a) from layers below by sealing micropores in layer (a) against layers below.
  • the grating structure (c) of an optical structure according to the invention can be a diffractive grating with a uniform period or a multi-diffractive grating. It is also possible for the grating structure (c) to have a periodicity that varies spatially perpendicular or parallel to the direction of propagation of the excitation light coupled into the optically transparent layer (a).
  • optically transparent layer (a) There are numerous different materials that are suitable for the optically transparent layer (a). The most important requirements are the greatest possible freedom from absorption and luminescence, at least at the wavelength of the irradiated excitation light, and the ability to conduct light at least over distances of the order of millimeters to centimeters.
  • the material of the optically transparent layer (a) consists of glass, quartz or a transparent plastic, for example from the group consisting of polycarbonate, polyamide, polyimide, polymethyl methacrylate, polypropylene, polystyrene, polyethylene, Polyacrylic acid, polyacrylic ester, polythioester, polyphenylene sulfide, polyethylene terephthalate (PET) and polyurethane, and derivatives thereof.
  • the optically transparent layer (a) can also be a material from the group of TiO 2 , ZnO, Nb 2 ⁇ 5, Ta 2 O 5 , HfO 2 , or ZrO 2 , particularly preferably made of TiO 2 or Nb O 5 or Ta O 5 , include. It is further preferred that the refractive index of the optically transparent layer (a) is greater than 1.8
  • the optically transparent layer (a) can be in a variety of different “outer” designs. It can be a fibrous or a planar waveguide. Other technically producible geometries are also possible.
  • the optically transparent layer (a) can be self-supporting, for example with a thickness (or diameter in the case of fibrous waveguides) in the order of magnitude of micrometers to millimeters.
  • Layer (a) can also be part of a multi-layer system, with layers adjacent to layer (a) having a lower refractive index than layer (a), wherein, for example, both fibrous and planar embodiments are possible.
  • the optically transparent layer (a) is a low-modal waveguide, i.e. can lead less than the first 10 modes of a predetermined polarization of an irradiated excitation wavelength.
  • the optically transparent layer (a) is a low-modal waveguide which can only carry 1-3 modes of a predetermined polarization of an irradiated excitation wavelength.
  • embodiments of an optical structure according to the invention are particularly preferred as (planar) optical thin-film waveguides.
  • the material of the optically transparent layer (b) of the optical structure according to the invention consists of glass, quartz or a transparent thermoplastic or sprayable plastic, for example from the group consisting of of polycarbonate, polyimide, polymethyl methacrylate, polypropylene, polystyrene, polyethylene, polyethylene terephthalate (PET) or polyurethane.
  • the thickness of the wave-guiding optically transparent layer (a) is the second relevant parameter for generating the strongest possible evanescent field at its interfaces with neighboring layers with a lower refractive index and the highest possible energy density within the layer (a).
  • the strength of the evanescent field increases with decreasing thickness of the waveguiding layer (a), as long as the layer thickness is sufficient to lead at least one mode of the excitation wavelength.
  • the minimum “cut-off” layer thickness for guiding a mode depends on the wavelength of this mode. It is larger for longer-wave light than for short-wave light. However, as the "cut-off" layer thickness is approached, undesired propagation losses also increase, (especially due to scattering at scattering centers), which further limits the selection of the preferred layer thickness.
  • layer thicknesses of the optically transparent layer (a) which only allow the guidance of 1 to 3 modes of a predetermined excitation wavelength
  • layer thicknesses which lead to monomodal waveguides for this excitation wavelength are very particularly preferred. It is clear that the discrete mode character of the guided light only refers to the transverse modes.
  • the product of the thickness of layer (a) and its refractive index is advantageously one tenth to a whole, preferably one tenth to two thirds, of the excitation wavelength of an excitation light to be coupled into layer (a).
  • the resonance angle for the coupling of the excitation light in accordance with the above-mentioned resonance condition depends on the diffraction order to be coupled in, the excitation wavelength and the grating period.
  • the coupling of the first diffraction order is advantageous.
  • the grating depth is decisive for the level of the coupling efficiency. In principle, the coupling efficiency increases with increasing grid depth.
  • the coupling-out efficiency also increases at the same time, so that it is used, for example, to excite luminescence in a measuring area (d) arranged on or adjacent to the lattice structure (c) (according to the following definition), depending on the geometry of the measuring ranges and the irradiated excitation light bundle, gives an optimum. Because of these boundary conditions, it is advantageous if the grating (c) has a period of 200 nm - 1000 nm and the modulation depth of the grating (c) is 3 to 100 nm, preferably 10 to 30 nm.
  • the ratio of the modulation depth to the thickness of the first optically transparent layer (a) is equal to or less than 0.2.
  • the grating structure (c) can be a relief grating with a rectangular, triangular or semicircular profile or a phase or volume grating with a periodic modulation of the refractive index in the essentially planar optically transparent layer (a).
  • optically or mechanically recognizable markings are applied to the optical structure to facilitate adjustment in an optical system and / or for connection to sample containers as part of an analytical system.
  • the optical structure according to the invention is particularly suitable for use in biochemical analysis, for the highly sensitive detection of one or more analytes in one or more samples supplied.
  • biological or biochemical or synthetic recognition recognition elements for the recognition and binding of analytes to be detected are immobilized on the optical structure. This can take place over a large area, possibly over the entire structure, or in discrete so-called measuring ranges.
  • spatially separated measuring areas are to be defined by the area occupied by biological or biochemical or synthetic recognition elements immobilized there for recognizing one or more analytes from a liquid sample.
  • These surfaces can have any geometry, for example the shape of points, circles, rectangles, triangles, ellipses or lines. It is possible that in a 2-dimensional arrangement up to 1,000,000 measuring areas are arranged on an optical structure according to the invention, with a single measuring area taking up an area of 0.001 mm 2 - 6 mm 2 , for example.
  • Identical recognition elements for recognition and binding or detection of an individual analyte on this measurement range, or else different recognition elements for recognizing different analytes can be immobilized within a single measurement range.
  • Compounds which have several (ie two or more) different regions or sections to which different analytes can bind can also be used as recognition elements.
  • the measuring areas can be arranged on such a grating structure or on a uniform, unmodulated area, following such a grating structure in the direction of propagation of the guided excitation light his.
  • Different segments can be formed by lattice structures (c) or by other subdivisions created on the optical structure, for example absorbent strips of an applied pigment or the intermediate walls of structures for producing sample containers with the wave-guiding layer (a) of the optical structure as the base area, in particular optically separated from one another, if crosstalk of luminescent light generated in adjacent segments and fed back into layer (a) is to be prevented.
  • different segments can be delimited from one another by an applied border, which contributes to the fluidic sealing against adjacent areas and / or to a further reduction in optical crosstalk between adjacent segments.
  • an adhesion-promoting layer (f) is applied to the optically transparent layer (a) for the immobilization of biological or biochemical or synthetic recognition elements (e).
  • This adhesive layer should also be optically transparent.
  • the adhesive layer should not protrude beyond the depth of penetration of the evanescent field from the wave-guiding layer (a) into the medium above. Therefore, the adhesion promoting layer (f) should have a thickness of less than 200 nm, preferably less than 20 nm.
  • it can include chemical compounds from the group consisting of silanes, epoxides, functionalized, charged or polar polymers and "self-organized functionalized monolayers".
  • Luminescence-labeled analogs of the analyte or another luminescence-labeled binding partner in a multi-stage assay will only selectively bind these luminescence-capable molecules to the surface of the optical structure in the measurement areas that are defined by the areas occupied by the immobilized recognition elements.
  • one or more methods from the group of methods can be used, from inkjet spotting, mechanical spotting, micro contact printing, fluidic contacting of the measurement areas with the biological or biochemical or synthetic recognition elements by their supply in parallel or crossed microchannels, under the influence of pressure differences or electrical or electromagnetic potentials ".
  • components from the group can be applied, which consist of nucleic acids (e.g. DNA, RNA, oligonucleotides), nucleic acid analogs (e.g. PNA), antibodies and antibody fragments, aptamers, peptides and polypeptides, membrane-bound and isolated receptors, whose ligands, antigens for antibodies, "histidine tag components", cavities generated by chemical synthesis for receiving molecular imprints, natural and artificial polymers, etc. are formed.
  • nucleic acids e.g. DNA, RNA, oligonucleotides
  • nucleic acid analogs e.g. PNA
  • antibodies and antibody fragments e.g. PNA
  • aptamers e.g. DNA, RNA, oligonucleotides
  • peptides and polypeptides e.g. PNA
  • membrane-bound and isolated receptors whose ligands, antigens for antibodies, "histidine tag components”
  • the analyte or an analogue of the analyte is encapsulated in a polymer structure. It is then called the "imprint”. Then the analyte or its analogue is removed from the polymer structure with the addition of suitable reagents, so that it leaves an empty cavity there. This empty cavity can then be used as a binding site with high steric selectivity in a later detection method.
  • any other compound is also suitable as a recognition element which recognizes and interacts with an analyte to be detected in accordance with the desired selectivity required for the respective application.
  • Said recognition elements can be applied directly to the optical structure or mediated via an adhesion-reducing layer, as described above, on the optical structure.
  • the function of “recognition element” and “analyte” can also be exchanged in such a way that, if appropriate after a corresponding chemical pretreatment, the compounds in a sample to be examined for their constituents are immobilized in a sample on an optical structure according to the invention and in a subsequent one Step the corresponding biological or biochemical or synthetic recognition elements are brought into contact with it.
  • Discrete measurement areas can be generated, for example, after dividing a sample into individual aliquots by subsequently applying them in discrete areas on the optical structure. In this case, a mixture of different compounds would typically be immobilized in each measuring range.
  • the detection limit of an analytical method is limited by signals of so-called non-specific binding, ie by signals which are generated by binding the analyte or other compounds used for the detection of the analyte, which are not only in the area of the immobilized biological or biochemical or synthetic recognition elements used , but can also be bound in areas of an optical structure that are not covered, for example by hydrophobic adsorption or by electrostatic interactions. It is therefore advantageous if "chemically neutral" compounds are used between the spatially separated measuring areas (d) with respect to the analyte Reduction of non-specific binding or adsorption are applied.
  • “Chemically neutral” compounds are substances which do not themselves have any specific binding sites for the detection and binding of the analyte or an analogue of the analyte or another binding partner in a multi-stage assay and which, due to their presence, give access to the analyte or its analogue or block another binding partner to the surface of the optical structure.
  • substances from the groups can be used, for example, of albumins, in particular bovine serum albumin or human serum albumin, which do not hybridize with analyzed polynucleotides, fragmented natural or synthetic DNA, such as herring or salmon sperm, or also uncharged, but hydrophilic polymers, such as polyethylene glycols or dextrans, are formed.
  • albumins in particular bovine serum albumin or human serum albumin
  • hydrophilic polymers such as polyethylene glycols or dextrans
  • the selection of the substances mentioned for reducing unspecific hybridization in polynucleotide hybridization assays is determined by the empirical preference for DNA that is as widely different as possible for the polynucleotides to be analyzed, and about which no interactions with the polynucleotide sequences to be detected are known.
  • Another object of the invention is an optical system for multi-photon excitation, comprising at least one excitation light source and an optical structure according to the invention, characterized in that the intensity of a coupled into the wave-guiding layer (a) of the optical structure and in the layer (a) guided excitation light on the layer (a) and in the layer (a) is sufficiently high to molecules on the surface of the layer (a) or at a distance of less than 200 nm to the layer (a) by means of multi-photon excitation to stimulate.
  • a group of embodiments of an optical system according to the invention is characterized in that it is located on the surface of layer (a) or in at a distance of less than 200 nm from the layer (a) of the optical structure, molecules excited by multi-photon excitation are photoreactive, ie chemically reactive molecules or molecular groups after light excitation.
  • a variant consists in that photopolymerization is triggered by the multi-photon excitation of said photoreactive molecules on layer (a) or at a distance of less than 200 nm from layer (a).
  • Compounds with photolabile protective groups, for example, are suitable as photoreactive molecules for this purpose.
  • Another variant is characterized by the fact that the multi-photon excitation of said photoreactive molecules on layer (a) or at a distance of less than 200 nm from layer (a) causes photodissociation, i.e. Splitting of a molecule or molecular complex existing up to the multi-photon excitation is triggered on the layer (a) or at a distance of less than 200 nm from the layer (a).
  • Said photoreactive molecules or groups of molecules can be, for example, so-called photolabile crosslinkers.
  • photoreactive molecules are part of a molecular matrix for embedding molecules of higher molecular weight, in particular natural and synthetic polymers or biological molecules such as proteins, polypeptides and nucleic acids.
  • the optical structure is a sample carrier for mass spectrometry, preferably for MALDI / TOF-MS (matrix-assisted laser desorption / ionization time-of-flight mass spectrometry) ,
  • An optical system for multi-photon excitation comprising at least one excitation light source and an optical structure according to the invention, characterized in that the intensity of an excitation light coupled into the wave-guiding layer (a) of the optical structure and guided in the layer (a) of layer (a) and in layer (a) is sufficiently high to be on the surface of layer (a) or to excite molecules at a distance of less than 200 nm from layer (a) by means of multi-photon excitation for luminescence.
  • the optical system according to the invention is typically designed such that the coupling of excitation light into layer (a) takes place via one or more optical coupling elements from the group consisting of prism couplers, evanescent couplers with matched optical waveguides with overlapping evanescent fields, end face couplers with one in front End face of the waveguiding layer arranged focusing lenses, preferably cylindrical lenses, and grating couplers is formed.
  • optical coupling elements from the group consisting of prism couplers, evanescent couplers with matched optical waveguides with overlapping evanescent fields, end face couplers with one in front End face of the waveguiding layer arranged focusing lenses, preferably cylindrical lenses, and grating couplers is formed.
  • the excitation light is coupled into the layer (a) via a grating structure (c) modulated in the layer (a).
  • the optical structure is a planar thin-film waveguide structure.
  • Such an embodiment of an optical system according to the invention is particularly preferred, comprising at least one excitation light source and an optical structure according to one of the aforementioned embodiments, which is characterized in that the intensity of one at the resonance angle for coupling into layer (a) onto one in the layer (a) modulated lattice structure (c) of the optical structure of irradiated excitation light on the layer (a) and in the layer (a) at least in the region of the lattice structure (c) is sufficiently high to be on the surface of the layer (a) or in a Excite molecules less than 200 nm from layer (a) by means of multi-photon excitation.
  • the multi-photon excitation is preferably a 2-photon excitation.
  • Preferred embodiments are those which make it possible to line-up molecules on the surface of layer (a) or at a distance of less than 200 nm from layer (a), that is to say at the same time along the excitation light guided in layer (a) To excite multi-photon excitation.
  • Embodiments are particularly advantageous in this case which line-like multi-photon excitation of molecules located on the surface of layer (a) or at a distance of less than 200 nm from layer (a) over a distance of at least 5 mm, calculated from the location the coupling of the excitation light into layer (a).
  • an optical system according to the invention with which simultaneous two-dimensional multi-photon excitation of molecules located on the surface of layer (a) or at a distance of less than 200 nm from layer (a) on an area of at least 1 mm 2 , more preferably on an area of at least 10 mm 2 , even more preferably on an area of at least 1 cm 2 is possible.
  • an optical system comprises uniform, unmodulated areas of the layer (a), which preferably extend in the direction of propagation of the layer which is coupled in via a grating structure (c) and is in the layer (a ) guided excitation light are arranged.
  • the optical structure comprises a plurality of grating structures (c) of the same or different period with optionally adjoining uniform, unmodulated regions of the layer (a) on a common, continuous substrate.
  • An essential characteristic of numerous embodiments of an optical system for luminescence excitation according to the invention is that a luminescence generated on or in the near field of layer (a) of the optical structure by means of multi-photon absorption at least partially couples into layer (a) and by conduction in the Layer (a) is guided to adjacent areas on said optical structure.
  • an optical system additionally comprises at least one detector for detecting one or more luminescence from the optical structure.
  • One of the preferred embodiments is characterized in that the excitation light emitted by the at least one excitation light source is essentially parallel and is irradiated at a resonance angle for coupling into the optically transparent layer (a) onto a grating structure (c) modulated in the layer (a) ,
  • a particularly preferred embodiment is characterized in that the excitation light is expanded by at least one light source with an expansion optic to form an essentially parallel beam and is modulated at the resonance angle for coupling into the optically transparent layer (a) to a large area in the layer (a) Lattice structure (c) is irradiated.
  • Another preferred embodiment is characterized in that the excitation light from the at least one light source by one or, in the case of several Light sources, possibly several diffractive optical elements, preferably Dammann gratings, or refractive optical elements, preferably microlens arrays, are broken down into a large number of individual beams of the same intensity as possible of the partial beams originating from a common light source, each of which is essentially parallel to one another on grating structures ( c) are irradiated at the resonance angle for coupling into layer (a).
  • diffractive optical elements preferably Dammann gratings, or refractive optical elements, preferably microlens arrays
  • two or more light sources with the same or different emission wavelength are used as excitation light sources.
  • such an embodiment of the optical system is preferred, which is characterized in that the excitation light from 2 or more light sources simultaneously or sequentially from different directions onto a grating structure (c) is irradiated and via this is coupled into the layer (a) of the optical structure, which comprises a superposition of lattice structures with different periodicity.
  • At least one spatially resolving detector is used for the detection, for example from the group formed by CCD cameras, CCD chips, photodiode arrays, avalanche diode arrays, multichannel plates and multichannel photomultipliers.
  • the optical system comprises those embodiments which are characterized in that optical components from the group are used between the one or more excitation light sources and the optical structure according to the invention and / or between said optical structure and the one or more detectors
  • Lenses or lens systems for shaping the transmitted light bundles planar or curved mirrors for deflecting and possibly additionally for shaping light bundles, Prisms for deflection and, if necessary, for spectral division of light bundles, dichroic mirrors for spectrally selective deflection of parts of light bundles, neutral filters for regulating the transmitted light intensity, optical filters or monochromators for spectrally selective transmission of parts of light bundles or polarization-selective elements for selecting discrete polarization directions of the excitation - And / or luminescent light are formed.
  • the excitation light can be irradiated in pulses with a duration of between 1 fsec and 10 minutes and for the emission light from the measurement ranges to be measured in a temporally resolved manner.
  • the measurement of the emission light from the measurement ranges can be correlated with the pulsed radiation of the excitation light.
  • the optical system according to the invention with an optical structure according to the invention is characterized in that lasers with a longer pulse duration (e.g. B. picosecond or even nanosecond laser) can optionally be used as an excitation light source for multi-photon luminescence excitation (preferably 2-photon excitation) with a possibly lower pulse frequency.
  • a 100 fs laser can typically have a bandwidth of the order of 5-15 nm.
  • an optical system is characterized in that for reference purposes light signals from the group are measured, which are from excitation light at the location of the light sources or after their expansion or after their subdivision into partial beams, scattered light at the excitation wavelength from the range of one or a plurality of spatially separated measuring ranges, and light of the excitation wavelength that is coupled out is formed via the grating structure (c) in addition to the measuring ranges. It is particularly advantageous if the measuring ranges for determining the emission light and the reference signal are identical.
  • the excitation light can be irradiated and the emission light to be detected sequentially from one or more measurement areas for individual or more measurement areas. This can be achieved in particular by sequential excitation and detection using movable optical components which are formed from the group of mirrors, deflection prisms and dichroic mirrors.
  • Such an optical system is also part of the invention, which is characterized in that sequential excitation and detection takes place using an essentially angle and focus-accurate scanner. It is also possible that the optical structure is moved between steps of sequential excitation and detection.
  • Another object of the invention is an analytical system for the detection of one or more analytes, by means of multi-photon excitation of the analyte or one of its binding partners or the molecules of a sample matrix surrounding the analyte molecules, in at least one sample on one or more measuring areas on an optical structure, comprising an optical waveguide, with
  • said optical waveguide is again an optical thin-film waveguide.
  • a special embodiment of such an analytical system according to the invention is characterized in that it is a mass spectrometric measuring system, preferably MALDI7TOF-MS (matrix-assisted laser desorption / ionization time-of-flight mass spectrometry), and, in the case of said optical structure, a sample carrier is for mass spectrometry, the analyte molecules to be detected, preferably molecules of higher molecular weight, in particular natural and artificial polymers or biological molecules such as proteins, polypeptides and nucleic acids, being embedded in a matrix of photoreactive molecules, from which they become photoreactive by means of multi-photon excitation Molecules can be dissociated or desorbed.
  • MALDI7TOF-MS matrix-assisted laser desorption / ionization time-of-flight mass spectrometry
  • Another embodiment is characterized in that photopolymerization is triggered by the multi-photon excitation of said photoreactive molecules on the layer (a) or at a distance of less than 200 nm from the layer (a).
  • Another variant is characterized by the fact that the multi-photon excitation of said photoreactive molecules on the layer (a) or at a distance of less as molecules 200 nm from layer (a), a photodissociation, ie splitting of a molecule or molecular complex existing up to multi-photon excitation on layer (a) or at a distance of less than 200 nm from layer (a) is triggered.
  • An analytical system for luminescence detection of one or more analytes, by means of multi-photon excitation of the analyte or one of its binding partners, is preferred in at least one sample on one or more measurement areas.
  • an optical structure comprising an optical waveguide (preferably designed as a thin-film waveguide)
  • the analytical system additionally comprises one or more sample containers, which are open to the optical structure at least in the area of the one or more measurement areas or the measurement areas combined into segments, the sample containers preferably each having a volume of 0.1 nl-100 ⁇ l to have.
  • a possible embodiment consists in that the sample containers on the side facing away from the optically transparent layer (a), with the exception of inlet and / or outlet openings for the supply or the outlet of the samples and possibly additional reagents, are closed and the supply or the outlet of samples and, if necessary, additional reagents take place in a closed flow-through system, in the case of liquid supply to several measurement areas or segments with common inlet and outlet openings, these are preferably addressed in columns or rows.
  • Another possible embodiment is characterized in that the sample containers have openings on the side facing away from the optically transparent layer (a) for locally addressed addition or removal of the samples or other reagents.
  • a further development of the analytical system according to the invention is designed such that containers are provided for reagents which are wetted during the method for the detection of the one or more analytes and brought into contact with the measurement areas
  • An analytical system according to the invention for luminescence detection of one or more analytes is particularly suitable for (“high-through put”) screening applications, for example for the selection of bindable substance for a so-called target compound and its enrichment in subsequent process steps.
  • sample containers for holding the one or more samples and, if appropriate, additional reagents
  • Such an embodiment of an analytical system according to the invention is preferred, which is characterized in that it comprises a separation of different molecular complexes bound to said optical structure with analytes detected in one or more samples supplied, or of parts of these molecular complexes, according to the height of the absorption cross section of the latter Molecular complexes for photodissociation made possible by multi-photon excitation.
  • Another object of the invention is a method for multi-photon excitation, using an optical structure according to the invention and / or an optical system and / or an analytical system according to the invention, in each case according to one of the aforementioned embodiments, characterized in that the intensity of a in the wave-guiding layer (a) of the optical structure and guided in the layer (a) excitation light on the layer (a) and in the layer (a) is sufficiently high to be on the surface of the layer (a) or at a distance to excite molecules from less than 200 nm to layer (a) by means of multi-photon excitation.
  • a group of embodiments of the method according to the invention is characterized in that molecules located on the surface of layer (a) or at a distance of less than 200 nm from layer (a) of the optical structure are photoreactive and by means of multi-photon excitation to form a chemical reaction.
  • a variant here is that molecules located on the surface of layer (a) or at a distance of less than 200 nm from layer (a) of the optical structure are excited to bind with other molecules by multi-photon excitation.
  • a special embodiment is characterized in that on the surface of layer (a) or at a distance of less than 200 nm from layer (a) Molecules located in the optical structure are excited to photopolymerization by multi-photon excitation.
  • Another variant of the method is characterized in that the multi-photon excitation of said photoreactive molecules on layer (a) or at a distance of less than 200 nm from layer (a) causes photodissociation, i.e. Splitting of a molecule or molecular complex existing up to the multi-photon excitation is triggered on the layer (a) or at a distance of less than 200 nm from the layer (a).
  • a special embodiment of the method according to the invention is characterized in that said analytical system is a mass spectrometric measuring system, preferably MALDI / TOF-MS (matrix-assisted laser desorption / ionization time-of-flight mass spectrometry), and said optical structure is a sample carrier for mass spectrometry, the analyte molecules to be detected, preferably molecules of higher molecular weight, in particular natural and artificial polymers or biological molecules such as proteins, polypeptides and nucleic acids, embedded in a matrix of photoreactive molecules, from which they are formed by means of multi-photon molecules. Excitation of said photoreactive molecules can be dissociated or desorbed.
  • MALDI / TOF-MS matrix-assisted laser desorption / ionization time-of-flight mass spectrometry
  • a preferred embodiment is a method for luminescence excitation, using an optical structure according to the invention and / or an optical and / or an analytical system according to the invention, in each case according to one of the aforementioned embodiments, characterized in that the intensity of a into the waveguiding layer (a) the excitation light coupled into the optical structure and guided in the layer (a) on the layer (a) and in the layer (a) is sufficiently high to be on the surface of the layer (a) or at a distance of less than 200 nm from the layer (a) to excite molecules by means of multi-photon excitation for luminescence.
  • a method for luminescence detection of one or more analytes in one or more samples on one or more measurement areas on an optical structure according to the invention according to one of the corresponding embodiments for determining one or more luminescence from a measurement area or from an array of at least two or more, spatially separated measuring areas (d) or at least two or more spatially separated segments (d '), in which a number of measuring areas are combined, on said optical structure, characterized in that the intensity of a and coupled into the waveguiding layer (a) of the optical structure excitation light carried in layer (a) on layer (a) and in layer (a) is sufficiently high to be on the surface of layer (a) or at a distance of less than 200 nm from layer (a) To excite the molecule to luminescence using multi-photon excitation.
  • the excitation light can be coupled into the layer (a) via one or more optical coupling elements from the group arranged by prism couplers, evanescent couplers with matched optical waveguides with overlapping evanescent fields, end face couplers with in front of an end face of the waveguiding layer focusing lenses, preferably cylindrical lenses, and grating couplers is formed.
  • the excitation light is coupled into the layer (a) via a grating structure (c) modulated in the layer (a).
  • the optical structure is preferably a planar thin-film waveguide structure.
  • a method with an optical structure comprising a planar thin-film waveguide, with a layer (a) which is transparent at at least one excitation wavelength, on a layer (b) which is likewise transparent at at least this excitation wavelength and has a lower refractive index than layer (a) and at least one modulated in layer (a) Lattice structure (c), characterized in that the intensity of an excitation light radiated under the resonance angle for coupling into the layer (a) on the layer (a) and in the layer (a) is sufficiently high, at least in the region of the lattice structure (c), to excite molecules on the surface of layer (a) or at a distance of less than 200 nm from layer (a) by means of multi-photon excitation.
  • the multi-photon excitation is a 2-photon excitation.
  • Such embodiments of the method according to the invention are advantageous, which are characterized in that molecules located on the surface of layer (a) of the optical structure or at a distance of less than 200 nm from layer (a) are linear, that is to say at the same time along the surface of the layer Layer (a) guided excitation light, can be excited by means of multi-photon excitation.
  • Embodiments are particularly advantageous in this case which line-like multi-photon excitation of molecules located on the surface of layer (a) or at a distance of less than 200 nm from layer (a) over a distance of at least 5 mm, calculated from the location the coupling of the excitation light into layer (a).
  • the excitation light bundle is preferably widened parallel to the grating lines via a grating structure (c) modulated therein.
  • the optical structure as part of the optical system, comprises uniform, unmodulated regions of the layer (a), which preferably extend in the direction of propagation of the layer which is coupled in via a grating structure (c) and in the layer (a) guided excitation light are arranged.
  • the optical structure comprises a multiplicity of grating structures (c) of the same or different periods with, if appropriate, subsequent, uniform, unmodulated regions of the layer (a) on a common, continuous substrate.
  • the optical system is designed such that a luminescence generated on or in the near field of layer (a) of the optical structure by multi-photon absorption at least partially couples into layer (a) and by conduction in the Layer (a) is guided to adjacent areas on said optical structure.
  • a luminescence or fluorescence label can be used to generate the luminescence or fluorescence, which can be excited at a wavelength between 200 nm and 1100 nm.
  • the luminescent or fluorescent labels can be conventional luminescent or fluorescent dyes or so-called luminescent or fluorescent nanoparticles based on semiconductors (WCW Chan and S. Nie, "Quantum dot bioconjugates for ultrasensitive nonisotopic detection", Science 281 (1998) 2016 - 2018) act.
  • luminescence labels are best suited which have a particularly large multi-photon absorption cross-section at the excitation wavelength used, in the case of the preferred 2-photon excitation a particularly large 2-photon absorption cross-section and at the same time have the highest possible photostability.
  • said luminescence label is excited by means of 2-photon absorption.
  • said luminescence label is excited to ultraviolet or blue luminescence by 2-photon absorption of an excitation light in the visible or near infrared.
  • the luminescence label can be bound to the analyte or in a competitive assay to an analog of the analyte or in a multistage assay to one of the binding partners of the immobilized biological or biochemical or synthetic recognition elements or to the biological or biochemical or synthetic recognition elements.
  • a second or even more luminescence label with the same or different excitation wavelength as the first luminescence label and the same or different emission wavelength can be used. It can be advantageous here if the second or even more luminescence label can be excited at the same wavelength as the first luminescence label, but can emit at other wavelengths.
  • the excitation spectra and emission spectra of the luminescence labels used overlap only slightly or not at all.
  • a particular embodiment of the method according to the invention for the detection of luminescence of one or more analytes is based on the fact that the autofluorescence (“autofluorescence”) of fluorescent biomolecules, such as, for example, proteins with fluorescent amino acids such as tryptophan, tyrosine or phenylalanine, which are on the surface of layer (a) or at a distance of less than 200 nm from layer (a), can be excited by multi-photon absorption (preferably 2-photon absorption).
  • autofluorescence of fluorescent biomolecules, such as, for example, proteins with fluorescent amino acids such as tryptophan, tyrosine or phenylalanine
  • tryptophan with a molar extinction coefficient of 5600 (L mol-1 cm-1) at 280 nm and a quantum yield of the emission, around 360 nm, of 20% .
  • an excitation of tryptophan fluorescence in a classic one-photon absorption process in the evanescent field is one high refractive index waveguide is not possible because excitation light of such a short wavelength does not practice in the waveguide r significant distances, but is absorbed or spread.
  • excitation light of a suitable longer wavelength for a multi-photon absorption process which is guided over longer distances in the wave-guiding layer (a), and thus to excite the short-wave fluorescence.
  • a particular advantage of this variant of the method is that it eliminates the need to chemically link the analyte or one of its binding partners in a detection method with a luminescence label. Instead, the detection can be based directly on the detection of luminescent biological compounds which are present as a natural component of these compounds or, e.g. B. are incorporated into the analyte or one of its binding partners by point mutations of individual amino acids in a biological production process.
  • the biological or biochemical or synthetic recognition elements immobilized for analyte detection can be selected such that they have no or only minimal self-luminescence due to multi-photon excitation (under the respective test conditions). It is thus possible to obtain the lowest possible background signal in the step of analyte detection by luminescence excitation by means of multiphoton absorption of the analyte itself or one of the binding partners used in the detection method.
  • Another advantageous embodiment tries to determine the immobilization density in the measurement areas with the aid of self-luminescence (self- or auto-fluorescence) of the immobilized biological or biochemical or synthetic recognition elements which is excited in a multi-photon absorption process.
  • one and the same laser can be used for (simultaneous or sequential) single-photon excitation and multi-photon excitation of luminescence, in the case of a sequential excitation of this type, their preferred order may differ depending on the particular application.
  • luminescence excitation takes place simultaneously at up to three different wavelengths, for example with a laser with 1064 nm emission wavelength excitation a NIR dye by one-photon absorption, excitation of a visible dye (about 532 nm) by two-photon absorption and a UV dye by three-photon absorption (at about 355 nm). Corresponding wavelengths when using a laser with emission at 780 nm would be 390 nm for the two-photon absorption and 260 nm for the three-photon absorption.
  • the inventive method of multi-photon excitation can thus be combined with a simultaneous or correspondingly sequential luminescence detection of the emission of luminescent molecules which can be excited in a one-photon absorption process at the irradiated excitation wavelength.
  • the one or more luminescences and / or determinations of light signals are carried out polarization-selectively at the excitation wavelength. Furthermore, the method allows the possibility that the one or more luminescences are measured with a different polarization than that of the excitation light.
  • Another object of the invention is an embodiment of the method according to the invention with an analytical system for luminescence detection of one or more analytes, by means of luminescence excitation of the analyte or one of its binding partners (after single or multi-photon excitation), in at least one sample on one or more measurement areas on an optical structure comprising an optical waveguide (preferably a thin-film waveguide)
  • Feed means to bring the one or more samples into contact with the measurement areas on the optical structure
  • sample containers for holding the one or more samples and, if appropriate, additional reagents
  • Means for removing the liquid contained in the sample containers characterized in that after the detection of the binding of one or more analytes in one or more measuring ranges, the molecular complex formed by this analyte with the relevant immobilized recognition element and possibly further binding partners can be split up by means of photodissociation after multi-photon excitation or split off from the optical structure and said molecular complex as a whole or in parts, after elution from the sample container in question, can be subjected to a further analytical or preparative treatment.
  • a special variant of the method according to the invention is characterized in that during the multi-photon excitation of molecules located on the surface of the layer (a) or within a distance of less than 200 nm from the layer (a) are held captive within this distance , in that the near-surface high excitation intensity and its increasing gradient in the direction of the surface has the effect of an “optical tweezers” on these molecules.
  • the method according to the invention enables simultaneous and / or sequential, quantitative and / or qualitative determination of one or more analytes from the group of antibodies or antigens, receptors or ligands, chelators or ' ⁇ istidine tag components', oligonucleotides , DNA or RNA strands, DNA or RNA analogs, enzymes, enzyme factors or inhibitors, lectins and carbohydrates.
  • the samples to be examined can be naturally occurring body fluids such as blood, serum, plasma, lymph or urine or egg yolk.
  • a sample to be examined can also be an optically cloudy liquid, surface water, a soil or plant extract, a bio- or synthesis process broth.
  • the samples to be examined can also be taken from biological tissue parts.
  • the present invention furthermore relates to the use of an optical structure according to the invention and / or an optical system according to the invention and / or an analytical system and / or a method according to the invention, in each case according to one of the aforementioned embodiments, for quantitative and / or qualitative analyzes for determining chemical , biochemical or biological analytes in screening processes in pharmaceutical research, combinatorial chemistry, clinical and preclinical development, for real-time binding studies and for determining kinetic parameters in affinity screening and in research, for qualitative and quantitative analyte determinations, in particular for DNA and RNA analysis , for the preparation of toxicity studies as well as for the determination of expression profiles and for the detection of antibodies, antigens, pathogens or bacteria in pharmaceutical product development and research, human and veterinary diagnostics, agrochemical product development and research, symptomatic and presymptomatic plant diagnostics, for patient stratification in pharmaceutical product development and for therapeutic drug selection, for the detection of pathogens, pollutants and pathogens, especially of salmonella, prions and bacteria, in food and
  • Another object of this invention is the use of an optical structure according to the invention and / or an optical system according to the invention and / or a method according to the invention in non-linear optics or in telecommunications or communications technology.
  • an optical structure according to the invention and / or an optical system according to the invention and / or an analytical system according to the invention and / or a method according to the invention are also suitable for Surface-based investigations, which require the use of very high excitation light intensities and / or excitation durations, such as studies on the photostability of materials, photocatalytic processes etc.
  • 1 is a camera image of a fluorescence after 2-photons that is visible to the naked eye and is generated with the aid of an optical structure according to the invention.
  • 2 and 3 show cross-sectional profiles of the fluorescence generated by 2-photon excitation, after excitation by excitation light beams collimated to different degrees;
  • Example 1 shows the quadratic dependence of the measured fluorescence intensity on the excitation light intensity.
  • Coupling gratings in the form of relief gratings (grating period 360 nm, grating depth 12 nm) produced in the layer (a) at a distance of 9 mm are used to couple light into and out of the waveguiding layer (a).
  • a pulsed titanium sapphire laser with emission at approx. 800 nm serves as the excitation light source (pulse length: 100 fsec, repetition rate: 80 MHz, average power used: up to 0.6 W, spectral pulse width: 8 nm).
  • the intensity of the excitation light emitted by the laser can be continuously regulated between 0% and 100% of the output power using an electro-optical modulator; it can also be computer controlled up or down in this area.
  • lenses can be used in the excitation beam path (in the direction of the optical structure) in order to generate excitation light bundles of the desired geometry which are irradiated in parallel on the coupling grating (c) of the optical structure.
  • the incident excitation light is deflected via a mirror onto the coupling grating (c) of the optical structure, which is mounted on an adjusting element which translates in the x, y and z directions (parallel and in the axes perpendicular to the grating lines) and rotation ( with axis of rotation, coinciding with the grid lines of the coupling grid).
  • a collimated beam is directed at the resonance angle for coupling onto the coupling grating.
  • the coupling grating level of the optical structure
  • the image section shows the holder with the The left bright light spot marks the coupling position of the excitation light on the coupling grating.
  • the intensity of the excitation light scattered on the grating is strong enough that it can still be seen by the camera despite decreasing sensitivity at long wavelengths
  • the coupled mode (at a wavelength of 800 nm) spreads in the image ne from left to right. Until the area where the rhodamine dye is immobilized, the guided fashion is invisible. In the direction of mode propagation, to the right, the fluorescence of the rhodamine dye generated by means of 2-photon excitation can then be clearly recognized.
  • the light track to be observed corresponds to a length of approx. 8 mm, up to the next grating structure at which the guided excitation light is coupled out again.
  • the full width at half maximum of the fluorescence profile is approximately 360 ⁇ m, the base width approximately 800 ⁇ m, corresponding to a fluorescence (along the mode path of 8 mm) on a total area of approximately 6 mm 2 with 2-photon excitation.
  • Example 2 Another optical system for 2-photon excitation
  • a high-power laser diode with an emission wavelength of 810 nm (fiber-coupled, 10 W) serves as the excitation light source.
  • a beam shaping optic arranged after the fiber, a parallel excitation beam bundle of the desired shape is generated and irradiated onto the grating (period 360 nm, grating depth 12 nm) at the coupling angle for coupling into the waveguiding layer (a) of the optical structure.

Abstract

Die Erfindung betrifft eine variable Ausführungsform einer optischen Struktur, umfassend einen optischen Wellenleiter, mit einer bei mindestens einer Anregungswellenlänge transparenten, wellenleitenden Schicht (a), dadurch gekennzeichnet, dass die Intensität eines in die Schicht (a) eingekoppelten und in der Schicht (a) geführten Anregungslichts auf der Schicht (a) und in der Schicht (a) ausreichend hoch ist, um auf der Oberfläche der Schicht (a) oder in einem Abstand von weniger als 200 nm zur Schicht (a) befindliche, lumineszenzfähige und/oder photoreaktive Moleküle mittels Multi-Photonen-Anregung, vorzugsweise 2-Photonen-Anregung, anzuregen. Bevorzugt sind dabei solche Auführungsformen, welche eine linienhafte oder flächenhafte Multi-Photonen-Anregung, längs des in der Schicht (a) geführten Anregungslichts, ermöglichen. Die Erfindung betrifft auch verschiedene Ausführungsformen optischer Systeme und analytischer Systeme mit einer Anregungslichtquelle und einer erfindungsgemässen Ausführung einer optischer Struktur sowie darauf basierende Verfahren, insbesondere zur Lumineszenzanregung sowie zum Lumineszenznachweis eines oder mehrerer Analyten mittels Multi-Photonen-Anregung, sowie deren Verwendung.

Description

Optische Struktur zur Multi-Photonen-Anregung und deren
Verwendung
Die Erfindung betrifft eine variable Ausführungsform einer optischen Struktur, umfassend einen optischen Wellenleiter, mit einer bei mindestens einer Anregungs weilenlänge transparenten, wellenleitenden Schicht (a), dadurch gekennzeichnet, dass die Intensität eines in die Schicht (a) eingekoppelten und in der Schicht (a) geführten Anregungslichts auf der Schicht (a) und in der Schicht (a) ausreichend hoch ist, um auf der Oberfläche der Schicht (a)' oder in einem Abstand von weniger als 200 nm zur Schicht (a) befindliche, lumineszenzfähige und / oder photoreaktive Moleküle mittels Multi-Photonen-Anregung, vorzugsweise 2-Photonen- Anregung, anzuregen. Bevorzugt sind dabei solche Ausführungsformen, welche eine linienhafte oder flächenhafte Multi-Photonen-Anregung, längs des in der Schicht (a) geführten Anregungslichts, ermöglichen. Die Erfindung betrifft auch verschiedene Ausführungsformen optischer Systeme und analytischer Systeme mit einer Anregungslichtquelle und einer erfmdungsgemässen Ausführung einer optischen Struktur sowie darauf basierende Verfahren, insbesondere zur Lumineszenzanregung sowie zum Lumineszenznachweis eines oder mehrerer Analyten mittels Multi-Photonen-Anregung, sowie deren Verwendung.
Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von optischen Strukturen und einfach durchführbaren optischen Verfahren, um im Nahfeld der wellenleitenden Schicht der Struktur, d.h. auf dieser Struktur oder in einem Abstand von weniger als etwa 200 nm, eine Multi-Photonen-Anregung lumineszenzfähiger und / oder photoreaktiver Moleküle zu ermöglichen.
Im Rahmen dieser Erfindung wird unter einer „Multi-Photonen-Anregung" verstanden, dass ein Molekül (oder eine molekulare Gruppe) mehrere Photonen einer eingestrahlten Anregungswellenlänge absorbiert, bevor es (sie) aus dem daraus resultierenden angeregten Zustand in einen anderen Zustand, insbesondere den Grundzustand, zurückkehrt. Das Resultat einer solchen Multi-Photonen-Anregung kann eine bei der Rückkehr in den Grundzustand ausgestrahlte Lumineszenz, insbesondere Fluoreszenz, mit kürzerer Wellenlänge als der eingestrahlten Anregungswellenlänge sein. Es kann aber auch in der Überwindung der Aktivierungsenergie zum Übergang in einen photoreaktiven Zustand bestehen. Dieser photoreaktive Zustand kann zur Ausbildung von molekularen Bindungen zu anderen Molekülen oder Molekülkomplexen führen (z. B. in Form einer Photopolymerisation) oder auch zum Bruch bestehender Bindungen (Photodissoziation, gegebenenfalls gefolgt von einer Desorption). Entsprechend wird unter einer „EinPhotonen-Anregung" verstanden, dass ein Molekül durch Absorption eines einzelnen Photons in besagten angeregten Zustand angeregt wird.
Unter dem Begriff Molekül soll nachfolgend, sofern nicht explizit anders bezeichnet, der Begriff „molekulare Gruppe" (wie z. B. ein Fluoreszenzlabel als Teil eines fluoreszenzmarkierten Moleküls) subsumiert sein.
Beispielsweise in der biochemischen Analytik besteht ein hoher Bedarf nach Anordnungen und Methoden, mit denen, unter Verwendung von auf einer Oberfläche immobilisierten biochemischen oder biologischen oder synthetischen Erkennungselementen, ein in einer zugeführten Probe befindlicher Analyt mit hoher Selektivität und Empfindlichkeit nachgewiesen werden kann. Viele bekannte Nachweismethoden stützen sich dabei auf die Bestimmung einer oder mehrerer Lumineszenzen in Anwesenheit des Analyten.
Mit dem Begriff "Lumineszenz" wird dabei in dieser Anmeldung die spontane Emission von Photonen im ultravioletten bis infraroten Bereich nach optischer oder nichtoptischer, wie beispielsweise elektrischer oder chemischer oder biochemischer oder thermischer Anregung, bezeichnet. Beispielsweise sind Chemilumineszenz, Biolumineszenz, Elektrolumineszenz und insbesondere Fluoreszenz und Phosphoreszenz unter dem Begriff "Lumineszenz" mit eingeschlossen. Der Begriff "optische Transparenz eines Materials" wird im folgenden in dem Sinne verwendet, dass die Transparenz dieses Materials bei mindestens einer Anregungswellenlänge gefordert wird. Bei einer längeren oder kürzeren Wellenlänge kann dieses Material auch absorbierend sein.
Mittels hochbrechender Dünnschichtwellenleiter, basierend auf einem nur einige hundert Nanometer dünnen wellenleitenden Film auf einem transparenten Trägermaterial, konnte in den letzten Jahren die Empfindlichkeit deutlich gesteigert werden. Beispielsweise wird in der WO 95/33197 eine Methode beschrieben, in der das Anregungslicht über ein Reliefgitter als diffraktives optisches Element in den wellenleitenden Film eingekoppelt wird. Die Oberfläche der Sensorplattform wird mit einer den Analyten enthaltenden Probe in Kontakt gebracht, und die isotrop abgestrahlte Lumineszenz in der Eindringtiefe des evaneszenten Feldes befindlicher lumineszenzfähiger Substanzen wird mittels geeigneter Messvorrichtungen wie zum Beispiel Photodioden, Photomultiplier oder CCD-Kameras gemessen. Es ist auch möglich, den in den Wellenleiter rückgekoppelten Anteil der evaneszent angeregten Strahlung über ein diffraktives optisches Element, zum Beispiel ein Gitter, auszukoppeln und zu messen. Diese Methode ist zum Beispiel in der WO 95/33198 beschrieben.
Die Begriffe "evaneszentes Feld" und "Nahfeld" werden nachfolgend synonym verwendet.
Ein Nachteil aller oben im Stand der Technik, insbesondere in der WO 95/33197 und WO 95/33198 beschriebenen Verfahren zur Detektion evaneszent angeregter Lumineszenz liegt darin, dass auf der als homogener Film ausgebildeten wellenleitenden Schicht der Sensorplattform jeweils nur eine Probe analysiert werden kann. Um weitere Messungen auf derselben Sensorplattform durchführen zu können, sind fortlaufend aufwendige Wasch- bzw. Reinigungsschritte notwendig. Dieses gilt insbesonders, wenn ein von der ersten Messung verschiedener Analyt detektiert werden soll. Im Falle eines Immunoassays bedeutet dieses im allgemeinen, dass die gesamte immobilisierte Schicht auf der Sensorplattform ausgetauscht oder gleich eine neue Sensorplattform als Ganzes verwendet werden muss.
Es besteht daher zugleich das Bedürfnis, ein Verfahren zu entwickeln, welches es erlaubt, parallel, das heisst gleichzeitig oder direkt hintereinander ohne zusätzliche Reinigungsschritte, mehrere Proben zu analysieren.
Zur gleichzeitigen oder aufeinanderfolgenden Durchführung von ausschliesslich lumineszenzbasierenden Mehrfachmessungen mit im wesentlichen monomodalen, planaren anorganischen Wellenleitern sind, z. B. in der WO 96/35940, Vorrichtungen (Arrays) bekannt geworden, in denen auf einer Sensorplattform wenigstens zwei getrennte wellenleitende Bereiche angeordnet sind, die getrennt mit Anregungslicht bestrahlt werden. Die Aufteilung der Sensorplattform in getrennte wellenleitende Bereiche hat allerdings nachteilig zur Folge, dass der Platzbedarf für diskrete Messbereiche, in diskreten wellenleitenden Bereichen auf der gemeinsamen Sensorplattform relativ gross ist und daher wieder nur eine verhältnismässige geringe Dichte unterschiedlicher Messfelder (oder sogenannter "features") erreicht werden kann.
Es besteht daher ausserdem der Bedarf nach einer Vergrösserung der Feature-Dichte bzw. nach einer Verkleinerung der erforderlichen Fläche pro Messbereich.
Basierend auf einfachen Glas- oder Mikroskop-Plättchen, ohne zusätzliche wellenleitende Schichten, sind Arrays mit einer sehr hohen Feature-Dichte bekannt. Beispielsweise werden in der US 5445934 (Affymax Technologies) Arrays von Oligonukleotiden mit einer Dichte von mehr als 1000 Features pro Quadratzentimeter beschrieben und beansprucht. Die Anregung und das Auslesen solcher Arrays beruht auf klassischen optischen Anordnungen und Methoden. Es kann das ganze Array gleichzeitig mit einem aufgeweiteten Anregungslichtbündel beleuchtet werden, was jedoch zu einer relativ geringen Empfindlichkeit führt, da die Anregung nicht auf die wechselwirkende Oberfläche beschränkt ist und da ausserdem der Streulichtanteil relativ gross ist und Streulicht oder Untergrundfluoreszenzlicht aus dem Glassubstrat auch in den Bereichen erzeugt wird, in denen sich keine zur Bindung des Analyten immobilisierten Oligonukleotide befinden. Um die Anregungsintensität zu erhöhen und die Empfindlichkeit bei der Detektion zu verbessern, werden vielfach konfokale Messanordnungen eingesetzt und die verschiedenen Features sequentiell mittels "Scannen" ausgelesen. Dieses hat jedoch einen grösseren Zeitaufwand zum Auslesen eines grossen Arrays und einen relativ komplexen optischen Aufbau zur Folge.
Es besteht daher das Bedürfnis nach einer Ausgestaltung der .Sensorplattform und nach einer optischen Messanordnung, womit eine ebenso hohe oder sogar noch höhere Empfindlichkeit erzielt werden kann, wie diese mit Sensorplattformen basierend auf Dünnschichtwellenleitern erreicht wurde, und mit der zugleich die Messfläche pro Feature minimiert werden kann.
In einer co-pendenten Anmeldung (PCT/EP 00/04869) wird eine Sensorplattform mit einem Schichtwellenleiter, umfassend eine optisch transparente Schicht (a) auf einer zweiten Schicht (b) mit niedrigerem Brechungsindex als Schicht (a) und einer in der optisch transparenten Schicht (a) modulierten Gitterstruktur (c) mit darauf erzeugten Messbereichen beschrieben. Dabei kann durch geeignete Wahl der Parameter, insbesondere der Gittertiefe, nach Einkopplung von Anregungslicht zu den Messbereichen und damit verbundener Lumineszenzanregung im Nahfeld der Schicht (a) das in die Schicht (a) rückgekoppelte Lumineszenzlicht über kürzeste Strecken, d.h. wenige hundert Mikrometer vollständig ausgekoppelt und damit an einer weiteren Ausbreitung in der wellenleitenden Schicht (a) gehindert werden.
Durch diese Anordnung ist es möglich, einen hochempfindlichen gleichzeitigen Nachweis einer Vielzahl von Analyten auf sehr engem Raum durchzuführen. Durch Optimiemng der Strahlengänge und Ausblenden von Reflexionen oder Streulicht kann die Empfindlichkeit weiter gesteigert werden, jedoch bleiben schliesslich die Untergrundsignale und das damit verbundene Rauschen des Untergrunds limitierend. Dieses ist für diese, ebenso wie für alle vorgenannten Anregungs- und Detektions- konfigurationen, unter anderem dadurch bedingt, dass bei den meisten verwendeten Lumineszenzfarbstoffen der spektrale Abstand zwischen Anregungs- und Emissionswellenlänge (Stokes-Shift) relativ gering ist, typischerweise zwischen 20 nm und 50 nm. Zwar sind einige Lumineszenzfarbstoffe bekannt, welche einen grossen Stokes-Shift, bis etwa 300 nm, aufweisen, wie beispielsweise einige Lanthanid- Komplexe. Diese besitzen nachteilig jedoch im allgemeinen eine relativ niedrige Quantenausbeute und / oder Photostabilität.
Ausserdem ist bei den bekannten Anordnungen basierend auf hochbrechenden Dünnschichtwellenleitern, beispielsweise basierend auf wellenleitenden Schichten aus Ta2O5 oder TiO2, mit herkömmlicher Anregung nachteilig, dass die Ausbreitungsverluste dieser Wellenleiter, wie auch die Eigenfluoreszenz dieser Dünnschichtwellenleiter (beispielsweise durch Spuren von fluoreszenten Verunreinigungen in der Schicht (b)), bei kurzen Anregungswellenlängen drastisch ansteigen. So ist hier kurzwellige Anregung bei etwa 450 nm bis 500 nm limitiert. Es wäre jedoch eine Anordnung wünschenswert, mit der Fluorophore auch bei kürzeren Wellenlängen angeregt werden und ihre Lumineszenzen mit einem möglichst niedrigen oder bestenfalls sogar ohne Untergrund detektiert werden können.
Seit kurzem sind Methoden bekannt geworden, welche eine nahezu hintergrundfreie Lumineszenzdetektion erlauben und auf Multi-Photonen-Anregung, insbesondere 2- Photonen-Anregung beruhen. Eine 2-Photonen- Anregung erfordert jedoch extrem hohe Feldstärken bzw. Intensitäten des Anregungslichts. Diese erreicht man in den beschriebenen Anordnungen mit leistungsstarken Pulslasern extrem kurzer Pulslängen (typischerweise von Femtosekunden). Diese optischen Anordnungen sind jedoch mit sehr hohen Systemkosten verbunden und stellen hohe Anforderungen an die fachliche Qualifikation des Benutzers. Sie sind daher für routinemässigere Anwendungen, ausserhalb des Forschungsbereichs, nicht geeignet. Beispielsweise wird in einer sehr frühem Arbeit, in der US 3572941 aus dem Jahre 1967, zur Entwicklung von Anordnungen für 3-dimensionale Bild wiedergäbe und -speicherung, beschrieben, dass beispielsweise zur (permanenten) Änderung der optischen Dichte eines Speichermediums, z. B. eines Einkristalles, beispielsweise CaF2 dotiert mit La, Anregungsintensitätsdichten in der Grössenordnung von mindestens 20 MW/cm2 erforderlich sind. Solche Intensitätsdichten sind beispielsweise mit gepulsten Hochleistungslasern in konfokalen mikroskopischen Anordnungen erreicht und beschrieben worden, wie zum Beispiel in der US 5034613 mit einem Laserfökusdurchmesser von weniger als einem Mikrometer in der Fokusebene des Mikroskops. Die Ausmessung einer ausgedehnten Fläche mittels Scannens erfordert jedoch wiederum neben dem grossen instrumenteilen Aufwand nachteilig auch einen hohen Zeitaufwand.
Es wurde nun überraschend gefunden, dass mit einer optischen Struktur, basierend auf einem Dünnschichtwellenleiter mit einer bei mindestens bei der Anregungswellenlänge transparenten, wellenleitenden Schicht (a) auf einer bei mindestens dieser Anregungswellenlänge ebenfalls transparenten Schicht (b) mit niedrigerem Brechungsindex als Schicht (a) bei geeigneter Wahl der physikalischen Parameter und unter Einsatz ausreichend hoher Anregungslichtintensitäten die Intensität eines in die Schicht (a) eingekoppelten und in der Schicht (a) geführten Anregungslichts auf der Schicht (a) und in der Schicht (a) ausreichend hoch ist, um auf der Oberfläche der Schicht (a) oder in einem Abstand von weniger als 200 nm zur Schicht (a) befindliche Moleküle mittels Multi-Photonen-Anregung zur Lumineszenz anzuregen.
Mit einer bevorzugten Ausführungsform einer erfindungsgemässen optischen Struktur, ausgebildet als ein planarer Dünnschicht- Wellenleiter, mit einer bei mindestens einer Anregungswellenlänge transparenten Schicht (a) auf einer bei mindestens dieser Anregungs weilenlänge ebenfalls transparenten Schicht (b)'mit niedrigerem Brechungsindex als Schicht (a) und mindestens einer in Schicht (a) modulierten Gitterstruktur (c), konnte überraschend gezeigt werden, dass die Intensität eines unter dem Resonanzwinkel zur Einkopplung in die Schicht (a) eingestrahlten Anregungslichts auf der Schicht (a) und in der Schicht (a) sogar längs des gesamten Ausbreitungsweges des Anregungslichts in der Schicht (a) ausreichend hoch ist, um linienhaft und sogar flächenhaft längs dieses Ausbreitungsweges eine 2-Photonen- Anregung auf der Schicht (a) immobilisierter lumineszenzfähiger Moleküle zu ermöglichen. Dabei kann durch 2- Photonen- Absorption eine so starke Lumineszenz erzeugt werden, dass sie sogar bei Raumlicht mit blossem Auge erkennbar ist.
Während bis jetzt eine Multi-Photonen-Anregung nur auf kleinstem Raum, nämlich im Fokus leistungsstarker (im allgemeinen mit hoher Repetitionsrate gepulster) Laser (typischerweise Femtosekunden-Laser) möglich war, ermöglicht die vorliegende Erfindung eine gleichzeitige 2-Photonen-Lumineszenz-Anregung und -Beobachtung in makroskopischen Ausdehnungen, d..h. über Längen von Millimetern bis Zentimetern und auf Flächen von Quadratmillimetern bis Quadratzentimetern. Zugleich können dank der vorliegenden Erfindung die Anforderungen an die Pulsenergien der Anregungslichtquellen während eines einzigen Pulses deutlich gesenkt werden, was bedeutet, dass auch die Verwendung längerpulsiger Laser (z. B. von Pikosekunden- oder sogar Nanosekunden-Lasern anstelle von Femtosekunden-Lasern) oder sogar von kontinuierlich emittierenden (cw) Lasern zur Multi-Photonen-Lumineszenzanregung mit einer erfindungsgemässen optischen Struktur möglich wird.
Ein wesentlicher Vorteil einer Lumineszenzanregung, insbesondere zum Analytnachweis mithilfe oberflächengebundener Erkennungselemente für den Analyten, mittels Multi- Photonen-Anregung im evaneszenten Feld eines Wellenleiters, im Vergleich zur klassischen Anregung mittels Ein-Photonen- Absorption, ist eine nochmals deutlich verschärfte Selektivität der Anregung mit wachsendem Abstand von der hochbrechenden Wellenleiter-Oberfläche. Während die Stärke des evaneszenten Feldes, und (proportional dazu) damit die Intensität einer in diesem Feld nach klassischer Ein-Photonen- Anregung erzeugten Lumineszenz, exponentiell mit dem Abstand x abfällt, ist die Abnahme bei Lumineszenz nach n-Photonen- Absorption proportional zu 1 / enx, für den Fall der 2- Photonen-Anregung also proportional zu 1 / e2x.
Aufgrund der mit relativ geringem Aufwand erreichbaren sehr hohen, oberflächengebundenen Anregungslichtintensitäten, die aufgrund der sehr hohen Verstärkungsfaktoren selbst für vergleichsweise niedrige eingestrahlte Anregungsintensitäten erreicht werden können, eignen sich erfindungsgemässe optische Strukturen für den Einsatz in einer Vielzahl verschiedener technischer Gebiete, auch ausserhalb der Bioanalytik, beispielsweise zur Untersuchung photophysikalischer oder photochemischer Eigenschaften insbesondere neuer Materialien unter dem Einfluss hoher Anregungslichtintensitäten.
Insbesondere können, wie nachfolgend genauer für die verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung beschrieben, photoreaktive Moleküle oder Molekülgruppen innerhalb des genannten sehr kleinen Abstands von der wellenleitenden Schicht der Struktur (z-Richtung) mittels Multi-Photonen-Anregung, vorzugsweise 2- Photonen- Anregung, zu chemischen Reaktionen angeregt werden. Diese können in der Ausbildung chemischer Bindungen zu benachbarten Molekülen bestehen, beispielsweise mit dem Ergebnis einer Photopolymerisation, mit welcher auf einfache Weise räumliche Strakturen mit Abmessungen von molekularer Grosse in z-Richtung erzeugt werden, oder in dem oberflächennahen, selektiven Aufbrechen molekularer Bindungen auf einer makroskopischen Grundfläche, woraus sich beispielsweise neue vereinfachte Methoden für die Massenspektrometrie, insbesondere MALDI/TOF-MS (matrix-assisted laser desorption / ionization time-of-flight mass spectrometry) sowie für molekulare Trennungen, als eine neue, optische Chromatographie-Methode, ergeben.
Erster Gegenstand der Erfindung ist eine optische Struktur, umfassend einen optischen Wellenleiter, mit einer bei mindestens einer Anregungswellenlänge transparenten, wellenleitenden Schicht (a), dadurch gekennzeichnet, dass die Intensität eines in die Schicht (a) eingekoppelten und in der Schicht (a) geführten Anregungslichts auf der Schicht (a) ausreichend hoch ist, um auf der Oberfläche der Schicht (a) oder in einem Abstand von weniger als 200 nm zur Schicht (a) befindliche Moleküle oder molekulare Gruppen mittels Multi-Photonen-Anregung anzuregen.
Vorzugsweise handelt es sich bei besagtem optischem Wellenleiter um einen optischen Dünnschichtwellenleiter, mit einer bei mindestens einer Anregungswellenlänge transparenten, wellenleitenden Schicht (a) auf einer bei mindestens dieser Anregungswellenlänge ebenfalls transparenten Schicht (b) mit niedrigerem Brechungsindex als Schicht (a).
Eine Gruppe von Ausführungsformen der erfindungsgemässen optischen-Struktur ist dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den auf der Oberfläche der Schicht (a) oder in einem Abstand von weniger als 200 nm zur Schicht (a) durch Multi-Photonen-Anregung angeregten Molekülen um photoreaktive, d.h. nach Lichtanregung chemisch reaktive Moleküle oder molekulare Gruppen handelt. Diese photoreaktiven Moleküle können beispielsweise sogenannte Photo-Initiatoren sein, welche bei Einstrahlung eines geeigneten, typischerweise kurzwelligen Anregungslichts (z.B. UV-Licht) eine Photopolymerisation auslösen. Diese besondere Ausführungsform ist also dadurch gekennzeichnet, dass durch die Multi-Photonen-Anregung besagter photoreaktiver Moleküle auf der Schicht (a) oder in einem Abstand von weniger als 200 nm zur Schicht (a) befindlicher Moleküle eine Photopolymerisation ausgelöst wird. Gegenüber dem Stand der Technik ergeben sich daraus zweierlei Vorteile. Zum einen kann, unter Einstrahlung verhältnismässig geringer Anregungsintensitäten in Oberflächennähe (definiert durch den Abstand z von der wellenleitenden Schicht (a) der Struktur, innerhalb dessen für die betreffende Verbindung eine 2-Photonen- Anregung möglich ist) effizient eine Polymerisation angeregt werden. Andererseits können, gegeben durch den Abstand z, auf einfache Weise äusserst flache (d.h. von molekularer Grosse) räumliche Strukturen erzeugt werden. Die linien- oder flächenhafte Ausdehnung, parallel zur Oberfläche der optischen Struktur, wird dabei begrenzt durch die Ausbreitungslänge des eingestrahlten Anregungslichts innerhalb der wellenleitenden Schicht (a). Sofern der Prozess der Photopolymerisation auf einer in der Schicht (a) modulierten Gitterstruktur, zur gleichzeitigen Ein- und Auskopplung des Anregungslichts (siehe ausführlichere Beschreibung weiter unten) stattfindet, können auch Polymerstrukturen sehr kleiner lateraler Ausdehnungen (in der Grössenordnung von Mikrometern) erzeugt oder „geschrieben" werden (durch laterale Bewegung der optischen Struktur bezüglich des eingestrahlten Anregungslichts). Kennzeichen einer anderen Ausführungsform einer erfindungsgemässen optischen Struktur ist, dass durch die Multi-Photonen-Anregung besagter photoreaktiver Moleküle auf der Schicht (a) oder in einem Abstand von weniger als 200 nm zur Schicht (a) befindlicher Moleküle eine Photodissoziation, d.h. Aufspaltung eines bis zu der Multi- Photonen-Anregung bestehenden Moleküls oder molekularen Komplexes auf der Schicht (a) oder in einem Abstand von weniger als 200 nm zu der Schicht (a) ausgelöst wird.
Eine besondere Varianteώesteht dabei darin, dass besagte photoreaktive Moleküle Bestandteil einer Molekülmatrix zur Einbettung von Molekülen höheren Molekulargewichts, insbesondere von natürlichen und künstlichen Polymeren bzw. von biologischen Molekülen wie Proteinen, Polypeptiden und Nukleinsäuren, sind. Besonders bevorzugt ist dabei eine solche Ausführungsform, welche darin besteht, dass es sich bei der optischen Struktur um einen Probenträger für die Massenspektrometrie, vorzugsweise für MALDI/TOF-MS (matrix-assisted laser desorption / ionization time-of-flight mass spectrometry) handelt.
Eine andere bevorzugte Ausführungsform ist eine optische Struktur, umfassend einen optischen Dünnschicht- Wellenleiter, mit einer bei mindestens einer Anregungswellenlänge transparenten, wellenleitenden Schicht (a) auf einer bei mindestens dieser Anregungswellenlänge ebenfalls transparenten Schicht (b) mit niedrigerem Brechungsindex als Schicht (a), dadurch gekennzeichnet, dass die Intensität eines in die Schicht (a) eingekoppelten und in der Schicht (a) geführten Anregungslichts auf der Schicht (a) und in der Schicht (a) ausreichend hoch ist, um auf der Oberfläche der Schicht (a) oder in einem Abstand von weniger als 200 nm zur Schicht (a) befindliche Moleküle mittels Multi-Photonen-Anregung zur Lumineszenz anzuregen.
Die Einkopplung von Anregungslicht in die Schicht (a) kann über ein oder mehrere optische Einkoppelelemente aus der Gruppe erfolgen, die von Prismenkopplern, evaneszenten Kopplern mit zusammengebrachten optischen Wellenleitern mit überlappenden evaneszenten Feldern, Stirnflächenkopplern mit vor einer Stirnseite der wellenleitenden Schicht angeordneten fokussierenden Linsen, vorzugsweise Zylinderlinsen, und Gitterkopplern gebildet wird.
Es wird bevorzugt, dass die Einkopplung von Anregungslicht in die Schicht (a) über eine in der Schicht (a) modulierte Gitterstruktur (c) erfolgt.
Ausserdem wird bevorzugt, dass es sich bei der optischen Struktur um eine planare Dünnschicht- Wellenleiter-Struktur handelt.
Besonders bevorzugt wird eine Ausführungsform der erfindungsgemässen optischen Struktur, umfassend einen planaren Dünnschicht- Wellenleiter, mit einer bei mindestens einer Anregungswellenlänge transparenten Schicht (a) auf einer bei mindestens dieser Anregungswellenlänge ebenfalls transparenten Schicht (b) mit niedrigerem Brechungsindex als Schicht (a) und mindestens einer in Schicht (a) modulierten Gitterstruktur (c), welche dadurch gekennzeichnet ist, dass die Intensität eines unter dem Resonanzwinkel zur Einkopplung in die Schicht (a) eingestrahlten Anregungslichts auf der Schicht (a) und in der Schicht (a) zumindest im Bereich der Gitterstruktur (c) ausreichend hoch ist, um auf der Oberfläche der Schicht (a) oder in einem Abstand von weniger als 200 nm zur Schicht (a) befindliche Moleküle mittels Multi-Photonen- Anregung anzuregen.
Bevorzugt handelt es sich bei der Multi-Photonen-Anregung um eine 2-Photonen- Anregung.
Mithilfe einer erfindungsgemässen optischen Struktur wird es ermöglicht, auf der Oberfläche der Schicht (a) oder in einem Abstand von weniger als 200 nm zur Schicht (a) befindliche Moleküle linienhaft, das heisst gleichzeitig längs des in der Schicht (a) geführten Anregungslichts, mittels Multi-Photonen-Anregung anzuregen.
Besonders vorteilhaft sind solche Ausführungsformen, welche linienhafte Multi- Photonen-Anregung von auf der Oberfläche der Schicht (a) oder in einem Abstand von weniger als 200 nm zur Schicht (a) befindlichen Molekülen längs einer Distanz von mindestens 5 mm, gerechnet vom Ort der Einkopplung des Anregungslichts in die Schicht (a), ermöglichen.
Von besonderem Vorteil ist dabei auch, wenn, unter Einstrahlung eines aufgeweiteten Anregungslichts, auf der Oberfläche der Schicht (a) oder in einem Abstand von weniger als 200 nm zur Schicht (a) befindliche Moleküle gleichzeitig längs des in der Schicht (a) geführten Anregungslichts mittels Multi-Photonen-Anregung angeregt werden können. Im Falle der Lichteinkopplung über ein Gitter (c) in die Schicht (a) ist dabei das Anregungslichtbündel vorzugsweise parallel zu den Gitterlinien aufgeweitet.
Es wird bevorzugt, dass eine erfindungsgemässe optische Struktur gleichzeitige flächenhafte Multi-Photonen-Anregung von auf der Oberfläche der Schicht (a) oder in einem Abstand von weniger als 200 nm zur Schicht (a) befindlichen Molekülen auf einer Fläche von mindestens 1 mm2, stärker bevorzugt auf einer Fläche von mindestens 10 mm2, noch stärker bevorzugt auf einer Fläche von mindestens 1 em2 ermöglicht.
Die sehr grosse oberflächengebundene bzw. oberflächennahe Anregungsintensität, insbesondere zur Ermöglichung einer Multi-Photonen-Anregung, ist für eine Vielzahl verschiedener Anwendungen nützlich, insbesondere in der Biosensorik, wie später genauer ausgeführt, aber auch in der Nachrichten- und (Tele-)Kommunikationstechnik.
Weiterhin wird bevorzugt, dass die Struktur gleichförmige, unmodulierte Bereiche der Schicht (a) umfasst, welche vorzugsweise in Ausbreitungsrichtung des über eine Gitterstruktur (c) eingekuppelten und in der Schicht (a) geführten Anregungslichts angeordnet sind. Insbesondere kann die Struktur so gestaltet sein, dass sie eine Vielzahl von Gitterstrukturen (c) gleicher oder unterschiedlicher Periode mit optional daran anschliessenden gleichförmigen, unmodulierten Bereichen der Schicht (a) auf einem gemeinsamen, durchgehenden Substrat umfasst. Dadurch ist es, im Falle der Lumineszenzanregung durch Multi-Photonen-Anregung, auch möglich, dass eine auf oder im Nahfeld der Schicht (a) durch Multi-Photonen- Absorption erzeugte Lumineszenz mindestens teilweise in die Schicht (a) einkoppelt und durch Leitung in der Schicht (a) zu benachbarten Bereichen auf besagter optischer Struktur geführt wird.
Für bestimmte Anwendungen ist es wünschenswert, gleichzeitig oder sequentiell Anregungslicht unterschiedlicher Wellenlänge für dieselbe optische Struktur zu verwenden. Dann kann es von Vorteil sein, wenn diese eine Überlagerung von 2 oder mehreren Gitterstrukturen unterschiedlicher Periodizität mit zueinander paralleler oder nicht paralleler, vorzugsweise nicht paralleler Ausrichtung der Gitterlinien umfasst, welche der Einkopplung von Anregungslicht unterschiedlicher Wellenlänge dient, wobei im Falle von 2 überlagerten Gitterstrukturen deren Gitterlinien vorzugsweise senkrecht zueinander ausgerichtet sind.
Die Höhe der Ausbreitungsverluste eines in einer optisch wellenleitenden Schicht (a) geführten Modes wird in hohem Masse von der Oberflächenrauhigkeit einer darunter liegenden Trägerschicht sowie von Absorption durch möglicherweise in dieser Trägerschicht vorhandene Chromophoren bestimmt, was zusätzlich das Risiko der Anregung von für viele Anwendungen unerwünschter Lumineszenz in dieser Trägerschicht, durch Eindringen des evaneszenten Feldes des in der Schicht (a) geführten Modes, in sich birgt. Weiterhin kann es zum Auftreten thermischer Spannungen infolge unterschiedlicher thermischer Ausdehnungskoeffizienten der optisch transparenten Schichten (a) und (b) kommen. Im Falle einer chemisch empfindlichen optisch transparenten Schicht (b), sofern sie beispielsweise aus einem transparenten thermoplastischen Kunststoff besteht, ist es wünschenswert, ein Eindringen von Lösungsmitteln, welche die Schicht (b) angreifen könnten, durch eventuell in der optisch transparenten Schicht (a) vorhandene Mikroporen zu verhindern.
Im Falle eines aus mehreren Schichten ((a) und (b)) bestehenden Wellenleiters ist es daher von Vorteil, wenn sich zwischen den optisch transparenten Schichten (a) und (b) und in Kontakt mit Schicht (a) eine weitere optisch transparente Schicht (b') mit niedrigerem Brechungsindex als dem der Schicht (a) und einer Stärke von 5 nm - 10 000 nm, vorzugsweise von 10 nm - 1000 nm, befindet. Durch die Einführung dieser Zwischenschicht können eine Vielzahl von Aufgaben erfüllt werden: Verringerung der Oberflächenrauhigkeit unter der Schicht (a), Verminderung des Eindringens des evaneszenten Feldes von in Schicht (a) geführtem Licht in die eine oder mehrere darunter liegende Schichten, Verbesserung der Haftung der Schicht (a) auf der einen oder mehreren darunter liegenden Schichten, Verminderung von thermisch hervorgerufenen Spannungen innerhalb der Wellenleiter-Struktur, chemische Isolation der optisch transparenten Schicht (a) von darunter liegenden Schichten mittels Abdichten von Mikroporen in der Schicht (a) gegen darunter liegende Schichten.
Die Gitterstruktur (c) einer erfindungsgemässen optischen Struktur kann ein diffraktives Gitter mit einer einheitlichen Periode oder ein multidiffraktives Gitter sein. Es ist auch möglich, dass die Gitterstruktur (c) eine senkrecht oder parallel zur Ausbreitungsrichtung des in die optisch transparente Schicht (a) eingekoppelten Anregungslichts räumlich variierende Periodiziät aufweist.
Es gibt zahlreiche unterschiedliche Materialien, welche für die optisch transparente Schicht (a) geeignet sind. Wesentlichste Voraussetzungen sind weitestmögliche Absorptions- und Lumineszenzfreiheit zumindest bei der Wellenlänge des eingestrahlten Anregungslichts und die Fähigkeit zur Lichtleitung zumindest über Distanzen in der Grössenordnung von Millimetern bis Zentimetern.
Für bestimmte Ausführungsformen einer erfindungsgemässen optischen Struktur wird bevorzugt, dass das Material der optisch transparenten Schicht (a) aus Glas, Quarz oder einem transparenten Kunststoff besteht, beispielsweise aus der Gruppe, welche Polycarbonat, Polyamid, Polyimid, Polymethylmethacrylat, Polypropylen, Polystyrol, Polyethylen, Polyacrylsäure, Polyacrylester, Polythioester, Polyphenylensulfid Polyethylenterephthalat (PET) und Polyurethan sowie deren Derivate umfasst.
Die optisch transparente Schicht (a) kann auch ein Material aus der Gruppe von TiO2, ZnO, Nb2θ5, Ta2O5, HfO2, oder ZrO2, besonders bevorzugt aus TiO2 oder Nb O5 oder Ta O5, umfassen. Es wird weiterhin bevorzugt, dass der Brechungsindex der optisch transparenten Schicht (a) grösser als 1.8 ist
Die optisch transparente Schicht (a) kann in einer Vielzahl verschiedener „äusserer" Ausführunggsformen vorliegen. Es kann sich hierbei um einen faserförmigen oder einen planaren Wellenleiter handeln. Auch andere technisch herstellbare Geometrien sind möglich.
Die optisch transparente Schicht (a) kann selbsttragend sein, beispielsweise mit einer Dicke (oder Durchmesser im Falle faserförmiger Wellenleiter) in der Grössenordnung von Mikrometern bis Millimetern. Die Schicht (a) kann auch Bestandteil eines Mehrschichtsystems sein, mit an die Schicht (a) angrenzenden Schichten niedrigeren Brechungsindexes als Schicht (a), wobei wiederum beispielsweise sowohl faserförmige als auch planare Ausführungsformen möglich sind.
Von besonderem Vorteil insbesondere ist es, wenn die optisch transparente Schicht (a) ein niedermodaler Wellenleiter ist, d.h. weniger als die ersten 10 Moden einer vorgegebenen Polarisation einer eingestrahlten Anregungswellenlänge führen kann.
Besonders bevorzugt wird, wenn die optisch transparente Schicht (a) ein niedermodaler Wellenleiter ist, welcher nur 1 - 3 Moden einer vorgegebenen Polarisation einer eingestrahlten Anregungswellenlänge führen kann.
Wie bereits vorangehend ausgeführt, werden besonders Ausführungsformen einer erfindungsgemässen optischen Struktur als (planarer) optischer Dünnschichtwellenleiter bevorzugt.
Dann wird bevorzugt, dass das Material der optisch transparenten Schicht (b) der erfindungsgemässen optischen Struktur aus Glas, Quarz oder einem transparenten thermoplastischen oder spritzbaren Kunststoff, beispielsweise aus der Gruppe besteht, die von Polycarbonat, Polyimid, Polymethylmethacrylat, Polypropylen, Polystyrol, Polyethylen, Polyethylenterephthalat (PET) oder Polyurethan gebildet wird.
Neben dem Brechungsindex der wellenleitenden optisch transparenten Schicht (a) ist deren Dicke der zweite massgebliche Parameter zur Erzeugung eines möglichst starken evaneszenten Feldes an deren Grenzflächen zu benachbarten Schichten mit niedrigerem Brechungsindex sowie einer möglichst hohen Energiedichte innerhalb der Schicht (a). Dabei nimmt die Stärke des evaneszenten Feldes mit abnehmender Dicke der wellenleitenden Schicht (a) zu, solange die Schichtdicke ausreicht, um mindestens einen Mode der Anregungswellenlänge zu führen. Dabei ist die minimale "Cut-off '- Schichtdicke zur Führung eines Modes abhängig von der Wellenlänge dieses Modes. Sie ist für längerwelliges Licht grösser als für kurzwelliges Licht. Mit Annäherung an die "Cut-off '-Schichtdicke nehmen allerdings auch ungewünschte Ausbreitungsverluste, (insbesondere durch Streuung an Streuzentren) stark zu, was die Auswahl der bevorzugten Schichtdicke zusätzlich nach unten begrenzt. Diese Ausbreitungsverluste sind für längerwelliges Licht allerdings im allgemeinen geringer als für kurzwelliges Licht. Bevorzugt sind solche Schichtdicken der optisch transparenten Schicht (a), welche nur die Führung von 1 bis 3 Moden einer vorgegebenen Anregungswellenlänge ermöglichen, ganz besonders bevorzugt sind Schichtdicken, welche zu monomodalen Wellenleitern für diese Anregungswellenlänge führen. Dabei ist klar, dass sich der diskrete Modencharakter des geführten Lichts nur auf die transversalen Moden bezieht.
Diese Anforderungen führen dazu, dass vorteilhaft das Produkt aus der Dicke der Schicht (a) und ihrem Brechungsindex ein Zehntel bis ein Ganzes, bevorzugt ein Zehntel bis zwei Drittel, der Anregungswellenlänge eines in die Schicht (a) einzukoppelnden Anregungslichts beträgt.
Bei vorgegebenen Brechungsindices der wellenleitenden, optisch transparenten Schicht (a) und der benachbarten Schichten ist der Resonanzwinkel für die Einkopplung des Anregungslichts entsprechend der oben genannten Resonanzbedingung abhängig von der einzukoppelnden Beugungsordnung, der Anregungswellenlänge sowie der Gitterperiode. Zum Erreichen einer hohen Einkoppeleffizienz ist die Einkopplung der ersten Beugungsordnung vorteilhaft. Neben der Höhe der Beugungsordnung ist für die Höhe der Einkoppeleffizienz die Gittertiefe massgebend. Prinzipiell vergrössert sich die Koppeleffizienz mit steigender Gittertiefe. Da der Prozess der Auskopplung völlig reziprok zur Einkopplung erfolgt, erhöht sich jedoch zugleich auch die Auskoppeleffizienz, so dass es beispielsweise zur Anregung von Lumineszenz in einem auf der Gitterstruktur (c) angeordneten oder an diese angrenzenden Messbereich (d) (gemäss nachfolgender Definition), in Abhängigkeit von der Geometrie der Messbereiche und der eingestrahlten Anregungslichtbündel, ein Optimum gibt. Aufgrund dieser Randbedingungen ist es von Vorteil, wenn das Gitter (c) eine Periode von 200 nm - 1000 nm aufweist und die Modulationstiefe des Gitters (c) 3 bis 100 nm, bevorzugt 10 bis 30-nm beträgt.
Weiterhin wird bevorzugt, dass das Verhältnis von Modulationstiefe zur Dicke der ersten optisch transparenten Schicht (a) gleich oder kleiner als 0,2 ist.
Dabei kann die Gitterstruktur (c) ein Reliefgitter mit Rechteck-, Dreieck- oder halbkreisförmigem Profil oder ein Phasen- oder Volumengitter mit einer periodischen Modulation des Brechungsindex in der im wesentlichen planaren optisch transparenten Schicht (a) sein.
Weiterhin kann es von Vorteil sein, wenn auf der optischen Struktur optisch oder mechanisch erkennbare Markierungen zur Erleichterung der Justierung in einem optischen System und / oder zur Verbindung mit Probenbehältnissen als Teil eines analytischen Systems aufgebracht sind.
Die erfindungsgemässe optische Struktur eignet sich insbesondere für den Einsatz in der biochemischen Analytik, zum hochempfindlichen Nachweis eines oder mehrerer Analyten in einer oder mehreren zugeführten Proben. Dazu werden biologische oder biochemische oder synthetische Erkennungskennungselemente zur Erkennung und Bindung nachzuweisender Analyten auf der optischen Struktur immobilisiert. Dieses kann grossflächig, eventuell über der gesamten Struktur, oder in diskreten sogenannten Messbereichen geschehen.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung sollen räumlich getrennte Messbereiche (d) durch die Fläche definiert werden, die dort immobilisierte biologische oder biochemische oder synthetische Erkennungselementen zur Erkennung eines oder mehrerer Analyten aus einer flüssigen Probe einnehmen. Diese Flächen können dabei eine beliebige Geometrie, beispielsweise die Formvon Punkten, Kreisen, Rechtecken, Dreiecken, Ellipsen oder Linien, haben. Es ist möglich, dass in einer 2-dimensionalen Anordnung bis zu 1 000 000 Messbereiche auf einer erfindungsgemässen optischen Struktur angeordnet sind, wobei ein einzelner Messbereich beispielsweise eine Fläche von 0.001 mm2 - 6 mm2 einnehmen kann. Innerhalb eines einzelnen Messbereichs können gleichartige Erkennungselemente für Erkennung und Bindung bzw. Nachweis eines einzelnen Analyten auf diesem Messbereich, oder auch unterschiedliche Erkennungselemente, zur Erkennung verschiedener Analyten, immobilisiert sein. Es können als Erkennungselemente auch solche Verbindungen verwendet werden, welche mehrere (d.h. zwei oder mehr) unterschiedliche Bereiche oder Abschnitte aufweisen, an welche unterschiedliche Analyten binden können.
Beispielsweise im Falle eines planaren optischen Dünnschichtwellenleiters mit einer oder mehreren Gitterstrukturen (c) zur Einkopplung von Anregungslicht als Wellenleiter- Struktur können die Messbereiche auf einer solchen Gitterstruktur oder auf einem gleichförmigen, unmodulierten Bereich, in Ausbreitungsrichtung des geführten Anregungslichts nachfolgend auf eine solche Gitterstruktur, angeordnet sein.
Um gleichzeitig mehrere Analyten in einer Probe nachzuweisen, kann es von Vorteil sein, zwei oder mehrere räumlich getrennte Messbereiche jeweils zu Segmenten auf der optischen Struktur zusammenzufassen. Verschiedene Segmente können durch Gitterstrukturen (c) oder durch andere auf der optischen Struktur erzeugte Unterteilungen, beispielsweise absorbierende Streifen eines aufgebrachten Pigments oder die Zwischenwände von Strukturen zur Erzeugung von Probenbehältnissen mit der wellenleitenden Schicht (a) der optischen Struktur als Grundfläche, insbesondere optisch voneinander getrennt sein, wenn ein Übersprechen von in benachbarten Segmenten erzeugtem und in die Schicht (a) rückgekoppeltem Lumineszenzlicht verhindert werden soll. Zusätzlich können verschiedene Segmente durch eine aufgebrachte Berandung, welche zur fluidischen Abdichtung gegen Nachbarbereiche und / oder zu einer weiteren Verminderung optischen Übersprechens zwischen benachbarten Segmenten beiträgt, gegeneinander abgegrenzt werden.
Es gibt eine Vielzahl von Methoden zur Aufbringung der biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselementen auf die optisch transparente Schicht (a). Beispielsweise kann dieses durch physikalische Adsorption bzw. durch elektrostatische Wechselwirkung erfolgen. Die Orientierung der Erkennungselemente ist dann im allgemeinen statistisch. Ausserdem besteht die Gefahr, dass bei unterschiedlicher Zusammensetzung der den Analyten enthaltenden Probe oder der im Nachweisverfahren eingesetzten Reagentien ein Teil der immobilisierten Erkennungselemente fortgespült wird. Daher kann es von Vorteil sein, wenn zur Immobilisierung biologischer oder biochemischer oder synthetischer Erkennungselemente (e) auf der optisch transparenten Schicht (a) eine Haftvermittlungsschicht (f) aufgebracht ist. Diese Haftvermittlungsschicht sollte ebenfalls optisch transparent sein. Insbesondere sollte die Haftvermittlungsschicht nicht über die Eindringtiefe des evaneszenten Feldes aus der wellenleitenden Schicht (a) in das darüber liegende Medium hinausragen. Daher sollte die Haftvermittlungsschicht (f) eine Stärke von weniger als 200 nm, vorzugsweise von weniger als 20 nm, haben. Sie kann beispielsweise chemische Verbindungen aus der Gruppe Silane, Epoxide, funktionalisierte, geladene oder polare Polymere und "selbstorganisierte funktionalisierte Monoschichten" umfassen.
Wie in der Definition der Messbereiche festgestellt, ist es möglich, durch räumlich selektive Aufbringung von biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselementen auf der optischen Struktur räumlich getrennte Messbereiche (d) zu erzeugen. Im Kontakt mit einem lumineszenzfähigen Analyten oder eines mit dem Analyten um die Bindung an die immobilisierten Erkennungselemente konkurrierenden lumineszenzmarkierten Analogen des Analyten oder eines weiteren lumineszenzmarkierten Bindungspartners in einem mehrstufigen Assay werden diese lumineszenzfähigen Moleküle nur selektiv in den Messbereichen an die Oberfläche der optischen Struktur binden, welche durch die Flächen definiert werden, die von den immobilisierten Erkennungselementen eingenommen werden.
Zur Aufbringung der biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselementen können eines oder mehrere Verfahren verwendet werden aus der Gruppe von Verfahren, die von "InkJet spotting, mechanischem Spotting, micro contact printing, fluidische Kontaktierung der Messbereiche mit den biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselementen durch deren Zufuhr in parallelen oder gekreuzten Mikrokanälen, unter Einwirkung von Druckunterschieden oder elektrischen oder elektromagnetischen Potentialen" , gebildet werden.
Als biologische oder biochemische oder synthetische Erkennungselementen können beispielsweise, ohne Einschränkung der Allgemeinheit, Komponenten aus der Gruppe aufgebracht werden, die von Nukleinsäuren (beispielsweise DNA, RNA, Oligonukleotiden), Nukleinsäureanalogen (z. B. PNA), Antikörpern und Antikörperfragmenten, Aptameren, Peptiden und Polypeptiden, membran-gebundenen und isolierten Rezeptoren, deren Liganden, Antigenen für Antikörper, "Histidin-Tag- Komponenten", durch chemische Synthese erzeugten Kavitäten zur Aufnahme molekularer Imprints, natürlichen und künstlichen Polymeren, etc. gebildet wird. Unter der letztgenannten Art von Erkennungselementen sind Kavitäten zu verstehen, die in einem Verfahren hergestellt werden, welches als "molecular imprinting" in der Literatur beschrieben wurde. Dazu wird, meistens in organischer Lösung, der Analyt oder ein Analogon des Analyten, in einer Polymerenstruktur eingekapselt. Man bezeichnet ihn dann als "Imprint". Dann wird der Analyt oder sein Analogon unter Zugabe geeigneter Reagentien aus der Polymerenstruktur wieder herausgelöst, so dass er dort eine leere Kavität zurücklässt. Diese leere Kavität kann dann als eine Bindungsstelle mit hoher sterischer Selektivität in einem späteren Nachweisverfahren eingesetzt werden. Selbstverständlich eignet sich auch jede andere Verbindung als Erkennungselement, welche entsprechend der gewünschten und für die jeweilige Anwendung erforderlichen Selektivität einen nachzuweisenden Analyten erkennt und mit ihm wechselwirkt.
Es ist auch möglich, dass als biochemische oder biologische Erkennungselemente ganze Zellen oder Zellfragmente oder zelluläre SubStrukturen aufgebracht werden.
Besagte Erkennungselemente können direkt auf der optischen Struktur oder vermittelt über eine Haftveπnittlungsschicht, wie vorangehend beschrieben, auf der optischen Struktur aufgebracht werden.
Ausserdem ist die Funktion von „Erkennungselement" und „Analyt" auch in der Weise austauschbar, dass, gegebenenfalls nach einer entsprechenden chemischen Vorbehandlung, die in einer auf ihre Bestandteile zu untersuchtungen Verbindungen in einer Probe auf einer erfindungsgemässen optischen Struktur immobilisiert werden und in einem nachfolgenden Schritt die entsprechenden biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselemente damit in Kontakt gebracht werden. Diskrete Messbereiche können dabei beispielsweise nach Aufteilung einer Probe in einzelne Aliquots durch deren anschliessende Aufbringung in diskreten Flächen auf der optischen Struktur erzeugt werden. In diesem Falle wäre typischerweise in jedem Messbereich eine Mischung verschiedener Verbindungen immobilisiert.
In vielen Fällen wird die Nachweisgrenze eines analytischen Verfahrens limitiert durch Signale sogenannter unspezifischer Bindung, d. h. durch Signale, welche durch Bindung des Analyten oder anderer zum Nachweis des Analyten eingesetzter Verbindungen erzeugt werden, welche nicht nur im Bereich der eingesetzten immobilisierten biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselemente, sondern auch in davon unbedeckten Bereichen einer optischen Struktur gebunden werden, beispielsweise durch hydrophobe Adsorption oder durch elektrostatische Wechselwirkungen. Daher ist es von Vorteil, wenn zwischen den räumlich getrennten Messbereichen (d) gegenüber dem Analyten "chemisch neutrale" Verbindungen zur Verminderung unspezifischer Bindung oder Adsorption aufgebracht sind. Als "chemisch neutrale" Verbindungen werden dabei solche Stoffe bezeichnet, welche selbst keine spezifischen Bindungsstellen zur Erkennung und Bindung des Analyten oder eines Analogen des Analyten oder eines weiteren Bindungspartners in einem mehrstufigen Assay aufweisen und durch ihre Anwesenheit den Zugang des Analyten oder seines Analogen oder der weiteren Bindungspartner zur Oberfläche der optischen Struktur blockieren.
Als "chemisch neutrale" Verbindungen können beispielsweise Stoffe aus den Gruppen eingesetzt werden, die von Albuminen, insbesondere Rinderserumalbumin oder Humanserumalbumin, nicht mit zu analysierenden Polynukleotiden hybridisierender, fragmentierter natürlicher oder synthetischer DNA, wie beispielsweise von Herings- oder Lachssperma, oder auch ungeladenen, aber hydrophilen Polymeren, wie beispielsweise Polyethylenglycole oder Dextrane, gebildet werden.
Insbesondere die Auswahl der genannten Stoffe zur Verminderung unspezifischer Hybridisierung in Polynukleotid-Hybridisierungsassays (wie Herings- oder Lachssperma) wird dabei durch die empirische Bevorzugung von für die zu analysierenden Polynukleotide möglichst weitgehend verschiedener DNA bestimmt, über die keine Wechselwirkungen mit den nachzuweisenden Polynukleotidsequenzen bekannt ist.
Weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein optisches System zur Multi-Photonen- Anregung, umfassend mindestens eine Anregungslichtquelle und eine erfindungsgemässe optische Struktur, dadurch gekennzeichnet, dass die Intensität eines in die wellenleitende Schicht (a) der optischen Struktur eingekoppelten und in der Schicht (a) geführten Anregungslichts auf der Schicht (a) und in der Schicht (a) ausreichend hoch ist, um auf der Oberfläche der Schicht (a) oder in einem Abstand von weniger als 200 nm zur Schicht (a) befindliche Moleküle mittels Multi-Photonen-Anregung anzuregen.
Eine Gruppe von Ausführungsformen eines erfindungsgemässen optischen Systems ist dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den auf der Oberfläche der Schicht (a) oder in einem Abstand von weniger als 200 nm zur Schicht (a) der optischen Struktur durch Multi-Photonen-Anregung angeregten Moleküle um photoreaktive, d.h. nach Lichtanregung chemisch reaktive Moleküle oder molekulare Gruppen handelt. Dabei besteht eine Variante darin, dass durch die Multi-Photonen-Anregung besagter photoreaktiver Moleküle auf der Schicht (a) oder in einem Abstand von weniger als 200 nm zur Schicht (a) befindlicher Moleküle eine Photopolymerisation ausgelöst wird. Als photoreaktive Moleküle eignen sich hierfür beispielsweise Verbindungen mit photolabilen Schutzgruppen.
Kennzeichen einer anderen Variante ist, dass durch die Multi-Photonen-Anregung besagter photoreaktiver Moleküle auf der Schicht (a) oder in einem Abstand von weniger als 200 nm zur Schicht (a) befindlicher Moleküle eine Photodissoziation, d.h. Aufspaltung eines bis zu der Multi-Photonen-Anregung bestehenden Moleküls oder molekularen Komplexes auf der Schicht (a) oder in einem Abstand von weniger als 200 nm zu der Schicht (a) ausgelöst wird. Hierbei können besagte photoreaktive Moleküle oder Molekülgruppen beispielsweise sogenannte photolabile Crosslinker sein.
Eine besondere Variante besteht dabei darin, dass besagte photoreaktive Moleküle Bestandteil einer Molekülmatrix zur Einbettung von Molekülen höheren Molekulargewichts, insbesondere von natürlichen und künstlichen Polymeren bzw. von biologischen Molekülen wie Proteinen, Polypeptiden und Nukleinsäuren, sind. Besonders bevorzugt ist dabei eine solche Ausführungsform, welche darin besteht, dass es sich bei der optischen Struktur um einen Probenträger für die Massenspektrometrie, vorzugsweise für MALDI/TOF-MS (matrix-assisted laser desorption / ionization time-of-flight mass spectrometry) handelt.
Bevorzugt ist ein optisches System zur Multi-Photonen-Anregung, umfassend mindestens eine Anregungslichtquelle und eine erfindungsgemässe optische Struktur, dadurch gekennzeichnet, dass die Intensität eines in die wellenleitende Schicht (a) der optischen Struktur eingekoppelten und in der Schicht (a) geführten Anregungslichts auf der Schicht (a) und in der Schicht (a) ausreichend hoch ist, um auf der Oberfläche der Schicht (a) oder in einem Abstand von weniger als 200 nm zur Schicht (a) befindliche Moleküle mittels Multi-Photonen-Anregung zur Lumineszenz anzuregen.
Das erfindungsgemässe optische System ist typischerweise so gestaltet, dass die Einkopplung von Anregungslicht in die Schicht (a) über ein oder mehrere optische Einkoppelelemente aus der Gruppe erfolgt, die von Prismenkopplern, evaneszenten Kopplern mit zusammengebrachten optischen Wellenleitern mit überlappenden evaneszenten Feldern, Stirnflächenkopplern mit vor einer Stirnseite der wellenleitenden Schicht angeordneten fokussierenden Linsen, vorzugsweise Zylinderlinsen, und Gitterkopplern gebildet wird.
Es wird bevorzugt, dass die Einkopplung von Anregungslicht in die Schicht (a) über eine in der Schicht (a) modulierte Gitterstruktur (c) erfolgt.
Ausserdem wird bevorzugt, dass es sich bei der optischen Struktur um eine planare Dünnschicht- Wellenleiter-Struktur handelt.
Besonders bevorzugt wird eine solche Ausführungsform eines erfindungsgemässen optischen Systems, umfassend mindestens eine Anregungslichtquelle und eine optische Struktur nach einer der vorgenannten Ausführungsformen, welche dadurch gekennzeichnet ist, dass die Intensität eines unter dem Resonanzwinkel zur Einkopplung in die Schicht (a) auf eine in der Schicht (a) modulierte Gitterstruktur (c) der optischen Struktur eingestrahlten Anregungslichts auf der Schicht (a) und in der Schicht (a) zumindest im Bereich der Gitterstruktur (c) ausreichend hoch ist, um auf der Oberfläche der Schicht (a) oder in einem Abstand von weniger als 200 nm zur Schicht (a) befindliche Moleküle mittels Multi-Photonen-Anregung anzuregen.
Bevorzugt handelt es sich bei der Multi-Photonen-Anregung um eine 2-Photonen- Anregung. Bevorzugt werden solche Ausführungsformen, welche es ermöglichen, auf der Oberfläche der Schicht (a) oder in einem Abstand von weniger als 200 nm zur Schicht (a) befindliche Moleküle linienhaft, das heisst gleichzeitig längs des in der Schicht (a) geführten Anregungslichts, mittels Multi-Photonen-Anregung anzuregen.
Besonders vorteilhaft sind dabei solche Ausführungsformen, welche linienhafte Multi- Photonen-Anregung von auf der Oberfläche der Schicht (a) oder in einem Abstand von weniger als 200 nm zur Schicht (a) befindlichen Molekülen längs einer Distanz von mindestens 5 mm, gerechnet vom Ort der Einkopplung des Anregungslichts in die Schicht (a), ermöglichen.
Ausserdem wird bevorzugt, dass, unter Einstrahlung eines aufgeweiteten Anregungslichts, auf der Oberfläche der Schicht (a) oder in einem Abstand von weniger als 200 nm zur Schicht (a) befindliche Moleküle gleichzeitig flächenhaft längs des in der Schicht (a) geführten Anregungslichts mittels Multi-Photonen-Anregung angeregt werden können. Sofern die Lichteinkopplung in die Schicht (a) über eine darin modulierte Gitterstruktur (c) erfolgt, ist dabei das Anregungslichtbündel vorteilhaft parallel zu den Gitterlinien aufgeweitet.
Von besonderem Vorteil sind auch solche Ausführungsformen eines erfindungsgemässen optischen Systems, mit denen gleichzeitige flächenhafte Multi-Photonen-Anregung von auf der Oberfläche der Schicht (a) oder in einem Abstand von weniger als 200 nm zur Schicht (a) befindlichen Molekülen auf einer Fläche von mindestens 1 mm2 , stärker bevorzugt auf einer Fläche von mindestens 10 mm2, noch stärker bevorzugt auf einer Fläche von mindestens 1 cm2 möglich ist.
Ebenfalls bevorzugte Ausführungsformen eines erfindungsgemässen optischen Systems sind dadurch gekennzeichnet, dass die optische Struktur, als Teil dieses Systems, gleichförmige, unmodulierte Bereiche der Schicht (a) umfasst, welche vorzugsweise in Ausbreitungsrichtung des über eine Gitterstruktur (c) eingekoppelten und in der Schicht (a) geführten Anregungslichts angeordnet sind. Wiederum ist auch für viele Anwendungen vorteilhaft, wenn die optische Struktur eine Vielzahl von Gitterstrukturen (c) gleicher oder unterschiedlicher Periode mit optional daran anschliessenden gleichförmigen, unmodulierten Bereichen der Schicht (a) auf einem gemeinsamen, durchgehenden Substrat umfasst.
Ein wesentliches Kennzeichen zahlreicher Ausführungsformen eines erfindungsgemässen optischen Systems zur Lumineszenzanregung ist auch, dass eine auf oder im Nahfeld der Schicht (a) der optischen Struktur durch Multi-Photonen- Absorption erzeugte Lumineszenz mindestens teilweise in die Schicht (a) einkoppelt und durch Leitung in der Schicht (a) zu benachbarten Bereichen auf besagter optischer Struktur geführt wird.
Typischerweise umfasst ein erfindungsgemässes optisches System zusätzlich mindestens einen Detektor zur Erfassung einer oder mehrerer Lumineszenzen von der optischen Struktur.
Für die Geometrie der Strahlführung des Anregungslichts bis zum Auftreffen auf der erfindungsgemässen optischen Struktur gibt es eine Vielzahl möglicher verschiedener Ausführungsformen. Eine der bevorzugten Ausführungen ist dadurch gekennzeichnet, dass das von der mindestens einen Anregungslichtquelle ausgesandte Anregungslicht im wesentlichen parallel ist und unter dem Resonanzwinkel zur Einkopplung in die optisch transparente Schicht (a) auf eine in der Schicht (a) modulierte Gitterstruktur (c) eingestrahlt wird.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform ist dadurch gekennzeichnet, dass das Anregungslicht von mindestens einer Lichtquelle mit einer Aufweitungsoptik zu einem im wesentlichen parallelen Strahlenbündel aufgeweitet wird und unter dem Resonanzwinkel zur Einkopplung in die optisch transparente Schicht (a) auf eine grossflächige in der Schicht (a) modulierte Gitterstruktur (c) eingestrahlt wird.
Eine andere bevorzugte Ausführungsform ist dadurch gekennzeichnet, dass das Anregungslicht von der mindestens einen Lichtquelle durch ein oder, im Falle mehrerer Lichtquellen, gegebenenfalls mehrere diffraktive optische Elemente, vorzugsweise Dammann-Gitter, oder refraktive optische Elemente, vorzugsweise Mikrolinsen- Arrays, in eine Vielzahl von Einzelstrahlen möglichst gleicher Intensität der von einer gemeinsamen Lichtquelle stammenden Teilstrahlen zerlegt wird, welche jeweils im wesentlichen parallel zueinander auf Gitterstrukturen (c) unter dem Resonanzwinkel zur Einkopplung in die Schicht (a) eingestrahlt werden.
Für bestimmte Anwendungen wird bevorzugt, dass als Anregungslichtquellen zwei oder mehrere Lichtquellen mit gleicher oder unterschiedlicher Emissionswellenlänge verwendet werden.
Für solche Anwendungen, in denen zwei oder mehr unterschiedliche Anregungswellenlängen eingesetzt werden sollen, wird eine solche Ausführungsform des optischen System "bevorzugt, welche dadurch gekenzeichnet ist, dass das Anregungslicht von 2 oder mehr Lichtquellen gleichzeitig oder sequentiell aus verschiedenen Richtungen auf eine Gitterstruktur (c) eingestrahlt und über diese in die Schicht (a) der optischen Struktur eingekoppelt wird, welche eine Überlagerung von Gitterstrukturen mit unterschiedlicher Periodizität umfasst.
Es wird bevorzugt, dass zur Detektion mindestens ein ortsauflösender Detektor verwendet wird, beispielsweise aus der Gruppe, die von CCD-Kameras, CCD-Chips, Photodioden-Arrays, Avalanche-Dioden- Arrays, Multichannelplates und Vielkanal- Photomulipliern gebildet wird.
Gemäss dieser Erfindung umfasst das optische System solche Ausführungsformen, welche dadurch gekennzeichnet sind, dass zwischen der einen oder mehreren Anregungslichtquellen und der erfindungsgemässen optischen Struktur und /oder zwischen besagter optischer Struktur und dem einen oder mehreren Detektoren optische Komponenten aus der Gruppe verwendet werden, die von Linsen oder Linsensystemen zur Formgestaltung der übertragenen Lichtbündel, planaren oder gekrümmten Spiegeln zur Umlenkung und gegebenenfalls zusätzlich zur Formgestaltung von Lichtbündeln, Prismen zur Umlenkung und gegebenenfalls zur spektralen Aufteilung von Lichtbündeln, dichroischen Spiegeln zur spektral selektiven Umlenkung von Teilen von Lichtbündeln, Neutralfiltern zur Regelung der übertragenen Lichtintensität, optischen Filtern oder Monochromatoren zur spektral selektiven Übertragung von Teilen von Lichtbündeln oder polarisationsselektiven Elementen zur Auswahl diskreter Polarisationsrichtungen des Anregungs- und / oder Lumineszenzlichts gebildet werden.
Es ist möglich, dass die Einstrahlung des Anregungslichts in Pulsen mit einer Dauer zwischen 1 fsec und 10 Minuten erfolgt und gegebenenfalls das Emissionslicht aus den Messbereichen zeitlich aufgelöst gemessen wird. Dabei kann, unter Einsatz von • Detektoren geeigneter zeitlicher Auflösung, die Messung des Emissionslichts aus den Messbereichen korreliert mit der gepulsten Einstrahlung des Anregungslichts erfolgen. Während in den bekannten Anordnungen zur 2-Photonen-Fluoreszenzanregung im typischerweise beugungsbegrenzten Fokusdurchmesser des Anregungs-Lasers in hoher Pulsfolge betriebene Femtosekunden-Pulslaser Verwendung fanden, ist das erfindungsgemässe optische System mit einer erfindungsgemässen optischen Struktur dadurch gekennzeichnet, dass auch Laser längerer Pulsdauer (z. B. Pikosekunden- oder sogar Nanosekunden-Laser) bei gegebenenfalls auch niedrigerer Pulsfrequenz als Anregungslichtquelle zur Multi-Photonen-Lumineszenzanregung (vorzugsweise 2- Photonen-Anregung) verwendet werden können.
Bei Verwendung sehr kurzpulsiger Laser ist die Abhängigkeit der spektralen Bandbreite des Anregungspulses von der Pulslänge (als Folge der Unschärferelation) zu beachten, um die Einkopplung des Anregungslichts eines solchen Laser in eine erfindungsgemässe optische Struktur auf maximale Einkoppeleffizienz zu optimieren. Beispielsweise kann typischerweise ein 100 fs-Laser eine Bandbreite in der Grössenordnung von 5 - 15 nm haben. Bezogen auf eine erreichbare Einkoppeleffizienz in eine Wellenleiter-Struktur über ein Koppelgitter (c) bedeutet dieses, dass - im Falle flacher Gitter von beispielsweise < 10 nm - bei einem eingestellten Winkel nur für einen kleinen Anteil des eingestrahlten Spektrums die Resonanzbedingimg zur Einkopplung erfüllt ist und damit die Effizienz der Einkopplung gering ist. Durch die Verwendung tieferer Gitter kann die Schärfe der Resonanzbedingung, sowohl hinsichtlich der Winkel- als auch der Spektralakzeptanz, verringert werden. Als Grundregel bedeutet dieses, dass bei Laserpulsdauern von weniger als ca. 1 - 10 psec (in Abhängigkeit von den übrigen Systemparametern) dieser Zusammenhang bei der Optimierung der Gitterparameter berücksichtigt werden muss, wobei tendenziell zur effizienten Einkopplung von Licht mit kürzeren Pulsdauern grössere Gittertiefen erforderlich sind.
Weitere bevorzugte Ausführungsformen eines erfindungsgemässen optischen Systems zeichnen sich dadurch aus, dass zur Referenzierung Lichtsignale aus der Gruppe gemessen werden, die von Anregungslicht am Ort der Lichtquellen oder nach ihrer Aufweitung oder nach ihrer Unterteilung in Teilstrahlen, Streulicht bei der Anregungswellenlänge aus dem Bereich der einen oder mehreren räumlich getrennten Messbereiche, und über die Gitterstruktur (c) neben den Messbereichen ausgekoppeltem Licht der Anregungswellenlänge gebildet werden. Insbesondere ist dabei von Vorteil, wenn die Messbereiche zur Bestimmung des Emissionslichts und des Referenzsignals identisch sind.
Es ist möglich, dass die Einstrahlung des Anregungslichts auf und Detektion des Emissionslichts von einem oder mehreren Messbereichen sequentiell für einzelne oder mehrere Messbereiche erfolgt. Dieses kann insbesondere dadurch realisiert werden, dass sequentielle Anregung und Detektion unter Verwendung beweglicher optischer Komponenten erfolgt, die aus der Gruppe von Spiegeln, Umlenkprismen und dichroischen Spiegeln gebildet wird.
Bestandteil der Erfindung ist auch ein solches optisches System, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass sequentielle Anregung und Detektion unter Verwendung eines im wesentlichen winkel- und fokusgetreuen Scanners erfolgt. Ausserdem ist es möglich, dass die optische Struktur zwischen Schritten der sequentiellen Anregung und Detektion bewegt wird. Weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein analytisches System zum Nachweis eines oder mehrerer Analyten, mittels Multi-Photonen-Anregung des Analyten oder eines seiner Bindungspartner oder der die Analytmoleküle umgebenden Moleküle einer Probenmatrix, in mindestens einer Probe auf einem oder mehreren Messbereichen auf einer optischen Struktur, umfassend einen optischen Wellenleiter, mit
- einer erfindungsgemässen optischen Struktur nach einer der genannten Ausführungsformen und
- einem erfindungsgemässen optischen System nach einer der vorgenannten Ausführungsformen.
Vorzugsweise handelt es sich bei besagtem optischem Wellenleiter wiederum um einen optischen Dünnschichtwellenleiter.
Eine spezielle Ausführungsform eines solchen erfindungsgemässen analytischen Systems ist dadurch gekennzeichnet, dass es sich hierbei um ein massenspektrometrisches Messsystem, vorzugsweise MALDI7TOF-MS (matrix-assisted laser desorption / ionization time-of-flight mass spectrometry), und bei besagter optischer Struktur um einen Probenträger für die Massenspektrometrie handelt, wobei die nachzuweisenden Analytmoleküle, vorzugsweise Moleküle höheren Molekulargewichts, insbesondere natürliche und künstliche Polymeren bzw. biologische Moleküle wie Proteine, Polypeptide und Nukleinsäuren, eingebettet sind in eine Matrix photoreaktiver Moleküle, aus der sie mittels Multi-Photonen-Anregung besagter photoreaktiver Moleküle dissoziiert bzw. desorbiert werden können.
Eine andere Ausführungsform ist dadurch gekennzeichnet, dass durch die Multi- Photonen-Anregung besagter photoreaktiver Moleküle auf der Schicht (a) oder in einem Abstand von weniger als 200 nm zur Schicht (a) befindlicher Moleküle eine Photopolymerisation ausgelöst wird.
Kennzeichen einer weiteren Variante ist, dass durch die Multi-Photonen-Anregung besagter photoreaktiver Moleküle auf der Schicht (a) oder in einem Abstand von weniger als 200 nm zur Schicht (a) befindlicher Moleküle eine Photodissoziation, d.h. Aufspaltung eines bis zu der Multi-Photonen-Anregung bestehenden Moleküls oder molekularen Komplexes auf der Schicht (a) oder in einem Abstand von weniger als 200 nm zu der Schicht (a) ausgelöst wird.
Bevorzugt wird ein analytisches System zum Lumineszenznachweis eines oder mehrerer Analyten, mittels Multi-Photonen-Anregung des Analyten oder eines seiner Bindungspartner, in mindestens einer Probe auf einem oder mehreren Messbereichen auf . einer optischen Struktur, umfassend einen optischen Wellenleiter (vorzugsweise ausgebildet als Dünnschichtwellenleiter), mit
- einer erfindungsgemässen optischen Struktur
- einem erfindungsgemässen optischen System sowie
- Zuführungsmitteln, um die eine oder mehrere Proben mit den Messbereichen auf der optischen Struktur in Kontakt zu bringen.
Dabei wird bevorzugt, dass das analytische System zusätzlich eine oder mehrere Probenbehältnisse umfasst, welche mindestens im Bereich der einen oder mehreren Messbereiche oder der zu Segmenten zusammengefassten Messbereiche zur optischen Struktur hin geöffnet sind, wobei die Probenbehältnisse vorzugsweise jeweils ein Volumen von 0.1 nl - 100 μl haben.
Eine mögliche Ausführungsform besteht darin, dass die Probenbehältnisse auf der von der optisch transparenten Schicht (a) abgewandten Seite, mit Ausnahme von Ein- und / oder Auslassöffnungen für die Zufuhr oder den Auslass der Proben und gegebenenfalls zusätzlicher Reagentien, geschlossen sind und die Zufuhr oder der Auslass von Proben und gegebenenfalls zusätzlicher Reagentien in einem geschlossenen Durchflusssystem erfolgen, wobei im Falle der Flüssigkeitszufuhr zu mehreren Messbereichen oder Segmenten mit gemeinsamen Einlass- und Auslassöffnungen diese bevorzugt spalten- oder zeilenweise addressiert werden. Eine andere mögüche Ausführungsform ist dadurch gekennzeichnet, dass die Probenbehältnisse auf der von der optisch transparenten Schicht (a) abgewandten Seite Öffnungen zur lokal addressierten Zugabe oder Entfernung der Proben oder anderer Reagentien besitzen.
Eine Weiterentwicklung des erfindungsgemässen analytischen Systems ist so gestaltet, dass Behältnisse für Reagentien vorgesehen sind, welche während des Verfahrens zum Nachweis des einen oder mehrerer Analyten benetzt und mit den Messbereichen in Kontakt gebracht werden
Insbesondere für („High-Through-Put"-) Screening- Applikationen, beispielsweise zur Auswahl bindungsfähiger Substanz für eine sogenannte Zielverbindung („Target") und deren Anreicherung in nachfolgenden Verfahrensschritten, geeignet ist ein erfindungsgemässes analytisches System zum Lumineszenznachweis eines oder mehrerer Analyten, mittels Lumineszenzanregung des Analyten oder eines seiner Bindungspartner, in mindestens einer Probe auf einem oder mehreren Messbereichen auf einer optischen Struktur, umfassend einen optischen Wellenleiter (vorzugsweise einen Dünnschichtwellenleiter), mit
- einer erfindungsgemässen optischen Struktur
- einem erfindungsgemässen optischen System
- Zuführungsmitteln, um die eine oder mehrere Proben mit den Messbereichen auf der optischen Struktur in Kontakt zu bringen
- einem oder mehreren Probenbehältnissen zur Aufnahme der einen oder mehreren Proben und gegebenenfalls zusätzlicher Reagentien sowie
- Mitteln zur Entfernung der in den Probenbehältnissen enthaltenen Flüssigkeit, dadurch gekennzeichnet, dass nach dem Nachweis der Bindung eines oder mehrerer Analyten in einem oder mehreren Messbereichen der von diesem Analyten mit dem betreffenden immobilisierten Erkennungselement und gegebenenfalls weiteren Bindungspartnern gebildete Molekülkomplex mittels Photodissoziation nach Multi- Photonen-Anregung aufgespalten oder von der optischen Struktur abgespalten werden kann und besagter Molekülkomplex als ganzer oder in Teilen, nach Elution aus dem betreffenden Probenbehältnis, einer weiteren analytischen oder präparativen Behandlung zugeführt werden kann.
Bevorzugt wird dabei eine solche Ausführungsform eines erfindungsgemässen analytischen Systems, welche dadurch gekennzeichnet ist, dass diese eine Auftrennung verschiedener auf besagter optischer Struktur gebundener Molekülkomplexe mit in einer oder mehreren zugeführten Proben nachgewiesenen Analyten, oder von Teilen dieser Molekülkomplexe, nach der.Höhe des Absorptionsquerschnitts dieser Molekülkomplexe für eine Photodissoziation mittels Multi-Photonen-Anregung ermöglicht.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Multi-Photonen-Anregung, unter Verwendung einer erfindungsgemässen optischen Struktur und / oder eines erfindungsgemässen optischen Systems und / oder eines erfindungsgemässen analytischen Systems, jeweils nach einer der vorgenannten Ausführungsformen, dadurch gekennzeichnet, dass die Intensität eines in die wellenleitende Schicht (a) der optischen Struktur eingekoppelten und in der Schicht (a) geführten Anregungslichts auf der Schicht (a) und in der Schicht (a) ausreichend hoch ist, um auf der Oberfläche der Schicht (a) oder in einem Abstand von weniger als 200 nm zur Schicht (a) befindliche Moleküle mittels Multi-Photonen-Anregung anzuregen.
Eine Gruppe von Ausführungsformen des erfindungsgemässen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass auf der Oberfläche der Schicht (a) oder in einem Abstand von weniger als 200 nm zur Schicht (a) der optischen Struktur befindliche Moleküle photoreaktiv sind und durch Multi-Photonen-Anregung zu einer chemischen Reaktion angeregt werden.
Dabei besteht eine Variante darin, dass auf der Oberfläche der Schicht (a) oder in einem Abstand von weniger als 200 nm zur Schicht (a) der optischen Struktur befindliche Moleküle durch Multi-Photonen-Anregung zu einer Bindung mit anderen Molekülen angeregt werden. Kennzeichen einer speziellen Ausführungsform ist dabei, dass auf der Oberfläche der Schicht (a) oder in einem Abstand von weniger als 200 nm zur Schicht (a) der optischen Struktur befindliche Moleküle durch Multi-Photonen-Anregung zu einer Photopolymerisation angeregt werden.
Kennzeichen einer anderen Variante des Verfahrens ist, dass durch die Multi-Photonen- Anregung besagter photoreaktiver Moleküle auf der Schicht (a) oder in einem Abstand von weniger als 200 nm zur Schicht (a) befindlicher Moleküle eine Photodissoziation, d.h. Aufspaltung eines bis zu der Multi-Photonen-Anregung bestehenden Moleküls oder molekularen Komplexes auf der Schicht (a) oder in einem Abstand von weniger als 200 nm zu der Schicht (a) ausgelöst wird.
Eine spezielle Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei besagtem analytischen System um ein massenspektrometrisches Messsystem, vorzugsweise MALDI/TOF-MS (matrix-assisted laser desorption / ionization time-of-flight mass spectrometry), und bei besagter optischen Struktur um einen Probenträger für die Massenspektrometrie handelt, wobei die nachzuweisenden Analytmoleküle, vorzugsweise Moleküle höheren Molekulargewichts, insbesondere natürliche und künstliche Polymeren bzw. biologische Moleküle wie Proteine, Polypeptide und Nukleinsäuren, eingebettet sind in eine Matrix photoreaktiver Moleküle, aus der sie mittels Multi-Photonen-Anregung besagter photoreaktiver Moleküle dissoziiert bzw. desorbiert werden können.
Eine bevorzugte Ausführungsform ist ein Verfahren zur Lumineszenzanregung, unter Verwendung einer erfindungsgemässen optischen Struktur und / oder eines erfindungsgemässen optischen und / oder eines erfindungsgemässen analytischen Systems, jeweils nach einer der vorgenannten Ausführungsformen, dadurch gekennzeichnet, dass die Intensität eines in die wellenleitende Schicht (a) der optischen Struktur eingekoppelten und in der Schicht (a) geführten Anregungslichts auf der Schicht (a) und in der Schicht (a) ausreichend hoch ist, um auf der Oberfläche der Schicht (a) oder in einem Abstand von weniger als 200 nm zur Schicht (a) befindliche Moleküle mittels Multi-Photonen-Anregung zur Lumineszenz anzuregen. Besonders bevorzugt wird ein Verfahren zum Lumineszenznachweis eines oder mehrerer Analyten in einer oder mehreren Proben auf einem oder mehreren Messbereichen auf einer erfindungsgemässen optischen Struktur nach einem der entsprechenden Ausführungsformen zur Bestimmung einer oder mehrerer Lumineszenzen von einem Messbereich oder von einem Array aus mindestens zwei oder mehr, räumlich getrennten Messbereichen (d) oder mindestens zwei oder mehr räumlich getrennten Segmenten (d'), in die mehrere Messbereiche zusammengefasst sind, auf besagter optischer Struktur, dadurch gekennzeichnet, dass die Intensität eines in die wellenleitende Schicht (a) der optischen Struktur eingekoppelten und in der Schicht (a) geführten Anregungslichts auf der Schicht (a) und in der Schicht (a) ausreichend hoch ist, um ein auf der Oberfläche der Schicht (a) oder in einem Abstand von weniger als 200 nm zur Schicht (a) befindliches Molekül mittels Multi-Photonen-Anregung zur Lumineszenz anzuregen.
In dem erfindungsgemässen Verfahren kann die Einkopplung von Anregungslicht in die Schicht (a) über ein oder mehrere optische Einkoppelelemente aus der Gruppe erfolgen, die von Prismenkopplern, evaneszenten Kopplern mit zusammengebrachten optischen Wellenleitern mit überlappenden evaneszenten Feldern, Stirnflächenkopplern mit vor einer Stirnseite der wellenleitenden Schicht angeordneten fokussierenden Linsen, vorzugsweise Zylinderlinsen, und Gitterkopplern gebildet wird.
Es wird bevorzugt, dass die Einkopplung von Anregungslicht in die Schicht (a) über eine in der Schicht (a) modulierte Gitterstruktur (c) erfolgt.
Vorzugsweise handelt es sich bei der optischen Struktur um eine planare Dünnnschicht- Wellenleiter-Struktur.
Besonders bevorzugt wird ein Verfahren mit einer optischen Struktur umfassend einen planaren Dünnschicht- Wellenleiter, mit einer bei mindestens einer Anregungswellenlänge transparenten Schicht (a) auf einer bei mindestens dieser Anregungswellenlänge ebenfalls transparenten Schicht (b) mit niedrigerem Brechungsindex als Schicht (a) und mindestens einer in Schicht (a) modulierten Gitterstruktur (c), dadurch gekennzeichnet, dass die Intensität eines unter dem Resonanzwinkel zur Einkopplung in die Schicht (a) eingestrahlten Anregungslichts auf der Schicht (a) und in der Schicht (a) zumindest im Bereich der Gitterstruktur (c) ausreichend hoch ist, um auf der Oberfläche der Schicht (a) oder in einem Abstand von weniger als 200 nm zur Schicht (a) befindliche Moleküle mittels Multi-Photonen- Anregung anzuregen.
Es wirc bevorzugt, dass dass es sich bei der Multi-Photonen-Anregung um eine 2- Photonen- Anregung handelt.
Vorteilhaft sind solche Ausführungsformen des erfindungsgemässen Verfahrens, welche dadurch gekennzeichnet sind, dass auf der Oberfläche der Schicht (a) der optischen Struktur oder in einem Abstand von weniger als 200 nm zur Schicht (a) befindliche Moleküle linienhaft, das heisst gleichzeitig längs des in der Schicht (a) geführten Anregungslichts, mittels Multi-Photonen-Anregung angeregt werden können.
Besonders vorteilhaft sind dabei solche Ausführungsformen, welche linienhafte Multi- Photonen-Anregung von auf der Oberfläche der Schicht (a) oder in einem Abstand von weniger als 200 nm zur Schicht (a) befindlichen Molekülen längs einer Distanz von mindestens 5 mm, gerechnet vom Ort der Einkopplung des Anregungslichts in die Schicht (a), ermöglichen.
Ausserdem wird bevorzugt, dass, unter Einstrahlung eines aufgeweiteten Anregungslichts, auf der Oberfläche der Schicht (a) oder in einem Abstand von weniger als 200 nm zur Schicht (a) befindliche Moleküle gleichzeitig flächenhaft längs des in der Schicht (a) geführten Anregungslichts mittels Multi-Photonen-Anregung angeregt werden können. Dabei ist das Anregungslichtbündel im Falle der Lichteinkopplung in die Schicht (a) über eine darin modulierte Gitterstniktur (c) vorzugsweise wiedemm parallel zu den Gitterlinien aufgeweitet. Von besonderem Vorteil sind auch solche Ausführungsformen eines erfindungsgemässen Verfahrens, mit denen gleichzeitige flächenhafte Multi-Photonen-Anregung von auf der Oberfläche der Schicht (a) oder in einem Abstand von weniger als 200 nm zur Schicht (a) befindlichen Molekülen auf einer Fläche von mindestens 1 mm , stärker bevorzugt auf einer Fläche von mindestens 10 mm2, noch stärker bevorzugt auf einer Fläche von mindestens 1 cm2 möglich ist.
Dafür kann es für verschiedene Ausführungsformen des erfindungsgemässen Verfahrens vorteilhaft sein, wenn die optische Struktur, als Teil des optischen Systems, gleichförmige, unmodulierte Bereiche der Schicht (a) umfasst, welche vorzugsweise in Ausbreitungsrichtung des über eine Gitterstruktur (c) eingekoppelten und in der Schicht (a) geführten Anregungslichts angeordnet sind. Insbesondere kann es vorteilhaft sein, wenn die optische Struktur eine Vielzahl von Gitterstrukturen (c) gleicher oder unterschiedlicher Periode mit gegebenenfalls daran anschliessenden gleichförmigen, unmodulierten Bereichen der Schicht (a) auf einem gemeinsamen, durchgehenden Substrat umfasst. In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens ist das optische System dabei so gestaltet, dass eine auf oder im Nahfeld der Schicht (a) der optischen Struktur durch Multi-Photonen- Absorption erzeugte Lumineszenz mindestens teilweise in die Schicht (a) einkoppelt und durch Leitung in der Schicht (a) zu benachbarten Bereichen auf besagter optischer Struktur geführt wird.
Bei den vorgenannten Verfahren zur Lumineszenzdetektion ist es möglich, dass (1) die isotrop abgestrahlte Lumineszenz oder (2) in die optisch transparente Schicht (a) eingekoppelte und über Gitterstrukturen (c) ausgekoppelte Lumineszenz oder Lumineszenzen beider Anteile (1) und (2) gleichzeitig gemessen werden.
In dem erfindungsgemässen Verfahren kann zur Erzeugung der Lumineszenz oder Fluoreszenz ein Lumineszenz- oder Fluoreszenzlabel verwendet werden, das bei einer Wellenlänge zwischen 200 nm und 1100 nm angeregt werden kann. Bei den Lumineszenz- oder Fluoreszenzlabeln kann es sich um herkömmliche Lumineszenz- oder Fluoreszenzfarbstoffe oder auch um sogenannte lumineszente oder fluoreszente Nanopartikel, basierend auf Halbleitern (W. C. W. Chan und S. Nie, "Quantum dot bioconjugates for ultrasensitive nonisotopic detection", Science 281 (1998) 2016 - 2018) handeln. Selbstverständlich eignen sich solche Lumineszenzlabel am besten, welche bei der eingesetzten Anregungswellenlänge einen besonders grossen Multi-Photonen- Absorptionsquerschnitt, im Falle der bevorzugten 2-Photonen-Anregung einen besonders grossen 2-Photonen-Absorptionsquerschnitt, und dabei zugleich eine möglichst hohe Photostabilität aufweisen.
Es wird bevorzugt, dass besagtes Lumineszenzlabel mittels 2-Photonen- Absorption angeregt wird. Insbesondere wird dabei bevorzugt, dass besagtes Lumineszenzlabel durch 2-Photonen-Absorption eines Anregungslichts im Sichtbaren oder nahen Infraroten zu einer ultravioeletten oder blauen Lumineszenz angeregt wird.
Das Lumineszenzlabel kann an den Analyten oder in einem kompetitiven Assay an einen Analogen des Analyten oder in einem mehrstufigen Assay an einen der Bindungspartner der immobilisierten biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselementen oder an die biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselementen gebunden sein.
Zusätzlich können ein zweites oder noch weitere Lumineszenzlabel mit gleicher oder unterschiedlicher Anregungswellenlänge wie das erste Lumineszenzlabel und gleicher oder unterschiedlicher Emissionswellenlänge verwendet werden. Hierbei kann es vorteilhaft sein, wenn das zweite oder noch weitere Lumineszenzlabel bei der gleichen Wellenlänge wie das erste Lumineszenzlabel angeregt werden können, aber bei anderen Wellenlängen emittieren.
Für andere Applikationen ist es vorteilhaft, wenn die Anregungsspektren und Emissionsspektren der eingesetzten Lumineszenzlabel nur wenig oder gar nicht überlappen. In dem erfindungsgemässen Verfahren kann es weiterhin vorteilhaft sein, wenn zum Nachweis des Analyten Ladungs- oder optischer Energietransfer von einem als Donor dienenden ersten Lumineszenzlabel zu einem als Akzeptor dienenden zweiten Lumineszenzlabel verwendet wird.
Eine besondere Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens zum Lumineszenznachweis eines oder mehrerer Analyten be ht darauf, dass die Eigenfluoreszenz („Autofluoreszenz") fluoreszenzfähiger Biomoleküle, wie beispielsweise von Proteinen mit fluoreszenzfähigen Aminosäuren wie z. B. Tryptophan, Tyrosin oder Phenylalanin, welche sich auf der Oberfläche der Schicht (a) oder in einem Abstand von weniger als 200 nm zur Schicht (a) befinden, durch Multi-Photonen- Absorption (vorzugsweise 2-Photonen- Absorption) angeregt werden kann. Unter dieser Gruppe bevorzugt ist Tryptophan mit einem molaren Extinktionskoeffiezienten von ca. 5600 (L mol-1 cm-1) bei 280 nm und einer Quantenausbeute der Emission, um 360 nm, von 20 %. Typischerweise ist daher eine Anregung der Tryptophan-Fluoreszenz in einem klassischen Ein-Photonen-Absorptionsprozess im evaneszenten Feld eines hochbrechenden Wellenleiters nicht möglich, da Anregungslicht einer so kurzen Wellenlänge im Wellenleiter nicht über signifikante Entfernungen geführt, sondern absorbiert oder ausgestreut wird. Oft ist es auch nicht möglich, derart kurwelliges Anregungslicht an den Wellenleiter heranzuführen, beispielsweise dann nicht, wenn zuvor ein bei dieser Wellenlänge absorbierendes Material (wie beispielsweise die meisten Kunststoffe) durchstrahlt werden muss. Dem erfindungsgemässen Verfahren folgend, ist es jedoch möglich, für einen Multi-Photonen-Absorptionsprozess Anregungslicht geeigneter längerer Wellenlänge zu verwenden, welches in der wellenleitenden Schicht (a) über längere Strecken geführt wird, und damit die kurzwellige Fluoreszenz anzuregen. Ein besonderer Vorteil dieser Variante des Verfahrens ist, dass sich damit die chemische Verknüpfung des Analyten, oder eines seiner Bindungspartner in einem Nachweisverfahren, mit einem Lumineszenzlabel erübrigt. Stattdessen kann der Nachweis direkt auf der Detektion lumineszenzfähiger biologischer Verbindungen beruhen, welche als natürlicher Bestandteil dieser Verbindungen vorliegen oder, z. B. durch Punktmutationen einzelner Aminosäuren in einem biologischen Erzeugungsprozess in den Analyten oder einen seiner Bindungspartner eingebaut werden.
Für diese besondere Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens gibt es wiederum zahlreiche mögliche Untervarianten. Beispielsweise können die zum Analytnachweis immobilisierten biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselemente so ausgewählt sein, dass sie keine oder nur möglichst geringe Eigenlumineszenz durch Multi-Photonen-Anregung aufweisen (unter den jeweiligen Versuchsbedingungen). Damit ist es möglich, ein möglichst niedriges Hintergrundsignal beim Schritt des Analytnachweises durch eine Lumineszenzanregung mittels Multiphotonen- Absorption des Analyten selbst oder eines der im Nachweisverfahren eingesetzten Bindungspartners zu erhalten. Eine andere vorteilhafte Ausführungsform bemht darauf, mithilfe einer in einem Multi-Photonen- Absorptionsprozess angeregten Eigenlumineszenz (Eigen- oder Auto-Fluoreszenz) der immobilisierten biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselemente deren Immobilisierungsdichte in den Messbereichen zu bestimmen. Damit ist es möglich, das im Analytnachweisschritt (durch Multi-Photonen- Absorption oder auch Ein-Photonen-Absorption) angeregte Lumineszenzsignal des Analyten oder eines seiner Bindungspartner bezüglich der Anzahl oder Dichte der verfügbaren Bindungsstellen zu korrigieren bzw. zu normieren.
Insbesondere kann bei geeigneten Absorptionsspektren der Analyten bzw. derer Bindungspartner sowie der immobilisierten Erkennungselemente für die Ein- bzw. MultiPhotonen-Absorption ein- und derselbe Laser zur (gleichzeitigen oder sequentiellen) EinPhotonen-Anregung und einer Multi-Photonen-Anregung von Lumineszenz eingesetzt werden, wobei im Falle einer sequentiellen solchen Anregung deren bevorzugte Reihenfolge in Abhängigkeit von der jeweiligen Applikation unterschiedlich sein kann.
Bei sehr hoher Energiedichte an der Oberfläche der Schicht (a) und unter Bereitstellung von Luminophoren mit geeigneten Absorptionsquerschnitten ist es vorstellbar, dass eine Lumineszenzanregung gleichzeitig bei bis zu drei verschiedenen Wellenlängen stattfindet, beispielsweise nit einem Laser mit 1064 nm Emissionswellenlänge Anregung eines NIR-Farbstoffs durch Ein-Photonen-Absorption, Anregung eines Farbstoffs im Sichtbaren (etwa 532 nm) durch Zwei-Photonen- Absorption und eines UV-Farbstoffs durch Drei-Photonen- Absorption (bei etwa 355 nm). Entsprechende Wellenlängen bei Einsatz eines Lasers mit Emission bei 780 nm wären 390 nm für die Zwei-Photonen- Absorption und 260 nm für die Drei-Photonen- Absorption.
Das erfindungsgemässe Verfahren der Multi-Photonen-Anregung kann also mit einem einem gleichzeitigen oder entsprechend sequentiell durchzuführenden Lumineszenznachweis der Emission von lumineszenzfähigen Molekülen, welche in einem Ein-Photonen- Absorptionsprozess bei der eingestrahlten Anregungswellenlänge angeregt werden können, kombiniert werden.
Zusätzlich kann es von Vorteil sein, wenn die einen oder mehreren Lumineszenzen und / oder Bestimmungen von Lichtsignalen bei der Anregungswellenlänge polarisationsselektiv vorgenommen werden. Weiterhin erlaubt das Verfahren die Möglichkeit, dass die einen oder mehreren Lumineszenzen bei einer anderen Polarisation als der des Anregungslichts gemessen werden.
Weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens mit einem analytischen System zum Lumineszenznachweis eines oder mehrerer Analyten, mittels Lumineszenzanregung des Analyten oder eines seiner Bindungspartner (nach Ein- oder Multi-Photonen-Anregung), in mindestens einer Probe auf einem oder mehreren Messbereichen auf einer optischen Struktur, umfassend einen optischen Wellenleiter (vorzugsweise einen Dünnschichtwellenleiter), mit
- einer erfindungsgemässen optischen Struktur
- einem erfindungsgemässen optischen System
- Zufühmngsmitteln, um die eine oder mehrere Proben mit den Messbereichen auf der optischen Struktur in Kontakt zu bringen
- einem oder mehreren Probenbehältnissen zur Aufnahme der einen oder mehreren Proben und gegebenenfalls zusätzlicher Reagentien sowie
- Mitteln zur Entfernung der in den Probenbehältnissen enthaltenen Flüssigkeit, dadurch gekennzeichnet, dass nach dem Nachweis der Bindung eines oder mehrerer Analyten in einem oder mehreren Messbereichen der von diesem Analyten mit dem betreffenden immobilisierten Erkennungselement und gegebenenfalls weiteren Bindungspartnern gebildete Molekülkomplex mittels Photodissoziation nach Multi- Photonen-Anregung aufgespalten oder von der optischen Struktur abgespalten werden kann und besagter Molekülkomplex als ganzer oder in Teilen, nach Elution aus dem betreffenden Probenbehältnis, einer weiteren analytischen oder präparativen Behandlung zugeführt werden kann.
Eine spezielle Variante des erfindungsgemässen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass während der Multi-Photonen-Anregung von an der Oberfläche der Schicht (a) oder innerhalb eines Abstandes von weniger als 200 nm von der Schicht (a) befindliche Moleküle innerhalb dieses Abstandes gefangen gehalten werden, indem die oberflächennahe hohe Anregungsintensität und deren ansteigender Gradient in Richtung der Oberfläche auf diese Moleküle den Effekt einer „optischen Pinzette" („optical tweezers") ausübt.
Das erfindungsgemässe Verfahren nach einer der voranstehenden Ausfuhrungsformen ermöglicht eine gleichzeitige und / oder sequentielle, quantitative und / oder qualitative Bestimmung eines oder mehrerer Analyten aus der G ppe von Antikörpern oder Antigenen, Rezeptoren oder Liganden, Chelatoren oder 'Ηistidin-Tag-Komponenten", Oligonukleotiden, DNA- oder RNA-Strängen, DNA- oder RNA- Analoga, Enzymen, Enymcofaktoren oder Inhibitoren, Lektinen und Kohlehydraten.
Die zu untersuchenden Proben können natürlich vorkommende KörperfTüssigkeiten wie Blut, Serum, Plasma, Lymphe oder Urin oder Eigelb sein.
Eine zu untersuchende Probe kann aber auch eine optisch trübe Flüssigkeit, Oberflächenwasser, ein Boden- oder Pflanzenextrakt, eine Bio- oder Syntheseprozessbrühe sein. Die zu untersuchenden Proben können auch aus biologischen Gewebeteilen entnommen sein.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung Verwendung einer erfindungsgemässen optischen Struktur und / oder eines erfindungsgemässen optischen Systems und / eines erfindungsgemässen analytischen Systems und / oder eines erfindungsgemässen Verfahrens, jeweils nach einer der vorgenannten Ausführungsformen, zu quantitativen und / oder qualitativen Analysen zur Bestimmung chemischer, biochemischer oder biologischer Analyten in Screeningverfahren in der Pharmaforschung, der Kombinatorischen Chemie, der Klinischen und Präklinischen Entwicklung, zu Echtzeitbindungsstudien und zur Bestimmung kinetischer Parameter im Affihitätsscreening und in der Forschung, zu qualitativen und quantitativen Analytbestimmungen, insbesondere für die DNA- und RNA- Analytik, für die Erstellung von Toxizitätsstudien sowie für die Bestimmung von Expressionsprofilen sowie zum Nachweis von Antikörpern, Antigenen, Pathogenen oder Bakterien in der pharmazeutischen Protduktentwicklung und Forschung, der Human- und Veterinärdiagnostik, der Agrochemischen Produktentwicklung und Forschung, der symptomatischen und präsymptomatischen Pflanzendiagnostik, zur Patientenstratifikation in der pharmazeutischehn Produktentwicklung und für die therapeutische Medikamentenauswahl, zum Nachweis von Pathogenen, Schadstoffen und Erregern, insbesondere von Salmonellen, Prionen und Bakterien, in der Lebensmittel- und Umweltanalytik.
Weiterer Gegenstand dieser Erfindung ist die Verwendung einer erfindungsgemässen optischen Struktur und / oder eines erfindungsgemässen optischen Systems und / oder eines erfindungsgemässen Verfahrens in der nichtlinearen Optik oder in der Telekommunikation oder der Nachrichtentechnik.
Ganz allgemein eignen sich eine erfindungsgemässe optische Struktur und / oder ein erfindungsgemässes optisches System und / oder ein erfindungsgemässes analytisches System und / oder ein erfindungsgemässes Verfahren ausserdem für oberflächengebundene Untersuchungen, welche den Einsatz sehr hoher Anregungslichtintensitäten und / oder Anregungsdauern erfordern, wie beispielsweise Studien zur Photostabilität von Materialien, photokatalytische Prozesse etc.
Mit dem nachfolgenden Ausfühmngsbeispiel soll die Erfindung genauer erläutert und demonstriert werden, ohne dass durch die dargestellten spezifischen Ausführangsformen die Allgemeinheit der Erfindung eingeschränkt werden soll.
Es zeigen
Fig. 1 eine Kamera- Aufnahme einer mit blossem Auge sichtbaren, mithilfe einer erfindungsgemässen optischen Struktur erzeugten Fluoreszenz nach 2-Photonen-
Anregung;
Fig. 2 und Fig. 3 Querschnittsprofile der durch 2-Photonen- Anregung erzeugten Fluoreszenz, nach Anregung durch unterschiedlich stark kollimierte Amegungslichtstrahlen;
Fig. 4 das Querschnittsprofil der durch 2-Photonen-Anregung erzeugten Fluoreszenz, nach Anregung durch den parallel zu den Gitterlinien der optischen Struktur aufgeweiteten Anregungslichtstrahl;
Fig. 5 die quadratische Abhängigkeit der gemessenen Fluoreszenzintensität von der Anregungslichtintensität. Beispiel 1:
1. Optische Struktur zur 2-Photonen-Anregung
Die optische Struktur besteht aus einem Glassubstrat (AF45-Glas als optische Schicht (b), n = 1.496 bei 800 nm) mit einer darauf aufgebrachten 150 nm dünnen Schicht (b) aus Tantalpentoxid (wellenleitende Schicht (a), n = 2.092 bei 800 nm). Zur Ein- und Auskopplung von Licht in bzw. aus der wellenleitenden Schicht (a) dienen im Abstand von 9 mm in der Schicht (a) erzeugte Koppelgitter in der Form von Reliefgittern (Gitterperiode 360 nm, Gittertiefe 12 nm). Unter diesen Bedingungen beträgt der Einkoppelwinkel vom Glassubstrat (optische Schicht (b), n = 1.496 bei 810 nm) zur wellenleitenden Schicht (a) -20.4°; der äussere Einstrahlwinkel auf die Schicht (b) (gemessen zur Normalen der optischen Struktur) beträgt -31.4°.
Zur Erzeugung und Demonstration der Eignung dieser optischen Struktur für eine 2- Photonen- Anregung werden zwischen zwei Gitterstrukturen auf der Schicht (a) 1 Tropfen von je 0.5 μl einer Rhodamin-Lösung (15.9 μM Rhodamin B in Ethanol) aufgebracht, so dass die Rhodamin-Moleküle als Beispiel für lumineszenzfähige Moleküle nach Verdampfen des Ethanol auf der Schicht (a) verbleiben.
2. Optisches System zur 2-Photonen-Anregung, Messverfahren zur 2-Photonen- Anregung und dessen Ergebnisse
Als Anregungslichtquelle dient ein gepulster Titan-Sapphir-Laser mit Emission bei ca. 800 nm (Pulslänge: 100 fsec, Repetitionsrate: 80 MHz, eingesetzte mittlere Leistung: bis 0.6 W, spektrale Pulsbreite: 8 nm). Die Intensität des vom Laser ausgestrahlten Anregungslichts kann mit einem elektrooptischen Modulator kontinuierlich zwischen 0 % und 100 % der Ausgangsleistung reguliert werden; sie kann auch computergesteuert in diesem Bereich herauf- oder heruntergefahren werden. Nach dem elektrooptischen Modulator können im Anregungsstrahlengang (in Richtung der optischen Struktur) Linsen eingesetzt werden, um auf dem Einkoppelgitter (c) der optischen Struktur parallel eingestrahlte Anregungslichtbündel gewünschter Geometrie zu erzeugen. Das eingestrahlte Anregungslicht wird über einen Spiegel umgelenkt auf das Einkoppelgitter (c) der optischen Struktur, welche auf einem Justierelement montiert ist, welches Translation in x- y- und z-Richtung (parallel und in den Achsen senkrecht zu den Gitterlinien) und Rotation (mit Drehachse, übereinstimmend mit den Gitterlinien des Einkoppelgitters) erlaubt.
Zunächst wird, bei einer eingestrahlten Durchschnittsleistung von 0.4 W, ein kollimierter Strahl unter dem Resonanzwinkel zur Einkopplung auf das Einkoppelgitter geleitet. Dazu wird der Strahl mit einer Linse (f = 12.7 cm) leicht fokussiert, mit dem Einkoppelgitter (Ebene der optischen Struktur) im „beam waste", so dass das Anregungslicht dort als eine ebene Welle auftrifft. Überraschenderweise wird, längs des in der optischen Struktur geführten Modes, im Bereich des immobilisierten Lumineszenz-Farbstoffs, eine so starke 2-Photonen-Fluoreszenz angeregt, dass sie sogar bei Raumlicht mit blossem Auge beobachtbar ist. (Fig. 1, aufgenommen ohne Filter). Der Bildausschnitt zeigt die Halterung mit der darin montierten optischen Struktur. Der linke helle Lichtfleck markiert die Einkoppelposition des Anregungslichts auf dem Einkoppelgitter. Da dieses Bild ohne jegliche Filter aufgenommen wurde, ist die Intensität des am Gitter gestreuten Anregungslichts stark genug, dass es von der Kamera trotz abnehmender Empfindlichkeit bei langen Wellenlängen noch aufgezeichnet wird. Der eingekoppelte Mode (bei einer Wellenlänge von 800 nm) breitet sich in der Bildebene von links nach rechts aus. Bis zum Erreichen des Gebietes, in dem der Rhodamin-Farbstoff immobilisiert ist, ist der geführte Mode unsichtbar. In Mode- Ausbreitungsrichtung folgend, nach rechts, ist dann deutlich die mittels 2-Photonen-Anregung erzeugte Fluoreszenz des Rhodamin-Farbstoffs zu erkennen. Die zu beobachtende Lichtspur entspricht einer Länge von ca. 8 mm, bis zur nächsten Gitterstruktur, an der das geführte Anregungslicht wieder ausgekoppelt wird. Eine signifikante Abschwächung des geführten Lichts bzw. der angeregten 2-Photonen- Fluoreszenz ist längs der gesamten Distanz nicht erkennbar. Fig. 2 zeigt in einem Querschnitt, parallel zu den Gitterlinien, das Profil der angeregten 2-Photonen-Fluoreszenz, aufgenommen mit einem IR-blockierenden Filter (BG 39) vor einer CCD-Kamera als Detektor. Das Anregungsstrahlprofil auf dem Gitter war auf eine theoretische Breite von ca. 100 μm eingestellt, was gut mit der gemessenen Halbwertsbreite der Fluoreszenzspur (100 μm) übereinstimmt. In diesem Beispiel konnte also linienhaft über eine Strecke von 8 mm (auf einer Fläche von etwa 2 mm2, bei Zugrundelegung der Basisbreite des Fluoreszenzprofils, mittels 2-Photonen-Anregung Fluoreszenz erzeugt werden. Es ist zu beachten, dass die Ausbreitungslänge des geführten Anregungslichts und damit die Anregungsstrecke für die 2-Photonen-Anregung lediglich durch das Auskoppelgitter begrenzt ist.
Fig. 3 zeigt ein entsprechendes Fluoreszenzprofil für den direkt, ohne weitere strahlformende Linsen, eingestrahlten Laserstrahl. In diesem Fall beträgt die Halbwertsbreite des Fluoreszenzprofils ca. 360 μm, die Basisbreite ca. 800 μm, entsprechend einer (längs des Moden-Laufweges von 8 mm) auf einer Gesamtfläche von ca. 6 mm2 mit 2-Photonen- Anregung erzeugten Fluoreszenz.
In einem weiteren Schritt wird dann der Laserstrahl mit einer Zylinderlinse (f = 40 mm) parallel zu den Gitterlinien aufgeweitet. Aus dem entsprechenden Fluoreszenzprofil (Fig. 4) ergeben sich eine Halbwertsbreite von ca. 1.7 mm und eine Basisbreite von ca. 3 mm, entsprechend einer flächenhaft auf mehr als 20 mm2 mittels 2-Photonen- Anregung erzeugten Fluoreszenz.
Ein wichtiges Kriterium zur zweifelsfreien Zurückfühmng einer angeregten Fluoreszenz auf 2-Photonen- Anregung ist die quadratische Abhängigkeit ihrer Intensität von der eingestrahlten Anregungsintensität. Dazu wird, anstelle der CCD-Kamera, eine Si- Photodiode, verbunden mit einem Lock-in- Verstärker (Chopper-Frequenz: 2 kHz), als Detektor verwendet. Die isotrop abgestrahlte, mittels 2-Photonen- Anregung im evaneszenten Feld der Wellenleiter-Struktur erzeugte Fluoreszenz wird mit einer Linse auf besagte Photodiode, vor der sich wiedemm ein IR-blockierender Filter (BG 39) befindet, fokussiert. Mithilfe des computergesteuerten elektrooptischen Modulators wird die auf die optische Struktur eingestrahlte Anregungsintensität in Inkrementen von ca. 6 mW von 0 auf nahe 300 mW (eingestrahlte Durchschnittsleistung) erhöht und jeweils die erzeugte Fluoreszenzintensität gemessen. Fig. 5 zeigt die gemessenen Fluoreszenzsintensitäten und - als durchgezogene Linie - eine Kurvenanpassung der Intensität nach der Gleichung y = ax2 (mit y entsprechend der Fluoreszenzintensität, x entsprechend der Anregungsintensität, a entsprechend einem Fitparameter). Es zeigt sich überraschenderweise eine perfekte quadratische Abhängigkeit der gemessenen Fluoreszenzintensität von der Anregungslichtintensität, ohne jeglichen Offset, welcher einem zusätzlichen Hintergrandsignal entsprechen würde. Damit demonstriert dieses Beispiel, dass die gemessene Fluoreszenz eindeutig auf 2-Photonen- Anregung zurückzuführen ist und diese, unter diesen Versuchsbedingungen, frei von Hintergrandsignalen, angeregt werden kann.
Beispiel 2: Weiteres optisches System zur 2-Photonen- Anregung
Als Anregungslichtquelle dient eine Hochleistungslaserdiode mit Emissionswellenlänge 810 nm (fasergekoppelt, 10 W). Mit einer nach der Faser angeordneten Strahlformungsoptik wird ein paralleles Anregungsstrahlenbündel gewünschter Form erzeugt und unter dem Koppelwinkel für die Einkopplung in die wellenleitende Schicht (a) der optischen Struktur auf das Gitter (Periode 360 nm, Gittertiefe 12 nm) eingestrahlt. Der Einkoppel winkel im Glassubstrat (optische Schicht (b), n = 1.496 bei 810 nm) beträgt -21.7° (beim Übergang des Lichts von der Schicht (b) zur Schicht (a)); der äussere Einstrahl winkel beträgt -34.1°. Die wellenleitende Schicht (a) beträgt 150 nm Tantalpentoxid (n = 2.09 bei 810 nm). Mit diesen Parametern kann ein Anteil von 24 % in die Schicht (a) eingekoppelt werden, und die Anregungsintensität an der Oberfläche der Schicht (a) ist ausreichend für eine 2-Photonen-Anregung.

Claims

Patentansprüche
1. Optische Struktur, umfassend einen optischen Wellenleiter, mit einer bei mindestens einer Anregungswellenlänge transparenten, wellenleitenden Schicht (a), dadurch gekennzeichnet, dass die Intensität eines in die Schicht (a) eingekoppelten und in der Schicht (a) geführten Anregungslichts auf der Schicht (a) ausreichend hoch ist, um auf der Oberfläche der Schicht (a) oder in einem Abstand von weniger als 200 nm zur Schicht (a) befindliche Moleküle oder molekulare Gruppen mittels Multi-Photonen- Anregung anzuregen.
2. Optische Struktur nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem optischen Wellenleiter um einen optischen Dünnschichtwellenleiter handelt, mit einer bei mindestens einer Anregungswellenlänge transparenten, wellenleitenden Schicht (a) auf einer bei mindestens dieser Anregungswellenlänge ebenfalls transparenten Schicht (b) mit niedrigerem Brechungsindex als Schicht (a).
3. Optische Struktur nach einem der Ansprüche 1 - 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den auf der Oberfläche der Schicht (a) oder in einem Abstand von weniger als 200 nm zur Schicht (a) durch Multi-Photonen-Anregung angeregten Molekülen um photoreaktive, d.h. nach Lichtanregung chemisch reaktive Moleküle oder molekulare Gruppen handelt.
4. Optische Struktur nach Ansprach 3, dadurch gekennzeichnet, dass durch die Multi- Photonen-Anregung besagter photoreaktiver Moleküle auf der Schicht (a) oder in einem Abstand von weniger als 200 nm zur Schicht (a) befindlicher Moleküle eine Photopolymerisation ausgelöst wird.
5. Optische Struktur nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass durch die Multi- Photonen-Anregung besagter photoreaktiver Moleküle auf der Schicht (a) oder in einem Abstand von weniger als 200 nm zur Schicht (a) befindlicher Moleküle eine Photodissoziation, d.h. Aufspaltung eines bis zu der Multi-Photonen-Anregung bestehenden Moleküls oder molekularen Komplexes auf der Schicht (a) oder in einem Abstand von weniger als 200 nm zu der Schicht (a) ausgelöst wird.
6. Optische Struktur nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass besagte photoreaktive Moleküle Bestandteil einer Molekülmatrix zur Einbettung von Molekülen höheren Molekulargewichts, insbesondere von natürlichen und künstlichen Polymeren bzw. von biologischen Molekülen wie Proteinen, Polypeptiden. und Nukleinsäuren, sind.
7. Optische Struktur nach Ansprach 6, dadurch gekennzeichnet, dass es sich hierbei um einen Probenträger für die Massenspektrometrie, vorzugsweise für MALDI/TOF-MS (matrix-assisted laser desorption / ionization time-of-flight mass spectrometry) handelt.
8. Optische Struktur nach einem der Ansprüche 1 - 7, umfassend einen optischen Dünnschicht- Wellenleiter, mit einer bei mindestens einer Anregungswellenlänge transparenten, wellenleitenden Schicht (a) auf einer bei mindestens dieser Anregungs Wellenlänge ebenfalls transparenten Schicht (b) mit niedrigerem Brechungsindex als Schicht (a), dadurch gekennzeichnet, dass die Intensität eines in die Schicht (a) eingekoppelten und in der Schicht (a) geführten Anregungslichts auf der Schicht (a) und in der Schicht (a) ausreichend hoch ist, um auf der Oberfläche der Schicht (a) oder in einem Abstand von weniger als 200 nm zur Schicht (a) befindliche Moleküle mittels Multi-Photonen-Anregung zur Lumineszenz anzuregen.
9. Optische Struktur nach einem der Ansprüche 1 - 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Einkopplung von Anregungslicht in die Schicht (a) über ein oder mehrere optische Einkoppelelemente aus der Gruppe erfolgt, die von Prismenkopplern, evaneszenten Kopplern mit zusammengebrachten optischen Wellenleitern mit überlappenden evaneszenten Feldern, Stirnflächenkopplern mit vor einer Stirnseite der wellenleitenden Schicht angeordneten fokussierenden Linsen, vorzugsweise Zylinderlinsen, und Gitterkopplern gebildet wird.
10. Optische Struktur nach Ansprach 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Einkopplung von Anregungslicht in die Schicht (a) über eine in der Schicht (a) modulierte Gitterstraktur (c) erfolgt.
11. Optische Struktur nach einem der Ansprüche 1 - 10, dadurch gekennzeichnet, dass es sich hierbei um eine planare Dünnschicht- Wellenleiter-Struktur handelt.
12. Optische Struktur nach Ansprach 11, umfassend einen planaren Dünnschicht- Wellenleiter, mit einer bei mindestens einer Anregungswellenlänge transparenten Schicht (a) auf einer bei mindestens dieser Anregungswellenlänge ebenfalls transparenten Schicht (b) mit niedrigerem Brechungsindex als Schicht (a) und mindestens einer in Schicht (a) modulierten Gitterstruktur (c), dadurch gekennzeichnet, dass die Intensität eines unter dem Resonanzwinkel zur Einkopplung in die Schicht (a) eingestrahlten Anregungslichts auf der Schicht (a) und in der Schicht (a) zumindest im Bereich der Gitterstruktur (c) ausreichend hoch ist, um auf der Oberfläche der Schicht (a) oder in einem Abstand von weniger als 200 nm zur Schicht (a) befindliche Moleküle mittels Multi-Photonen-Anregung anzuregen.
13. Optische Struktur nach einem der Ansprüche 1 - 12, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Multi-Photonen-Anregung um eine 2-Photonen- Anregung handelt.
14. Optische Struktur nach einem der Ansprüche 1 - 13, dadurch gekennzeichnet, dass sie es ermöglicht, auf der Oberfläche der Schicht (a) oder in einem Abstand von weniger als 200 nm zur Schicht (a) befindliche Moleküle linienhaft, das heisst gleichzeitig längs des in der Schicht (a) geführten Anregungslichts, mittels Multi- Photonen-Anregung anzuregen.
15. Optische Struktur nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass sie linienhafte Multi-Photonen-Anregung von auf der Oberfläche der Schicht (a) oder in einem Abstand von weniger als 200 nm zur Schicht (a) befindlichen Molekülen längs einer Distanz von mindestens 5 mm, gerechnet vom Ort der Einkopplung des Anregungslichts in die Schicht (a), ermöglicht.
16. Optische Struktur nach einem der Ansprüche 1 - 15, dadurch gekennzeichnet, dass sie es ermöglicht, unter Einstrahlung eines aufgeweiteten Anregungslichts, auf der Oberfläche der Schicht (a) oder in einem Abstand von weniger als 200 nm zur Schicht (a) befindliche Moleküle gleichzeitig flächenhaft längs des in der Schicht (a) geführten Anregungslichts mittels Multi-Photonen-Anregung anzuregen.
17. Optische Struktur nach einem der Ansprüche 1 - 16, dadurch gekennzeichnet, dass sie gleichzeitige flächenhafte Multi-Photonen-Anregung von auf der Oberfläche der Schicht (a) oder in einem Abstand von weniger als 200 nm zur Schicht (a) befindlichen Molekülen auf einer Fläche von mindestens 1 mm2 ermöglicht.
18. Optische Struktur nach einem der Ansprüche 1 - 16, dadurch gekennzeichnet, dass sie gleichzeitige flächenhafte Multi-Photonen-Anregung von auf der Oberfläche der Schicht (a) oder in einem Abstand von weniger als 200 nm zur Schicht (a) befindlichen Molekülen auf einer Fläche von mindestens 10 mm2 ermöglicht.
19. Optische Struktur nach einem der Ansprüche 1 - 16, dadurch gekennzeichnet, dass sie gleichzeitige flächenhafte Multi-Photonen-Anregung von auf der Oberfläche der Schicht (a) oder in einem Abstand von weniger als 200 nm zur Schicht (a) befindlichen Molekülen auf einer Fläche von mindestens 1 cm2 ermöglicht.
20. Optische Struktur nach einem der Ansprüche 10 - 19, dadurch gekennzeichnet, dass sie gleichförmige, unmodulierte Bereiche der Schicht (a) umfasst, welche vorzugsweise in Ausbreitungsrichtung des über eine Gitterstraktur (c) eingekoppelten und in der Schicht (a) geführten Anregungslichts angeordnet sind.
21. Optische Struktur nach einem der Ansprüche 10 - 20, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Vielzahl von Gitterstrakturen (c) gleicher oder unterschiedlicher Periode mit optional daran anschliessenden gleichförmigen, unmodulierten Bereichen der Schicht (a) auf einem gemeinsamen, durchgehenden Substrat umfasst.
22. Optische Struktur nach einem der Ansprüche 8 - 21, dadurch gekennzeichnet, dass eine auf oder im Nahfeld der Schicht (a) durch Multi-Photonen-Anregung erzeugte Lumineszenz mindestens teilweise in die Schicht (a) einkoppelt und durch Leitung in der Schicht (a) zu benachbarten Bereichen auf besagter optischer Struktur geführt wird.
23. Optische Struktur nach einem der Ansprüche 12 - 22, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Überlagerung von 2 oder mehreren Gitterstmkturen unterschiedlicher Periodizität mit zueinander paralleler oder nicht paralleler, vorzugsweise nicht paralleler Ausrichtung der Gitterlinien umfasst, welche der Einkopplung von Anregungslicht unterschiedlicher Wellenlänge dient, wobei im Falle von 2 überlagerten Gitterstmkturen deren Gitterlinien vorzugsweise senkrecht zueinander ausgerichtet sind.
24. Optische Struktur nach einem der Ansprüche 2 - 23, dadurch gekennzeichnet, dass sich zwischen den optisch transparenten Schichten (a) und (b) und in Kontakt mit Schicht (a) eine weitere optisch transparente Schicht (b') mit niedrigerem Brechungsindex als dem der Schicht (a) und einer Stärke von 5 nm - 10 000 nm, vorzugsweise von 10 nm - 1000 nm, befindet.
25. Optische Struktur nach einem der Ansprüche 10 - 22 oder 24, dadurch gekennzeichnet, dass die Gitterstruktur (c) ein diffraktives Gitter mit einer einheitlichen Periode oder ein multidiffraktives Gitter ist.
26. Optische Struktur nach einem der Ansprüche 10 - 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Gitterstruktur (c) eine senkrecht oder parallel zur Ausbreitungsrichtung des in die optisch transparente Schicht (a) eingekoppelten Anregungslichts räumlich variierende Periodiziät aufweist.
27. Optische Struktur nach einem der Ansprüche 1 - 26, dadurch gekennzeichnet, dass das Material der optisch transparenten Schicht (a) aus Glas, Quarz oder einem transparenten Kunststoff besteht, beispielsweise aus der Gruppe, welche Polycarbonat, Polyamid, Polyimid, Polymethylmethacrylat, Polypropylen, Polystyrol, Polyethylen, Polyacrylsäure, Polyacrylester, Polythioester, Polyphenylensulfid Polyethylenterephthalat (PET) und Polyurethan sowie deren Derivate umfasst.
28. Optische Struktur nach einem der Ansprüche 1 - 27, dadurch gekennzeichnet, dass die optisch transparente Schicht (a) ein Material aus der Gruppe von TiO2, ZnO, Nb2Os, Ta2O5, HfO2, oder ZrO , besonders bevorzugt aus TiO2 oder Nb2O5 oder Ta O5, umfasst.
29. Optische Struktur nach einem der Ansprüche 1 - 28, dadurch gekennzeichnet, dass der Brechungsindex der optisch transparenten Schicht (a) grösser als 1.8 ist.
30. Optische Struktur nach einem der Ansprüche 1 - 29, dadurch gekennzeichnet, dass die optisch transparente Schicht (a) selbsttragend ist.
31. Optische Struktur nach einem der Ansprüche 1 - 29, dadurch gekennzeichnet, dass die optisch transparente Schicht (a) ein niedermodaler Wellenleiter ist, d.h. weniger als die ersten 10 Moden einer vorgegebenen Polarisation einer eingestrahlten Anregungswellenlänge führen kann.
32. Optische Struktur nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, dass die optisch transparente Schicht (a) ein niedermodaler Wellenleiter ist, welcher nur 1 - 3 Moden einer vorgegebenen Polarisation einer eingestrahlten Anregungswellenlänge führen kann.
33. Optische Struktur nach einem der Ansprüche 2 - 32, dadurch gekennzeichnet, dass das Material der optisch transparenten Schicht (b) aus Glas, Quarz oder einem transparenten thermoplastischen oder spritzbaren Kunststoff, beispielsweise aus der Gruppe besteht, die von Polycarbonat, Polyimid, Polymethylmethacrylat, Polypropylen, Polystyrol, Polyethylen, Polyethylenterephthalat (PET) oder Polyurethan gebildet wird.
34. Optische-Straktur nach einem der Anspruch 1 - 33, dadurch gekennzeichnet, dass das Produkt aus der Dicke der Schicht (a) und ihrem Brechungsindex ein Zehntel bis ein Ganzes, bevorzugt ein Zehntel bis zwei Drittel, der Anregungswellenlänge eines in die Schicht (a) einzukoppelnden Anregungslichts beträgt.
35. Optische Struktur nach einem der Ansprüche 10 - 34, dadurch gekennzeichnet, dass in der Schicht (a) modulierte Gitterstrukturen (c) eine Periode von 200 nm - 1000 nm aufweisen und ihre Modulations tiefe 3 bis 100 nm, bevorzugt 10 bis 30 nm beträgt.
36. Optische Struktur nach einem der Ansprüche 10 - 35, dadurch gekennzeichnet, dass das Verhältnis von Modulationstiefe zur Dicke der ersten optisch transparenten Schicht (a) gleich oder kleiner als 0,2 ist.
37. Optische Struktur nach einem der Ansprüche 10 - 36, dadurch gekennzeichnet, dass die Gitterstruktur (c) ein Reliefgitter mit Rechteck-, Dreieck- oder halbkreisförmigem Profil oder ein Phasen- oder Volumengitter mit einer periodischen Modulation des Brechungsindex in der im wesentlichen planaren optisch transparenten Schicht (a) ist.
38. Optische Struktur nach einem der Ansprüche 1 - 37, dadurch gekennzeichnet, dass sie mit optisch oder mechanisch erkennbaren Markierungen zur Erleichterung der Justierung in einem optischen System und / oder zur Verbindung mit Probenbehältnissen als Teil eines analytischen Systems versehen ist.
39. Optische Struktur nach einem der Ansprüche 1 - 38, dadurch gekennzeichnet, dass zur Immobilisierung biologischer oder biochemischer oder synthetischer Erkennungselemente (e) zum Nachweis eines oder mehrerer Analyten in einer zugeführten Probe auf der optisch transparenten Schicht (a) eine Haftvermittlungsschicht (f) mit einer Stärke von vorzugsweise weniger als 200 nm, besonders bevorzugt von weniger als 20 nm aufgebracht ist, und dass die Haftvermittlungsschicht (f) vorzugsweise eine chemische Verbindung aus den Gruppen umfasst, die Silane, Epoxide, funktionalisierte, geladene oder polare Polymere und "selbstorganisierte funktionalisierte Monoschichten" umfasst.
40. Optische Struktur nach einem der Ansprüche 1 - 39, dadurch gekennzeichnet, dass räumlich getrennte Messbereiche (d) durch räumlich selektive Aufbringung von biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselementen auf besagter Wellenleiter-Straktur erzeugt werden, vorzugsweise unter Verwendung eines oder mehrerer Verfahren aus der Gruppe von Verfahren, die von "InkJet spotting, mechanischem Spotting, micro contact printing, fluidische Kontaktierung der Messbereiche mit den biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselementen durch deren Zufuhr in parallelen oder gekreuzten Mikrokanälen, unter Einwirkung von Drackunterschieden oder elektrischen oder elektromagnetischen Potentialen", gebildet wird.
41. Optische Struktur nach einem der Ansprüche 1 - 40, dadurch gekennzeichnet, dass als besagte biologische oder biochemische oder synthetische Erkennungselemente Komponenten aus der Gruppe aufgebracht werden, die von Nukleinsäuren (beispielsweise DNA, RNA, Oligonukleotiden) und Nukleinsäureanalogen (z. B. PNA), Antikörpern oder Antikörperfragmenten, Aptameren, membrangebundenen und isolierten Rezeptoren, deren Liganden, Antigenen für Antikörper, "Histidin-Tag- Komponenten", durch chemische Synthese erzeugte Kavitäten zur Aufnahme molekularer Imprints, natürlichen und künstlichen Polymeren, etc. gebildet wird, oder dass als biologische oder biochemische oder synthetische Erkennungselemente ganze Zellen oder Zellfragmente aufgebracht werden, wobei diese Erkennungselemente direkt auf der optischen Struktur oder vermittelt über eine Haftvermittlungsschicht nach Anspruch 39 auf der optischen Straktur aufgebracht werden.
42. Optische Struktur nach einem der Ansprüche 40 - 41, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen den räumlich getrennten Messbereichen (d) gegenüber dem Analyten "chemisch neutrale" Verbindungen aufgebracht sind, vorzugsweise beispielsweise bestehend aus den Gruppen, die von Albuminen, insbesondere Rinderserumalbumin oder Humanserumalbumin, nicht mit zu analysierenden Polynukleotiden hybridisierender, fragmentierter natürlicher oder synthetischer DNA, wie beispielsweise von Herings- oder Lachssperma, oder auch ungeladenen, aber hydrophilen Polymeren, wie beispielsweise Polyethylenglycole oder Dextrane, gebildet werden.
43. Optische Struktur nach einem der Ansprüche 40 - 42, dadurch gekennzeichnet, dass zwei oder mehrere räumlich getrennte Messbereiche jeweils zu Segmenten auf der optischen Straktur zusammengefasst sind und dass bevorzugt verschiedene Segmente zusätzlich durch eine aufgebrachte Berandung, welche zur fluidischen Abdichtung gegen Nachbarbereiche und / oder zu einer weiteren Verminderung optischen Übersprechens zwischen benachbarten Segmenmten beiträgt, gegeneinander abgegrenzt sind.
44. Optische Struktur nach einem der Ansprüche 40 - 43, dadurch gekennzeichnet, dass in einer 2-dimensionalen Anordnung bis zu 1 000 000 Messbereiche angeordnet sind und ein einzelner Messbereich eine Fläche von 0.001 - 6 mm2 einnimmt.
45. Optisches System zur Multi-Photonen-Anregung, umfassend mindestens eine Anregungslichtquelle und eine optische Struktur nach einem der Ansprüche 1 - 44, dadurch gekennzeichnet, dass die Intensität eines in die wellenleitende Schicht (a) der optischen Struktur eingekoppelten und in der Schicht (a) geführten Anregungslichts auf der Schicht (a) und in der Schicht (a) ausreichend hoch ist, um auf der Oberfläche der Schicht (a) oder in einem Abstand von weniger als 200 nm zur Schicht (a) befindliche Moleküle mittels Multi-Photonen-Anregung anzuregen.
46. Optisches System zur Multi-Photonen-Anregung nach Anspruch 45, dadurch gekennzeichnet, dass die Intensität eines in die wellenleitende Schicht (a) der optischen Straktur eingekoppelten und in der Schicht (a) geführten Anregungslichts auf der Schicht (a) und in der Schicht (a) ausreichend hoch ist, um auf der Oberfläche der Schicht (a) oder in einem Abstand von weniger als 200 nm zur Schicht (a) befindliche Moleküle mittels Multi-Photonen-Anregung zur Lumineszenz anzuregen.
47. Optisches System nach einem der Ansprüche 45 - 46, dadurch gekennzeichnet, dass die Einkopplung von Anregungslicht in die Schicht (a) über ein oder mehrere optische Einkoppelelemente aus der Gruppe erfolgt, die von Prismenkopplern, evaneszenten Kopplern mit zusammengebrachten optischen Wellenleitern mit überlappenden evaneszenten Feldern, Stirnflächenkopplern mit vor einer Stirnseite der wellenleitenden Schicht angeordneten fokussierenden Linsen, vorzugsweise Zylinderlinsen, und Gitterkopplern gebildet wird.
48. Optisches System nach Ansprach 47, dadurch gekennzeichnet, dass die Einkopplung von Anregungslicht in die Schicht (a) über eine in der Schicht (a) modulierte Gitterstraktur (c) erfolgt.
49. Optisches System nach einem der Ansprüche 45 - 48, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei besagter optischer Straktur um eine planare Dünnschicht- Wellenleiter- Struktur handelt.
50. Optisches System nach Ansprach 49, umfassend mindestens eine Anregungslichtquelle und eine optische Struktur nach einem der Ansprüche 10 - 44, dadurch gekennzeichnet, dass die Intensität eines unter dem Resonanzwinkel zur Einkopplung in die Schicht (a) auf eine in der Schicht (a) modulierte Gitterstraktur (c) der optischen Straktur eingestrahlten Anregungslichts auf der Schicht (a) und in der Schicht (a) zumindest im Bereich der Gitterstruktur (c) ausreichend hoch ist, um auf der Oberfläche der Schicht (a) oder in einem Abstand von weniger als 200 nm zur Schicht (a) befindliche Moleküle mittels Multi-Photonen-Anregung anzuregen.
51. Optisches System nach einem der Ansprüche 45 - 50, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Multi-Photonen-Anregung um eine 2-Photonen- Anregung handelt.
52. Optisches System nach einem der Ansprüche 45 - 51, dadurch gekennzeichnet, dass es ermöglicht, auf der Oberfläche der Schicht (a) oder in einem Abstand von weniger als 200 nm zur Schicht (a) befindliche Moleküle linienhaft, das heisst gleichzeitig längs des in der Schicht (a) geführten Anregungslichts, mittels Multi-Photonen- Anregung anzuregen.
53. Optisches System nach Ansprach 52, dadurch gekennzeichnet, dass es linienhafte Multi-Photonen-Anregung von auf der Oberfläche der Schicht (a) oder in einem Abstand von weniger als 200 nm zur Schicht (a) befindlichen Molekülen längs einer Distanz von mindestens 5 mm, gerechnet vom Ort der Einkopplung des Anregungslichts in die Schicht (a), ermöglicht.
54. Optisches System nach einem der Ansprüche 45 - 53, dadurch gekennzeichnet, dass es ermöglicht, unter Einstrahlung eines aufgeweiteten Anregungslichts, auf der Oberfläche der Schicht (a) oder in einem Abstand von weniger als 200 nm zur Schicht (a) befindliche Moleküle gleichzeitig flächenhaft längs des in der Schicht (a) geführten Anregungslichts mittels Multi-Photonen-Anregung anzuregen.
55. Optisches System nach einem der Ansprüche 45 - 54, dadurch gekennzeichnet, dass es gleichzeitige flächenhafte Multi-Photonen-Anregung von auf der Oberfläche der Schicht (a) oder in einem Abstand von weniger als 200 nm zur Schicht (a) befindlichen Molekülen auf einer Fläche von mindestens 1 mm2 ermöglicht.
56. Optisches System nach einem der Ansprüche 46 - 54, dadurch gekennzeichnet, dass eine auf oder im Nahfeld der Schicht (a) der optischen Struktur durch MultiPhotonen-Absorption erzeugte Lumineszenz mindestens teilweise in die Schicht (a) einkoppelt und durch Leitung in der Schicht (a) zu benachbarten Bereichen auf besagter optischer Struktur geführt wird.
57. Optisches System nach einem der Ansprüche 45 - 56, dadurch gekennzeichnet, dass es zusätzlich mindestens einen Detektor zur Erfassung einer oder mehrerer Lumineszenzen von der optischen Straktur umfasst.
58. Optisches System nach einem der Ansprüche 48 - 57, dadurch gekennzeichnet, dass das von der mindestens einen Anregungslichtquelle ausgesandte Anregungslicht im wesentlichen parallel ist und unter dem Resonanzwinkel zur Einkopplung in die optisch transparente Schicht (a) auf eine in der Schicht (a) modulierte Gitterstraktur (c) eingestrahlt wird.
59. Optisches System nach einem der Ansprüche 48 - 58, dadurch gekennzeichnet, dass das Anregungslicht von mindestens einer Lichtquelle mit einer Aufweitungsoptik zu einem im wesentlichen parallelen Strahlenbündel aufgeweitet wird und unter dem Resonanzwinkel zur Einkopplung in die optisch transparente Schicht (a) auf eine grossflächige in der Schicht (a) modulierte Gitterstraktur (c) eingestrahlt wird.
60. Optisches System nach einem der Ansprüche 48 - 59, dadurch gekennzeichnet, dass das Anregungslicht von der mindestens einen Lichtquelle durch ein oder, im Falle mehrerer Lichtquellen, gegebenenfalls mehrere diffraktive optische Elemente, vorzugsweise Dammann-Gitter, oder refraktive optische Elemente, vorzugsweise Mikrolinsen- Arrays, in eine Vielzahl von Einzelstrahlen möglichst gleicher Intensität der von einer gemeinsamen Lichtquelle stammenden Teilstrahlen zerlegt wird, welche jeweils im wesentlichen parallel zueinander auf Gitterstrukturen (c) unter dem Resonanzwinkel zur Einkopplung in die Schicht (a) eingestrahlt werden.
61. Optisches System nach einem der Ansprüche 45 - 60, dadurch gekennzeichnet, dass als Anregungslichtquellen zwei oder mehrere Lichtquellen mit gleicher oder unterschiedlicher Emissionswellenlänge verwendet werden.
62. Optisches System nach Ansprach 61 mit einer optischen Straktur nach Anspruch 23, dadurch gekenzeichnet, dass das Anregungslicht von 2 oder mehr Lichtquellen gleichzeitig oder sequentiell aus verschiedenen Richtungen auf eine Gitterstraktur (c) eingestrahlt und über diese in die Schicht (a) der optischen Struktur eingekoppelt wird, welche eine Überlagerung von Gitterstrukturen mit unterschiedlicher Periodizität umfasst.
63. Optisches System nach einem der Ansprüche 45 - 62, dadurch gekennzeichnet, dass zur Detektion mindestens ein ortsauflösender Detektor verwendet wird, beispielsweise aus der Gruppe, die von CCD-Kameras, CCD-Chips, Photodioden- Arrays, Avalanche-Dioden-Arrays, Multichannelplates und Vielkanal- Photomulipliern gebildet wird.
64. Optisches System nach einem der Ansprüche 45 - 63, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen der einen oder mehreren Anregungslichtquellen und der optischen Straktur nach einem der Ansprüche 1 - 44 und /oder zwischen besagter optischer Straktur und dem einen oder mehreren Detektoren optische Komponenten aus der Gruppe verwendet werden, die von Linsen oder Linsensystemen zur Formgestaltung der übertragenen Lichtbündel, planaren oder gekrümmten Spiegeln zur Umlenkung und gegebenenfalls zusätzlich zur Formgestaltung von Lichtbündeln, Prismen zur Umlenkung und gegebenenfalls zur spektralen Aufteilung von Lichtbündeln, dichroischen Spiegeln zur spektral selektiven Umlenkung von Teilen von Lichtbündeln, Neutralfiltern zur Regelung der übertragenen Lichtintensität, optischen Filtern oder Monochromatoren zur spektral selektiven Übertragung von Teilen von Lichtbündeln oder polarisationsselektiven Elementen zur Auswahl diskreter Polarisationsrichtungen des Anregungs- und / oder Lumineszenzlichts gebildet werden.
65. Optisches System nach einem der Ansprüche 46 - 64, dadurch gekenzeichnet, dass die Einstrahlung des Anregungslichts in Pulsen mit einer Dauer zwischen 1 fsec und 10 Minuten erfolgt und gegebenenfalls das Emissionslicht aus den Messbereichen zeitlich aufgelöst gemessen wird.
66. Optisches System nach einem der Ansprüche 46 - 65, dadurch gekennzeichnet, dass zur Referenzierung Lichtsignale aus der Gmppe gemessen werden, die von Anregungslicht am Ort der Lichtquellen oder nach ihrer Aufweitung oder nach ihrer Unterteilung in Teilstrahlen, Streulicht bei der Anregungswellenlänge aus dem Bereich der einen oder mehreren räumlich getrennten Messbereiche, und über die Gitterstraktur (c) neben den Messbereichen ausgekoppeltem Licht der Anregungswellenlänge gebildet werden.
67. Optisches System nach einem der Ansprüche 46 - 66, dadurch gekennzeichnet, dass die Messbereiche zur Bestimmung des Emissionslichts und eines Referenzsignals identisch sind.
68. Optisches System nach einem der Anspräche 46 - 67, dadurch gekenzeichnet, dass die Einstrahlung des Anregungslichts auf und Detektion des Emissionslichts von einem oder mehreren Messbereichen sequentiell für einzelne oder mehrere Messbereiche erfolgt.
69. Optisches System nach Ansprach 68, dadurch gekennzeichnet, dass sequentielle Anregung und Detektion unter Verwendung beweglicher optischer Komponenten erfolgt, die aus der Gruppe von Spiegeln, Umlenkprismen und dichroischen Spiegeln gebildet wird.
70. Optisches System nach Ansprach 69, dadurch gekennzeichnet, dass sequentielle Anregung und Detektion unter Verwendung eines im wesentlichen winkel- und fokusgetreuen Scanners erfolgt.
71. Optisches System nach einem der Anspräche 68 - 70, dadurch gekennzeichnet, dass die optische Straktur zwischen Schritten der sequentiellen Anregung und Detektion bewegt wird.
72. Verfahren zur Multi-Photonen-Anregung, unter Verwendung einer optischen Struktur nach einem der Ansprüche 1 - 44 und / oder eines optischen Systems nach einem der Anspräche 45 - 71, dadurch gekennzeichnet, dass die Intensität eines in die wellenleitende Schicht (a) der optischen Straktur eingekoppelten und in der Schicht (a) geführten Anregungslichts auf der Schicht (a) und in der Schicht (a) ausreichend hoch ist, um auf der Oberfläche der Schicht (a) oder in einem Abstand von weniger als 200 nm zur Schicht (a) befindliche Moleküle mittels Multi-Photonen-Anregung anzuregen.
73. Verfahren nach Ansprach 72, dadurch gekennzeichnet, dass auf der Oberfläche der Schicht (a) oder in einem Abstand von weniger als 200 nm zur Schicht (a) der optischen Struktur befindliche Moleküle photoreaktiv sind und durch Multi- Photonen-Anregung zu einer chemischen Reaktion angeregt werden.
74. Verfahren nach Ansprach 73, dadurch gekennzeichnet, dass auf der Oberfläche der Schicht (a) oder in einem Abstand von weniger als 200 nm zur Schicht (a) der optischen Straktur befindliche Moleküle durch Multi-Photonen-Anregung zu einer Bindung mit anderen Molekülen angeregt werden.
75. Verfahren nach Anspruch 74, dadurch gekennzeichnet, dass auf der Oberfläche der Schicht (a) oder in einem Abstand von weniger als 200 nm zur Schicht (a) der optischen Struktur befindliche Moleküle durch Multi-Photonen-Anregung zu einer Photopolymerisation angeregt werden.
76. Verfahren nach Ansprach 73, dadurch gekennzeichnet, dass durch die Multi- Photonen-Anregung besagter photoreaktiver Moleküle auf der Schicht (a) oder in einem Abstand von weniger als 200 nm zur Schicht (a) befindlicher Moleküle eine Photodissoziation, d.h. Aufspaltung eines bis zu der Multi-Photonen-Anregung bestehenden Moleküls oder molekularen Komplexes auf der Schicht (a) oder in einem Abstand von weniger als 200 nm zu der Schicht (a) ausgelöst wird.
77. Verfahren zur Lumineszenzanregung, unter Verwendung einer optischen Struktur nach einem der Anspräche 1 - 44 und / oder eines optischen Systems nach einem der Anspräche 45 - 71, dadurch gekennzeichnet, dass die Intensität eines in die wellenleitende Schicht (a) der optischen Struktur eingekoppelten und in der Schicht (a) geführten Anregungslichts auf der Schicht (a) und in der Schicht (a) ausreichend hoch ist, um auf der Oberfläche der Schicht (a) oder in einem Abstand von weniger als 200 nm zur Schicht (a) befindliche Moleküle mittels Multi-Photonen-Anregung zur Lumineszenz anzuregen.
78. Verfahren zum Lumineszenznachweis eines oder mehrerer Analyten in einer oder mehreren Proben auf einem oder mehreren Messbereichen auf einer optischen Straktur nach einem der Ansprüche 39 - 44 zur Bestimmung einer oder mehrerer Lumineszenzen von einem Messbereich oder von einem Array aus mindestens zwei oder mehr, räumlich getrennten Messbereichen (d) oder mindestens zwei oder mehr räumlich getrennten Segmenten (d'), in die mehrere Messbereiche zusammengefasst sind, auf besagter optischer Struktur, dadurch gekennzeichnet, dass die Intensität eines in die wellenleitende Schicht (a) der optischen Straktur eingekoppelten und in der Schicht (a) geführten Anregungslichts auf der Schicht (a) und in der Schicht (a) ausreichend hoch ist, um auf der Oberfläche der Schicht (a) oder in einem Abstand von weniger als 200 nm zur Schicht (a) befindliche Moleküle mittels Multi- Photonen-Anregung zur Lumineszenz anzuregen.
79. Verfahren nach einem der Anspräche 72 - 78, dadurch gekennzeichnet, dass die Einkopplung von Anregungslicht in die Schicht (a) über ein oder mehrere optische Einkoppelelemente aus der Gruppe erfolgt, die von Prismenkopplern, evaneszenten Kopplern mit zusammengebrachten optischen Wellenleitern mit überlappenden evaneszenten Feldern, Stirnflächenkopplern mit vor einer Stirnseite der wellenleitenden Schicht angeordneten fokussierenden Linsen, vorzugsweise Zylinderlinsen, und Gitterkopplern gebildet wird.
80. Verfahren nach einem der Anspräche 72 - 79, dadurch gekennzeichnet, dass die Einkopplung von Anregungslicht in die Schicht (a) über eine in der Schicht (a) modulierte Gitterstraktur (c) erfolgt.
81. Verfahren nach einem der Anspräche 72 - 80, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der optischen Struktur um eine planare Dünnschicht- Wellenleiter-Straktur handelt.
82. Verfahren nach Anspruch 81 mit einer optischen Straktur umfassend einen planaren Dünnschicht- Wellenleiter, mit einer bei mindestens einer Anregungswellenlänge transparenten Schicht (a) auf einer bei mindestens dieser Anregungswellenlänge ebenfalls transparenten Schicht (b) mit niedrigerem Brechungsindex als Schicht (a) und mindestens einer in Schicht (a) modulierten Gitterstraktur (c), dadurch gekennzeichnet, dass die Intensität eines unter dem Resonanzwinkel zur Einkopplung in die Schicht (a) eingestrahlten Anregungslichts auf der Schicht (a) und in der Schicht (a) zumindest im Bereich der Gitterstraktur (c) ausreichend hoch ist, um auf der Oberfläche der Schicht (a) oder in einem Abstand von weniger als 200 nm zur Schicht (a) befindliche Moleküle mittels Multi- Photonen-Anregung anzuregen.
83. Verfahren nach einem der Anspräche 72 - 82, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Multi-Photonen-Anregung um eine 2-Photonen- Anregung handelt.
84. Verfahren nach einem der Ansprüche 72 - 83, dadurch gekennzeichnet, dass auf der Oberfläche der Schicht (a) der optischen Struktur oder in einem Abstand von weniger als 200 nm zur Schicht (a) befindliche Moleküle linienhaft, das heisst gleichzeitig längs des in der Schicht (a) geführten Anregungslichts, mittels Multi- Photonen-Anregung angeregt werden können.
85. Verfahren nach Anspruch 84, dadurch gekennzeichnet, dass linienhafte Multi- Photonen-Anregung von auf der Oberfläche der Schicht (a) oder in einem Abstand von weniger als 200 nm zur Schicht (a) befindlichen Molekülen längs einer Distanz von mindestens 5 mm, gerechnet vom Ort der Einkopplung des Anregungslichts in die Schicht (a), möglich ist.
86. Verfahren nach einem der Ansprüche 80 - 85, dadurch gekennzeichnet, dass, unter Einstrahlung eines aufgeweiteten Anregungslichts, auf der Oberfläche der Schicht (a) oder in einem Abstand von weniger als 200 nm zur Schicht (a) befindliche Moleküle gleichzeitig flächenhaft längs des in der Schicht (a) geführten Anregungslichts mittels Multi-Photonen-Anregung angeregt werden können.
87. Verfahren nach einem der Ansprüche 72 - 86, dadurch gekennzeichnet, dass es gleichzeitige flächenhafte Multi-Photonen-Anregung von auf der Oberfläche der Schicht (a) oder in einem Abstand von weniger als 200 nm zur Schicht (a) befindlichen Molekülen auf einer Fläche von mindestens 1 mm2 ermöglicht.
88. Verfahren nach einem der Ansprüche 72 - 87, dadurch gekennzeichnet, dass es gleichzeitige flächenhafte Multi-Photonen-Anregung von auf der Oberfläche der Schicht (a) oder in einem Abstand von weniger als 200 nm zur Schicht (a) befindlichen Molekülen auf einer Fläche von mindestens 1 cm2 ermöglicht
89. Verfahren nach einem der Ansprüche 80 - 88, dadurch gekennzeichnet, dass die optische Straktur gleichförmige, unmodulierte Bereiche der Schicht (a) umfasst, welche vorzugsweise in Ausbreitungsrichtung des über eine Gitterstraktur (c) eingekoppelten und in der Schicht (a) geführten Anregungslichts angeordnet sind.
90. Verfahren nach einem der Ansprüche 80 - 89, dadurch gekennzeichnet, dass die optische Straktur eine Vielzahl von Gitterstrukturen (c) gleicher oder unterschiedlicher Periode mit optional daran anschliessenden gleichförmigen, unmodulierten Bereichen der Schicht (a) auf einem gemeinsamen, durchgehenden Substrat umfasst.
91. Verfahren nach einem der Anspräche 80 - 90, dadurch gekennzeichnet, dass eine auf oder im Nahfeld der Schicht (a) der optischen Straktur durch Multi-Photonen- Absoiption erzeugte Lumineszenz mindestens teilweise in die Schicht (a) einkoppelt und durch Leitung in der Schicht (a) zu benachbarten Bereichen auf besagter optischer Straktur geführt wird.
92. Verfahren nach einem der Anspräche 77 - 91, dadurch gekennzeichnet, dass zur Erzeugung der Lumineszenz ein Lumineszenzfarbstoff oder lumineszentes Nanopartikel als Lumineszenzlabel verwendet wird, das bei einer Wellenlänge zwischen 200 nm und 1100 nm angeregt werden kann.
93. Verfahren nach Anspruch 92, dadurch gekennzeichnet, dass besagtes Lumineszenzlabel mittels 2-Photonen- Absorption angeregt wird.
94. Verfahren nach Ansprach 93, dadurch gekennzeichnet, dass besagtes Lumineszenzlabel durch 2-Photonen-Absorption eines Anregungslichts im Sichtbaren oder nahen Infraroten zu einer ultravioeletten oder blauen Lumineszenz angeregt wird.
95. Verfahren nach einem der Anspräche 92 - 94, dadurch gekennzeichnet, dass das Lumineszenzlabel an den Analyten oder in einem kompetitiven Assay an einen Analogen des Analyten oder in einem mehrstufigen Assay an einen der Bindungspartner der immobilisierten biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselementen oder an die biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselementen gebunden ist.
96. Verfahren nach einem der Ansprüche 92 - 95, dadurch gekennzeichnet, dass ein zweites oder noch weitere Lumineszenzlabel mit gleicher oder unterschiedlicher Anregungswellenlänge wie das erste Lumineszenzlabel und gleicher oder unterschiedlicher Emissionswellenlänge verwendet werden.
97. Verfahren nach einem der Anspräche 77 - 91, dadurch gekennzeichnet, dass die Eigenfluoreszenz („Autofluoreszenz") fluoreszenzfähiger Biomoleküle, wie beispielsweise von Proteinen mit fluoreszenzfähigen Aminosäuren, mittels MultiPhotonen-Absorption angeregt wird.
98. Verfahren nach Ansprach 97, dadurch gekennzeichnet, dass besagte fluoreszenzfähigen Aminosäuren ausgewählt sind aus der Gruppe, die von Tryptophan, Tyrosin und Phenylalanin gebildet wird.
99. Verfahren nach einem der Anspräche 77 - 98, dadurch gekennzeichnet, dass mithilfe einer mittels Multi-Photonen- Absorption angeregten Eigenlumineszenz (Eigen- oder Auto-Fluoreszenz) der immobilisierten biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselemente deren Immobilisierungsdichte in den Messbereichen bestimmt wird.
100. Verfahren nach einem der Anspräche 77 - 99, dadurch gekennzeichnet, dass das im Analytnachweisschritt (durch Multi-Photonen- Absorption oder auch EinPhotonen-Absorption) angeregte Lumineszenzsignal des Analyten oder eines seiner Bindungspartner bezüglich der Anzahl oder Dichte der verfügbaren Bindungsstellen anhand der gemessenen, durch Multi-Photonen-Absorption angeregten Eigenlumineszenz der immobilisierten biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselemente korrigiert bzw. normiert wird.
101. Verfahren nach einem der Anspräche 77 - 100, dadurch gekennzeichnet, dass die einen oder mehreren Lumineszenzen und / oder Bestimmungen von Lichtsignalen bei der Anregungswellenlänge polarisationsselektiv vorgenommen werden, wobei vorzugsweise die einen oder mehreren Lumineszenzen bei einer anderen Polarisation als der des Anregungslichts gemessen werden.
102. Verfahren nach einem der Ansprüche 72 - 101, dadurch gekennzeichnet, dass während der Multi-Photonen-Anregung von an der Oberfläche der Schicht (a) oder innerhalb eines Abstandes von weniger als 200 nm von der Schicht (a) befindliche Moleküle innerhalb dieses Abstandes gefangen gehalten werden, indem die oberflächennahe hohe Anregungsintensität und deren ansteigender Gradient in Richtung der Oberfläche auf diese Moleküle den Effekt einer „optischen Pinzette" („optical tweezers") ausübt.
103. Verfahren nach einem der Anspräche 72 - 102 zur gleichzeitigen und / oder sequentiellen, quantitativen und / oder qualitativen Bestimmung eines oder mehrerer Analyten aus der Gruppe von Antikörpern oder Antigenen, Rezeptoren oder Liganden, Chelatoren oder "Histidin-tag-Komponenten", Oligonukleotiden, DNA- oder RNA-Strängen, DNA- oder RNA- Analoga, Enzymen, Enymcofaktoren oder Inhibitoren, Lektinen und Kohlehydraten.
104. Verfahren nach mindestens einem der Anspräche 72 - 103, dadurch gekennzeichnet, dass die zu untersuchenden Proben natürlich vorkommende Körperflüssigkeiten wie Blut, Serum, Plasma, Lymphe oder Urin oder Eigelb oder optisch trübe Flüssigkeiten oder Oberflächenwasser oder Boden- oder Pflanzenextrakte oder Bio- oder Syntheseprozessbrähen oder aus biologischen Gewebeteilen entnommen sind.
105. Verwendung einer optischen Straktur nach einem der Ansprüche 1 - 44 und / oder eines optischen Systems nach einem der Ansprüche 45 - 71 und / oder eines Verfahrens nach mindestens einem der Ansprüche 72 - 104 zu quantitativen und / oder qualitativen Analysen zur Bestimmung chemischer, biochemischer oder biologischer Analyten in Screeningverfahren in der Pharmaforschung, der Kombinatorischen Chemie, der Klinischen und Präklinischen Entwicklung, zu Echtzeitbindungsstudien und zur Bestimmung kinetischer Parameter im Affinitätsscreening und in der Forschung, zu qualitativen und quantitativen Analytbestimmungen, insbesondere für die DNA- und RNA- Analytik, für die Erstellung von Toxizitätsstudien sowie für die Bestimmung von Expressionsprofilen sowie zum Nachweis von Antikörpern, Antigenen, Pathogenen oder Bakterien in der pharmazeutischen Protduktentwicklung und -forschung, der Human- und Veterinärdiagnostik, der Agrochemischen Produktentwicklung und -forschung, der symptomatischen und präsymptomatischen Pflanzendiagnostik, zur Patientenstratifikation in der pharmazeutischen Produktentwicklung und für die therapeutische Medikamentenauswahl, zum Nachweis von Pathogenen, Schadstoffen und Erregern, insbesondere von Salmonellen, Prionen und Bakterien, in der Lebensmittel- und Umweltanalytik.
Verwendung einer optischen Struktur nach einem der Anspräche 1 - 44 und / oder eines optischen Systems nach einem der Ansprüche 45 - 71 und / oder eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 72 - 104 für oberflächengebundene Untersuchungen, welche den Einsatz sehr hoher Anregungslichtintensitäten und / oder Anregungsdauern und / oder Mehr-Photonen- Anregung erfordern, wie beispielsweise Untersuchungen der photophysikalischen und photochemischen Eigenschaften insbesondere neuer Materialien, Studien zur Photostabilität von Materialien, photokatalytische Prozesse etc.
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