JP2004530125A - 多光子励起のための光学構造及びその使用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、少なくとも一つの励起波長で透明である導波層（ａ）を有する光学導波体を含む光学構造の可変的な実施態様に関する。前記光学構造は、層（ａ）中に入力されかつ前記層（ａ）中を誘導される励起光の強さが、前記層（ａ）の上及び中で、層（ａ）の表面に又は後者（ａ）から２００nm未満の距離に位置する、ルミネセンスが可能である分子及び／又は光反応性分子を多光子励起、好ましくは２光子励起によって励起させるのに十分なほど高いことを特徴とする。好ましい実施態様は、層（ａ）中を誘導される励起光に沿って直線的又は平面的多光子励起を可能にする実施態様である。本発明はまた、励起光源を含む光学系及び分析系の種々の実施態様ならびに光学構造の新規な実施態様ならびにそれに基づく方法、特に多光子励起による１種又はいくつかの分析対象物のルミネセンス励起及び発光検出、さらには前記実施態様及び方法の使用に関する。
Description
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくともある励起波長で光学的に透明である導波層（ａ）を有する光学導波体を含む光学構造であって、層（ａ）に内結合されかつ層（ａ）の中を誘導される励起光の強さが、層（ａ）内及び層（ａ）上で、層（ａ）の表面又は２００nm未満の距離内に位置する、ルミネセンスが可能である及び／又は光反応性である分子を多光子励起、好ましくは２光子励起によって励起するのに十分なほど高くなる光学構造の可変的な実施態様に関する。これに関して、層（ａ）中を誘導される励起光のトレースに沿って、巨視的距離にわたり又は拡大面で多光子励起を可能にする実施態様が好ましい。本発明はまた、励起光源を有する光学系及び分析系の種々の実施態様ならびに本発明の光学構造の実施態様ならびにそれに基づく、特にルミネセンス励起のための及び多光子励起後のルミネセンス検出による１種以上の分析対象物の測定のための方法ならびにその使用に関する。
【０００２】
本発明の目標は、導波構造の近接場、すなわち導波構造の上で又は約２００nm未満の距離内で、ルミネセンスが可能である及び／又は光反応性である分子の多光子励起を可能にするための光学構造及び使いやすい光学的方法を提供することである。
【０００３】
本発明の範囲内で、「多光子励起」とは、分子（又は分子群）が、得られた励起状態から別の状態、特に基底状態まで緩和する前に、照射励起波長の多数の光子を吸収することをいうと理解される。このような多光子励起の結果は、基底状態への減衰によって発される、照射励起波長よりも短い波長のルミネセンス、特に蛍光であることできる。結果はまた、光反応性状態への遷移のための活性化障壁の解消であることができる。この光反応性状態は、他の分子又は分子複合体への分子結合の形成（たとえば光重合の形態）に通じることもできるし、既存の結合の破断（後に脱着が続くこともある光解離）に通じることもできる。相応に、「１光子励起」とは、単一の光子の吸収によって分子が前記励起状態に励起されることと理解される。
【０００４】
明示的に区別されない限り、「分子群」（たとえば、蛍光的にマークされた分子の一部としての蛍光標識）は、「分子」の使用に含まれる。
【０００５】
たとえば生化学的分析学では、供給されたサンプル中の分析対象物を、表面に固定化された生化学的又は生物学的又は合成認識要素を使用して高い選択性及び感度で測定するための構造及び方法が大きく要望されている。それに関して、多くの公知の測定法は、分析対象物の存在における一以上のルミネセンスの検出に基づく。
【０００６】
これに関して、本出願では「ルミネセンス」は、光学的又は非光学的、たとえば電気的、化学的、生化学的又は熱的励起ののちに起こる、紫外線から赤外線までのスペクトル範囲における光子の自然発生的放出をいう。たとえば、ケミルミネセンス、バイオルミネセンス、エレクトロルミネセンスならびに特に蛍光及びリン光が「ルミネセンス」に含まれる。
【０００７】
以下、「物質の光学透明性」は、少なくともある励起波長でその物質の透明性が求められるという意味で使用する。より短い又はより長い波長では、この物質は吸収性になることもできる。
【０００８】
近年、わずか数１００ナノメートルの薄い導波膜に基づく高屈折薄膜導波体により、感度が有意に高められた。たとえば、ＷＯ９５／３３１９７には、レリーフ格子を回折光学要素として使用して励起光を導波膜に結合する方法が記載されている。センサプラットフォームの表面を、分析対象物を含有するサンプルと接触させ、減衰フィールドの浸透深さ内に位置しかつルミネセンスが可能である物質から等方的に発されるルミネセンスを、適切な計測装置、たとえばフォトダイオード、光電子増倍管又はＣＣＤカメラによって記録する。また、減衰的に励起されたルミネセンスのうち、導波体に逆結合された部分を回折光学要素、たとえば格子によって外結合し、計測することが可能である。この方法はたとえばＷＯ９５／３３１９８に記載されている。
【０００９】
以下、「減衰フィールド」と「近接場」とは同義に使用する。
【００１０】
現在の技術水準、特にＷＯ９５／３３１９７及びＷＯ３３／１９８における上記した減衰的に励起されるルミネセンスを検出する方法の欠点は、センサプラットフォームの、均質な膜として設けられた導波層上で常に１種のサンプルしか分析することができないことである。同じセンサプラットフォーム上でさらなる計測を可能にするためには、面倒な洗浄及び清浄工程が絶えず求められる。これは、最初の計測とは別の分析対象物を測定しなければならない場合、特に当てはまる。免疫検定の場合、これは通常、センサプラットフォーム上の固定化層をまるごと交換しなければならないか、新たなセンサプラットフォームを全体として使用しなければならないことを意味する。
【００１１】
したがって、いくつかのサンプルを平行に、すなわち同時に又は追加的な清浄工程をはさむことなく続けざまに分析することを可能にする方法を開発することが要望されている。
【００１２】
本質的に単モードの平面無機導波体を使用してルミネセンス検出のみに基づく多数の計測を同時又は順次に実施するため、たとえばＷＯ９６／３５９４０には、互いに別々に励起光を照射される少なくとも二つの別個の導波区域が１個のセンサプラットフォーム上に配設されている装置（アレイ）が報告されている。しかし、センサプラットフォームを別々の導波区域に隔離することから生じる欠点として、共通のセンサプラットフォーム上の別個の導波領域における別個の計測区域のための所要面積が比較的大きい。したがって、ここでもまた、比較的低い密度の異なる計測フィールド（又はいわゆる「フィーチャ」）しか達成することができない。
【００１３】
したがって、フィーチャ密度を増す又は計測面積あたりの所要面積を減らすこともまた要望されている。
【００１４】
簡単なガラス又は顕微鏡スライドに基づき、さらなる導波層をもたない、非常に高いフィーチャ密度のアレイが公知である。たとえば、米国特許第５，４４５，９３４号（Affymax Technologies）では、１平方センチメートルあたり１０００を超えるフィーチャの密度を有するオリゴヌクレオチドのアレイが記載され、特許請求されている。このようなアレイの励起及び読出しは、従来の光学構造及び方法に基づく。拡大させた励起光束を使用するとアレイ全体を同時に照らすことができるが、結果として、比較的低い感度しか得られない。散乱光の部分が比較的大きくなり、また、分析対象物の結合のためのオリゴヌクレオチドが固定化されていない領域では、ガラス基板からの散乱光又はバックグラウンド蛍光が発生する。励起及び検出を固定化されたフィーチャの領域に限定し、隣接領域における発光を抑制するため、共焦点計測構造が広く使用され、種々のフィーチャが走査によって順次に分析される。しかし、その結果、大きなアレイの読出しに要する時間が増し、光学設備が比較的複雑になる。
【００１５】
したがって、薄膜導波体に基づくセンサプラットフォームによって達成されてきた同じ高さの感度を達成すると同時にフィーチャあたりの所要計測面積を最小限にすることを可能にするセンサプラットフォームの実施態様及び光学構造が要望されている。
【００１６】
同時係属出願（ＰＣＴ／ＥＰ００／０４８６９）には、光学的に透明な層（ａ）を層（ａ）よりも低い屈折率の第二の層（ｂ）の上に含み、層（ａ）中で変調される格子構造（ｃ）をその上に設けられた計測区域とともに含む膜導波体を有するセンサプラットフォームが記載されている。それに関して、パラメータ、特に格子深さの適切な選択により、励起光を計測区域に内結合し、対応するルミネセンス励起を層（ａ）の近接場に内結合したのち層（ａ）中に逆結合されるルミネセンス光を、短い距離、すなわち、何百マイクロメートルで完全に外結合することでき、ひいては、導波層（ａ）中にさらに広がることを防ぐことができる。
【００１７】
この構造は、非常に小さな区域での多種の分析対象物の高感度同時測定を見込んでいる。光路を最適化し、反射又は散乱光を遮蔽すると、感度をさらに高めることができる。しかし、最後に、バックグラウンド信号及び対応するバックグラウンドのノイズによる制限が残る。これは、とりわけ、大部分の被着されるルミネセンス染料に関して、励起波長と発光波長との間のスペクトル分離（ストークスシフト）が比較的小さく、通常は２０nm〜５０nmであるという事実による。３００nmまでの大きなストークスシフトを示すルミネセンス染料が知られているが、これらの染料は一般に、欠点として、量子収率及び／又は光安定性が比較的低い。
【００１８】
さらには、従来の励起と組み合わせた高屈折薄膜導波体、たとえばＴａ2Ｏ5又はＴｉＯ2の導波膜に基づく公知の構造の欠点は、これらの導波体の伝播損及びこれらの薄膜導波体の自己蛍光（たとえば層（ｂ）中の極微量の蛍光性汚染物によって生じる）が短い励起波長で強烈に増すということである。その結果、短波長励起は約４５０nm〜５００nmに限られる。しかし、短めの波長においてもフルオロフォアを励起し、できるだけ低いバックグラウンドで又はできればバックグラウンドなしでそのルミネセンスを検出することを可能にする構造が高く評価されるであろう。
【００１９】
最近、ほぼバックグラウンドなしのルミネセンス検出を可能にする、２光子励起に基づく方法が報告された。しかし、２光子励起は、きわめて高いフィールド強度及び励起光の強さを要する。記載された構造では、これは、極短いパルス期間（通常はフェムト秒単位）を有する強力なパルスレーザによって達成される。しかし、これらの光学構造は非常に高額なシステム費を特徴とし、このシステム費が使用者の特定の資格に関して高い要件を課す。三次元画像の再現及び記憶のための構造の開発に関する１９６７年の米国特許第３，５７２，９４１号における非常に初期の研究では、たとえば、記憶媒体、たとえば単結晶、たとえばＬａでドープされたＣａＦ2の光学密度の変化（永久的）に関して、２０MW/cm2のオーダの励起強さ密度が必要であると記載されている。たとえば、このような高強度密度は、たとえば米国特許第５，０３４，６１３号では、パルス高出力レーザを、そのレーザ焦点の直径が顕微鏡の焦点面で１マイクロメートル未満である状態で、共焦点顕微鏡的配置で使用することによって達成され、記載されている。しかし、走査による拡大区域の計測は、計器に多くの手間をかける他に、大きな時間的投資を要する。
【００２０】
驚くことに今、少なくともある励起波長で透明である導波層（ａ）を、前記励起波長で同じく透明である、層（ａ）よりも低い屈折率の層（ｂ）の上に有する薄膜導波体に基づく光学構造の物理的パラメータを適切に選択し、十分に高い励起光強さを適用することにより、層（ａ）に内結合され、層（ａ）中を誘導される励起光の強さが、層（ａ）上及び層（ａ）内で、層（ａ）の表面又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に位置する分子を多光子吸収によって励起してルミネセンスに至らせるのに十分なほど高くなるということがわかった。
【００２１】
驚くことに、少なくともある励起波長で透明である層（ａ）を、少なくとも前記励起波長で同じく透明である、層（ａ）よりも低い屈折率の層（ｂ）の上に有し、層（ａ）中で変調される少なくとも１個の格子構造（ｃ）を有する平面薄膜導波体として設けられる本発明の光学構造の好ましい実施態様により、層（ａ）に内結合するための共振角で投射される励起光の強さが、層（ａ）上及び層（ａ）内で、層（ａ）中の励起光の伝播路全体にわたり、層（ａ）上に固定化されたルミネセンスが可能である分子を直線的なトレースにたわり前記伝播路に沿って拡大面上で２光子励起によって励起するのに十分なほど高くなるということが示された。これに関して、肉眼によって周囲光ででも観察することができるほど強いルミネセンスを２光子吸収によって発生させることができる。
【００２２】
これまで多光子励起はきわめて小さな空間、すなわち高出力レーザ（一般には、高い繰り返し率で脈動するフェムト秒レーザ）の焦点でのみ可能であったが、本発明は、巨視的寸法、すなわちミリメートルからセンチメートルの範囲にわたり平方ミリメートルから平方センチメートルの面積で２光子ルミネセンス励起及び観察を同時に可能にする。本発明のおかげで、たとえば単一のパルスのための励起光源のパルスエネルギーに対する要求を相当に軽減することができ、すなわち、本発明の導波構造を用いる多光子ルミネセンス励起のために、より長いパルスのレーザ（たとえば、フェムト秒レーザではなくピコ秒又はナノ秒レーザ）又は連続発光（ｃｗ）レーザの使用が可能になる。
【００２３】
特に分析対象物に対して表面結合認識要素を使用する分析対象物測定のための導波体の減衰フィールドにおける多光子励起によるルミネセンス励起の重要な利点は、高屈折導波体面からの距離の増大に関して、１光子吸収による従来の励起に比べてさらに有意に増大した励起の感度である。従来の１光子吸収によって発生する減衰フィールドの強さ及びルミネセンスの強さ（フィールド強さに比例する）は距離ｘとともに指数関数的に減少するが、ｎ光子吸収後のルミネセンスの減少は、１／ｅnxに比例する、すなわち、２光子励起の場合、１／ｅ2xに比例する。
【００２４】
比較的低い照射励起光強さの場合でも非常に大きな増幅定数のおかげで比較的わずかな努力で達成することができる非常に高い表面結合励起光強さにより、本発明の光学構造は、多様な異なる技術分野で、生分析学以外ででも、たとえば高い励起光強さにさらされる特に新規な物質の光物理的又は光化学的性質の調査に応用することができる。
【００２５】
特に、本発明の種々の実施態様に関して以下さらに詳細に記載するように、導波構造から非常に小さな距離（ｚ方向）の範囲内に位置する光反応性分子又は分子群を多光子励起、好ましくは２光子励起によって励起して化学反応に至らせることができる。これらの化学反応は、ｚ方向への分子拡張の三次元構造を簡単に生成することができる光重合をたとえば生じさせる、隣接分子への化学結合の形成であることができる。化学反応はまた、巨視的基底区域で、マススペクトロメトリー、特にＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳ（マトリックス支援レーザ脱離／イオン化飛行時間型マススペクトロメトリー）及び新たな光学的クロマトグラフィー法としての分子分離のための新規で簡素化された方法をたとえば生じさせる分子結合の表面閉じ込め選択的破断であることもできる。
【００２６】
本発明の第一の主題は、少なくともある励起波長で光学的に透明である導波層（ａ）を有する光学導波体を含む光学構造であって、層（ａ）に内結合されかつ層（ａ）中を誘導される励起光の強さが、層（ａ）内及び層（ａ）上で、層（ａ）の表面に又は２００nm未満の距離内に位置する分子を多光子励起によって励起させることができるのに十分なほど高い光学構造である。
【００２７】
好ましくは、前記光学導波体は、少なくともある励起波長で光学的に透明である導波層（ａ）を、少なくともその励起波長で同じく光学的に透明である、層（ａ）よりも低い屈折率の層（ｂ）の上に有する光学薄膜導波体である。
【００２８】
本発明の光学構造の実施態様の一群に特徴的であることは、層（ａ）の表面に又は２００nm未満の距離内に位置しかつ多光子励起によって励起される分子が光反応性分子又は分子群である、すなわち、光による励起ののち化学反応性になる分子又は分子群であるということである。これらの光反応性分子は、たとえば、適当な、通常は短波長の励起光（たとえばＵＶ光）の照射ののち光重合を開始することができるいわゆる光開始剤であることができる。したがって、この特別な実施態様に特徴的であることは、層（ａ）上に又は２００nm未満の距離内に位置する前記光反応性分子の多光子励起によって光重合が開始されるということである。これは、現在の技術水準に比較して二重の利点をもたらす。まず、比較的低い励起強さの照射により、表面近く（構造の導波層（ａ）からの距離ｚであって、その範囲内で当該化合物の２光子励起が可能である距離によって定義される）で重合を効率的に励起することができる。他方、距離ｚによって定義されるきわめて浅い（すなわち分子サイズの）三次元構造（すなわち分子サイズの）を簡単な方法で生成することができる。これに関して、光学構造の表面に対して平行な線形又は横方向の範囲が、導波層（ａ）内の照射励起光の伝播長によって制限される。励起光の内結合及び外結合を同時に得るために光重合の工程が層（ａ）中で変調される格子構造上で実施されるならば（以下さらに詳細な説明を参照）、同じく非常に小さな横方向範囲（マイクロメータレベルの）のポリマー構造を生成又は書き込みすることができる（照射励起光に関して横方向への光学構造の動きによって）。
【００２９】
本発明の光学構造のもう一つの実施態様に特徴的であることは、光解離が、すなわち、層（ａ）上に又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に設けられ、多光子励起の瞬間まで存在する分子又は分子複合体の破断が、層（ａ）上に又は層（ａ）から２００nm未満の距離内で、前記光反応性分子の多光子励起によって開始されるということである。
【００３０】
特殊な変形態様に特徴的であることは、前記光反応性分子が、比較的高分子量の分子、特に天然及び人造（合成）ポリマーならびに生物学的分子、たとえばタンパク質、ポリペプチド及び核酸を埋め込むための分子マトリックスの一部であるということである。これに関して、光学構造は、マススペクトロメトリー、好ましくはＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳ（マトリックス支援レーザ脱離／イオン化飛行時間型マススペクトロメトリー）のためのサンプルキャリヤとして設けられることが特に好ましい。
【００３１】
もう一つの好ましい実施態様は、少なくともある励起波長で光学的に透明である導波層（ａ）を、少なくとも前記励起波長で同じく光学的に透明である、層（ａ）よりも低い屈折率の層（ｂ）の上に有する光学薄膜導波体を含む光学構造であって、層（ａ）に内結合されかつ層（ａ）中を誘導される励起光の強さが、層（ａ）上及び層（ａ）内で、層（ａ）の表面に又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に位置する分子を多光子励起によって励起させてルミネセンスに至らせるのに十分なほど高い光学構造である。
【００３２】
層（ａ）への励起光の内結合は、プリズムカプラと、重畳する減衰フィールドを有する連結した光学導波体に基づく減衰カプラと、導波層の前に位置する合焦レンズ、好ましくは円柱レンズを有する前面カプラと、格子カプラとによって形成される群からの１個以上の光学内結合素子を使用して実施することができる。
【００３３】
好ましくは、層（ａ）への励起光の内結合は、層（ａ）中で変調される格子構造によって実施される。
【００３４】
さらには、光学構造は平面薄膜導波構造であることが好ましい。
【００３５】
特に好ましいものは、少なくともある励起波長で光学的に透明である層（ａ）を、少なくとも前記励起波長で同じく光学的に透明である、層（ａ）よりも低い屈折率の層（ｂ）の上に有するとともに、層（ａ）中で変調される少なくとも１個の格子構造（ｃ）を有する平面薄膜導波体を含み、層（ａ）に内結合するための共振角で投射される励起光の強さが、層（ａ）上及び層（ａ）内で、少なくとも格子構造（ｃ）の領域で、層（ａ）の表面に又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に位置する分子を多光子励起によって励起させるのに十分なほど高い本発明の光学構造の実施態様である。
【００３６】
好ましくは、多光子励起は２光子励起である。
【００３７】
本発明の光学構造により、層（ａ）の表面に又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に位置する分子を、直線経路に沿って、すなわち層（ａ）中を誘導される励起光に沿って同時に多光子励起によって励起させることが可能である。
【００３８】
特に有利であるものは、層（ａ）の表面に又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に位置する分子の多光子励起を、層（ａ）への励起光の内結合の位置から起算して少なくとも５mmの距離にわたり直線経路に沿って可能にするような実施態様である。
【００３９】
また、拡大した励起光の照射により、層（ａ）の表面に又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に位置する分子が、層（ａ）中を誘導される励起光に沿って拡大区域で同時に多光子励起によって励起されるならば、それは特に有利である。格子（ｃ）によって光を層（ａ）に内結合する場合、励起光束は、好ましくは、格子線に対して平行に拡大される。
【００４０】
本発明の光学構造は、層（ａ）の表面に又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に少なくとも１mm2の面積で、より好ましくは少なくとも１０mm2の面積で、さらに好ましくは少なくとも１cm2の面積で位置する分子の同時多光子励起のために作動可能であることが好ましい。
【００４１】
特に多光子励起を可能にするための非常に高い表面閉じ込め励起光強さ及び表面に近いところでの高い強さは、以下さらに詳細に概説するように、多様な用途、特にバイオセンシングに有利であるが、通信及び遠隔通信技術にも有利である。
【００４２】
さらには、構造は、格子構造（ｃ）によって内結合され、層（ａ）中を誘導される励起光の伝播方向に配設されることが好ましい、層（ａ）の連続非変調領域を含むことが好ましい。特に、構造は、同一又は異なる周期を有する多数の格子構造（ｃ）が、場合によっては層（ａ）の連続非変調領域がそれに隣接する状態で、共通の連続基板上に設けられるような方法で設計することができる。したがって、多光子励起によるルミネセンス励起の場合、多光子吸収によって層（ａ）の上に又はその近接場で生成されるルミネセンスを少なくとも部分的に層（ａ）中に結合させるとともに、層（ａ）中の誘導によって前記光学構造上の隣接領域に伝播させることもまた可能である。
【００４３】
特定の用途では、異なる励起波長の励起光を同じ光学構造に同時又は順次に適用することが望ましい。その場合、この構造が、異なる周期数の２個以上の格子構造を、格子線が平行又は非平行、好ましくは非平行に配設された状態で重畳したものを含み（２個の重畳格子構造の場合、それらの格子線は、好ましくは互いに対して垂直に配設される）、その構造が異なる波長の励起光の内結合に作動可能であるならば、それは有利であることができる。
【００４４】
光学導波層（ａ）中を誘導されるモードの伝播損の量は、下に位置する支持層の表面粗さによって、及びこのキャリヤ層で起こるかもしれないクロモフォアの吸収（層（ａ）中を誘導されるモードの減衰フィールドの浸透による、多くの用途に望ましくない、このキャリヤにおけるルミネセンスの励起の危険をさらに伴う）によって多大な程度まで決まる。さらには、光学的に透明な層（ａ）及び（ｂ）の熱膨張率の違いによって熱ひずみが発生することもある。化学的に高感度で光学的に透明な層（ｂ）の場合、それがたとえば透明な熱可塑性プラスチックからなる場合、層（ｂ）を攻撃するかもしれない溶剤の、光学的に透明な層（ａ）中に存在するかもしれない微孔への浸透を防ぐことが望ましい。
【００４５】
したがって、多数の層（（ａ）及び（ｂ））を含む導波体の場合、層（ａ）よりも低い屈折率を有するとともに、５nm〜１００００nm、好ましくは１０nm〜１０００nmの厚さを有するさらなる光学的に透明な層（ｂ′）が、層（ａ）と層（ｂ）との間にかつ層（ａ）と接触した状態で位置するならば、それは有利である。この中間層の導入により、多様な課題―層（ａ）の下の表面粗さの軽減と、層（ａ）中を誘導される光の減衰フィールドの、下に位置する一以上の層への浸透の軽減と、格子導波構造内で熱的に誘発される応力の軽減と、層（ａ）の微孔を下に位置する層に対してシールすることによる、下に位置する層からの光学的に透明な層（ａ）の化学的分離と、―を満たすことができる。
【００４６】
本発明の光学構造の格子構造（ｃ）は、均一な周期の回折格子であることもできるし、多回折格子であることもできる。また、格子構造（ｃ）には、光学的に透明な層（ａ）中に結合される励起光の伝播方向に対して垂直又は平行な周期数であり、横方向に変化する周期数を備えることもできる。
【００４７】
光学的に透明な層（ａ）に使用することができる数多くの異なる材料がある。もっとも重要な事前要件は、できるだけ大きな程度で少なくとも投射励起光の波長における吸収又はルミネセンスの非存在と、少なくともミリメートルからセンチメートル程度の距離にわたる光誘導能力とである。
【００４８】
本発明の光学構造の特定の実施態様の場合、光学的に透明な（ａ）の材料は、ガラス、石英又はたとえばポリカーボネート、ポリアミド、ポリイミド、ポリメチルメタクリレート、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリアクリル酸、ポリアクリル酸エステル、ポリフェニレンスルフィド、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）及びポリウレタンならびにそれらの誘導体を含む群からの透明なプラスチックを含むことが好ましい。
【００４９】
光学的に透明な層（ａ）はまた、ＴｉＯ2、ＺｎＯ、Ｎｂ2Ｏ5、Ｔａ2Ｏ5、ＨｆＯ2又はＺｒＯ2の群の材料、特に好ましくはＴｉＯ2又はＮｂ2Ｏ5又はＴａ2Ｏ5の群の材料を含むことができる。
【００５０】
また、光学的に透明な層（ａ）の屈折率が１．８よりも大きいことが好ましい。
【００５１】
光学的に透明な層（ａ）は、多様な「外見的に」異なる実施態様で設けることができる。ファイバタイプであることもできるし、平面導波体であることもできる。なおさらに、技術的に製造可能な形状が可能である。
【００５２】
光学的に透明な層（ａ）は、たとえばマイクロメートルからミリメートル程度の厚さ（又はファイバタイプ導波体の場合は直径）を有して自立性であることができる。層（ａ）はまた、層（ａ）の屈折率よりも低い屈折率の層を層（ａ）に隣接して有する、同じくファイバタイプ実施態様及び平面的実施態様が可能である多層系の一部であることができる。
【００５３】
光学的に透明な層（ａ）が低モード導波体である、すなわち、照射励起光の所与の偏光の最初の１０モード未満を誘導するように作動可能であるならば、それは特に有利である。
【００５４】
光学的に透明な層（ａ）が、照射励起光の所与の偏光の１〜３モードのみを誘導するように作動可能である低モード導波体であることが特に好ましい。
【００５５】
上記ですでに概説したように、（平面）光学薄膜導波体としての本発明の光学構造の実施態様が特に好ましい。
【００５６】
その場合、光学的に透明な層（ｂ）の材料は、ガラス、石英又はたとえばポリカーボネート、ポリイミド、ポリメチルメタクリレート、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリアクリル酸、ポリアクリル酸エステル、ポリフェニレンスルフィド、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）及びポリウレタンによって形成される群からの透明な熱可塑性もしくは成形性プラスチックを含むことがさらに好ましい。
【００５７】
光学的に透明な導波層（ａ）の屈折率の他にも、その厚さが、より低い屈折率の隣接層との界面でできるだけ強い減衰フィールドを発生させるとともに、層（ａ）内でできるだけ高いエネルギー密度を発生させるのに重要な第二のパラメータである。層厚さが少なくとも一つの励起波長モードを誘導するのに十分である限り、導波層（ａ）の厚さの減少とともに減衰フィールドの強さが増す。それに関して、モードを誘導するための最小「カットオフ」層厚さは、このモードの波長に依存する。「カットオフ」層厚さは、短めの波長の光よりも長めの波長の光の場合の方が大きい。しかし、「カットオフ」層厚さに近づくと、望まれない伝播損もまた強く増大し（特に、散乱中心における散乱による）、それにより、好ましい層厚さの選択の下限をさらに限定する。しかし、これらの伝播損は一般に、短波長の光よりも長めの波長の光の場合の方が低い。好ましいものは、所与の励起波長で一つから三つのモードだけを誘導することを見込んだ光学的に透明な層（ａ）の厚さである。特に好ましいものは、この所与の励起波長で単モード導波体を生じさせる層厚さである。誘導される光の別々のモードの特性は横モードだけに関することが理解される。
【００５８】
これらの要件の結果として、層（ａ）の厚さとその屈折率との積は、層（ａ）中に結合される励起光の励起波長の、好ましくは１／１０〜１であり、もっとも好ましくは１／１０〜２／３である。
【００５９】
光学的に透明な導波層（ａ）及び隣接層の所与の屈折率に関して、上記共振条件にしたがって励起光を内結合するための共振角は、内結合される回折オーダと、励起波長と格子周期とに依存する。第一の回折オーダの内結合は、内結合効率を増すのに有利である。内結合効率の量のためには、回折オーダの数の他に、格子深さが重要である。原則として、結合効率は、格子深さが増すとともに増大する。しかし、外結合の過程が内結合に対して完全に逆であるため、外結合効率が同時に増し、その結果、格子構造（ｃ）の上又はそれに隣接して位置する計測区域（ｄ）（以下の定義に準じる）におけるルミネセンスの励起のための最適値が得られる。この最適値は、計測区域の形状及び投射される励起光束の形状に依存する。これらの境界条件に基づき、格子（ｃ）が２００nm〜１０００nmの周期及び３nm〜１００nm、好ましくは１０nm〜３０nmの変調深さを有するならば、それは有利である。
【００６０】
さらには、第一の光学的に透明な層（ａ）の厚さに対する格子の変調深さの比は０．２以下であることが好ましい。
【００６１】
それに関して、格子構造（ｃ）は、矩形、三角形又は半円形の断面のレリーフ格子であることもできるし、本質的に平面的な光学的に透明な層（ａ）中で屈折率の周期変調を有する位相又は容積格子であることもできる。
【００６２】
さらには、光学系における調節の簡素化のための及び／又は分析系の一部としてのサンプル区画への接続のための光学的又は機械的に認識可能な印が構造に設けられるならば、それは有利であることができる。
【００６３】
本発明の光学構造は、生化学的分析学における応用において１種以上の供給されるサンプル中の１種以上の分析対象物の高感度検出に特に適している。これらの応用の場合、測定する分析対象物の認識及び結合のための生物学的、生化学的又は合成認識要素が光学構造上に固定化される。固定化は、おそらくは構造全体に及ぶ大きな面で実施することもできるし、別個のいわゆる計測区域で実施することもできる。
【００６４】
本発明の本質では、液体サンプル中の１種又は多種の分析対象物の認識のため、横方向に分けられた計測区域（ｄ）が、その上に固定化された生物学的、生化学的又は合成認識要素によって占有される区域によって画定される。これらの区域は、いかなる形状、たとえば点、円、矩形、三角形、楕円又は線の形を有することもできる。１，０００，０００個までの計測区域を本発明の光学構造上に二次元配列で設けることが可能であり、その場合、単一の計測区域がたとえば０．００１mm2〜６mm2の面積を占有することができる。所与の計測区域内には、単一の分析対象物の認識及び結合ならびに測定のための同一の認識要素、又は種々の分析対象物の認識のための異なる認識要素を固定化することができる。また、認識要素として、異なる分析対象物を結合させることができるいくつか（すなわち二以上）の異なる領域又はセグメントを設けられている当該化合物を被着させることもできる。
【００６５】
たとえば、導波構造として励起光の内結合のための１個以上の格子構造（ｃ）を有する平面薄膜導波体の場合、計測区域は、そのような格子構造上に配設することもできるし、誘導励起光の伝播方向に関してそのような格子構造の後に位置する連続非変調領域に配設することもできる。
【００６６】
サンプル中の多種の分析対象物を同時に測定するためには、二以上の横方向に分けられた計測区域が光学構造上でセグメントに組み合わされるならば、それは有利であることができる。隣接セグメントで生成されかつ層（ａ）中に逆結合されるルミネセンスのクロストークを、格子構造（ｃ）によって防止する、又は光学構造上で生成される他の分離によって、たとえば被着された顔料の吸収ストリップもしくはサンプル区画の生成のための、光学構造の導波層（ａ）を下面として有する構造の隔壁によって防止するならば、種々のセグメントを特に光学的に互いに分けることができる。種々のセグメントはさらに、隣接区域間の流体シールを支持する被着されたリム及び／又は隣接区域間の光学クロストークの軽減に貢献する被着されたリムにより、互いから分けることができる。
【００６７】
生物学的、生化学的又は合成認識要素を光学的に透明な層（ａ）に被着させる方法は数多くある。たとえば、被着は、物理的吸着又は静電気的相互作用によって実施することができる。その場合、一般に、認識要素の向きは統計的性質である。さらには、分析対象物を含有するサンプル及び分析過程で加えられる試薬が異なる組成を有するならば、固定化された認識要素の一部が洗い落とされる危険がある。したがって、生物学的、生化学的又は合成認識要素（ｅ）の固定化のために付着促進層（ｆ）が光学的に透明な層（ａ）に被着されるならば、それは有利であることができる。この付着促進層はもまた、透明であるべきである。特に、付着促進層の厚さは、導波層（ａ）を出てその上に位置する媒体に入る減衰フィールドの浸透深さを超えるべきではない。したがって、付着促進層（ａ）は、厚さ２００nm未満、好ましくは２０nm未満であるべきである。付着促進層は、たとえば、シランと、エポキシドと、官能化された帯電又は極性ポリマーと、「自己組織化官能化単分子層」と、を含む群の化合物を含むことができる。
【００６８】
計測区域の定義で述べたように、横方向に分けられた計測区域（ｄ）は、生物学的又は生化学的又は合成認識要素を光学構造上に横方向に選択的に被着させることによって生成することができる。ルミネセンスが可能である分析対象物や、固定化された認識要素への結合を求めて分析対象物と競合する発光的にマークされた分析対象物類似体や多工程検定におけるさらに発光的にマークされた結合相手と、接触させられると、ルミネセンスが可能であるこれらの分子は、固定化された認識要素によって占有された区域によって画定される計測区域だけで選択的に光学構造の表面に結合する。
【００６９】
生物学的、生化学的又は合成認識要素を被着させるためには、インクジェットスポッティング、機械的スポッティング、マイクロコンタクトプリント及び生物学的、生化学的又は合成認識要素を平行又は交差マイクロチャネルに供給し、圧力差又は電気もしくは電磁ポテンシャルを印加して計測区域と流体接触させることを含む方法の群の一以上の方法を適用することができる。
【００７０】
概論の限定なしに、たとえば核酸（たとえばＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド）、核酸類似体（たとえばＰＮＡ）、抗体、アプタマー、膜結合しかつ単離された受容体、それらのリガンド、抗体に対する抗原、「ヒスチジンタグ成分」、分子インプリントをホストするための、化学合成によって生成されたキャビティなどを含む群の成分を、生物学的、生化学的又は合成認識要素として被着させることができる。最後に挙げたタイプの認識要素は、「分子インプリンティング」として文献に記載されている方法によって製造されるキャビティをいう。この手法では、大部分は有機溶液中の分析対象物又は分析対象物類似体をポリマー構造に封入する。すると、これが「インプリント」と呼ばれる。そして、適切な試薬の添加により、分析対象物又はその類似体をポリマー構造から溶解させ、ポリマー構造中に空のキャビティを残す。そして、この空のキャビティを、分析対象物測定のその後の方法で、高い立体選択性をもつ結合部位として使用することができる。
【００７１】
当然、考慮中の用途に望まれ、求められる選択性にしたがって、測定する分析対象物を選択的に認識し、それと相互作用する他の化合物もまた、認識要素として適当である。
【００７２】
また、全細胞又は細胞断片を生物学的又は生化学的又は合成認識要素として被着させることもできる。
【００７３】
前記認識要素は、光学構造に直接被着させることもできるし、光学構造上の付着促進層を介して被着させることもできる。
【００７４】
さらには、「認識要素」及び「分析対象物」の機能は、必要ならば適切な化学調製ののち、分析されるサンプルに含まれる化合物を本発明の光学構造に固定化することができ、対応する生物学的、生化学的又は合成認識要素が連続的な工程でそれらと接触するという意味において交換可能である。これに関して、別個の計測区域は、たとえば、サンプルを別々のアリコートに分割したのち、それらのアリコートを光学構造上の別個の区域に連続的に被着させることによって形成することができる。この場合、通常は種々の化合物の混合物が各計測区域に固定化されるであろう。
【００７５】
多くの場合、分析方法の検出限界は、いわゆる非特異的結合によって生じる信号によって、すなわち、分析対象物の結合によって又は分析対象物測定で加えられる他の成分（たとえば疎水性吸着又は静電気的相互作用により、設けられた固定化生物学的又は生化学的又は合成認識要素の区域で結合するだけでなく、これらの認識要素によって占有されないセンサプラットフォームの区域ででも結合する）の結合によって生じる信号によって制限される。したがって、非特異的結合又は吸着を最小限にするため、分析対象物に対して「化学的に中性」である化合物が横方向に分けられた計測区域（ｄ）の間に被着されるならば、それは有利である。多工程検定でそれ自体は分析対象物、分析対象物の類似体又はさらなる結合相手の認識及び結合に特異的な結合部位を有さず、かつ、その存在のため、分析対象物、その類似体又はさらなる結合相手のセンサプラットフォームの表面へのアクセスを阻止するような化合物が「化学的に中性」の化合物と呼ばれる。
【００７６】
アルブミン、特にウシ血清アルブミンもしくはヒト血清アルブミン、分析されるポリヌクレオチドとでハイブリダイズしない、断片化された天然もしくは合成ＤＮＡ、たとえばニシンもしくはサケ精液又は帯電していないが親水性のポリマー、たとえばポリエチレングリコールもしくはデキストランによって形成される群の化合物を「化学的に中性」の化合物として被着させることができる。
【００７７】
それに関して、特に、ポリヌクレオチドハイブリダイゼーション検定で非特異的ハイブリダイゼーションの低減のための前述の化合物（たとえばニシン又はサケ精液）の選択は、分析されるポリヌクレオチドとはできるだけ異なる、分析されるポリヌクレオチド配列との相互作用が知られていないＤＮＡの経験的好適さによって決定される。
【００７８】
本発明のさらなる主題は、少なくとも１個の励起光源と、本発明の光学構造とを含み、層（ａ）に内結合されかつ層（ａ）中を誘導される励起光の強さが、層（ａ）内及び層（ａ）上で、層（ａ）の表面又は２００nm未満の距離内に位置する分子を多光子励起によって励起させるのに十分なほど高い光学系である。
【００７９】
本発明の光学系の実施態様の一群に特徴的であることは、層（ａ）の表面又は層（ａ）から２００nm未満の距離内で多光子励起によって励起される分子が光反応性分子、すなわち、光による励起ののち化学反応性になる分子又は分子群であるということである。これに関して、一つの変形態様として、層（ａ）の表面又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に位置する前記光反応性分子の多光子励起によって光重合が開始される。その場合、たとえば、光不安定性の保護基を有する化合物が光反応性分子として適当である。
【００８０】
もう一つの変形態様に特徴的であることは、光解離が、すなわち、層（ａ）上又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に多光子励起工程の前に存在する分子又は分子複合体の破断が、層（ａ）上又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に位置する前記光反応性分子の多光子励起によって起こるということである。
【００８１】
特殊な変形態様として、前記光反応性分子は、比較的高分子量の分子を埋め込むための、特に天然及び人造（合成）ポリマーならびに生物学的分子、たとえばタンパク質、ポリペプチド及び核酸を埋め込むための分子マトリックスの一部である。特に好ましいものは、光学構造がマススペクトロメトリー、好ましくはＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳ（マトリックス支援レーザ脱離／イオン化飛行時間型マススペクトロメトリー）のためのサンプルキャリヤとして設けられる実施態様である。
【００８２】
好ましいものは、少なくとも１個の励起光源と、本発明の光学構造とを含み、層（ａ）に内結合され、層（ａ）中を誘導される励起光の強さが、層（ａ）内及び層（ａ）上で、層（ａ）の表面に又は２００nm未満の距離内に位置する分子を多光子励起によって励起させてルミネセンスに至らせるのに十分なほど高い光学系である。
【００８３】
本発明の光学系は、通常、層（ａ）への励起光の内結合が、プリズムカプラと、重畳する減衰フィールドを有する連結した光学導波体に基づく減衰カプラと、導波層の面に位置する合焦レンズ、好ましくは円柱レンズを有する前面カプラと、格子カプラとによって形成される群からの１個以上の光学内結合素子を使用して実施されるような方法で設計されている。
【００８４】
層（ａ）への励起光の内結合は、層（ａ）中で変調される格子構造によって実施されることが好ましい。
【００８５】
また、光学構造が平面薄膜導波構造であることが好ましい。
【００８６】
特に好ましいものは、少なくとも１個の励起光源と、上記実施態様のいずれかの光学構造とを含み、層（ａ）に内結合するための共振角で層（ａ）中で変調される格子構造（ｃ）に投射される励起光の強さが、層（ａ）上及び層（ａ）内で、少なくとも格子構造（ｃ）の領域で、層（ａ）の表面に又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に位置する分子を多光子励起によって励起させるのに十分なほど高い本発明の光学系の実施態様である。
【００８７】
好ましくは、多光子励起は２光子励起である。
【００８８】
好ましいものは、層（ａ）の表面に又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に位置する分子を、直線経路に沿って、すなわち層（ａ）中を誘導される励起光に沿って同時に多光子励起によって励起させるように作動可能であるような実施態様である。
【００８９】
特に有利なものは、層（ａ）の表面に又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に位置する分子の多光子励起を層（ａ）への励起光の内結合の位置から起算して少なくとも５mmの距離にわたり直線経路に沿って実施するように作動可能である実施態様である。
【００９０】
また、拡大した励起光の照射により、層（ａ）の表面に又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に位置する分子が、層（ａ）中を誘導される励起光に沿って拡大区域で同時に多光子励起によって励起されることが好ましい。層（ａ）への光の内結合が層（ａ）中で変調される格子構造（ｃ）によって実施されるならば、励起光束が格子線に対して平行に拡大されることが好ましい。
【００９１】
また、特に有利なものは、層（ａ）の表面に又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に少なくとも１mm2の面積で、好ましくは少なくとも１０mm2の面積で、さらに好ましくは少なくとも１cm2の面積で位置する分子の同時多光子励起を可能にするような本発明の光学系の実施態様である。
【００９２】
本発明の光学系の他の好ましい実施態様に特徴的であることは、系の一部としての光学構造が、格子構造（ｃ）によって内結合され、層（ａ）中を誘導される励起光の伝播方向に配設されることが好ましい、層（ａ）の連続非変調領域を含むということである。ここでもまた、多くの用途で、光学構造が、同一又は異なる周期を有する多数の格子構造（ｃ）を、場合によっては層（ａ）の連続非変調領域がそれに隣接する状態で、共通の連続基板上に含むならば、それは有利である。
【００９３】
また、本発明のルミネセンス励起のための光学系の多くの実施態様に不可欠な特徴は、多光子吸収によって層（ａ）の上に又はその近接場で生成されるルミネセンスが少なくとも部分的に層（ａ）中に結合されるとともに、層（ａ）中の誘導によって前記光学構造上の隣接領域に伝播されることである。
【００９４】
通常、本発明の光学系は、光学構造からの一以上のルミネセンスを検出するための少なくとも１個の検出器をさらに含む。
【００９５】
光学構造に当たるまでの励起光の光線誘導の幾何学に関して、多様な異なる実施態様が可能である。好ましい実施態様の一つに特徴的であることは、少なくとも１個の励起光源から発せられる励起光が本質的に平行であり、かつ、層（ａ）に内結合するための共振角で、光学的に透明な層（ａ）中で変調される格子構造（ｃ）に照射されるということである。
【００９６】
少なくとも１個の光源からの励起光が拡大光学部品によって本質的に平行な光束に拡大され、かつ、層（ａ）中に内結合するための共振角で、光学的に透明な層（ａ）中で変調される巨視的区域の肉眼的構造（ｃ）に照射されることが特に好ましい。
【００９７】
もう一つの好ましい実施態様に特徴的であることは、少なくとも１個の光源からの励起光が、回折光学要素又は、光源が多数ある場合には、好ましくはダンマン格子である多数の回折光学要素又は好ましくはマイクロレンズアレイである屈折光学要素によってできるだけ均一な強さの複数の個々の光線に分割され、個々の光線が、互いに対して本質的に平行に、層（ａ）に内結合するための共振角で格子構造（ｃ）に投射されるということである。
【００９８】
特定の用途では、同様な又は異なる発光波長の２個以上の光源を励起光源として使用することが好ましい。
【００９９】
二以上の異なる励起波長が照射されるような用途の場合、２個以上の光源からの励起光が異なる方向から同時又は順次に格子構造（ｃ）に投射され、異なる周期数の格子構造を重畳したものを含む格子構造によって層（ａ）中に内結合される光学系の実施態様が好ましい。
【０１００】
たとえば、ＣＣＤカメラ、ＣＣＤチップ、フォトダイオードアレイ、アバランシェダイオードアレイ、マルチチャネルプレート及びマルチチャネル光電子増倍管によって形成される群からの少なくとも１個の横方向に解像する検出器を信号検出に使用することが好ましい。
【０１０１】
本発明によると、光学系は、伝送される光束を成形するためのレンズもしくはレンズ系、光束を偏光させ、場合によってはさらに成形するための平面もしくは湾曲したミラー、光束を偏光させ、場合によってはスペクトル分離するためのプリズム、光束の部分をスペクトル選択的に偏光させるためのダイクロイックミラー、伝送される光の強さを調整するためのニュートラルフィルタ、光束の部分をスペクトル選択的に透過させるための光学フィルタもしくはモノクロメータ、又は励起及び／又はルミネセンス光の別個の偏光方向を選択するための偏光選択素子によって形成される群の光学部品が、１個以上の励起光源と本発明の光学構造との間に及び／又は光学構造と１個以上の検出器との間に配置されているような実施態様を含む。
【０１０２】
また、励起光を１fsec〜１０minの間隔のパルスで投射し、かつ、場合によっては、計測区域からの発光を時間分解的に計測することが可能である。これに関して、十分な時間的解像度の検出器の使用により、励起光のパルス照射によって計測区域からの発光の計測を実施し、修正することができる。通常、従来技術で公知の構造では２光子蛍光励起のために高いパルス繰り返し率のフェムト秒レーザが使用されてきたが、本発明の光学構造に関する本発明の光学系の場合、より長いパルス間隔のレーザ（たとえばピコ秒又はナノ秒レーザ）を、場合によってはより低い繰り返し率で、多光子ルミネセンス励起（好ましくは２光子ルミネセンス励起）のための励起光源として使用することもできるということが特徴的である。
【０１０３】
非常に短いパルスのレーザを使用するとき、このようなレーザからの励起光を本発明の光学構造に内結合する効率を最大限にするためには、パルス長からの励起パルスのスペクトル帯域幅の依存性（不確定性関係の結果として）を考慮に入れなければならない。たとえば、１００fsレーザは、５〜１５nm程度の帯域幅を有することができる。これは、格子構造（ｃ）による導波構造への内結合の達成可能な効率に関して、たとえば深さ＜１０nmの浅い格子の場合、内結合のための共振条件は、一定の調節角で照射されるスペクトルの小さな部分に関してしか満たされず、したがって、内結合効率が低いということを意味する。より深い格子を使用すると、角とスペクトル許容度との双方に関して共振条件の鋭さを落とすことができる。これは、原則的に、１〜１０psecよりも短いレーザパルスを使用するとき、格子パラメータを最適化するためにはこの関係を考慮に入れなければならないことを意味する（他の系パラメータにも依存する）。一傾向として、より短いレーザパルスの内結合にはより大きな格子深さが求められる。
【０１０４】
本発明の光学系のさらなる好ましい実施態様に特徴的であることは、参照のため、計測区域の他に、光源の位置での励起光、拡大後の励起光又は個々のビームに分割された後の励起光、一以上の横方向に分けられた計測区域の位置からの励起波長の散乱光及び格子構造（ｃ）によって外結合された励起波長の光によって形成される群の光信号が計測されるということである。それに関して、発光の測定のための計測区域と参照信号の測定のための計測区域とが同一であるならば、それは特に有利である。
【０１０５】
励起光の投射及び一以上の計測区域からの発光の検出は、一以上の計測区域ごとに順次に実施することができる。これに関して、特に、ミラー、偏光プリズム及びダイクロイックミラーによって形成される群の可動光学部品によって順次の励起及び検出を実施することができる。
【０１０６】
また、本発明の一部は、本質的に焦点及び角度保存的なスキャナを使用して順次の励起及び検出が実施されるような光学系である。また、光学構造を順次の励起及び検出の工程の間で動かすことが可能である。
【０１０７】
本発明のさらなる主題は、光学導波体を含む光学構造上の一以上の計測区域で少なくとも１種のサンプル中で１種以上の分析対象物を、その分析対象物、その結合相手又は分析対象物分子を取り囲むサンプルマトリックス分子の多光子励起によって測定するための分析系である。この分析系は、
本発明及び記載した実施態様のいずれかの光学構造と、
本発明及び上記実施態様のいずれかの光学系と
を含む。
【０１０８】
ここでもまた、前記光学導波体は、好ましくは光学薄膜導波体として設けられる。
【０１０９】
本発明のこのような分析系の特別な実施態様は、それがマススペクトロメトリー、好ましくはＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳ（マトリックス支援レーザ脱離／イオン化飛行時間型マススペクトロメトリー）のための計測系であり、前記光学構造がマススペクトロメトリーのためのサンプルキャリヤであり、測定される分析対象物分子、好ましくは比較的高分子量の分子、特に天然及び人造（合成）ポリマーならびに生物学的分子、たとえばタンパク質、ポリペプチド及び核酸が光反応性分子のマトリックスに埋め込まれ、このマトリックスから、前記光反応性分子の多光子励起によって解離させ、脱着させることができることを特徴とする。
【０１１０】
特殊な実施態様に特徴的であることは、層（ａ）上又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に位置する前記光反応性分子の多光子励起によって光重合が開始されるということである。
【０１１１】
もう一つの変形態様に特徴的であることは、光解離が、すなわち、多光子励起の工程の前に存在する分子又は分子複合体の破断が、層（ａ）上又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に位置する前記光反応性分子の多光子励起によって開始されるということである。
【０１１２】
好ましいものは、光学導波体（好ましくは薄膜導波体として設けられる）を含む光学構造の一以上の計測区域で少なくとも１種のサンプル中の１種以上の分析対象物を、分析対象物又はその結合相手の一つの多光子励起によるルミネセンス検出によって測定するための、
本発明の光学構造と、
本発明の光学系と、
１種以上のサンプルを光学構造の計測区域と接触させるための供給手段と
を含む分析系である。
【０１１３】
これに関して、分析系が、少なくとも一以上の計測区域の領域で光学構造に向けて開口した１個以上のサンプル区画をさらに含み、サンプル区画それぞれが好ましくは０．１nl〜１００μlの容積を有することが好ましい。
【０１１４】
一つの可能な実施態様として、サンプル区画は、光学的に透明な層（ａ）とは反対側が、サンプル及び場合によってはさらなる試薬の供給又は排除のための入口及び出口を除いて閉じられ、サンプル及び場合によってはさらなる試薬の供給又は排除が、共通の入口及び出口を有するいくつかの計測区域又はセグメントへの液体供給の場合、これらの開口が好ましくは行ごと又は列ごとに指定される閉鎖スルーフロー系で実施される。
【０１１５】
もう一つの可能な実施態様に特徴的であることは、サンプル区画が、サンプル又は他の試薬の局所的な指定供給又は排除のための開口を光学的に透明な層（ａ）とは反対側に設けられているということである。
【０１１６】
スクリーニング用途、たとえば、いわゆる「標的」化合物に結合することができる化合物の選択及び連続工程におけるこれらの化合物の濃縮に特に適しているものは、光学導波体（好ましくは薄膜導波体として設けられる）を含む光学構造の一以上の計測区域上の少なくとも１種のサンプル中で１種以上の分析対象物を、分析対象物又はその結合相手の一つのルミネセンス励起によるルミネセンス検出によって測定するための、
本発明の光学構造と、
本発明の光学系と、
１種以上のサンプルを光学構造の計測区域と接触させるための供給手段と、
１種以上のサンプル及び場合によってはさらなる試薬を受けるための１個以上のサンプル区画と、
サンプル区画に含まれる液体を除去するための手段と
を備え、
一以上の計測区域中の１種以上の分析対象物の結合の検出ののち、前記分析対象物と各固定化された認識要素及び場合によってはさらなる結合相手との間に形成される分子複合体を多光子励起後の光解離によって分裂させることができるか、光学構造から脱着させることができ、前記分子複合体を、各サンプル区画からの溶離ののち、まるごと又は断片化された形態でさらなる分析又は調製処理に付すことができる分析系である。
【０１１７】
これに関して、多光子励起による光解離のために前記光学構造上の１種以上のサンプル中で検出された分析対象物とで形成された、異なる分子複合体又は分子複合体の断片の分離をこれらの分子複合体の吸収断面にしたがって可能にするような本発明の分析系の実施態様が好ましい。
【０１１８】
本発明のさらなる主題は、本発明の光学構造及び／又は本発明の光学系及び／又は本発明の分析系の使用を含む、層（ａ）に内結合されかつ層（ａ）中を誘導される励起光の強さが、層（ａ）内及び層（ａ）上で、層（ａ）の表面に又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に位置する分子を多光子励起によって励起させるのに十分なほど高い多光子励起の方法である。
【０１１９】
本発明の方法の実施態様の一群に特徴的であることは、光学構造の層（ａ）の表面又は層（ａ）から２００nm未満の距離に位置する分子が光反応性であり、多光子励起によって励起して化学反応に至らせることができるということである。
【０１２０】
これに関して、一つの変形態様として、光学構造の層（ａ）の表面又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に位置する分子を多格子励起によって励起して他の分子に結合させることができる。特別な実施態様に特徴的であることは、光学構造の層（ａ）の表面又は層（ａ）から２００nm未満の距離に位置する分子を多格子励起によって励起して光重合に至らせることができることである。
【０１２１】
本方法のもう一つの変形態様に特徴的であることは、光解離が、すなわち、層（ａ）上又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に多光子励起まで存在する分子又は分子複合体の破断が、層（ａ）上又は２００nm未満の距離内に位置する前記光反応性分子の多光子励起によって開始されるということである。
【０１２２】
本発明の方法の特別な実施態様に特徴的であることは、前記分析系がマススペクトロメトリー、好ましくはＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳ（マトリックス支援レーザ脱離飛行時間型マススペクトロメトリー）のための計測系であり、前記光学構造がマススペクトロメトリーのためのサンプルキャリヤであり、検出される分析対象物分子、好ましくは比較的高分子量の分子、特に天然及び人造（合成）ポリマーならびに生物学的分子、たとえばタンパク質、ポリペプチド及び核酸が光反応性分子のマトリックスに埋め込まれ、このマトリックスから、前記光反応性分子の多光子励起によって解離させ、脱着させることができることである。
【０１２３】
好ましい実施態様は、本発明の光学構造及び／又は本発明の光学系及び／又は本発明の分析系の使用を含むルミネセンス励起の方法であって、層（ａ）に内結合されかつ層（ａ）中を誘導される励起光の強さが、層（ａ）上及び層（ａ）内で、層（ａ）の表面に又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に位置する分子を多光子励起によって励起させてルミネセンスに至らせるのに十分なほど高いルミネセンス励起の方法である。
【０１２４】
特に好ましいものは、本発明及び前記実施態様のいずれかの光学構造の一以上の計測区域上の１種以上のサンプル中で１種以上の分析対象物をルミネセンス検出によって検出するための、前記光学構造上の計測区域からの又は少なくとも二以上の横方向に分けられた計測区域（ｄ）のアレイ又はいくつかの計測区域を含む少なくとも２個以上の横方向に分けられたセグメント（ｄ′）のアレイからの一以上のルミネセンスを測定するための方法であって、層（ａ）に内結合されかつ層（ａ）中を誘導される励起光の強さが、層（ａ）上及び層（ａ）内で、層（ａ）の表面に又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に位置する分子を多光子励起によって励起させてルミネセンスに至らせるのに十分なほど高い方法である。
【０１２５】
本発明の方法では、層（ａ）への励起光の内結合は、プリズムカプラと、重複する減衰フィールドを有する連結した光学導波体に基づく減衰カプラと、導波層の前に位置する合焦レンズ、好ましくは円柱レンズを有する前面カプラと、格子カプラとによって形成される群からの１個以上の光学内結合素子を使用して実施することができる。
【０１２６】
層（ａ）への励起光の内結合は、層（ａ）中で変調される格子構造によって実施されることが好ましい。
【０１２７】
好ましくは、光学構造は平面薄膜導波構造である。
【０１２８】
特に好ましいものは、少なくともある励起波長で光学的に透明である層（ａ）を、少なくとも前記励起波長で同じく光学的に透明である、層（ａ）よりも低い屈折率の層（ｂ）の上に有するとともに、層（ａ）中で変調される少なくとも１個の格子構造（ｃ）を有する平面薄膜導波体を含む光学導波体の使用を含む方法であって、層（ａ）に内結合するための共振角で投射される励起光の強さが、層（ａ）上及び層（ａ）内で、少なくとも格子構造（ｃ）の領域で、層（ａ）の表面に又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に位置する分子を多光子励起によって励起させるのに十分なほど高い方法である。
【０１２９】
多光子励起は２光子励起であることが好ましい。
【０１３０】
有利であるものは、光学構造の層（ａ）の表面に又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に位置する分子を、直線経路に沿って、すなわち層（ａ）中を誘導される励起光に沿って同時に多光子励起によって励起させることができる本発明の方法の実施態様である。
【０１３１】
特に有利であるものは、層（ａ）の表面に又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に位置する分子の多光子励起が、層（ａ）への励起光の内結合の位置から起算して少なくとも５mmの距離にわたり直線経路に沿って可能になるような実施態様である。
【０１３２】
また、拡大した励起光の照射により、層（ａ）の表面に又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に位置する分子を、層（ａ）中を誘導される励起光に沿って拡大区域で同時に多光子励起によって励起させることができることが好ましい。格子構造（ｃ）によって光を層（ａ）に内結合する場合、励起光束は、ここでもまた、好ましくは、格子線に対して平行に拡大される。
【０１３３】
特に有利であるものは、同じく、層（ａ）の表面に又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に少なくとも１mm2の面積で、より好ましくは少なくとも１０mm2の面積で、さらに好ましくは少なくとも１cm2の面積で位置する分子の同時多光子励起を可能にするような本発明の方法の実施態様である。
【０１３４】
本発明の方法の種々の実施態様に関して、光学構造が、格子構造（ｃ）によって内結合されかつ層（ａ）中を誘導される励起光の伝播方向に配設されることが好ましい、層（ａ）の連続非変調領域を含むならば、それは有利であることができる。光学構造が、同一又は異なる周期を有する多数の格子構造（ｃ）を、場合によっては層（ａ）の連続非変調領域がそれに隣接する状態で、共通の連続基板上に含むならば、それは特に有利であることができる。それに関して、方法の好ましい実施態様では、光学系は、多光子吸収によって光学構造の層（ａ）の上に又は近接場で生成されるルミネセンスが少なくとも部分的に層（ａ）中に結合されるとともに、層（ａ）中の誘導によって前記光学構造の隣接領域に伝播するような方法で設計されている。
【０１３５】
上記ルミネセンス検出法の場合、（１）等方向のルミネセンス又は（２）層（ａ）に内結合され、格子構造（ｃ）によって外結合されたルミネセンス又は両方の部分（１）及び（２）のルミネセンスを同時に計測することができる。
【０１３６】
ルミネセンス又は蛍光の生成のために、本発明の方法では、２００nm〜１１００nmの波長で励起することができるルミネセンス又は蛍光標識を使用することができる。ルミネセンス又は蛍光標識は、従来のルミネセンス又は蛍光染料であってもよいし、半導体に基づく発光又は蛍光ナノ粒子であってもよい（W. C. W. Chan及びS. Nieの"Quantum dot bioconjugates for ultrasensitive nonisotopic detection", Science 281 (1998) 2016-2018）。当然、加えられる励起波長で特に大きな多光子吸収断面を有し、好ましい２光子励起の場合には特に大きな２光子吸収断面を有し、同時にできるだけ高い光安定性を示すルミネセンス標識が好適である。
【０１３７】
ルミネセンス標識は２光子吸収によって励起されることが好ましい。前記ルミネセンス標識を可視又は近赤外の励起光の２光子吸収によって励起して紫外線又は青ルミネセンスに至らせることが特に好ましい。
【０１３８】
ルミネセンス標識は、分析対象物に結合することもできるし、競合検定では、分析対象物類似体に結合することもできるし、多工程検定では、固定化された生物学的、生化学的又は合成認識要素の結合相手の一つに結合することもできるし、生物学的、生化学的又は合成認識要素に結合することもできる。
【０１３９】
さらには、第一のルミネセンス標識と同じ又は異なる励起波長及び同じ又は異なる発光波長の第二以降のルミネセンス標識を使用することができる。それに関して、第二以降のルミネセンス標識が、第一のルミネセンス標識と同じ波長で励起され、他の波長で発光することができるならば、それは有利であることができる。
【０１４０】
他の用途では、加えられる発光染料の励起スペクトルと発光スペクトルとが重複しないか、部分的にしか重複しないならば、それは有利であることができる。
【０１４１】
本発明の方法では、供与体として働く第一の発光染料から受容体として働く第二の発光染料への電荷又は光エネルギーの移動が分析対象物の検出に使用されるならば、それはさらに有利であることができる。
【０１４２】
本発明のルミネセンス検出による１種以上の分析対象物の測定方法の特別な実施態様は、層（ａ）の表面又は層（ａ）から２００nm未満の距離に位置する蛍光が可能である生分子、たとえば、蛍光が可能であるアミノ酸を有するタンパク質、たとえばトリプトファン、トリシン又はフェニルアニリンの、固有蛍光（「自己蛍光」）を多光子吸収（好ましくは２光子吸収）によって励起する能力に基づく。この群のうち、２８０nmで約５６００（１mol-1cm-1）のモル吸光係数及び約３６０nmの発光で２０％の発光量子収率を有するトリプトファンが好ましい。したがって、トリプトファン蛍光の励起は通常、高屈折導波体の減衰フィールドにおける従来の１光子吸収法によっては可能ではない。理由は、そのような短い波長の励起光は、導波体中で有意な距離を誘導されることはなく、吸収されたり散乱したりするからである。また、そのような短波長励起光を導波体に送ることは、たとえば励起光がまずこの波長で吸収性を示す物質（たとえば大部分のプラスチック）を透過しなければならないならば、しばしば不可能である。しかし、本発明の方法によると、適切な長めの波長の励起光を２光子吸収法に適用し、それを導波体（ａ）中で長めの距離にわたって誘導し、それにより、短波長蛍光を励起することが可能である。特別な利点として、方法のこの変形態様は、測定方法における分析対象物又はその結合相手の一つとルミネセンス標識との化学的会合を要しない。その代わりに、測定は、これらの化合物の天然部分として存在するか、生物学的製造法で分析対象物又はその結合相手の一つに挿入される、ルミネセンスが可能である生物学的化合物の検出に直接基づくことができる。
【０１４３】
本発明の方法のこの特殊な実施態様に関して、ここでもまた、多くの下位的変形態様が可能である。たとえば、分析対象物検出のために固定化された生物学的、生化学的又は合成認識要素は、多光子励起により、固有ルミネセンスを示さないか、できるだけ低いルミネセンスしか示さない（適用された実験条件下で）ような方法で選択することができる。したがって、分析対象物検出工程で、測定法で適用される分析対象物そのもの又は結合相手の一つの多光子吸収によってルミネセンス励起されると、バックグラウンド信号を最小限にすることが可能である。もう一つの有利な実施態様は、計測区域に固定化された生物学的、生化学的又は合成認識要素の固定化密度を、多光子吸収によって励起されるそれら固有ルミネセンス（固有蛍光又は自己蛍光）によって測定することに基づく。したがって、分析対象物検出工程（多光子吸収又は１光子吸収による）の間に励起される分析対象物からの又はその結合相手の一つからのルミネセンス信号を利用可能な結合部位の数及び密度に関して修正及び／又は正規化することが可能である。
【０１４４】
特に、分析対象物及び／又はその結合相手ならびに固定化された認識要素の適切な吸収スペクトルの条件下、１光子吸収及び多光子吸収の場合に、１個の同じレーザを（同時又は順次）１光子及び多光子励起ルミネセンスに適用することできる。このような順次励起の場合、好ましい順序は具体的な用途に依存して異なることがある。
【０１４５】
層（ａ）の表面のエネルギー密度が非常に高く、適切な吸収断面のルミノフォアを使用する場合、ルミネセンス励起を三つの異なる波長で、たとえば発光波長１０６４nmのレーザを用いる１光子吸収によるＮＩＲ染料の励起、２光子吸収による可視での染料の励起（約５３２nm）及び３光子吸収によるＵＶ染料の励起（約３５５nm）を同時に実施することができると想像することができる。７８０nmで発光するレーザを使用する場合、対応する波長は、２光子吸収の場合で３９０nmであり、３光子吸収の場合で２６０nmであろう。
【０１４６】
したがって、本発明の多光子励起の方法は、照射波長における１光子吸収の過程によって励起される、ルミネセンスが可能である分子からの発光の同時又は順次ルミネセンス検出と組み合わせることができる。
【０１４７】
さらには、励起波長における一以上のルミネセンスの計測及び／又は光信号の測定が偏光選択的に実施されるならば、それは有利であることができる。さらには、本方法は、励起光の偏光とは異なる偏光で一以上のルミネセンスを計測する可能性を提供する。
【０１４８】
本発明のさらなる主題は、光学導波体（好ましくは薄膜導波体として設けられる）を含む光学構造の一以上の計測区域における少なくとも１種のサンプル中で、分析対象物又はその結合相手の一つのルミネセンス励起（１光子又は多光子励起ののち）によるルミネセンス検出によって１種以上の分析対象物を測定するための分析系を、
本発明の光学構造と、
本発明の光学系と、
１種以上のサンプルを光学構造の計測区域と接触させるための供給手段と、
１種以上のサンプル及び場合によってはさらなる試薬を受けるための１個以上のサンプル区画と、
サンプル区画に含まれる液体を除去するための手段と
ともに使用して、一以上の計測区域中の１種以上の分析対象物の結合の検出ののち、前記分析対象物と各固定化された認識要素及び場合によってはさらなる結合相手との間に形成される分子複合体を多光子励起後の光解離によって分裂させることができるか、光学構造から脱着させることができ、前記分子複合体を、各サンプル区画からの溶離ののち、まるごと又は断片化された形態でさらなる分析又は調製処理に付すことができる本発明の方法の実施態様である。
【０１４９】
本発明の方法の特別な変形態様に特徴的であることは、層（ａ）の表面に又は層（ａ）から２００nm未満の距離に位置する分子が、層（ａ）上及び層（ａ）内に照射される励起光の大きな増幅により、この距離内で捕捉されるということである。理由は、高い表面閉じ込め励起光の強さと表面に向かう方向におけるその勾配の増大とがこれらの分子に「光学ピンセット」の作用を受けさせるからである。
【０１５０】
本発明及び上記実施態様のいずれかの方法は、抗体もしくは抗原、受容体もしくはリガンド、キレート化剤もしくは「ヒスチジンタグ成分」、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡもしくはＲＮＡストランド、ＤＮＡもしくはＲＮＡ類似体、酵素、酵素補因子もしくは阻害薬、レクチン及び炭水化物を含む群の１種以上の分析対象物の同時及び／又は順次の定量的及び／又は定性的測定を見込んだものである。
【０１５１】
試験するサンプルは、天然に産出する体液、たとえば血液、血清、血漿、リンパ液もしくは尿又は卵黄であることができる。
【０１５２】
試験するサンプルはまた、光学的に濁った液体もしくは表面水、土壌抽出物、植物抽出物又はバイオもしくはプロセスブロスであることができる。
【０１５３】
試験するサンプルはまた、生物学的組織片から採取することができる。
【０１５４】
本発明のさらなる主題は、薬学的研究、コンビナトリアルケミストリー、臨床及び臨床前開発におけるスクリーニング法での化学的、生化学的又は生物学的分析対象物の測定のための定量的及び／又は定性的分析、アフィニティースクリーニング及び研究における運動パラメータのリアルタイム結合研究及び測定、特にＤＮＡ及びＲＮＡ分析学のための分析対象物定性的及び定量的測定、毒性発生研究及び発現プロフィールの決定、ならびに医薬品研究開発、ヒト及び動物の診断、農薬製品研究開発における抗体、抗原、病原体又はバクテリアの決定、医薬品開発及び治療薬選択における患者層別化、食品及び環境分析学における病原体、有害薬剤及び細菌、特にサルモネラ、プリオン及びバクテリアの決定のための、本発明の光学構造及び／又は本発明の光学系及び／又は本発明の分析系及び／又は本発明の方法ならびに上記実施態様いずれかの使用である。
【０１５５】
本発明のさらなる主題は、本発明の光学構造及び／又は本発明の光学系及び／又は本発明の方法の、非線形光学又は遠隔通信もしくは通信技術における使用である。
【０１５６】
非常に一般的に、本発明の光学構造及び／又は本発明の光学系及び／又は本発明の分析系及び／又は本発明の方法は、非常に高い励起光強さ及び／又は励起期間の適用を要する表面閉じ込め研究、たとえば材料の光安定性の研究、光触媒法などに適している。
【０１５７】
記載した具体的な実施態様によって本発明の汎用性を限定する意図なく、以下の例によって本発明をさらに詳細に説明する。
【０１５８】
例１
１．ルミネセンスの２光子励起のための光学構造
光学構造は、ガラス基板（光学層（ｂ）としてのＡＦ４５ガラス、８００nmでｎ＝１．４９６）と、五酸化タンタルの１５０nm薄層（ａ）（導波層（ａ）、８００nmでｎ＝２．０９２）からなるものであった。層（ａ）中に９mm間隔で生成したレリーフ格子の形態の結合格子（格子周期３６０nm、格子深さ１２nm）を、層（ａ）への光の内結合及び層（ａ）からの光の外結合に使用した。これらの条件の下、ガラス基板（光学層（ｂ）、８１０nmでｎ＝１．４９６）から導波層（ａ）への方向における内結合角は−２０．４゜であった。層（ａ）への外部投射角（光学構造の法線に対して計測）は−３１．４゜に達した。
【０１５９】
２光子励起の場合のこの光学構造の適性の生成及び実証のために、ローダミンのエタノール溶液（エタノール中１５．９μMローダミンＢ）０．５μlの滴を層（ａ）上の２個の格子構造の間に被着させて、エタノールの蒸発後、ルミネセンスが可能である分子の例としてのローダミン分子が層（ａ）上に残るようにした。
【０１６０】
２．２光子励起のための光学系、２光子励起の計測方法及び結果
約８００nmで発光するパルス式チタンサファイヤレーザ（パルス長：１００fs、繰返し率：８０MHz、平均印加電力：最大０．６Wまで、スペクトルパルス幅：８nm）を励起光源として使用した。レーザによって発せられる励起光の強さは、電気光学変調器を使用して本来の出力の０％〜１００％の間で連続的に調整することができる。また、コンピュータ制御の下、この範囲で連続的に加減することもできる。
【０１６１】
光学構造の内結合格子（ｃ）上に所望の形状の平行な投射励起光束を生成するため、励起光路中の電気光学変調器の後に（導波構造に向かう方向で）レンズを挿入した。ｘ、ｙ及びｚ方向への並進（格子線に対して平行及び垂直）及び回転（内結合格子の格子線と同一である回転軸で）を可能にするための調節部品に取り付けたミラーを使用して、投射励起光を光学構造の内結合格子（ｃ）に向けた。
【０１６２】
まず、０．４Wの平均照射出力で、平行化したビームを内結合のための共振角で内結合格子に向けた。そのために、内結合格子（光学構造の平面）がビームウエスに位置する状態でレンズ（ｆ＝１２．７cm）によってビームをわずかに合焦させて、励起光が平面波として内結合格子に到達するようにした。驚くことに、固定化されたルミネセンス染料の領域で、光学構造中を誘導されるモードに沿って、屋内照明の下で肉眼でも観察することができるような強さの２格子蛍光が励起された（図１、フィルタなしで撮影）。画像部分は、光学構造を内側に取り付けられたホルダを示す。左側の明るい光点は、内結合格子への励起光の内結合の位置を示す。写真はフィルタなしで撮られているため、長い波長でカメラの感度が低下するにもかかわらず、格子で散乱する励起光の強さはカメラによって記録するのに十分な強さであった。内結合モード（波長８００nm）は、画像面で左から右に伝播した。ローダミン染料が固定化されている領域に達する前に、誘導モードは見えなくなった。そして、モード伝播がさらに右に向かうと、２光子励起によって生成されたローダミン染料の蛍光が明らかに見えるようになった。観察された光の跡は、誘導励起光が再び外結合される次の格子構造までの８mmの長さに相当した。全距離にわたり、誘導光及び励起された２格子蛍光の有意な減衰を観察することはできなかった。
【０１６３】
図２は、検出器としてのＣＣＤカメラの前にＩＲ遮断フィルタ（ＢＧ３９）を使用して撮影した励起された２光子蛍光のプロフィールを格子線に対して平行な断面図で示す。励起ビームプロフィールは、格子上で、蛍光トレースの計測された半値幅と良好に合致する約１００μmの理論幅に調節した。この例では、８mmの距離にわたる直線トレースに沿って（蛍光プロフィールの基底幅をとって約２mm2の面積）２格子励起によって蛍光を発生させた。誘導された励起光の伝播長、ひいては２格子励起の励起長は外結合格子によってのみ制限されるということが注記されなければならない。
【０１６４】
図３は、さらなるビーム形成レンズなしで直接照射されたレーザ光線の対応する蛍光プロフィールを示す。この場合、蛍光プロフィールの半値幅は約３６０μmであり、基底幅は約８００μmであり、約６mm2の全面積（８mmのモード伝播長に沿って）で２格子励起によって励起される蛍光に相当した。
【０１６５】
次に、さらなる工程で、円柱レンズ（ｆ＝４０mm）を用いてレーザビームを格子線に対して平行に拡大した。対応する蛍光プロフィール（図４）から、２０mm2を超える全面積で２格子励起によって励起される蛍光に対応する約１．７mmの半値幅及び約３mmの基底幅を測定した。
【０１６６】
励起蛍光が２格子励起によって生じたものであることを紛れなく識別するための重要な規準は、照射励起強さに対するその強さの二次方程式的依存性である。このためには、ＣＣＤカメラの代わりに、ロックイン増幅器（チョッパ周波数：２kHz）に接続されたＳｉフォトダイオードを検出器として使用した。導波構造の減衰フィールドにおける２格子励起によって励起された等方性に発される蛍光を、レンズにより、フォトダイオードの前に配置されたＩＲ遮断フィルタ（ＢＧ３９）をここでも使用して、前記フォトダイオードに合焦させた。コンピュータ制御された電気光学変調器により、光学構造に照射される励起強さを０mWから３００mW（平均照射出力）近くまで６mWきざみで増大させ、発生した蛍光強さを同時に計測した。図５は、計測された蛍光強さ及び、直線として、計測された強さの方程式ｙ≒ａｘ2（ｙは蛍光強さに対応し、ｘは励起強さに対応し、ａはフィッティングパラメータに対応する）へのあてはめを示す。驚くことに、さらなるバックグラウンド信号に相当するであろうオフセットなしで、励起強さに対する計測された蛍光強さの完璧な二次方程式的依存性が見いだされた。このように、この例では、計測された蛍光が疑う余地なく２光子励起に起因し、この実験条件下、バックグラウンド信号なしで、この２光子蛍光を励起することができるということが実証された。
【０１６７】
例２：２格子励起のための光学系
発光波長８１０nmの高出力レーザダイオード（ファイバ結合、１０W）を励起光源として使用した。ファイバの背後に（光の伝播方向で）位置するビーム成形光学部品により、所望の形状の平行な励起光束を生成し、光学構造の導波層（ａ）への内結合のための結合角で格子（格子周期３６０nm、格子深さ１２nm）に照射した。ガラス基板（光学層（ｂ）、８１０nmでｎ＝１．４９６）における内結合角は−２１．７゜であり、外投射角は−３４．１゜であった。導波層（ａ）は１５０nm五酸化タンタル（８１０nmでｎ＝２．０９）であった。これらのパラメータを使用して、２４％の部分を層（ａ）中に結合することができ、層（ａ）の表面における励起光強さは２格子励起にとって十分であった。
【図面の簡単な説明】
【０１６８】
【図１】本発明の導波構造による２光子励起ののち生成された、裸眼で見ることができる蛍光のＣＣＤカメラ画像を示す図である。
【図２】異なる程度に平行化された励起光線を使用して励起を実施した場合に２光子励起によって生成される蛍光の断面プロフィールを示す図である。
【図３】異なる程度に平行化された励起光線を使用して励起を実施した場合に２光子励起によって生成される蛍光の断面プロフィールを示す図である。
【図４】光学構造の格子線に対して平行に拡大された励起光線を使用する励起ののち、２光子蛍光によって生成された蛍光の断面プロフィールを示す図である。
【図５】励起光の強さに対する計測された蛍光強さの二次方程式的依存性を示す図である。
【０００１】
本発明は、少なくともある励起波長で光学的に透明である導波層（ａ）を有する光学導波体を含む光学構造であって、層（ａ）に内結合されかつ層（ａ）の中を誘導される励起光の強さが、層（ａ）内及び層（ａ）上で、層（ａ）の表面又は２００nm未満の距離内に位置する、ルミネセンスが可能である及び／又は光反応性である分子を多光子励起、好ましくは２光子励起によって励起するのに十分なほど高くなる光学構造の可変的な実施態様に関する。これに関して、層（ａ）中を誘導される励起光のトレースに沿って、巨視的距離にわたり又は拡大面で多光子励起を可能にする実施態様が好ましい。本発明はまた、励起光源を有する光学系及び分析系の種々の実施態様ならびに本発明の光学構造の実施態様ならびにそれに基づく、特にルミネセンス励起のための及び多光子励起後のルミネセンス検出による１種以上の分析対象物の測定のための方法ならびにその使用に関する。
【０００２】
本発明の目標は、導波構造の近接場、すなわち導波構造の上で又は約２００nm未満の距離内で、ルミネセンスが可能である及び／又は光反応性である分子の多光子励起を可能にするための光学構造及び使いやすい光学的方法を提供することである。
【０００３】
本発明の範囲内で、「多光子励起」とは、分子（又は分子群）が、得られた励起状態から別の状態、特に基底状態まで緩和する前に、照射励起波長の多数の光子を吸収することをいうと理解される。このような多光子励起の結果は、基底状態への減衰によって発される、照射励起波長よりも短い波長のルミネセンス、特に蛍光であることできる。結果はまた、光反応性状態への遷移のための活性化障壁の解消であることができる。この光反応性状態は、他の分子又は分子複合体への分子結合の形成（たとえば光重合の形態）に通じることもできるし、既存の結合の破断（後に脱着が続くこともある光解離）に通じることもできる。相応に、「１光子励起」とは、単一の光子の吸収によって分子が前記励起状態に励起されることと理解される。
【０００４】
明示的に区別されない限り、「分子群」（たとえば、蛍光的にマークされた分子の一部としての蛍光標識）は、「分子」の使用に含まれる。
【０００５】
たとえば生化学的分析学では、供給されたサンプル中の分析対象物を、表面に固定化された生化学的又は生物学的又は合成認識要素を使用して高い選択性及び感度で測定するための構造及び方法が大きく要望されている。それに関して、多くの公知の測定法は、分析対象物の存在における一以上のルミネセンスの検出に基づく。
【０００６】
これに関して、本出願では「ルミネセンス」は、光学的又は非光学的、たとえば電気的、化学的、生化学的又は熱的励起ののちに起こる、紫外線から赤外線までのスペクトル範囲における光子の自然発生的放出をいう。たとえば、ケミルミネセンス、バイオルミネセンス、エレクトロルミネセンスならびに特に蛍光及びリン光が「ルミネセンス」に含まれる。
【０００７】
以下、「物質の光学透明性」は、少なくともある励起波長でその物質の透明性が求められるという意味で使用する。より短い又はより長い波長では、この物質は吸収性になることもできる。
【０００８】
近年、わずか数１００ナノメートルの薄い導波膜に基づく高屈折薄膜導波体により、感度が有意に高められた。たとえば、ＷＯ９５／３３１９７には、レリーフ格子を回折光学要素として使用して励起光を導波膜に結合する方法が記載されている。センサプラットフォームの表面を、分析対象物を含有するサンプルと接触させ、減衰フィールドの浸透深さ内に位置しかつルミネセンスが可能である物質から等方的に発されるルミネセンスを、適切な計測装置、たとえばフォトダイオード、光電子増倍管又はＣＣＤカメラによって記録する。また、減衰的に励起されたルミネセンスのうち、導波体に逆結合された部分を回折光学要素、たとえば格子によって外結合し、計測することが可能である。この方法はたとえばＷＯ９５／３３１９８に記載されている。
【０００９】
以下、「減衰フィールド」と「近接場」とは同義に使用する。
【００１０】
現在の技術水準、特にＷＯ９５／３３１９７及びＷＯ３３／１９８における上記した減衰的に励起されるルミネセンスを検出する方法の欠点は、センサプラットフォームの、均質な膜として設けられた導波層上で常に１種のサンプルしか分析することができないことである。同じセンサプラットフォーム上でさらなる計測を可能にするためには、面倒な洗浄及び清浄工程が絶えず求められる。これは、最初の計測とは別の分析対象物を測定しなければならない場合、特に当てはまる。免疫検定の場合、これは通常、センサプラットフォーム上の固定化層をまるごと交換しなければならないか、新たなセンサプラットフォームを全体として使用しなければならないことを意味する。
【００１１】
したがって、いくつかのサンプルを平行に、すなわち同時に又は追加的な清浄工程をはさむことなく続けざまに分析することを可能にする方法を開発することが要望されている。
【００１２】
本質的に単モードの平面無機導波体を使用してルミネセンス検出のみに基づく多数の計測を同時又は順次に実施するため、たとえばＷＯ９６／３５９４０には、互いに別々に励起光を照射される少なくとも二つの別個の導波区域が１個のセンサプラットフォーム上に配設されている装置（アレイ）が報告されている。しかし、センサプラットフォームを別々の導波区域に隔離することから生じる欠点として、共通のセンサプラットフォーム上の別個の導波領域における別個の計測区域のための所要面積が比較的大きい。したがって、ここでもまた、比較的低い密度の異なる計測フィールド（又はいわゆる「フィーチャ」）しか達成することができない。
【００１３】
したがって、フィーチャ密度を増す又は計測面積あたりの所要面積を減らすこともまた要望されている。
【００１４】
簡単なガラス又は顕微鏡スライドに基づき、さらなる導波層をもたない、非常に高いフィーチャ密度のアレイが公知である。たとえば、米国特許第５，４４５，９３４号（Affymax Technologies）では、１平方センチメートルあたり１０００を超えるフィーチャの密度を有するオリゴヌクレオチドのアレイが記載され、特許請求されている。このようなアレイの励起及び読出しは、従来の光学構造及び方法に基づく。拡大させた励起光束を使用するとアレイ全体を同時に照らすことができるが、結果として、比較的低い感度しか得られない。散乱光の部分が比較的大きくなり、また、分析対象物の結合のためのオリゴヌクレオチドが固定化されていない領域では、ガラス基板からの散乱光又はバックグラウンド蛍光が発生する。励起及び検出を固定化されたフィーチャの領域に限定し、隣接領域における発光を抑制するため、共焦点計測構造が広く使用され、種々のフィーチャが走査によって順次に分析される。しかし、その結果、大きなアレイの読出しに要する時間が増し、光学設備が比較的複雑になる。
【００１５】
したがって、薄膜導波体に基づくセンサプラットフォームによって達成されてきた同じ高さの感度を達成すると同時にフィーチャあたりの所要計測面積を最小限にすることを可能にするセンサプラットフォームの実施態様及び光学構造が要望されている。
【００１６】
同時係属出願（ＰＣＴ／ＥＰ００／０４８６９）には、光学的に透明な層（ａ）を層（ａ）よりも低い屈折率の第二の層（ｂ）の上に含み、層（ａ）中で変調される格子構造（ｃ）をその上に設けられた計測区域とともに含む膜導波体を有するセンサプラットフォームが記載されている。それに関して、パラメータ、特に格子深さの適切な選択により、励起光を計測区域に内結合し、対応するルミネセンス励起を層（ａ）の近接場に内結合したのち層（ａ）中に逆結合されるルミネセンス光を、短い距離、すなわち、何百マイクロメートルで完全に外結合することでき、ひいては、導波層（ａ）中にさらに広がることを防ぐことができる。
【００１７】
この構造は、非常に小さな区域での多種の分析対象物の高感度同時測定を見込んでいる。光路を最適化し、反射又は散乱光を遮蔽すると、感度をさらに高めることができる。しかし、最後に、バックグラウンド信号及び対応するバックグラウンドのノイズによる制限が残る。これは、とりわけ、大部分の被着されるルミネセンス染料に関して、励起波長と発光波長との間のスペクトル分離（ストークスシフト）が比較的小さく、通常は２０nm〜５０nmであるという事実による。３００nmまでの大きなストークスシフトを示すルミネセンス染料が知られているが、これらの染料は一般に、欠点として、量子収率及び／又は光安定性が比較的低い。
【００１８】
さらには、従来の励起と組み合わせた高屈折薄膜導波体、たとえばＴａ2Ｏ5又はＴｉＯ2の導波膜に基づく公知の構造の欠点は、これらの導波体の伝播損及びこれらの薄膜導波体の自己蛍光（たとえば層（ｂ）中の極微量の蛍光性汚染物によって生じる）が短い励起波長で強烈に増すということである。その結果、短波長励起は約４５０nm〜５００nmに限られる。しかし、短めの波長においてもフルオロフォアを励起し、できるだけ低いバックグラウンドで又はできればバックグラウンドなしでそのルミネセンスを検出することを可能にする構造が高く評価されるであろう。
【００１９】
最近、ほぼバックグラウンドなしのルミネセンス検出を可能にする、２光子励起に基づく方法が報告された。しかし、２光子励起は、きわめて高いフィールド強度及び励起光の強さを要する。記載された構造では、これは、極短いパルス期間（通常はフェムト秒単位）を有する強力なパルスレーザによって達成される。しかし、これらの光学構造は非常に高額なシステム費を特徴とし、このシステム費が使用者の特定の資格に関して高い要件を課す。三次元画像の再現及び記憶のための構造の開発に関する１９６７年の米国特許第３，５７２，９４１号における非常に初期の研究では、たとえば、記憶媒体、たとえば単結晶、たとえばＬａでドープされたＣａＦ2の光学密度の変化（永久的）に関して、２０MW/cm2のオーダの励起強さ密度が必要であると記載されている。たとえば、このような高強度密度は、たとえば米国特許第５，０３４，６１３号では、パルス高出力レーザを、そのレーザ焦点の直径が顕微鏡の焦点面で１マイクロメートル未満である状態で、共焦点顕微鏡的配置で使用することによって達成され、記載されている。しかし、走査による拡大区域の計測は、計器に多くの手間をかける他に、大きな時間的投資を要する。
【００２０】
驚くことに今、少なくともある励起波長で透明である導波層（ａ）を、前記励起波長で同じく透明である、層（ａ）よりも低い屈折率の層（ｂ）の上に有する薄膜導波体に基づく光学構造の物理的パラメータを適切に選択し、十分に高い励起光強さを適用することにより、層（ａ）に内結合され、層（ａ）中を誘導される励起光の強さが、層（ａ）上及び層（ａ）内で、層（ａ）の表面又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に位置する分子を多光子吸収によって励起してルミネセンスに至らせるのに十分なほど高くなるということがわかった。
【００２１】
驚くことに、少なくともある励起波長で透明である層（ａ）を、少なくとも前記励起波長で同じく透明である、層（ａ）よりも低い屈折率の層（ｂ）の上に有し、層（ａ）中で変調される少なくとも１個の格子構造（ｃ）を有する平面薄膜導波体として設けられる本発明の光学構造の好ましい実施態様により、層（ａ）に内結合するための共振角で投射される励起光の強さが、層（ａ）上及び層（ａ）内で、層（ａ）中の励起光の伝播路全体にわたり、層（ａ）上に固定化されたルミネセンスが可能である分子を直線的なトレースにたわり前記伝播路に沿って拡大面上で２光子励起によって励起するのに十分なほど高くなるということが示された。これに関して、肉眼によって周囲光ででも観察することができるほど強いルミネセンスを２光子吸収によって発生させることができる。
【００２２】
これまで多光子励起はきわめて小さな空間、すなわち高出力レーザ（一般には、高い繰り返し率で脈動するフェムト秒レーザ）の焦点でのみ可能であったが、本発明は、巨視的寸法、すなわちミリメートルからセンチメートルの範囲にわたり平方ミリメートルから平方センチメートルの面積で２光子ルミネセンス励起及び観察を同時に可能にする。本発明のおかげで、たとえば単一のパルスのための励起光源のパルスエネルギーに対する要求を相当に軽減することができ、すなわち、本発明の導波構造を用いる多光子ルミネセンス励起のために、より長いパルスのレーザ（たとえば、フェムト秒レーザではなくピコ秒又はナノ秒レーザ）又は連続発光（ｃｗ）レーザの使用が可能になる。
【００２３】
特に分析対象物に対して表面結合認識要素を使用する分析対象物測定のための導波体の減衰フィールドにおける多光子励起によるルミネセンス励起の重要な利点は、高屈折導波体面からの距離の増大に関して、１光子吸収による従来の励起に比べてさらに有意に増大した励起の感度である。従来の１光子吸収によって発生する減衰フィールドの強さ及びルミネセンスの強さ（フィールド強さに比例する）は距離ｘとともに指数関数的に減少するが、ｎ光子吸収後のルミネセンスの減少は、１／ｅnxに比例する、すなわち、２光子励起の場合、１／ｅ2xに比例する。
【００２４】
比較的低い照射励起光強さの場合でも非常に大きな増幅定数のおかげで比較的わずかな努力で達成することができる非常に高い表面結合励起光強さにより、本発明の光学構造は、多様な異なる技術分野で、生分析学以外ででも、たとえば高い励起光強さにさらされる特に新規な物質の光物理的又は光化学的性質の調査に応用することができる。
【００２５】
特に、本発明の種々の実施態様に関して以下さらに詳細に記載するように、導波構造から非常に小さな距離（ｚ方向）の範囲内に位置する光反応性分子又は分子群を多光子励起、好ましくは２光子励起によって励起して化学反応に至らせることができる。これらの化学反応は、ｚ方向への分子拡張の三次元構造を簡単に生成することができる光重合をたとえば生じさせる、隣接分子への化学結合の形成であることができる。化学反応はまた、巨視的基底区域で、マススペクトロメトリー、特にＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳ（マトリックス支援レーザ脱離／イオン化飛行時間型マススペクトロメトリー）及び新たな光学的クロマトグラフィー法としての分子分離のための新規で簡素化された方法をたとえば生じさせる分子結合の表面閉じ込め選択的破断であることもできる。
【００２６】
本発明の第一の主題は、少なくともある励起波長で光学的に透明である導波層（ａ）を有する光学導波体を含む光学構造であって、層（ａ）に内結合されかつ層（ａ）中を誘導される励起光の強さが、層（ａ）内及び層（ａ）上で、層（ａ）の表面に又は２００nm未満の距離内に位置する分子を多光子励起によって励起させることができるのに十分なほど高い光学構造である。
【００２７】
好ましくは、前記光学導波体は、少なくともある励起波長で光学的に透明である導波層（ａ）を、少なくともその励起波長で同じく光学的に透明である、層（ａ）よりも低い屈折率の層（ｂ）の上に有する光学薄膜導波体である。
【００２８】
本発明の光学構造の実施態様の一群に特徴的であることは、層（ａ）の表面に又は２００nm未満の距離内に位置しかつ多光子励起によって励起される分子が光反応性分子又は分子群である、すなわち、光による励起ののち化学反応性になる分子又は分子群であるということである。これらの光反応性分子は、たとえば、適当な、通常は短波長の励起光（たとえばＵＶ光）の照射ののち光重合を開始することができるいわゆる光開始剤であることができる。したがって、この特別な実施態様に特徴的であることは、層（ａ）上に又は２００nm未満の距離内に位置する前記光反応性分子の多光子励起によって光重合が開始されるということである。これは、現在の技術水準に比較して二重の利点をもたらす。まず、比較的低い励起強さの照射により、表面近く（構造の導波層（ａ）からの距離ｚであって、その範囲内で当該化合物の２光子励起が可能である距離によって定義される）で重合を効率的に励起することができる。他方、距離ｚによって定義されるきわめて浅い（すなわち分子サイズの）三次元構造（すなわち分子サイズの）を簡単な方法で生成することができる。これに関して、光学構造の表面に対して平行な線形又は横方向の範囲が、導波層（ａ）内の照射励起光の伝播長によって制限される。励起光の内結合及び外結合を同時に得るために光重合の工程が層（ａ）中で変調される格子構造上で実施されるならば（以下さらに詳細な説明を参照）、同じく非常に小さな横方向範囲（マイクロメータレベルの）のポリマー構造を生成又は書き込みすることができる（照射励起光に関して横方向への光学構造の動きによって）。
【００２９】
本発明の光学構造のもう一つの実施態様に特徴的であることは、光解離が、すなわち、層（ａ）上に又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に設けられ、多光子励起の瞬間まで存在する分子又は分子複合体の破断が、層（ａ）上に又は層（ａ）から２００nm未満の距離内で、前記光反応性分子の多光子励起によって開始されるということである。
【００３０】
特殊な変形態様に特徴的であることは、前記光反応性分子が、比較的高分子量の分子、特に天然及び人造（合成）ポリマーならびに生物学的分子、たとえばタンパク質、ポリペプチド及び核酸を埋め込むための分子マトリックスの一部であるということである。これに関して、光学構造は、マススペクトロメトリー、好ましくはＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳ（マトリックス支援レーザ脱離／イオン化飛行時間型マススペクトロメトリー）のためのサンプルキャリヤとして設けられることが特に好ましい。
【００３１】
もう一つの好ましい実施態様は、少なくともある励起波長で光学的に透明である導波層（ａ）を、少なくとも前記励起波長で同じく光学的に透明である、層（ａ）よりも低い屈折率の層（ｂ）の上に有する光学薄膜導波体を含む光学構造であって、層（ａ）に内結合されかつ層（ａ）中を誘導される励起光の強さが、層（ａ）上及び層（ａ）内で、層（ａ）の表面に又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に位置する分子を多光子励起によって励起させてルミネセンスに至らせるのに十分なほど高い光学構造である。
【００３２】
層（ａ）への励起光の内結合は、プリズムカプラと、重畳する減衰フィールドを有する連結した光学導波体に基づく減衰カプラと、導波層の前に位置する合焦レンズ、好ましくは円柱レンズを有する前面カプラと、格子カプラとによって形成される群からの１個以上の光学内結合素子を使用して実施することができる。
【００３３】
好ましくは、層（ａ）への励起光の内結合は、層（ａ）中で変調される格子構造によって実施される。
【００３４】
さらには、光学構造は平面薄膜導波構造であることが好ましい。
【００３５】
特に好ましいものは、少なくともある励起波長で光学的に透明である層（ａ）を、少なくとも前記励起波長で同じく光学的に透明である、層（ａ）よりも低い屈折率の層（ｂ）の上に有するとともに、層（ａ）中で変調される少なくとも１個の格子構造（ｃ）を有する平面薄膜導波体を含み、層（ａ）に内結合するための共振角で投射される励起光の強さが、層（ａ）上及び層（ａ）内で、少なくとも格子構造（ｃ）の領域で、層（ａ）の表面に又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に位置する分子を多光子励起によって励起させるのに十分なほど高い本発明の光学構造の実施態様である。
【００３６】
好ましくは、多光子励起は２光子励起である。
【００３７】
本発明の光学構造により、層（ａ）の表面に又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に位置する分子を、直線経路に沿って、すなわち層（ａ）中を誘導される励起光に沿って同時に多光子励起によって励起させることが可能である。
【００３８】
特に有利であるものは、層（ａ）の表面に又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に位置する分子の多光子励起を、層（ａ）への励起光の内結合の位置から起算して少なくとも５mmの距離にわたり直線経路に沿って可能にするような実施態様である。
【００３９】
また、拡大した励起光の照射により、層（ａ）の表面に又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に位置する分子が、層（ａ）中を誘導される励起光に沿って拡大区域で同時に多光子励起によって励起されるならば、それは特に有利である。格子（ｃ）によって光を層（ａ）に内結合する場合、励起光束は、好ましくは、格子線に対して平行に拡大される。
【００４０】
本発明の光学構造は、層（ａ）の表面に又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に少なくとも１mm2の面積で、より好ましくは少なくとも１０mm2の面積で、さらに好ましくは少なくとも１cm2の面積で位置する分子の同時多光子励起のために作動可能であることが好ましい。
【００４１】
特に多光子励起を可能にするための非常に高い表面閉じ込め励起光強さ及び表面に近いところでの高い強さは、以下さらに詳細に概説するように、多様な用途、特にバイオセンシングに有利であるが、通信及び遠隔通信技術にも有利である。
【００４２】
さらには、構造は、格子構造（ｃ）によって内結合され、層（ａ）中を誘導される励起光の伝播方向に配設されることが好ましい、層（ａ）の連続非変調領域を含むことが好ましい。特に、構造は、同一又は異なる周期を有する多数の格子構造（ｃ）が、場合によっては層（ａ）の連続非変調領域がそれに隣接する状態で、共通の連続基板上に設けられるような方法で設計することができる。したがって、多光子励起によるルミネセンス励起の場合、多光子吸収によって層（ａ）の上に又はその近接場で生成されるルミネセンスを少なくとも部分的に層（ａ）中に結合させるとともに、層（ａ）中の誘導によって前記光学構造上の隣接領域に伝播させることもまた可能である。
【００４３】
特定の用途では、異なる励起波長の励起光を同じ光学構造に同時又は順次に適用することが望ましい。その場合、この構造が、異なる周期数の２個以上の格子構造を、格子線が平行又は非平行、好ましくは非平行に配設された状態で重畳したものを含み（２個の重畳格子構造の場合、それらの格子線は、好ましくは互いに対して垂直に配設される）、その構造が異なる波長の励起光の内結合に作動可能であるならば、それは有利であることができる。
【００４４】
光学導波層（ａ）中を誘導されるモードの伝播損の量は、下に位置する支持層の表面粗さによって、及びこのキャリヤ層で起こるかもしれないクロモフォアの吸収（層（ａ）中を誘導されるモードの減衰フィールドの浸透による、多くの用途に望ましくない、このキャリヤにおけるルミネセンスの励起の危険をさらに伴う）によって多大な程度まで決まる。さらには、光学的に透明な層（ａ）及び（ｂ）の熱膨張率の違いによって熱ひずみが発生することもある。化学的に高感度で光学的に透明な層（ｂ）の場合、それがたとえば透明な熱可塑性プラスチックからなる場合、層（ｂ）を攻撃するかもしれない溶剤の、光学的に透明な層（ａ）中に存在するかもしれない微孔への浸透を防ぐことが望ましい。
【００４５】
したがって、多数の層（（ａ）及び（ｂ））を含む導波体の場合、層（ａ）よりも低い屈折率を有するとともに、５nm〜１００００nm、好ましくは１０nm〜１０００nmの厚さを有するさらなる光学的に透明な層（ｂ′）が、層（ａ）と層（ｂ）との間にかつ層（ａ）と接触した状態で位置するならば、それは有利である。この中間層の導入により、多様な課題―層（ａ）の下の表面粗さの軽減と、層（ａ）中を誘導される光の減衰フィールドの、下に位置する一以上の層への浸透の軽減と、格子導波構造内で熱的に誘発される応力の軽減と、層（ａ）の微孔を下に位置する層に対してシールすることによる、下に位置する層からの光学的に透明な層（ａ）の化学的分離と、―を満たすことができる。
【００４６】
本発明の光学構造の格子構造（ｃ）は、均一な周期の回折格子であることもできるし、多回折格子であることもできる。また、格子構造（ｃ）には、光学的に透明な層（ａ）中に結合される励起光の伝播方向に対して垂直又は平行な周期数であり、横方向に変化する周期数を備えることもできる。
【００４７】
光学的に透明な層（ａ）に使用することができる数多くの異なる材料がある。もっとも重要な事前要件は、できるだけ大きな程度で少なくとも投射励起光の波長における吸収又はルミネセンスの非存在と、少なくともミリメートルからセンチメートル程度の距離にわたる光誘導能力とである。
【００４８】
本発明の光学構造の特定の実施態様の場合、光学的に透明な（ａ）の材料は、ガラス、石英又はたとえばポリカーボネート、ポリアミド、ポリイミド、ポリメチルメタクリレート、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリアクリル酸、ポリアクリル酸エステル、ポリフェニレンスルフィド、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）及びポリウレタンならびにそれらの誘導体を含む群からの透明なプラスチックを含むことが好ましい。
【００４９】
光学的に透明な層（ａ）はまた、ＴｉＯ2、ＺｎＯ、Ｎｂ2Ｏ5、Ｔａ2Ｏ5、ＨｆＯ2又はＺｒＯ2の群の材料、特に好ましくはＴｉＯ2又はＮｂ2Ｏ5又はＴａ2Ｏ5の群の材料を含むことができる。
【００５０】
また、光学的に透明な層（ａ）の屈折率が１．８よりも大きいことが好ましい。
【００５１】
光学的に透明な層（ａ）は、多様な「外見的に」異なる実施態様で設けることができる。ファイバタイプであることもできるし、平面導波体であることもできる。なおさらに、技術的に製造可能な形状が可能である。
【００５２】
光学的に透明な層（ａ）は、たとえばマイクロメートルからミリメートル程度の厚さ（又はファイバタイプ導波体の場合は直径）を有して自立性であることができる。層（ａ）はまた、層（ａ）の屈折率よりも低い屈折率の層を層（ａ）に隣接して有する、同じくファイバタイプ実施態様及び平面的実施態様が可能である多層系の一部であることができる。
【００５３】
光学的に透明な層（ａ）が低モード導波体である、すなわち、照射励起光の所与の偏光の最初の１０モード未満を誘導するように作動可能であるならば、それは特に有利である。
【００５４】
光学的に透明な層（ａ）が、照射励起光の所与の偏光の１〜３モードのみを誘導するように作動可能である低モード導波体であることが特に好ましい。
【００５５】
上記ですでに概説したように、（平面）光学薄膜導波体としての本発明の光学構造の実施態様が特に好ましい。
【００５６】
その場合、光学的に透明な層（ｂ）の材料は、ガラス、石英又はたとえばポリカーボネート、ポリイミド、ポリメチルメタクリレート、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリアクリル酸、ポリアクリル酸エステル、ポリフェニレンスルフィド、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）及びポリウレタンによって形成される群からの透明な熱可塑性もしくは成形性プラスチックを含むことがさらに好ましい。
【００５７】
光学的に透明な導波層（ａ）の屈折率の他にも、その厚さが、より低い屈折率の隣接層との界面でできるだけ強い減衰フィールドを発生させるとともに、層（ａ）内でできるだけ高いエネルギー密度を発生させるのに重要な第二のパラメータである。層厚さが少なくとも一つの励起波長モードを誘導するのに十分である限り、導波層（ａ）の厚さの減少とともに減衰フィールドの強さが増す。それに関して、モードを誘導するための最小「カットオフ」層厚さは、このモードの波長に依存する。「カットオフ」層厚さは、短めの波長の光よりも長めの波長の光の場合の方が大きい。しかし、「カットオフ」層厚さに近づくと、望まれない伝播損もまた強く増大し（特に、散乱中心における散乱による）、それにより、好ましい層厚さの選択の下限をさらに限定する。しかし、これらの伝播損は一般に、短波長の光よりも長めの波長の光の場合の方が低い。好ましいものは、所与の励起波長で一つから三つのモードだけを誘導することを見込んだ光学的に透明な層（ａ）の厚さである。特に好ましいものは、この所与の励起波長で単モード導波体を生じさせる層厚さである。誘導される光の別々のモードの特性は横モードだけに関することが理解される。
【００５８】
これらの要件の結果として、層（ａ）の厚さとその屈折率との積は、層（ａ）中に結合される励起光の励起波長の、好ましくは１／１０〜１であり、もっとも好ましくは１／１０〜２／３である。
【００５９】
光学的に透明な導波層（ａ）及び隣接層の所与の屈折率に関して、上記共振条件にしたがって励起光を内結合するための共振角は、内結合される回折オーダと、励起波長と格子周期とに依存する。第一の回折オーダの内結合は、内結合効率を増すのに有利である。内結合効率の量のためには、回折オーダの数の他に、格子深さが重要である。原則として、結合効率は、格子深さが増すとともに増大する。しかし、外結合の過程が内結合に対して完全に逆であるため、外結合効率が同時に増し、その結果、格子構造（ｃ）の上又はそれに隣接して位置する計測区域（ｄ）（以下の定義に準じる）におけるルミネセンスの励起のための最適値が得られる。この最適値は、計測区域の形状及び投射される励起光束の形状に依存する。これらの境界条件に基づき、格子（ｃ）が２００nm〜１０００nmの周期及び３nm〜１００nm、好ましくは１０nm〜３０nmの変調深さを有するならば、それは有利である。
【００６０】
さらには、第一の光学的に透明な層（ａ）の厚さに対する格子の変調深さの比は０．２以下であることが好ましい。
【００６１】
それに関して、格子構造（ｃ）は、矩形、三角形又は半円形の断面のレリーフ格子であることもできるし、本質的に平面的な光学的に透明な層（ａ）中で屈折率の周期変調を有する位相又は容積格子であることもできる。
【００６２】
さらには、光学系における調節の簡素化のための及び／又は分析系の一部としてのサンプル区画への接続のための光学的又は機械的に認識可能な印が構造に設けられるならば、それは有利であることができる。
【００６３】
本発明の光学構造は、生化学的分析学における応用において１種以上の供給されるサンプル中の１種以上の分析対象物の高感度検出に特に適している。これらの応用の場合、測定する分析対象物の認識及び結合のための生物学的、生化学的又は合成認識要素が光学構造上に固定化される。固定化は、おそらくは構造全体に及ぶ大きな面で実施することもできるし、別個のいわゆる計測区域で実施することもできる。
【００６４】
本発明の本質では、液体サンプル中の１種又は多種の分析対象物の認識のため、横方向に分けられた計測区域（ｄ）が、その上に固定化された生物学的、生化学的又は合成認識要素によって占有される区域によって画定される。これらの区域は、いかなる形状、たとえば点、円、矩形、三角形、楕円又は線の形を有することもできる。１，０００，０００個までの計測区域を本発明の光学構造上に二次元配列で設けることが可能であり、その場合、単一の計測区域がたとえば０．００１mm2〜６mm2の面積を占有することができる。所与の計測区域内には、単一の分析対象物の認識及び結合ならびに測定のための同一の認識要素、又は種々の分析対象物の認識のための異なる認識要素を固定化することができる。また、認識要素として、異なる分析対象物を結合させることができるいくつか（すなわち二以上）の異なる領域又はセグメントを設けられている当該化合物を被着させることもできる。
【００６５】
たとえば、導波構造として励起光の内結合のための１個以上の格子構造（ｃ）を有する平面薄膜導波体の場合、計測区域は、そのような格子構造上に配設することもできるし、誘導励起光の伝播方向に関してそのような格子構造の後に位置する連続非変調領域に配設することもできる。
【００６６】
サンプル中の多種の分析対象物を同時に測定するためには、二以上の横方向に分けられた計測区域が光学構造上でセグメントに組み合わされるならば、それは有利であることができる。隣接セグメントで生成されかつ層（ａ）中に逆結合されるルミネセンスのクロストークを、格子構造（ｃ）によって防止する、又は光学構造上で生成される他の分離によって、たとえば被着された顔料の吸収ストリップもしくはサンプル区画の生成のための、光学構造の導波層（ａ）を下面として有する構造の隔壁によって防止するならば、種々のセグメントを特に光学的に互いに分けることができる。種々のセグメントはさらに、隣接区域間の流体シールを支持する被着されたリム及び／又は隣接区域間の光学クロストークの軽減に貢献する被着されたリムにより、互いから分けることができる。
【００６７】
生物学的、生化学的又は合成認識要素を光学的に透明な層（ａ）に被着させる方法は数多くある。たとえば、被着は、物理的吸着又は静電気的相互作用によって実施することができる。その場合、一般に、認識要素の向きは統計的性質である。さらには、分析対象物を含有するサンプル及び分析過程で加えられる試薬が異なる組成を有するならば、固定化された認識要素の一部が洗い落とされる危険がある。したがって、生物学的、生化学的又は合成認識要素（ｅ）の固定化のために付着促進層（ｆ）が光学的に透明な層（ａ）に被着されるならば、それは有利であることができる。この付着促進層はもまた、透明であるべきである。特に、付着促進層の厚さは、導波層（ａ）を出てその上に位置する媒体に入る減衰フィールドの浸透深さを超えるべきではない。したがって、付着促進層（ａ）は、厚さ２００nm未満、好ましくは２０nm未満であるべきである。付着促進層は、たとえば、シランと、エポキシドと、官能化された帯電又は極性ポリマーと、「自己組織化官能化単分子層」と、を含む群の化合物を含むことができる。
【００６８】
計測区域の定義で述べたように、横方向に分けられた計測区域（ｄ）は、生物学的又は生化学的又は合成認識要素を光学構造上に横方向に選択的に被着させることによって生成することができる。ルミネセンスが可能である分析対象物や、固定化された認識要素への結合を求めて分析対象物と競合する発光的にマークされた分析対象物類似体や多工程検定におけるさらに発光的にマークされた結合相手と、接触させられると、ルミネセンスが可能であるこれらの分子は、固定化された認識要素によって占有された区域によって画定される計測区域だけで選択的に光学構造の表面に結合する。
【００６９】
生物学的、生化学的又は合成認識要素を被着させるためには、インクジェットスポッティング、機械的スポッティング、マイクロコンタクトプリント及び生物学的、生化学的又は合成認識要素を平行又は交差マイクロチャネルに供給し、圧力差又は電気もしくは電磁ポテンシャルを印加して計測区域と流体接触させることを含む方法の群の一以上の方法を適用することができる。
【００７０】
概論の限定なしに、たとえば核酸（たとえばＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド）、核酸類似体（たとえばＰＮＡ）、抗体、アプタマー、膜結合しかつ単離された受容体、それらのリガンド、抗体に対する抗原、「ヒスチジンタグ成分」、分子インプリントをホストするための、化学合成によって生成されたキャビティなどを含む群の成分を、生物学的、生化学的又は合成認識要素として被着させることができる。最後に挙げたタイプの認識要素は、「分子インプリンティング」として文献に記載されている方法によって製造されるキャビティをいう。この手法では、大部分は有機溶液中の分析対象物又は分析対象物類似体をポリマー構造に封入する。すると、これが「インプリント」と呼ばれる。そして、適切な試薬の添加により、分析対象物又はその類似体をポリマー構造から溶解させ、ポリマー構造中に空のキャビティを残す。そして、この空のキャビティを、分析対象物測定のその後の方法で、高い立体選択性をもつ結合部位として使用することができる。
【００７１】
当然、考慮中の用途に望まれ、求められる選択性にしたがって、測定する分析対象物を選択的に認識し、それと相互作用する他の化合物もまた、認識要素として適当である。
【００７２】
また、全細胞又は細胞断片を生物学的又は生化学的又は合成認識要素として被着させることもできる。
【００７３】
前記認識要素は、光学構造に直接被着させることもできるし、光学構造上の付着促進層を介して被着させることもできる。
【００７４】
さらには、「認識要素」及び「分析対象物」の機能は、必要ならば適切な化学調製ののち、分析されるサンプルに含まれる化合物を本発明の光学構造に固定化することができ、対応する生物学的、生化学的又は合成認識要素が連続的な工程でそれらと接触するという意味において交換可能である。これに関して、別個の計測区域は、たとえば、サンプルを別々のアリコートに分割したのち、それらのアリコートを光学構造上の別個の区域に連続的に被着させることによって形成することができる。この場合、通常は種々の化合物の混合物が各計測区域に固定化されるであろう。
【００７５】
多くの場合、分析方法の検出限界は、いわゆる非特異的結合によって生じる信号によって、すなわち、分析対象物の結合によって又は分析対象物測定で加えられる他の成分（たとえば疎水性吸着又は静電気的相互作用により、設けられた固定化生物学的又は生化学的又は合成認識要素の区域で結合するだけでなく、これらの認識要素によって占有されないセンサプラットフォームの区域ででも結合する）の結合によって生じる信号によって制限される。したがって、非特異的結合又は吸着を最小限にするため、分析対象物に対して「化学的に中性」である化合物が横方向に分けられた計測区域（ｄ）の間に被着されるならば、それは有利である。多工程検定でそれ自体は分析対象物、分析対象物の類似体又はさらなる結合相手の認識及び結合に特異的な結合部位を有さず、かつ、その存在のため、分析対象物、その類似体又はさらなる結合相手のセンサプラットフォームの表面へのアクセスを阻止するような化合物が「化学的に中性」の化合物と呼ばれる。
【００７６】
アルブミン、特にウシ血清アルブミンもしくはヒト血清アルブミン、分析されるポリヌクレオチドとでハイブリダイズしない、断片化された天然もしくは合成ＤＮＡ、たとえばニシンもしくはサケ精液又は帯電していないが親水性のポリマー、たとえばポリエチレングリコールもしくはデキストランによって形成される群の化合物を「化学的に中性」の化合物として被着させることができる。
【００７７】
それに関して、特に、ポリヌクレオチドハイブリダイゼーション検定で非特異的ハイブリダイゼーションの低減のための前述の化合物（たとえばニシン又はサケ精液）の選択は、分析されるポリヌクレオチドとはできるだけ異なる、分析されるポリヌクレオチド配列との相互作用が知られていないＤＮＡの経験的好適さによって決定される。
【００７８】
本発明のさらなる主題は、少なくとも１個の励起光源と、本発明の光学構造とを含み、層（ａ）に内結合されかつ層（ａ）中を誘導される励起光の強さが、層（ａ）内及び層（ａ）上で、層（ａ）の表面又は２００nm未満の距離内に位置する分子を多光子励起によって励起させるのに十分なほど高い光学系である。
【００７９】
本発明の光学系の実施態様の一群に特徴的であることは、層（ａ）の表面又は層（ａ）から２００nm未満の距離内で多光子励起によって励起される分子が光反応性分子、すなわち、光による励起ののち化学反応性になる分子又は分子群であるということである。これに関して、一つの変形態様として、層（ａ）の表面又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に位置する前記光反応性分子の多光子励起によって光重合が開始される。その場合、たとえば、光不安定性の保護基を有する化合物が光反応性分子として適当である。
【００８０】
もう一つの変形態様に特徴的であることは、光解離が、すなわち、層（ａ）上又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に多光子励起工程の前に存在する分子又は分子複合体の破断が、層（ａ）上又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に位置する前記光反応性分子の多光子励起によって起こるということである。
【００８１】
特殊な変形態様として、前記光反応性分子は、比較的高分子量の分子を埋め込むための、特に天然及び人造（合成）ポリマーならびに生物学的分子、たとえばタンパク質、ポリペプチド及び核酸を埋め込むための分子マトリックスの一部である。特に好ましいものは、光学構造がマススペクトロメトリー、好ましくはＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳ（マトリックス支援レーザ脱離／イオン化飛行時間型マススペクトロメトリー）のためのサンプルキャリヤとして設けられる実施態様である。
【００８２】
好ましいものは、少なくとも１個の励起光源と、本発明の光学構造とを含み、層（ａ）に内結合され、層（ａ）中を誘導される励起光の強さが、層（ａ）内及び層（ａ）上で、層（ａ）の表面に又は２００nm未満の距離内に位置する分子を多光子励起によって励起させてルミネセンスに至らせるのに十分なほど高い光学系である。
【００８３】
本発明の光学系は、通常、層（ａ）への励起光の内結合が、プリズムカプラと、重畳する減衰フィールドを有する連結した光学導波体に基づく減衰カプラと、導波層の面に位置する合焦レンズ、好ましくは円柱レンズを有する前面カプラと、格子カプラとによって形成される群からの１個以上の光学内結合素子を使用して実施されるような方法で設計されている。
【００８４】
層（ａ）への励起光の内結合は、層（ａ）中で変調される格子構造によって実施されることが好ましい。
【００８５】
また、光学構造が平面薄膜導波構造であることが好ましい。
【００８６】
特に好ましいものは、少なくとも１個の励起光源と、上記実施態様のいずれかの光学構造とを含み、層（ａ）に内結合するための共振角で層（ａ）中で変調される格子構造（ｃ）に投射される励起光の強さが、層（ａ）上及び層（ａ）内で、少なくとも格子構造（ｃ）の領域で、層（ａ）の表面に又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に位置する分子を多光子励起によって励起させるのに十分なほど高い本発明の光学系の実施態様である。
【００８７】
好ましくは、多光子励起は２光子励起である。
【００８８】
好ましいものは、層（ａ）の表面に又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に位置する分子を、直線経路に沿って、すなわち層（ａ）中を誘導される励起光に沿って同時に多光子励起によって励起させるように作動可能であるような実施態様である。
【００８９】
特に有利なものは、層（ａ）の表面に又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に位置する分子の多光子励起を層（ａ）への励起光の内結合の位置から起算して少なくとも５mmの距離にわたり直線経路に沿って実施するように作動可能である実施態様である。
【００９０】
また、拡大した励起光の照射により、層（ａ）の表面に又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に位置する分子が、層（ａ）中を誘導される励起光に沿って拡大区域で同時に多光子励起によって励起されることが好ましい。層（ａ）への光の内結合が層（ａ）中で変調される格子構造（ｃ）によって実施されるならば、励起光束が格子線に対して平行に拡大されることが好ましい。
【００９１】
また、特に有利なものは、層（ａ）の表面に又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に少なくとも１mm2の面積で、好ましくは少なくとも１０mm2の面積で、さらに好ましくは少なくとも１cm2の面積で位置する分子の同時多光子励起を可能にするような本発明の光学系の実施態様である。
【００９２】
本発明の光学系の他の好ましい実施態様に特徴的であることは、系の一部としての光学構造が、格子構造（ｃ）によって内結合され、層（ａ）中を誘導される励起光の伝播方向に配設されることが好ましい、層（ａ）の連続非変調領域を含むということである。ここでもまた、多くの用途で、光学構造が、同一又は異なる周期を有する多数の格子構造（ｃ）を、場合によっては層（ａ）の連続非変調領域がそれに隣接する状態で、共通の連続基板上に含むならば、それは有利である。
【００９３】
また、本発明のルミネセンス励起のための光学系の多くの実施態様に不可欠な特徴は、多光子吸収によって層（ａ）の上に又はその近接場で生成されるルミネセンスが少なくとも部分的に層（ａ）中に結合されるとともに、層（ａ）中の誘導によって前記光学構造上の隣接領域に伝播されることである。
【００９４】
通常、本発明の光学系は、光学構造からの一以上のルミネセンスを検出するための少なくとも１個の検出器をさらに含む。
【００９５】
光学構造に当たるまでの励起光の光線誘導の幾何学に関して、多様な異なる実施態様が可能である。好ましい実施態様の一つに特徴的であることは、少なくとも１個の励起光源から発せられる励起光が本質的に平行であり、かつ、層（ａ）に内結合するための共振角で、光学的に透明な層（ａ）中で変調される格子構造（ｃ）に照射されるということである。
【００９６】
少なくとも１個の光源からの励起光が拡大光学部品によって本質的に平行な光束に拡大され、かつ、層（ａ）中に内結合するための共振角で、光学的に透明な層（ａ）中で変調される巨視的区域の肉眼的構造（ｃ）に照射されることが特に好ましい。
【００９７】
もう一つの好ましい実施態様に特徴的であることは、少なくとも１個の光源からの励起光が、回折光学要素又は、光源が多数ある場合には、好ましくはダンマン格子である多数の回折光学要素又は好ましくはマイクロレンズアレイである屈折光学要素によってできるだけ均一な強さの複数の個々の光線に分割され、個々の光線が、互いに対して本質的に平行に、層（ａ）に内結合するための共振角で格子構造（ｃ）に投射されるということである。
【００９８】
特定の用途では、同様な又は異なる発光波長の２個以上の光源を励起光源として使用することが好ましい。
【００９９】
二以上の異なる励起波長が照射されるような用途の場合、２個以上の光源からの励起光が異なる方向から同時又は順次に格子構造（ｃ）に投射され、異なる周期数の格子構造を重畳したものを含む格子構造によって層（ａ）中に内結合される光学系の実施態様が好ましい。
【０１００】
たとえば、ＣＣＤカメラ、ＣＣＤチップ、フォトダイオードアレイ、アバランシェダイオードアレイ、マルチチャネルプレート及びマルチチャネル光電子増倍管によって形成される群からの少なくとも１個の横方向に解像する検出器を信号検出に使用することが好ましい。
【０１０１】
本発明によると、光学系は、伝送される光束を成形するためのレンズもしくはレンズ系、光束を偏光させ、場合によってはさらに成形するための平面もしくは湾曲したミラー、光束を偏光させ、場合によってはスペクトル分離するためのプリズム、光束の部分をスペクトル選択的に偏光させるためのダイクロイックミラー、伝送される光の強さを調整するためのニュートラルフィルタ、光束の部分をスペクトル選択的に透過させるための光学フィルタもしくはモノクロメータ、又は励起及び／又はルミネセンス光の別個の偏光方向を選択するための偏光選択素子によって形成される群の光学部品が、１個以上の励起光源と本発明の光学構造との間に及び／又は光学構造と１個以上の検出器との間に配置されているような実施態様を含む。
【０１０２】
また、励起光を１fsec〜１０minの間隔のパルスで投射し、かつ、場合によっては、計測区域からの発光を時間分解的に計測することが可能である。これに関して、十分な時間的解像度の検出器の使用により、励起光のパルス照射によって計測区域からの発光の計測を実施し、修正することができる。通常、従来技術で公知の構造では２光子蛍光励起のために高いパルス繰り返し率のフェムト秒レーザが使用されてきたが、本発明の光学構造に関する本発明の光学系の場合、より長いパルス間隔のレーザ（たとえばピコ秒又はナノ秒レーザ）を、場合によってはより低い繰り返し率で、多光子ルミネセンス励起（好ましくは２光子ルミネセンス励起）のための励起光源として使用することもできるということが特徴的である。
【０１０３】
非常に短いパルスのレーザを使用するとき、このようなレーザからの励起光を本発明の光学構造に内結合する効率を最大限にするためには、パルス長からの励起パルスのスペクトル帯域幅の依存性（不確定性関係の結果として）を考慮に入れなければならない。たとえば、１００fsレーザは、５〜１５nm程度の帯域幅を有することができる。これは、格子構造（ｃ）による導波構造への内結合の達成可能な効率に関して、たとえば深さ＜１０nmの浅い格子の場合、内結合のための共振条件は、一定の調節角で照射されるスペクトルの小さな部分に関してしか満たされず、したがって、内結合効率が低いということを意味する。より深い格子を使用すると、角とスペクトル許容度との双方に関して共振条件の鋭さを落とすことができる。これは、原則的に、１〜１０psecよりも短いレーザパルスを使用するとき、格子パラメータを最適化するためにはこの関係を考慮に入れなければならないことを意味する（他の系パラメータにも依存する）。一傾向として、より短いレーザパルスの内結合にはより大きな格子深さが求められる。
【０１０４】
本発明の光学系のさらなる好ましい実施態様に特徴的であることは、参照のため、計測区域の他に、光源の位置での励起光、拡大後の励起光又は個々のビームに分割された後の励起光、一以上の横方向に分けられた計測区域の位置からの励起波長の散乱光及び格子構造（ｃ）によって外結合された励起波長の光によって形成される群の光信号が計測されるということである。それに関して、発光の測定のための計測区域と参照信号の測定のための計測区域とが同一であるならば、それは特に有利である。
【０１０５】
励起光の投射及び一以上の計測区域からの発光の検出は、一以上の計測区域ごとに順次に実施することができる。これに関して、特に、ミラー、偏光プリズム及びダイクロイックミラーによって形成される群の可動光学部品によって順次の励起及び検出を実施することができる。
【０１０６】
また、本発明の一部は、本質的に焦点及び角度保存的なスキャナを使用して順次の励起及び検出が実施されるような光学系である。また、光学構造を順次の励起及び検出の工程の間で動かすことが可能である。
【０１０７】
本発明のさらなる主題は、光学導波体を含む光学構造上の一以上の計測区域で少なくとも１種のサンプル中で１種以上の分析対象物を、その分析対象物、その結合相手又は分析対象物分子を取り囲むサンプルマトリックス分子の多光子励起によって測定するための分析系である。この分析系は、
本発明及び記載した実施態様のいずれかの光学構造と、
本発明及び上記実施態様のいずれかの光学系と
を含む。
【０１０８】
ここでもまた、前記光学導波体は、好ましくは光学薄膜導波体として設けられる。
【０１０９】
本発明のこのような分析系の特別な実施態様は、それがマススペクトロメトリー、好ましくはＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳ（マトリックス支援レーザ脱離／イオン化飛行時間型マススペクトロメトリー）のための計測系であり、前記光学構造がマススペクトロメトリーのためのサンプルキャリヤであり、測定される分析対象物分子、好ましくは比較的高分子量の分子、特に天然及び人造（合成）ポリマーならびに生物学的分子、たとえばタンパク質、ポリペプチド及び核酸が光反応性分子のマトリックスに埋め込まれ、このマトリックスから、前記光反応性分子の多光子励起によって解離させ、脱着させることができることを特徴とする。
【０１１０】
特殊な実施態様に特徴的であることは、層（ａ）上又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に位置する前記光反応性分子の多光子励起によって光重合が開始されるということである。
【０１１１】
もう一つの変形態様に特徴的であることは、光解離が、すなわち、多光子励起の工程の前に存在する分子又は分子複合体の破断が、層（ａ）上又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に位置する前記光反応性分子の多光子励起によって開始されるということである。
【０１１２】
好ましいものは、光学導波体（好ましくは薄膜導波体として設けられる）を含む光学構造の一以上の計測区域で少なくとも１種のサンプル中の１種以上の分析対象物を、分析対象物又はその結合相手の一つの多光子励起によるルミネセンス検出によって測定するための、
本発明の光学構造と、
本発明の光学系と、
１種以上のサンプルを光学構造の計測区域と接触させるための供給手段と
を含む分析系である。
【０１１３】
これに関して、分析系が、少なくとも一以上の計測区域の領域で光学構造に向けて開口した１個以上のサンプル区画をさらに含み、サンプル区画それぞれが好ましくは０．１nl〜１００μlの容積を有することが好ましい。
【０１１４】
一つの可能な実施態様として、サンプル区画は、光学的に透明な層（ａ）とは反対側が、サンプル及び場合によってはさらなる試薬の供給又は排除のための入口及び出口を除いて閉じられ、サンプル及び場合によってはさらなる試薬の供給又は排除が、共通の入口及び出口を有するいくつかの計測区域又はセグメントへの液体供給の場合、これらの開口が好ましくは行ごと又は列ごとに指定される閉鎖スルーフロー系で実施される。
【０１１５】
もう一つの可能な実施態様に特徴的であることは、サンプル区画が、サンプル又は他の試薬の局所的な指定供給又は排除のための開口を光学的に透明な層（ａ）とは反対側に設けられているということである。
【０１１６】
スクリーニング用途、たとえば、いわゆる「標的」化合物に結合することができる化合物の選択及び連続工程におけるこれらの化合物の濃縮に特に適しているものは、光学導波体（好ましくは薄膜導波体として設けられる）を含む光学構造の一以上の計測区域上の少なくとも１種のサンプル中で１種以上の分析対象物を、分析対象物又はその結合相手の一つのルミネセンス励起によるルミネセンス検出によって測定するための、
本発明の光学構造と、
本発明の光学系と、
１種以上のサンプルを光学構造の計測区域と接触させるための供給手段と、
１種以上のサンプル及び場合によってはさらなる試薬を受けるための１個以上のサンプル区画と、
サンプル区画に含まれる液体を除去するための手段と
を備え、
一以上の計測区域中の１種以上の分析対象物の結合の検出ののち、前記分析対象物と各固定化された認識要素及び場合によってはさらなる結合相手との間に形成される分子複合体を多光子励起後の光解離によって分裂させることができるか、光学構造から脱着させることができ、前記分子複合体を、各サンプル区画からの溶離ののち、まるごと又は断片化された形態でさらなる分析又は調製処理に付すことができる分析系である。
【０１１７】
これに関して、多光子励起による光解離のために前記光学構造上の１種以上のサンプル中で検出された分析対象物とで形成された、異なる分子複合体又は分子複合体の断片の分離をこれらの分子複合体の吸収断面にしたがって可能にするような本発明の分析系の実施態様が好ましい。
【０１１８】
本発明のさらなる主題は、本発明の光学構造及び／又は本発明の光学系及び／又は本発明の分析系の使用を含む、層（ａ）に内結合されかつ層（ａ）中を誘導される励起光の強さが、層（ａ）内及び層（ａ）上で、層（ａ）の表面に又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に位置する分子を多光子励起によって励起させるのに十分なほど高い多光子励起の方法である。
【０１１９】
本発明の方法の実施態様の一群に特徴的であることは、光学構造の層（ａ）の表面又は層（ａ）から２００nm未満の距離に位置する分子が光反応性であり、多光子励起によって励起して化学反応に至らせることができるということである。
【０１２０】
これに関して、一つの変形態様として、光学構造の層（ａ）の表面又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に位置する分子を多格子励起によって励起して他の分子に結合させることができる。特別な実施態様に特徴的であることは、光学構造の層（ａ）の表面又は層（ａ）から２００nm未満の距離に位置する分子を多格子励起によって励起して光重合に至らせることができることである。
【０１２１】
本方法のもう一つの変形態様に特徴的であることは、光解離が、すなわち、層（ａ）上又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に多光子励起まで存在する分子又は分子複合体の破断が、層（ａ）上又は２００nm未満の距離内に位置する前記光反応性分子の多光子励起によって開始されるということである。
【０１２２】
本発明の方法の特別な実施態様に特徴的であることは、前記分析系がマススペクトロメトリー、好ましくはＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳ（マトリックス支援レーザ脱離飛行時間型マススペクトロメトリー）のための計測系であり、前記光学構造がマススペクトロメトリーのためのサンプルキャリヤであり、検出される分析対象物分子、好ましくは比較的高分子量の分子、特に天然及び人造（合成）ポリマーならびに生物学的分子、たとえばタンパク質、ポリペプチド及び核酸が光反応性分子のマトリックスに埋め込まれ、このマトリックスから、前記光反応性分子の多光子励起によって解離させ、脱着させることができることである。
【０１２３】
好ましい実施態様は、本発明の光学構造及び／又は本発明の光学系及び／又は本発明の分析系の使用を含むルミネセンス励起の方法であって、層（ａ）に内結合されかつ層（ａ）中を誘導される励起光の強さが、層（ａ）上及び層（ａ）内で、層（ａ）の表面に又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に位置する分子を多光子励起によって励起させてルミネセンスに至らせるのに十分なほど高いルミネセンス励起の方法である。
【０１２４】
特に好ましいものは、本発明及び前記実施態様のいずれかの光学構造の一以上の計測区域上の１種以上のサンプル中で１種以上の分析対象物をルミネセンス検出によって検出するための、前記光学構造上の計測区域からの又は少なくとも二以上の横方向に分けられた計測区域（ｄ）のアレイ又はいくつかの計測区域を含む少なくとも２個以上の横方向に分けられたセグメント（ｄ′）のアレイからの一以上のルミネセンスを測定するための方法であって、層（ａ）に内結合されかつ層（ａ）中を誘導される励起光の強さが、層（ａ）上及び層（ａ）内で、層（ａ）の表面に又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に位置する分子を多光子励起によって励起させてルミネセンスに至らせるのに十分なほど高い方法である。
【０１２５】
本発明の方法では、層（ａ）への励起光の内結合は、プリズムカプラと、重複する減衰フィールドを有する連結した光学導波体に基づく減衰カプラと、導波層の前に位置する合焦レンズ、好ましくは円柱レンズを有する前面カプラと、格子カプラとによって形成される群からの１個以上の光学内結合素子を使用して実施することができる。
【０１２６】
層（ａ）への励起光の内結合は、層（ａ）中で変調される格子構造によって実施されることが好ましい。
【０１２７】
好ましくは、光学構造は平面薄膜導波構造である。
【０１２８】
特に好ましいものは、少なくともある励起波長で光学的に透明である層（ａ）を、少なくとも前記励起波長で同じく光学的に透明である、層（ａ）よりも低い屈折率の層（ｂ）の上に有するとともに、層（ａ）中で変調される少なくとも１個の格子構造（ｃ）を有する平面薄膜導波体を含む光学導波体の使用を含む方法であって、層（ａ）に内結合するための共振角で投射される励起光の強さが、層（ａ）上及び層（ａ）内で、少なくとも格子構造（ｃ）の領域で、層（ａ）の表面に又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に位置する分子を多光子励起によって励起させるのに十分なほど高い方法である。
【０１２９】
多光子励起は２光子励起であることが好ましい。
【０１３０】
有利であるものは、光学構造の層（ａ）の表面に又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に位置する分子を、直線経路に沿って、すなわち層（ａ）中を誘導される励起光に沿って同時に多光子励起によって励起させることができる本発明の方法の実施態様である。
【０１３１】
特に有利であるものは、層（ａ）の表面に又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に位置する分子の多光子励起が、層（ａ）への励起光の内結合の位置から起算して少なくとも５mmの距離にわたり直線経路に沿って可能になるような実施態様である。
【０１３２】
また、拡大した励起光の照射により、層（ａ）の表面に又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に位置する分子を、層（ａ）中を誘導される励起光に沿って拡大区域で同時に多光子励起によって励起させることができることが好ましい。格子構造（ｃ）によって光を層（ａ）に内結合する場合、励起光束は、ここでもまた、好ましくは、格子線に対して平行に拡大される。
【０１３３】
特に有利であるものは、同じく、層（ａ）の表面に又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に少なくとも１mm2の面積で、より好ましくは少なくとも１０mm2の面積で、さらに好ましくは少なくとも１cm2の面積で位置する分子の同時多光子励起を可能にするような本発明の方法の実施態様である。
【０１３４】
本発明の方法の種々の実施態様に関して、光学構造が、格子構造（ｃ）によって内結合されかつ層（ａ）中を誘導される励起光の伝播方向に配設されることが好ましい、層（ａ）の連続非変調領域を含むならば、それは有利であることができる。光学構造が、同一又は異なる周期を有する多数の格子構造（ｃ）を、場合によっては層（ａ）の連続非変調領域がそれに隣接する状態で、共通の連続基板上に含むならば、それは特に有利であることができる。それに関して、方法の好ましい実施態様では、光学系は、多光子吸収によって光学構造の層（ａ）の上に又は近接場で生成されるルミネセンスが少なくとも部分的に層（ａ）中に結合されるとともに、層（ａ）中の誘導によって前記光学構造の隣接領域に伝播するような方法で設計されている。
【０１３５】
上記ルミネセンス検出法の場合、（１）等方向のルミネセンス又は（２）層（ａ）に内結合され、格子構造（ｃ）によって外結合されたルミネセンス又は両方の部分（１）及び（２）のルミネセンスを同時に計測することができる。
【０１３６】
ルミネセンス又は蛍光の生成のために、本発明の方法では、２００nm〜１１００nmの波長で励起することができるルミネセンス又は蛍光標識を使用することができる。ルミネセンス又は蛍光標識は、従来のルミネセンス又は蛍光染料であってもよいし、半導体に基づく発光又は蛍光ナノ粒子であってもよい（W. C. W. Chan及びS. Nieの"Quantum dot bioconjugates for ultrasensitive nonisotopic detection", Science 281 (1998) 2016-2018）。当然、加えられる励起波長で特に大きな多光子吸収断面を有し、好ましい２光子励起の場合には特に大きな２光子吸収断面を有し、同時にできるだけ高い光安定性を示すルミネセンス標識が好適である。
【０１３７】
ルミネセンス標識は２光子吸収によって励起されることが好ましい。前記ルミネセンス標識を可視又は近赤外の励起光の２光子吸収によって励起して紫外線又は青ルミネセンスに至らせることが特に好ましい。
【０１３８】
ルミネセンス標識は、分析対象物に結合することもできるし、競合検定では、分析対象物類似体に結合することもできるし、多工程検定では、固定化された生物学的、生化学的又は合成認識要素の結合相手の一つに結合することもできるし、生物学的、生化学的又は合成認識要素に結合することもできる。
【０１３９】
さらには、第一のルミネセンス標識と同じ又は異なる励起波長及び同じ又は異なる発光波長の第二以降のルミネセンス標識を使用することができる。それに関して、第二以降のルミネセンス標識が、第一のルミネセンス標識と同じ波長で励起され、他の波長で発光することができるならば、それは有利であることができる。
【０１４０】
他の用途では、加えられる発光染料の励起スペクトルと発光スペクトルとが重複しないか、部分的にしか重複しないならば、それは有利であることができる。
【０１４１】
本発明の方法では、供与体として働く第一の発光染料から受容体として働く第二の発光染料への電荷又は光エネルギーの移動が分析対象物の検出に使用されるならば、それはさらに有利であることができる。
【０１４２】
本発明のルミネセンス検出による１種以上の分析対象物の測定方法の特別な実施態様は、層（ａ）の表面又は層（ａ）から２００nm未満の距離に位置する蛍光が可能である生分子、たとえば、蛍光が可能であるアミノ酸を有するタンパク質、たとえばトリプトファン、トリシン又はフェニルアニリンの、固有蛍光（「自己蛍光」）を多光子吸収（好ましくは２光子吸収）によって励起する能力に基づく。この群のうち、２８０nmで約５６００（１mol-1cm-1）のモル吸光係数及び約３６０nmの発光で２０％の発光量子収率を有するトリプトファンが好ましい。したがって、トリプトファン蛍光の励起は通常、高屈折導波体の減衰フィールドにおける従来の１光子吸収法によっては可能ではない。理由は、そのような短い波長の励起光は、導波体中で有意な距離を誘導されることはなく、吸収されたり散乱したりするからである。また、そのような短波長励起光を導波体に送ることは、たとえば励起光がまずこの波長で吸収性を示す物質（たとえば大部分のプラスチック）を透過しなければならないならば、しばしば不可能である。しかし、本発明の方法によると、適切な長めの波長の励起光を２光子吸収法に適用し、それを導波体（ａ）中で長めの距離にわたって誘導し、それにより、短波長蛍光を励起することが可能である。特別な利点として、方法のこの変形態様は、測定方法における分析対象物又はその結合相手の一つとルミネセンス標識との化学的会合を要しない。その代わりに、測定は、これらの化合物の天然部分として存在するか、生物学的製造法で分析対象物又はその結合相手の一つに挿入される、ルミネセンスが可能である生物学的化合物の検出に直接基づくことができる。
【０１４３】
本発明の方法のこの特殊な実施態様に関して、ここでもまた、多くの下位的変形態様が可能である。たとえば、分析対象物検出のために固定化された生物学的、生化学的又は合成認識要素は、多光子励起により、固有ルミネセンスを示さないか、できるだけ低いルミネセンスしか示さない（適用された実験条件下で）ような方法で選択することができる。したがって、分析対象物検出工程で、測定法で適用される分析対象物そのもの又は結合相手の一つの多光子吸収によってルミネセンス励起されると、バックグラウンド信号を最小限にすることが可能である。もう一つの有利な実施態様は、計測区域に固定化された生物学的、生化学的又は合成認識要素の固定化密度を、多光子吸収によって励起されるそれら固有ルミネセンス（固有蛍光又は自己蛍光）によって測定することに基づく。したがって、分析対象物検出工程（多光子吸収又は１光子吸収による）の間に励起される分析対象物からの又はその結合相手の一つからのルミネセンス信号を利用可能な結合部位の数及び密度に関して修正及び／又は正規化することが可能である。
【０１４４】
特に、分析対象物及び／又はその結合相手ならびに固定化された認識要素の適切な吸収スペクトルの条件下、１光子吸収及び多光子吸収の場合に、１個の同じレーザを（同時又は順次）１光子及び多光子励起ルミネセンスに適用することできる。このような順次励起の場合、好ましい順序は具体的な用途に依存して異なることがある。
【０１４５】
層（ａ）の表面のエネルギー密度が非常に高く、適切な吸収断面のルミノフォアを使用する場合、ルミネセンス励起を三つの異なる波長で、たとえば発光波長１０６４nmのレーザを用いる１光子吸収によるＮＩＲ染料の励起、２光子吸収による可視での染料の励起（約５３２nm）及び３光子吸収によるＵＶ染料の励起（約３５５nm）を同時に実施することができると想像することができる。７８０nmで発光するレーザを使用する場合、対応する波長は、２光子吸収の場合で３９０nmであり、３光子吸収の場合で２６０nmであろう。
【０１４６】
したがって、本発明の多光子励起の方法は、照射波長における１光子吸収の過程によって励起される、ルミネセンスが可能である分子からの発光の同時又は順次ルミネセンス検出と組み合わせることができる。
【０１４７】
さらには、励起波長における一以上のルミネセンスの計測及び／又は光信号の測定が偏光選択的に実施されるならば、それは有利であることができる。さらには、本方法は、励起光の偏光とは異なる偏光で一以上のルミネセンスを計測する可能性を提供する。
【０１４８】
本発明のさらなる主題は、光学導波体（好ましくは薄膜導波体として設けられる）を含む光学構造の一以上の計測区域における少なくとも１種のサンプル中で、分析対象物又はその結合相手の一つのルミネセンス励起（１光子又は多光子励起ののち）によるルミネセンス検出によって１種以上の分析対象物を測定するための分析系を、
本発明の光学構造と、
本発明の光学系と、
１種以上のサンプルを光学構造の計測区域と接触させるための供給手段と、
１種以上のサンプル及び場合によってはさらなる試薬を受けるための１個以上のサンプル区画と、
サンプル区画に含まれる液体を除去するための手段と
ともに使用して、一以上の計測区域中の１種以上の分析対象物の結合の検出ののち、前記分析対象物と各固定化された認識要素及び場合によってはさらなる結合相手との間に形成される分子複合体を多光子励起後の光解離によって分裂させることができるか、光学構造から脱着させることができ、前記分子複合体を、各サンプル区画からの溶離ののち、まるごと又は断片化された形態でさらなる分析又は調製処理に付すことができる本発明の方法の実施態様である。
【０１４９】
本発明の方法の特別な変形態様に特徴的であることは、層（ａ）の表面に又は層（ａ）から２００nm未満の距離に位置する分子が、層（ａ）上及び層（ａ）内に照射される励起光の大きな増幅により、この距離内で捕捉されるということである。理由は、高い表面閉じ込め励起光の強さと表面に向かう方向におけるその勾配の増大とがこれらの分子に「光学ピンセット」の作用を受けさせるからである。
【０１５０】
本発明及び上記実施態様のいずれかの方法は、抗体もしくは抗原、受容体もしくはリガンド、キレート化剤もしくは「ヒスチジンタグ成分」、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡもしくはＲＮＡストランド、ＤＮＡもしくはＲＮＡ類似体、酵素、酵素補因子もしくは阻害薬、レクチン及び炭水化物を含む群の１種以上の分析対象物の同時及び／又は順次の定量的及び／又は定性的測定を見込んだものである。
【０１５１】
試験するサンプルは、天然に産出する体液、たとえば血液、血清、血漿、リンパ液もしくは尿又は卵黄であることができる。
【０１５２】
試験するサンプルはまた、光学的に濁った液体もしくは表面水、土壌抽出物、植物抽出物又はバイオもしくはプロセスブロスであることができる。
【０１５３】
試験するサンプルはまた、生物学的組織片から採取することができる。
【０１５４】
本発明のさらなる主題は、薬学的研究、コンビナトリアルケミストリー、臨床及び臨床前開発におけるスクリーニング法での化学的、生化学的又は生物学的分析対象物の測定のための定量的及び／又は定性的分析、アフィニティースクリーニング及び研究における運動パラメータのリアルタイム結合研究及び測定、特にＤＮＡ及びＲＮＡ分析学のための分析対象物定性的及び定量的測定、毒性発生研究及び発現プロフィールの決定、ならびに医薬品研究開発、ヒト及び動物の診断、農薬製品研究開発における抗体、抗原、病原体又はバクテリアの決定、医薬品開発及び治療薬選択における患者層別化、食品及び環境分析学における病原体、有害薬剤及び細菌、特にサルモネラ、プリオン及びバクテリアの決定のための、本発明の光学構造及び／又は本発明の光学系及び／又は本発明の分析系及び／又は本発明の方法ならびに上記実施態様いずれかの使用である。
【０１５５】
本発明のさらなる主題は、本発明の光学構造及び／又は本発明の光学系及び／又は本発明の方法の、非線形光学又は遠隔通信もしくは通信技術における使用である。
【０１５６】
非常に一般的に、本発明の光学構造及び／又は本発明の光学系及び／又は本発明の分析系及び／又は本発明の方法は、非常に高い励起光強さ及び／又は励起期間の適用を要する表面閉じ込め研究、たとえば材料の光安定性の研究、光触媒法などに適している。
【０１５７】
記載した具体的な実施態様によって本発明の汎用性を限定する意図なく、以下の例によって本発明をさらに詳細に説明する。
【０１５８】
例１
１．ルミネセンスの２光子励起のための光学構造
光学構造は、ガラス基板（光学層（ｂ）としてのＡＦ４５ガラス、８００nmでｎ＝１．４９６）と、五酸化タンタルの１５０nm薄層（ａ）（導波層（ａ）、８００nmでｎ＝２．０９２）からなるものであった。層（ａ）中に９mm間隔で生成したレリーフ格子の形態の結合格子（格子周期３６０nm、格子深さ１２nm）を、層（ａ）への光の内結合及び層（ａ）からの光の外結合に使用した。これらの条件の下、ガラス基板（光学層（ｂ）、８１０nmでｎ＝１．４９６）から導波層（ａ）への方向における内結合角は−２０．４゜であった。層（ａ）への外部投射角（光学構造の法線に対して計測）は−３１．４゜に達した。
【０１５９】
２光子励起の場合のこの光学構造の適性の生成及び実証のために、ローダミンのエタノール溶液（エタノール中１５．９μMローダミンＢ）０．５μlの滴を層（ａ）上の２個の格子構造の間に被着させて、エタノールの蒸発後、ルミネセンスが可能である分子の例としてのローダミン分子が層（ａ）上に残るようにした。
【０１６０】
２．２光子励起のための光学系、２光子励起の計測方法及び結果
約８００nmで発光するパルス式チタンサファイヤレーザ（パルス長：１００fs、繰返し率：８０MHz、平均印加電力：最大０．６Wまで、スペクトルパルス幅：８nm）を励起光源として使用した。レーザによって発せられる励起光の強さは、電気光学変調器を使用して本来の出力の０％〜１００％の間で連続的に調整することができる。また、コンピュータ制御の下、この範囲で連続的に加減することもできる。
【０１６１】
光学構造の内結合格子（ｃ）上に所望の形状の平行な投射励起光束を生成するため、励起光路中の電気光学変調器の後に（導波構造に向かう方向で）レンズを挿入した。ｘ、ｙ及びｚ方向への並進（格子線に対して平行及び垂直）及び回転（内結合格子の格子線と同一である回転軸で）を可能にするための調節部品に取り付けたミラーを使用して、投射励起光を光学構造の内結合格子（ｃ）に向けた。
【０１６２】
まず、０．４Wの平均照射出力で、平行化したビームを内結合のための共振角で内結合格子に向けた。そのために、内結合格子（光学構造の平面）がビームウエスに位置する状態でレンズ（ｆ＝１２．７cm）によってビームをわずかに合焦させて、励起光が平面波として内結合格子に到達するようにした。驚くことに、固定化されたルミネセンス染料の領域で、光学構造中を誘導されるモードに沿って、屋内照明の下で肉眼でも観察することができるような強さの２格子蛍光が励起された（図１、フィルタなしで撮影）。画像部分は、光学構造を内側に取り付けられたホルダを示す。左側の明るい光点は、内結合格子への励起光の内結合の位置を示す。写真はフィルタなしで撮られているため、長い波長でカメラの感度が低下するにもかかわらず、格子で散乱する励起光の強さはカメラによって記録するのに十分な強さであった。内結合モード（波長８００nm）は、画像面で左から右に伝播した。ローダミン染料が固定化されている領域に達する前に、誘導モードは見えなくなった。そして、モード伝播がさらに右に向かうと、２光子励起によって生成されたローダミン染料の蛍光が明らかに見えるようになった。観察された光の跡は、誘導励起光が再び外結合される次の格子構造までの８mmの長さに相当した。全距離にわたり、誘導光及び励起された２格子蛍光の有意な減衰を観察することはできなかった。
【０１６３】
図２は、検出器としてのＣＣＤカメラの前にＩＲ遮断フィルタ（ＢＧ３９）を使用して撮影した励起された２光子蛍光のプロフィールを格子線に対して平行な断面図で示す。励起ビームプロフィールは、格子上で、蛍光トレースの計測された半値幅と良好に合致する約１００μmの理論幅に調節した。この例では、８mmの距離にわたる直線トレースに沿って（蛍光プロフィールの基底幅をとって約２mm2の面積）２格子励起によって蛍光を発生させた。誘導された励起光の伝播長、ひいては２格子励起の励起長は外結合格子によってのみ制限されるということが注記されなければならない。
【０１６４】
図３は、さらなるビーム形成レンズなしで直接照射されたレーザ光線の対応する蛍光プロフィールを示す。この場合、蛍光プロフィールの半値幅は約３６０μmであり、基底幅は約８００μmであり、約６mm2の全面積（８mmのモード伝播長に沿って）で２格子励起によって励起される蛍光に相当した。
【０１６５】
次に、さらなる工程で、円柱レンズ（ｆ＝４０mm）を用いてレーザビームを格子線に対して平行に拡大した。対応する蛍光プロフィール（図４）から、２０mm2を超える全面積で２格子励起によって励起される蛍光に対応する約１．７mmの半値幅及び約３mmの基底幅を測定した。
【０１６６】
励起蛍光が２格子励起によって生じたものであることを紛れなく識別するための重要な規準は、照射励起強さに対するその強さの二次方程式的依存性である。このためには、ＣＣＤカメラの代わりに、ロックイン増幅器（チョッパ周波数：２kHz）に接続されたＳｉフォトダイオードを検出器として使用した。導波構造の減衰フィールドにおける２格子励起によって励起された等方性に発される蛍光を、レンズにより、フォトダイオードの前に配置されたＩＲ遮断フィルタ（ＢＧ３９）をここでも使用して、前記フォトダイオードに合焦させた。コンピュータ制御された電気光学変調器により、光学構造に照射される励起強さを０mWから３００mW（平均照射出力）近くまで６mWきざみで増大させ、発生した蛍光強さを同時に計測した。図５は、計測された蛍光強さ及び、直線として、計測された強さの方程式ｙ≒ａｘ2（ｙは蛍光強さに対応し、ｘは励起強さに対応し、ａはフィッティングパラメータに対応する）へのあてはめを示す。驚くことに、さらなるバックグラウンド信号に相当するであろうオフセットなしで、励起強さに対する計測された蛍光強さの完璧な二次方程式的依存性が見いだされた。このように、この例では、計測された蛍光が疑う余地なく２光子励起に起因し、この実験条件下、バックグラウンド信号なしで、この２光子蛍光を励起することができるということが実証された。
【０１６７】
例２：２格子励起のための光学系
発光波長８１０nmの高出力レーザダイオード（ファイバ結合、１０W）を励起光源として使用した。ファイバの背後に（光の伝播方向で）位置するビーム成形光学部品により、所望の形状の平行な励起光束を生成し、光学構造の導波層（ａ）への内結合のための結合角で格子（格子周期３６０nm、格子深さ１２nm）に照射した。ガラス基板（光学層（ｂ）、８１０nmでｎ＝１．４９６）における内結合角は−２１．７゜であり、外投射角は−３４．１゜であった。導波層（ａ）は１５０nm五酸化タンタル（８１０nmでｎ＝２．０９）であった。これらのパラメータを使用して、２４％の部分を層（ａ）中に結合することができ、層（ａ）の表面における励起光強さは２格子励起にとって十分であった。
【図面の簡単な説明】
【０１６８】
【図１】本発明の導波構造による２光子励起ののち生成された、裸眼で見ることができる蛍光のＣＣＤカメラ画像を示す図である。
【図２】異なる程度に平行化された励起光線を使用して励起を実施した場合に２光子励起によって生成される蛍光の断面プロフィールを示す図である。
【図３】異なる程度に平行化された励起光線を使用して励起を実施した場合に２光子励起によって生成される蛍光の断面プロフィールを示す図である。
【図４】光学構造の格子線に対して平行に拡大された励起光線を使用する励起ののち、２光子蛍光によって生成された蛍光の断面プロフィールを示す図である。
【図５】励起光の強さに対する計測された蛍光強さの二次方程式的依存性を示す図である。
Claims (106)
- 少なくともある励起波長で光学的に透明である導波層（ａ）を有する光学導波体を含む光学構造であって、層（ａ）に内結合されかつ層（ａ）中を誘導される励起光の強さが、層（ａ）内及び層（ａ）上で、層（ａ）の表面に又は２００nm未満の距離内に位置する分子又は分子群を多光子励起によって励起させることができるのに十分なほど高い光学構造。
- 光学導波体が、少なくともある励起波長で光学的に透明である導波層（ａ）を、少なくとも前記励起波長で同じく光学的に透明である、層（ａ）よりも低い屈折率の層（ｂ）の上に有する光学薄膜導波体である、請求項１記載の光学構造。
- 層（ａ）の表面に又は２００nm未満の距離内に位置しかつ多光子励起によって励起される分子が、光反応性の分子又は分子群、すなわち、光による励起ののち化学反応性になる分子又は分子群である、請求項１〜２のいずれか記載の光学構造。
- 層（ａ）上に又は２００nm未満の距離内に位置する前記光反応性分子の多光子励起によって光重合が開始される、請求項３記載の光学構造。
- 層（ａ）上に又は２００nm未満の距離内に位置する前記光反応性分子の多光子励起によって、光解離が、すなわち、層（ａ）上に又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に多光子励起まで存在する分子又は分子複合体の破断が開始される、請求項３記載の光学構造。
- 前記光反応性分子が、比較的高分子量の分子、特に天然及び人造（合成）ポリマーならびに生物学的分子、たとえばタンパク質、ポリペプチド及び核酸を埋め込むための分子マトリックスの一部である、請求項５記載の光学構造。
- 前記構造が、マススペクトロメトリー、好ましくはＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳ（マトリックス支援レーザ脱離／イオン化飛行時間型マススペクトロメトリー）のためのサンプルキャリヤとして設けられている、請求項５記載の光学構造。
- 少なくともある励起波長で光学的に透明である導波層（ａ）を、少なくとも前記励起波長で同じく光学的に透明である、層（ａ）よりも低い屈折率の層（ｂ）の上に有する光学薄膜導波体を含み、層（ａ）に内結合されかつ層（ａ）中を誘導される励起光の強さが、層（ａ）上及び層（ａ）内で、層（ａ）の表面に又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に位置する分子を多光子励起によって励起させてルミネセンスに至らせるのに十分なほど高い、請求項１〜７のいずれか記載の光学構造。
- 層（ａ）への励起光の内結合が、プリズムカプラと、重畳する減衰フィールドを有する連結した光学導波体に基づく減衰カプラと、導波層の前に位置する合焦レンズ、好ましくは円柱レンズを有する前面カプラと、格子カプラとによって形成される群からの１個以上の光学内結合素子を使用して実施される、請求項１〜８のいずれか記載の光学構造。
- 層（ａ）への励起光の内結合が、層（ａ）中で変調される格子構造によって実施される、請求項９記載の光学構造。
- 前記構造が平面薄膜導波構造である、請求項１〜１０のいずれか記載の光学構造。
- 少なくともある励起波長で光学的に透明である層（ａ）を、少なくとも前記励起波長で同じく光学的に透明である、層（ａ）よりも低い屈折率の層（ｂ）の上に有するとともに、層（ａ）中で変調される少なくとも１個の格子構造（ｃ）を有する平面薄膜導波体を含み、層（ａ）に内結合するための共振角で投射される励起光の強さが、層（ａ）上及び層（ａ）内で、少なくとも格子構造（ｃ）の領域で、層（ａ）の表面に又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に位置する分子を多光子励起によって励起させるのに十分なほど高い、請求項１１記載の光学構造。
- 多光子励起が２光子励起である、請求項１〜１２のいずれか記載の光学構造。
- 層（ａ）の表面に又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に位置する分子を、直線経路に沿って、すなわち層（ａ）中を誘導される励起光に沿って同時に多光子励起によって励起させるように作動可能である、請求項１〜１３のいずれか記載の光学構造。
- 層（ａ）の表面に又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に位置する分子の多光子励起を、層（ａ）への励起光の内結合の位置から起算して少なくとも５mmの距離にわたり直線経路に沿って実施するように作動可能である、請求項１４記載の光学構造。
- 拡大した励起光の照射により、層（ａ）の表面に又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に位置する分子を、層（ａ）中を誘導される励起光に沿って拡大区域で同時に多光子励起によって励起させるように作動可能である、請求項１〜１５のいずれか記載の光学構造。
- 層（ａ）の表面に又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に少なくとも１mm2の面積で位置する分子の同時多光子励起のために作動可能である、請求項１〜１６のいずれか記載の光学構造。
- 層（ａ）の表面に又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に少なくとも１０mm2の面積で位置する分子の同時多光子励起のために作動可能である、請求項１〜１６のいずれか記載の光学構造。
- 層（ａ）の表面に又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に少なくとも１cm2の面積で位置する分子の同時多光子励起のために作動可能である、請求項１〜１６のいずれか記載の光学構造。
- 前記構造が、格子構造（ｃ）によって内結合されかつ層（ａ）中を誘導される励起光の伝播方向に配設されることが好ましい、層（ａ）の連続非変調領域を含む、請求項１０〜１９のいずれか記載の光学構造。
- 前記構造が、同一又は異なる周期を有する多数の格子構造（ｃ）を、場合によっては層（ａ）の連続非変調領域がそれに隣接する状態で、共通の連続基板上に含む、請求項１０〜２０のいずれか記載の光学構造。
- 多光子吸収によって層（ａ）の上に又はその近接場で生成されるルミネセンスが、少なくとも部分的に層（ａ）中に結合されるとともに、層（ａ）中の誘導によって前記光学構造上の隣接領域に伝播する、請求項８〜２１のいずれか記載の光学構造。
- 前記構造が、異なる周期数の２個以上の格子構造を、格子線が平行又は非平行、好ましくは非平行に配設された状態で重畳したものを含み、その構造が異なる波長の励起光の内結合のために作動可能であり、二つの重畳格子構造の場合、それらの格子線が好ましくは互いに対して垂直に配設されている、請求項１２〜２２のいずれか記載の光学構造。
- 層（ａ）よりも低い屈折率を有するとともに、５nm〜１００００nm、好ましくは１０nm〜１０００nmの厚さを有するさらなる光学的に透明な層（ｂ′）が、層（ａ）と層（ｂ）との間にかつ層（ａ）と接触した状態で位置する、請求項２〜２３のいずれか記載の光学構造。
- 格子構造（ｃ）が、均一な周期の回折格子であるか、又は、多回折格子である、請求項１０〜２２又は２４のいずれか記載の光学構造。
- 格子構造（ｃ）は、光学的に透明な層（ａ）中に結合される励起光の伝播方向に対して垂直又は平行な周期数であり、横方向に変化する周期数を備える、請求項１０〜２５のいずれか記載の光学構造。
- 光学的に透明な（ａ）の材料が、ガラス、石英又はたとえばポリカーボネート、ポリアミド、ポリイミド、ポリメチルメタクリレート、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリアクリル酸、ポリアクリル酸エステル、ポリフェニレンスルフィド、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）及びポリウレタンならびにそれらの誘導体を含む群からの透明なプラスチックを含む、請求項１〜２６のいずれか記載の光学構造。
- 光学的に透明な層（ａ）が、ＴｉＯ2、ＺｎＯ、Ｎｂ2Ｏ5、Ｔａ2Ｏ5、ＨｆＯ2又はＺｒＯ2の群の材料、特に好ましくはＴｉＯ2又はＮｂ2Ｏ5又はＴａ2Ｏ5の群の材料を含む、請求項１〜２７のいずれか記載の光学構造。
- 光学的に透明な層（ａ）の屈折率が１．８よりも大きい、請求項１〜２８のいずれか記載の光学構造。
- 光学的に透明な層（ａ）が自立性である、請求項１〜２９のいずれか記載の光学構造。
- 光学的に透明な層（ａ）が低モード導波体である、すなわち、照射励起光の所与の偏光の最初の１０モード未満を誘導するように作動可能である、請求項１〜２９のいずれか記載の光学構造。
- 光学的に透明な層（ａ）が、照射励起光の所与の偏光の１〜３モードのみを誘導するように作動可能である低モード導波体である、請求項３１記載の光学構造。
- 光学的に透明な層（ｂ）の材料が、ガラス、石英又はたとえばポリカーボネート、ポリイミド、ポリメチルメタクリレート、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリアクリル酸、ポリアクリル酸エステル、ポリフェニレンスルフィド、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）及びポリウレタンによって形成される群からの透明な熱可塑性もしくは成形性プラスチックを含む、請求項２〜３２のいずれか記載の光学構造。
- 層（ａ）の厚さとその屈折率との積が、層（ａ）中に結合される励起光の励起波長の１／１０〜１、好ましくは１／１０〜２／３である、請求項１〜３３のいずれか記載の光学構造。
- 層（ａ）中で変調される格子構造（ｃ）が、２００nm〜１０００nmの周期及び３nm〜１００nm、好ましくは１０nm〜３０nmの変調深さを有する、請求項１０〜３４のいずれか記載の光学構造。
- 第一の光学的に透明な層（ａ）の厚さに対する格子の変調深さの比が０．２以下である、請求項１０〜３５のいずれか記載の光学構造。
- 格子構造（ｃ）が、矩形、三角形又は半円形の断面のレリーフ格子であるか、又は本質的に平面的な光学的に透明な層（ａ）中で屈折率の周期変調を有する位相又は容積格子である、請求項１０〜３６のいずれか記載の光学構造。
- 光学系における調節の簡素化のための及び／又は分析系の一部としてのサンプル区画への接続のための光学的又は機械的に認識可能な印が前記構造に設けられている、請求項１〜３７のいずれか記載の光学構造。
- 供給されるサンプル中の１種以上の分析対象物の測定に備えて生物学的又は生化学的又は合成認識要素（ｅ）を固定化するために、厚さが好ましくは２００nm未満、もっとも好ましくは２０nm未満の付着促進層（ｆ）が光学的に透明な層（ａ）に被着され、かつ、この付着促進層（ｆ）が、好ましくは、シランと、エポキシドと、官能化された帯電又は極性ポリマーと、「自己組織化官能化単分子層」と、を含む群からの化合物を含む、請求項１〜３８のいずれか記載の光学構造。
- 横方向に分けられた計測区域（ｄ）が、好ましくはインクジェットスポッティング、機械的スポッティング、マイクロコンタクトプリント、生物学的、生化学的又は合成認識要素を平行又は交差マイクロチャネルに供給し、圧力差又は電気もしくは電磁ポテンシャルを印加して計測区域と流体接触させることを含む方法の群の一つ以上の方法を適用することによって生物学的、生化学的又は合成認識要素を前記光学構造上に横方向に選択的に被着させることによって生成される、請求項１〜３９のいずれか記載の光学構造。
- 核酸（たとえばＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド）及び核酸類似体（たとえばＰＮＡ）、抗体、アプタマー、膜結合しかつ単離された受容体、それらのリガンド、抗体に対する抗原、「ヒスチジンタグ成分」、分子インプリントをホストするための、化学合成によって生成されたキャビティ、天然又は合成ポリマーなど又は全細胞もしくは細胞断片によって形成される群の成分が、生物学的又は生化学的又は合成認識要素として被着され、かつ、これらの認識要素が、光学構造上に直接又は請求項３９記載の付着促進層を介して被着されている、請求項１〜４０のいずれか記載の光学構造。
- 分析対象物に対して「化学的に中性」である化合物、好ましくはたとえばアルブミン、特にウシ血清アルブミンもしくはヒト血清アルブミン、分析されるポリヌクレオチドとでハイブリダイズしない、断片化された天然もしくは合成ＤＮＡ、たとえばニシンもしくはサケの精液又は帯電していないが親水性のポリマー、たとえばポリエチレングリコールもしくはデキストランによって形成される群の化合物が、横方向に分けられた計測区域（ｄ）の間に被着されている、請求項４０〜４１のいずれか記載の光学構造。
- 二以上の横方向に分けられた計測区域が光学構造上でセグメントに組み合わされ、かつ、好ましくは異なるセグメントがさらに、隣接区域間の流体シールを支持する被着されたリム及び／又は隣接区域間の光学クロストークの減少に貢献する被着されたリムによって互いに分けられている、請求項４０〜４２のいずれか記載の光学構造。
- １，０００，０００個までの計測区域が二次元配列で設けられ、かつ、単一の計測区域が０．００１mm2〜６mm2の面積を占有する、請求項４０〜４３のいずれか記載の光学構造。
- 少なくとも１個の励起光源と、請求項１〜４４のいずれか記載の光学構造とを含む多光子励起のための光学系であって、層（ａ）に内結合されかつ層（ａ）中を誘導される励起光の強さが、層（ａ）内及び層（ａ）上で、層（ａ）の表面に又は２００nm未満の距離内に位置する分子を多光子励起によって励起させるのに十分なほど高い光学系。
- 層（ａ）に内結合されかつ層（ａ）中を誘導される励起光の強さが、層（ａ）内及び層（ａ）上で、層（ａ）の表面に又は２００nm未満の距離内に位置する分子を多光子励起によって励起させてルミネセンスに至らせるのに十分なほど高くなる、請求項４５記載の多光子励起のための光学系。
- 層（ａ）への励起光の内結合が、プリズムカプラと、重畳する減衰フィールドを有する連結した光学導波体に基づく減衰カプラと、導波層の前に位置する合焦レンズ、好ましくは円柱レンズを有する前面カプラと、格子カプラとによって形成される群からの１個以上の光学内結合素子を使用して実施される、請求項４５〜４６のいずれか記載の光学系。
- 層（ａ）への励起光の内結合が、層（ａ）中で変調される格子構造によって実施される、請求項４７記載の光学系。
- 前記構造が平面薄膜導波構造である、請求項４５〜４８のいずれか記載の光学系。
- 少なくとも１個の励起光源と、請求項１０〜４４のいずれか記載の光学構造とを含み、層（ａ）に内結合するための共振角で層（ａ）中で変調される格子構造（ｃ）に投射される励起光の強さが、層（ａ）上及び層（ａ）内で、少なくとも格子構造（ｃ）の領域で、層（ａ）の表面に又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に位置する分子を多光子励起によって励起させるのに十分なほど高い、請求項４９記載の光学系。
- 多光子励起が２光子励起である、請求項４５〜５０のいずれか記載の光学系。
- 層（ａ）の表面に又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に位置する分子を、直線経路に沿って、すなわち層（ａ）中を誘導される励起光に沿って同時に多光子励起によって励起させるように作動可能である、請求項４５〜５１のいずれか記載の光学系。
- 層（ａ）の表面に又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に位置する分子の多光子励起を、層（ａ）への励起光の内結合の位置から起算して少なくとも５mmの距離にわたり直線経路に沿って実施するように作動可能である、請求項５２記載の光学系。
- 拡大した励起光の照射により、層（ａ）の表面に又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に位置する分子を、層（ａ）中を誘導される励起光に沿って拡大区域で同時に多光子励起によって励起させるように作動可能である、請求項４５〜５３のいずれか記載の光学系。
- 層（ａ）の表面に又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に少なくとも１mm2の面積で位置する分子の同時多光子励起のために作動可能である、請求項４５〜５４のいずれか記載の光学系。
- 多光子吸収によって層（ａ）の上に又はその近接場で生成されるルミネセンスが、少なくとも部分的に層（ａ）中に結合されるとともに、層（ａ）中の誘導によって前記光学構造上の隣接領域に伝播する、請求項４６〜５４のいずれか記載の光学系。
- 光学構造からの一以上のルミネセンスを検出するための少なくとも１個の検出器をさらに含む、請求項４５〜５６のいずれか記載の光学系。
- 少なくとも１個の励起光源から発せられる励起光が本質的に平行であり、かつ、層（ａ）に内結合するための共振角で、光学的に透明な層（ａ）中で変調される格子構造（ｃ）に照射される、請求項４８〜５７のいずれか記載の光学系。
- 少なくとも１個の光源からの励起光が拡大光学部品によって本質的に平行な光束に拡大され、かつ、層（ａ）中に内結合するための共振角で、光学的に透明な層（ａ）中で変調される巨視的区域の格子構造（ｃ）に照射される、請求項４８〜５８のいずれか記載の光学系。
- 少なくとも１個の光源からの励起光が、回折光学要素又は、光源が多数ある場合には、好ましくはダンマン格子である多数の回折光学要素又は好ましくはマイクロレンズアレイである屈折光学要素によってできるだけ均一な強さの複数の個々の光線に分割され、個々の光線が、互いに対して本質的に平行に、層（ａ）に内結合するための共振角で格子構造（ｃ）に投射される、請求項４８〜５９のいずれか記載の光学系。
- 同様な又は異なる発光波長の２個以上の光源が励起光源として使用される、請求項４５〜６０のいずれか記載の光学系。
- 請求項２３に記載の光学構造を有し、２個以上の光源からの励起光が異なる方向から同時又は順次に格子構造（ｃ）に投射され、異なる周期数の格子構造を重畳したものを含むその格子構造によって層（ａ）に内結合される、請求項６１記載の光学系。
- たとえば、ＣＣＤカメラ、ＣＣＤチップ、フォトダイオードアレイ、アバランシェダイオードアレイ、マルチチャネルプレート及びマルチチャネル光電子増倍管によって形成される群からの少なくとも１個の横方向に解像する検出器が信号検出に使用される、請求項４５〜６２のいずれか記載の光学系。
- 伝送される光束を成形するためのレンズもしくはレンズ系、光束を偏光させ、場合によってはさらに成形するための平面もしくは湾曲したミラー、光束を偏光させ、場合によってはスペクトル分離するためのプリズム、光束の部分をスペクトル選択的に偏光させるためのダイクロイックミラー、伝送される光の強さを調整するためのニュートラルフィルタ、光束の部分をスペクトル選択的に透過させるための光学フィルタもしくはモノクロメータ、又は励起及び／又はルミネセンス光の別個の偏光方向を選択するための偏光選択素子によって形成される群の光学部品が、１個以上の励起光源と請求項１〜４４の光学構造との間に及び／又は前記光学構造と１個以上の検出器との間に配置されている、請求項４５〜６３のいずれか記載の光学系。
- 励起光が１fsec〜１０minの間隔のパルスで投射され、かつ、場合によっては、計測区域からの発光が時間分解的に計測される、請求項４６〜６４のいずれか記載の光学系。
- 参照のため、計測区域の他に、光源の位置での励起光又は拡大後の励起光又は個々のビームに分割された後の励起光と、一以上の横方向に分けられた計測区域の位置からの励起波長の散乱光と、格子構造（ｃ）によって外結合された励起波長の光と、によって形成される群の光信号が計測される、請求項４６〜６５のいずれか記載の光学系。
- 発光の測定のための計測区域と参照信号の測定のための計測区域とが同一である、請求項４６〜６６のいずれか記載の光学系。
- 励起光の投射及び一以上の計測区域からの発光の検出が一以上の計測区域ごとに順次に実施される、請求項４６〜６７のいずれか記載の光学系。
- 順次の励起及び検出が、ミラー、偏光プリズム及びダイクロイックミラーによって形成される群の可動光学部品によって実施される、請求項６８記載の光学系。
- 順次の励起及び検出が、本質的に焦点及び角度保存的なスキャナを使用して実施される、請求項６９記載の光学系。
- 光学構造が順次の励起及び検出の過程の間で動かされる、請求項６８〜７０のいずれか記載の光学系。
- 請求項１〜４４のいずれか記載の光学構造及び／又は請求項４５〜７１のいずれか記載の光学系の使用を含む多光子励起の方法であって、層（ａ）に内結合されかつ層（ａ）中を誘導される励起光の強さが、層（ａ）内及び層（ａ）上で、層（ａ）の表面に又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に位置する分子を多光子励起によって励起させるのに十分なほど高い方法。
- 光学構造の層（ａ）の表面に又は層（ａ）から２００nm未満の距離に位置する分子が光反応性であり、かつ、多光子励起によって励起して化学反応に至らせることができる、請求項７２記載の方法。
- 光学構造の層（ａ）の表面に又は層（ａ）から２００nm未満の距離に位置する分子を多格子励起によって励起して他の分子に結合させることができる、請求項７３記載の方法。
- 光学構造の層（ａ）の表面に又は層（ａ）から２００nm未満の距離に位置する分子を多格子励起によって励起して光重合に至らせることができる、請求項７３記載の方法。
- 光解離を、すなわち、層（ａ）上に又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に多光子励起まで存在する分子又は分子複合体の破断を、層（ａ）上に又は２００nm未満の距離内に位置する前記光反応性分子の多光子励起によって開始させる、請求項７３記載の方法。
- 請求項１〜４４のいずれか記載の光学構造及び／又は請求項４５〜７１のいずれか記載の光学系の使用を含むルミネセンス励起の方法であって、層（ａ）に内結合されかつ層（ａ）中を誘導される励起光の強さが、層（ａ）上及び層（ａ）内で、層（ａ）の表面に又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に位置する分子を多光子励起によって励起させてルミネセンスに至らせるのに十分なほど高い方法。
- 請求項３９〜４４のいずれか記載の光学構造の一以上の計測区域上の１種以上のサンプル中で１種以上の分析対象物をルミネセンス検出によって検出するための、前記光学構造上で計測区域からの又は少なくとも二以上の横方向に分けられた計測区域（ｄ）のアレイ又はいくつかの計測区域を含む少なくとも２個以上の横方向に分けられたセグメントのアレイからの一以上のルミネセンスを測定するための方法であって、層（ａ）に内結合されかつ層（ａ）中を誘導される励起光の強さが、層（ａ）上及び層（ａ）内で、層（ａ）の表面に又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に位置する分子を多光子励起によって励起させてルミネセンスに至らせるのに十分なほど高い方法。
- プリズムカプラと、重畳する減衰フィールドを有する連結した光学導波体に基づく減衰カプラと、導波層の前に位置する合焦レンズ、好ましくは円柱レンズを有する前面カプラと、格子カプラとによって形成される群からの１個以上の光学内結合素子を使用して層（ａ）への励起光の内結合を実施する、請求項７２〜７８のいずれか記載の方法。
- 層（ａ）中で変調される格子構造によって層（ａ）への励起光の内結合を実施する、請求項７２〜７９のいずれか記載の方法。
- 光学構造が平面薄膜導波構造である、請求項７２〜８０のいずれか記載の方法。
- 少なくともある励起波長で光学的に透明である層（ａ）を、少なくとも前記励起波長で同じく光学的に透明である、層（ａ）よりも低い屈折率の層（ｂ）の上に有するとともに、層（ａ）中で変調される少なくとも１個の格子構造（ｃ）を有する平面薄膜導波体を含む光学構造の使用を含み、層（ａ）に内結合するための共振角で投射される励起光の強さが、層（ａ）上及び層（ａ）内で、少なくとも格子構造（ｃ）の領域で、層（ａ）の表面に又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に位置する分子を多光子励起によって励起させるのに十分なほど高い、請求項８１記載の方法。
- 多光子励起が２光子励起である、請求項７２〜８２のいずれか記載の方法。
- 光学構造の層（ａ）の表面に又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に位置する分子を、直線経路に沿って、すなわち層（ａ）中を誘導される励起光に沿って同時に多光子励起によって励起させることができる、請求項７２〜８３のいずれか記載の方法。
- 層（ａ）の表面に又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に位置する分子の多光子励起を、層（ａ）への励起光の内結合の位置から起算して少なくとも５mmの距離にわたり直線経路に沿って実施するように作動可能である、請求項８４記載の方法。
- 拡大した励起光の照射により、層（ａ）の表面に又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に位置する分子を、層（ａ）中を誘導される励起光に沿って拡大区域で同時に多光子励起によって励起させるように作動可能である、請求項８０〜８５のいずれか記載の方法。
- 層（ａ）の表面に又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に少なくとも１mm2の面積で位置する分子の同時多光子励起のために作動可能である、請求項７２〜８６のいずれか記載の方法。
- 層（ａ）の表面に又は層（ａ）から２００nm未満の距離内に少なくとも１cm2の面積で位置する分子の同時多光子励起のために作動可能である、請求項７２〜８７のいずれか記載の方法。
- 光学構造が、格子構造（ｃ）によって内結合されかつ層（ａ）中を誘導される励起光の伝播方向に配設されることが好ましい、層（ａ）の連続非変調領域を含む、請求項８０〜８８のいずれか記載の方法。
- 光学構造が、同一又は異なる周期を有する多数の格子構造（ｃ）を、場合によっては層（ａ）の連続非変調領域がそれに隣接する状態で、共通の連続基板上に含む、請求項８０〜８９のいずれか記載の方法。
- 多光子吸収によって光学構造の層（ａ）の上に又はその近接場で生成されるルミネセンスが、少なくとも部分的に層（ａ）中に結合させるとともに、層（ａ）中の誘導によって前記光学構造の隣接領域に伝播する、請求項８０〜９０のいずれか記載の方法。
- ルミネセンスの生成のために、２００nm〜１１００nmの波長で励起することができるルミネセンス染料又は発光性ナノ粒子をルミネセンス標識として使用する、請求項７７〜９１のいずれか記載の方法。
- 前記ルミネセンス標識を２光子吸収によって励起する、請求項９２記載の方法。
- 前記ルミネセンス標識を可視又は近赤外の励起光の２光子吸収によって励起して紫外又は青ルミネセンスに至らせる、請求項９３記載の方法。
- ルミネセンス標識を、分析対象物に結合するか、競合検定で、分析対象物類似体に結合するか、多工程検定で、固定化された生物学的、生化学的又は合成認識要素の結合相手の一つに結合するか、生物学的、生化学的又は合成認識要素に結合する、請求項９２〜９４のいずれか記載の方法。
- 第一のルミネセンス標識と同じ又は異なる励起波長及び同じ又は異なる発光波長の第二以降のルミネセンス標識を使用する、請求項９２〜９５のいずれか記載の方法。
- 蛍光が可能である生分子、たとえば、蛍光性アミノ酸を有するタンパク質の固有蛍光（「自己蛍光」）を多光子励起によって励起する、請求項７７〜９１のいずれか記載の方法。
- 蛍光が可能である前記アミノ酸が、トリプトファン、トリシン及びフェニルアラニンによって形成される群から選択される、請求項９７記載の方法。
- 計測区域に固定化された生物学的、生化学的又は合成認識要素の固定化密度を、多光子吸収によって励起されるそれら固有ルミネセンス（固有蛍光又は自己蛍光）から測定する、請求項７７〜９８のいずれか記載の方法。
- 分析対象物検出過程（多光子吸収又は１光子吸収による）で励起される分析対象物からの又はその結合相手の一つからのルミネセンス信号を、利用可能な結合部位の数及び密度に関して、多光子吸収によって励起される固定化された生物学的、生化学的又は合成認識要素の計測された固有ルミネセンスに基づいて修正及び／又は正規化する、請求項７７〜９９のいずれか記載の方法。
- 励起波長における一以上のルミネセンスの計測及び／又は光信号の測定を偏光選択的に実施し、好ましくは、励起光の偏光とは異なる偏光で一以上のルミネセンスを計測する、請求項７７〜１００のいずれか記載の方法。
- 層（ａ）の表面に又は層（ａ）から２００nm未満の距離に位置する分子を、層（ａ）上及び層（ａ）内に照射される励起光の大きな増幅により、高い表面閉じ込め励起光の強さと表面に向かう方向におけるその勾配の増大とがこれらの分子に「光学ピンセット」の作用を受けさせることにより、この距離内で捕捉する、請求項７２〜１０１のいずれか記載の方法。
- 抗体もしくは抗原、受容体もしくはリガンド、キレート化剤もしくは「ヒスチジンタグ成分」、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡもしくはＲＮＡストランド、ＤＮＡもしくはＲＮＡ類似体、酵素、酵素補因子もしくは阻害薬、レクチン及び炭水化物を含む群の１種以上の分析対象物の同時及び／又は順次の定量的及び／又は定性的測定のための、請求項７２〜１０２のいずれか記載の方法。
- 試験するサンプルが、天然に産出する体液、たとえば血液、血清、血漿、リンパ液もしくは尿又は卵黄、光学的に濁った液体、表面水、土壌抽出物、植物抽出物又はバイオもしくはプロセスブロスであるか、生物学的組織片から採取されるものである、請求項７２〜１０３のいずれか記載の方法。
- 薬学的研究、コンビナトリアルケミストリー、臨床及び臨床前開発におけるスクリーニング法での化学的、生化学的又は生物学的分析対象物の測定のための定量的及び／又は定性的分析、アフィニティースクリーニング及び研究における運動パラメータのリアルタイム結合研究及び測定、特にＤＮＡ及びＲＮＡ分析学のための分析対象物定性的及び定量的測定、毒性発生研究及び発現プロフィールの決定、ならびに医薬品研究開発、ヒト及び動物の診断、農薬製品研究開発における抗体、抗原、病原体又はバクテリアの決定、医薬品開発及び治療薬選択における患者層別化、食品及び環境分析学における病原体、有害薬剤及び細菌、特にサルモネラ、プリオン及びバクテリアの決定のための、請求項１〜４４のいずれか記載の光学構造及び／又は請求項４５〜７１のいずれか記載の光学系及び／又は請求項７２〜１０４のいずれか記載の方法の使用。
- 非常に高い励起光強さ及び／又は励起期間の適用を要する表面閉じ込め研究、たとえば材料の光安定性の研究、光触媒法などのための、請求項１〜４４のいずれか記載の光学構造及び／又は請求項４５〜７１のいずれか記載の光学系及び／又は請求項７２〜１０４のいずれか記載の方法の使用。
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