WO2012006995A1 - Mikrostrukturierter messchip zur optischen messung von eigenschaften künstlicher oder biologischer membranen und verfahren zu dessen herstellung - Google Patents

Mikrostrukturierter messchip zur optischen messung von eigenschaften künstlicher oder biologischer membranen und verfahren zu dessen herstellung Download PDF

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microstructured
silicon
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Guido BÖSE
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Nanospot Gmbh
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    • Y10T156/1052—Methods of surface bonding and/or assembly therefor with cutting, punching, tearing or severing
    • Y10T156/1062—Prior to assembly

Definitions

  • the invention relates to a microstructured measuring chip for the optical measurement of properties of artificial or biological membranes with a lower, transparent carrier layer and at least one opaque main layer arranged thereon, which are designed as measuring chambers
  • Membrane permeability is crucial for the availability of drugs in cells, as well as in the brain, as it requires the blood-brain barrier to be penetrated. In drug development, availability at the target site is thus a crucial property of potential drugs.
  • Receptor proteins such as G-protein coupled receptors (GPCR for short) possess extracellular regions for ligand binding, transmembrane
  • Receptor activation is a detection of the signal, so the
  • electrical measurements can be used to analyze transport rates of ions and charged particles. This process already has an application in higher throughput in the biotechnological and
  • Nuclear pore complex in core casings made from Xenopus Laevis has also been used to measure the transport of calcium ions through the a-hemolysin pore, which has been inserted directly into prefabricated, artificial lipid membranes, refolding from a denatured structure into a functional form.
  • a-hemolysin pore which has been inserted directly into prefabricated, artificial lipid membranes, refolding from a denatured structure into a functional form.
  • Polycarbonate filter or polycarbonate structures were used, the wells were used for the fluorescence measurement of transport rates using confocal laser scanning microscopy. This causes poor optical properties, i.a. due to divergences in refractive indices of polycarbonate and measuring buffer.
  • the metal layer contains a measuring chamber with a much smaller diameter than the wavelength of the radiated from below excitation light and thereby acts as a so-called zero-mode waveguide.
  • the excitation light thus does not penetrate into the depressions, but some of the light energy reaches the measuring chambers. Above the measuring chambers no substrate molecules are excited.
  • a measuring chip has numerous disadvantages. Due to their small dimensions, the volume of the measuring chamber with few zeptoliters is very small, so that they can not be used for transport operations. In addition, only the lower area of the measuring chamber can be used, since only there excitation occurs. As a result, the signal-to-noise ratio of the measurements is very poor and it requires a complex measuring device.
  • the object of the invention is to provide a measuring chip with which the properties of membranes or transport systems can be measured by means of commercially available, conventional measuring devices with higher measuring accuracy and higher throughput.
  • Measurements can be made of conventional fluorescence microscopes with the noncoherent light of a fluorescent lamp, but also laser scanning microscopes.
  • the measurement is made from below through the translucent carrier layer of the measuring chip. Therefore, it is permeable to the excitation light of a fluorescent lamp.
  • the excitation light for example, suitable
  • Measuring chambers are stimulated.
  • the side wall or the side walls of the measuring chambers are not smooth, but according to the invention have depressions and / or elevations. Smooth reflecting side surfaces would reduce the emissions from above the
  • Membrane or measuring fluid reduced. Overall, an undesirable optical detection of emissions of substrate molecules within and above minimized membrane and achieved a predominant detection of emissions of substrate molecules within the measuring chambers. This is also possible with conventional fluorescence microscopy.
  • Recesses and elevations alternate, that are formed like a groove and the grooves in the direction of the longitudinal axis of the measuring chambers a corrugated
  • the alternating recesses or elevations or grooves each have a periodic spacing of 0.1 to 0.6 ⁇ on.
  • the distance can also be a few nanometers to several micrometers.
  • the distance between the highest point of the elevations and the lowest point of the depressions is 20 to 1 10 nm, but can also be up to a few micrometers.
  • the measuring chambers each have the basic shape of a circular cylinder or a truncated cone. Because the
  • the grooves and bumps forming the grooves circulate the sidewall, i. both the
  • Measuring chambers and the grooves are approximately circular in section perpendicular to the longitudinal axis of the measuring chambers.
  • Such a corrugated surface structure can be achieved by the reactive silicon ion deep etching (DRIE, Bosch process) for the deep etching of silicon. This includes an alternating sequence of etching process and passivation step and thereby generates such a wave or comb structure of the side walls perpendicular to the etching direction.
  • Shape and Gap spacing varies with process settings and etch depth.
  • the grooves in the sidewalls of opaque, rather reflective material produce scattering of both the incident excitation light and the emission light in the measurement chambers, while smooth sidewalls would allow reflection of light longitudinally through the measurement chambers and thus propagation as in an optical fiber.
  • excitation light irradiated from the underside of the measuring chip is better shielded from an exit from the upper opening of the measuring chamber.
  • interference emissions above the measuring chambers are better shielded from passage from the bottom of the measuring chambers to the camera, and measurement accuracy is further improved overall.
  • the lower, translucent carrier layer consists for example of plastic or glass. It has been found that, in particular, borosilicate glass is suitable, which is produced by the float process or as a polished wafer.
  • the opaque, microstructured main layer with the wells serving as measuring chambers comprises metal, plastic or silicon.
  • silicon also includes silicon compounds. Silicon has the advantage that in the processing, ie the production of the wells, some known methods in the field of electronic microchips can be used.
  • a cover layer, preferably of silicon dioxide and / or metal, may be arranged on the main layer. The cover layer then has openings which are arranged above the openings of the measuring chambers. Preferably, in each case an opening in the cover layer is arranged above the opening of a measuring chamber.
  • the surface of the measuring chip may contain one or more chemically reactive and / or polar coatings, in particular poly-L-lysine and / or
  • Membrane direct or indirect, covalent or noncovalent to bind to the measuring chip.
  • Measuring chambers facing bottom of the cover layer and / or the top of the main layer may additionally each have an opaque coating, preferably of metal, in particular of gold or titanium. This is preferably done by means of known PVD methods (abbreviation for "physical vapor deposition") .
  • the coating has several advantages
  • silicon is substantially opaque to wavelengths of visible light up to 600 nm.
  • silicon becomes increasingly permeable. This would be annoying if that
  • standardized thiol compounds such as ß-mercaptoethanol or
  • Mercaptopropionic acid but also components of a detection system of the Couple receptor activation.
  • the layer of silicon or silicon oxide does not bind these and can therefore be selectively modified by silanization. This allows a different modification of the measuring chambers and the top of the measuring chip, which is advantageous for certain measuring tasks.
  • Microplates or coverslips meet.
  • the reservoirs are continuous channels, i. they initially have no bottom but a lower opening.
  • Glass carrier a silicone adhesive, preferably Sylguard 184, proved to be suitable for sticking the measuring chips on the glass carrier.
  • the reservoirs form in this way for the microstructured measuring chips a container for a suitable measuring liquid.
  • the optical measurement is carried out from the underside of the holder through the translucent carrier layer of the measuring chips or additionally by glass carrier and adhesive as described above.
  • the invention also includes a method for producing microstructured measuring chips, in particular having the features described above.
  • a silicon wafer is used as the starting material or as a substrate, as it is used in microelectronics for the production of integrated circuits.
  • known methods of microstructuring such as
  • Photolithography and etching can be applied.
  • the upper silicon layer of the silicon wafer with the etched measuring chambers is then connected to the carrier layer, preferably by anodic bonding, wherein the previous opening of the measuring chamber with the carrier layer as a bottom to its underside.
  • the buried layer is completely or partially removed, preferably by etching, using a special etchant that attacks and dissolves the buried layer, for example hydrofluoric acid.
  • a special etchant that attacks and dissolves the buried layer, for example hydrofluoric acid.
  • the buried layer is selectively photolithographically patterned at the locations where it covers the measuring chamber openings. The buried layer then forms the cover layer with the cover layer openings of the measuring chip.
  • FIG. 6 shows a vertical section through a further embodiment of the invention
  • Figure 7 is a plan view of the measuring chip in a partial view
  • FIG. 8a shows a vertical section through a holder
  • Figure 8b is a plan view of the holder of Figure 8a; 9 shows a vertical section through another embodiment of the
  • Partial view a vertical section through an SOI wafer as in Figure 10 with etched measuring chambers; a vertical section through an SOI wafer as in Figure 1 1 with an upper, bonded support layer; a vertical section through an SOI wafer as in Figure 12 after removal of the lower silicon layer; a vertical section through an SOI wafer as in Figure 13 after turning over; and a vertical section through an SOI wafer as in FIG. 14 after the partial removal of the hidden layer.
  • the measuring chip 1 consists of interconnected layers or materials. As a base, it has a lower, translucent carrier layer 10 made of floated or polished borosilicate glass. Proven have "Borofloat 30" or "Pyrex". The thickness of the carrier layer 10 is about 140-200 ⁇ , although it may also be thicker or thinner. The carrier layer 10 is permeable to excitation light 80 or emitted fluorescent light 81. On the carrier layer 10, a substantially opaque main layer 20 of silicon is arranged, which forms the top 17 of the measuring chip 1. It should be noted for the sake of completeness that the main layer 20 of silicon oxidizes externally in the air and so a superficial, but only nanometer thick
  • the main layer 20 is firmly connected to the carrier layer 10 by anodic bonding.
  • the main layer 20 has circular cylindrical, continuous
  • Circular cylinder formed and the circular upper opening 25 through his
  • each metering chamber 30 is formed by the top surface of the translucent support layer 10.
  • the measuring chambers 30 have a depth 33 of 10 to 30 ⁇ , but there are also depths of a few nanometers to millimeters possible.
  • the diameter 31 of the measuring chambers 30 is about 1 ⁇ , but there are also diameter 31 of a few nanometers to a millimeter possible.
  • the distance 32 between the longitudinal axes of the individual measuring chambers 30 is 2.5 ⁇ to 4 ⁇ ; but it is also distances 32 from a few nanometers to a millimeter possible.
  • FIG. 2 shows a detailed view of a measuring chamber of another
  • the ratio of depth 22 to diameter 31 of the measuring chambers 30 is about 1 to 10. This can only substantially parallel to
  • Measuring chamber side wall 26 radiated excitation light 80 through the opening of the measuring chamber.
  • the side walls 26 of the measuring chambers 30 partially have a corrugated surface structure extending through in the direction of
  • FIG. 3 shows a section of a measuring chip as in FIG. 1.
  • a lipid membrane 40 is shown which is used in measurements with the measuring chip 1.
  • the lipid membrane 40 is applied to the top 17 of the measuring chip 1, so that at least some of the measuring chamber openings 25 are covered and closed by the lipid membrane.
  • the membrane 40 has been produced from artificial proteol liposomes, which upon addition can spontaneously fuse with the chip surface and thus form the membrane 40.
  • the membrane 40 contains individual transport proteins 50 for transporter analyzes, for example
  • Substrate molecules 60 are added which either fluoresce intrinsically or are covalently labeled with a fluorescent dye.
  • Substrate molecules 60 through the introduced into the membrane 40 transport proteins 50 in the measuring chambers 30 of the measuring chip 1 is specific to the
  • Transport protein 50 and can be detected by detecting the fluorescence in the
  • Measuring chambers 30 are measured. This allows conclusions to be drawn about specific parameters such as transport rates and permeability and allows, for example, the evaluation of drug candidates for drugs.
  • Measurement takes place in an aqueous medium, i. Measuring chambers 30, membranes 40, proteins 50 and substrate molecules 60 are of a type (not shown).
  • a measuring liquid for example a suitable saline
  • Substrate molecules 60 emitted fluorescent emissions 81 radiate from the measuring chamber 30 through the translucent
  • the wavy surface structure reduces unwanted propagation of excitation light 80 out of the measuring chambers 30. Nevertheless, should a certain residual portion of the excitation light 80 radiate through the measuring chamber 30 and through the membrane 40, then undesirably also the substrate molecules 60 above the
  • Spurious emissions 82 from. Due to the corrugated surface structure 27, 28, the propagation of the interference emissions 82 above the measuring chip 1 through the
  • FIG. 4 shows a vertical section through another, preferred embodiment of the measuring chip 1, which essentially corresponds to that shown in FIG. 1 but has an additional covering layer 12.
  • the cover layer 12 is on the
  • FIG. 5 shows, in a vertical section, a detailed view of a further embodiment of the measuring chip 1 with a measuring chamber 30 with covering layer 12 of silicon dioxide and an additional opaque coating 21 made of titanium and / or gold. If gold is used, titanium serves as a bonding agent.
  • the components of the measuring chip 1 with metal coating 21 are shown in FIG. 6 by means of thicker line thicknesses. These are the side walls 26 of the measuring chambers 30, the underside 16 of the cover layer 12 facing the measuring chamber 30 and the underside 24 of the main layer 20 resting on the carrier layer 10.
  • the metal coating 21 has several advantages. On the one hand, translucent silicon dioxide can be used as cover layer 12. This has advantages in the production of the measuring chip 1 (see below). Although the main layer 20 of silicon is substantially opaque to wavelengths of visible light up to 600 nm. For deep red and infrared light, however, silicon becomes increasingly permeable. This would be annoying if the excitation light 80 or interference emissions 82 (not shown) are in this wavelength range. However, titanium and gold are far into the infrared wavelength range
  • shutters 12 are formed by the coated cover layer, which are irradiated from the underside of the measuring chip 1
  • Metal coating 21 therefore improves the measurement accuracy.
  • the same effect can be achieved by a metal coating above the cover layer 12.
  • Another advantage is that the metal coating 21 can be contacted and used as an electrode for electrical measurements or excitations (not shown). The metal coating 21 can in this way for
  • the measuring chip 1 can be used in such a way that the impedance of a membrane 40 stretched over it or cells (not shown) can be measured. As a result, the tightness of membranes 40, cell or tissue layers can be determined.
  • the measuring chip 1 can also be used to generate an electric field by means of the gold coating 21, in particular for controlling voltage-sensitive transport systems.
  • voltage dependent ion channels i. Ion channels that open or close at a certain threshold of membrane voltage.
  • the measuring chip 1 By changing the applied electric field so functional switching processes can be triggered, which result in a change of the transport 70 of substrate molecules 60 via a membrane 40 (not shown). The substrate molecules 60 can then be detected in the measuring chambers 30 by means of fluorescence.
  • Another application of the measuring chip 1 is that the upper
  • Covering layer 12 of the measuring chip 1 is covered with a lipid membrane
  • Messchipoberseite 17 of the measuring chip acting electrode applied an electric field. Another electrode in the solution above the membrane creates a membrane potential. , The applied voltage leads to the activation of the
  • the illustrated embodiment of the measuring chip 1 thus has the advantage that biological transport systems are switched electrically functional and at the same time the transport generated thereby can be measured optically by means of fluorescence via the membranes 40. Yet another advantage results in combination with a chemically reactive or polar coating (not shown). To a gold coating 21 on the side wall 26 of the measuring chambers 30 can be standardized
  • Thiol compounds such as ⁇ -mercaptoethanol or mercaptopropionic but also components of a detection system of receptor activation are bound.
  • FIG. 5 also shows the effect of the cover layer 12. Openings 14 of the cover layer 14 are arranged centrally above the openings 25 of the measuring chambers 30. If a bundle of excitation light 80 is irradiated from below, it is partially dimmed by the cover layer 12 or reflected by the gold coating 21 on the underside 16 of the cover layer 12 and only reaches the area above the measuring chip 1 with reduced intensity, which results in the measurement accuracy elevated. In the embodiment shown, interference emissions from above the measuring chip 1 penetrate the light-permeable covering layer 21
  • FIG. 6 shows a vertical section through a further embodiment of the invention
  • FIG. 6 shows that, due to the corrugated surface structure of the side walls 26 in connection with the upwardly tapering measuring chamber 30, the excitation light 80 radiated from below does not leave the measuring chamber opening 25 for the most part. Also, spurious emissions 82 (not shown) above the main layer 20 through the smaller upper opening 25 better shielded. Due to the synergistic effect of both features, the measurement accuracy achievable with the measuring chip 1 is further increased considerably.
  • Diameter 31 of 1 ⁇ but are also possible embodiments with diameters from a few nanometers to several hundred
  • the distance 32 of the centers of the measuring chambers is 2.5 to 4 ⁇ , but are also possible a few nanometers.
  • the measuring chambers 30 have the basic shape of a circular cylinder. However, as FIG. 8 shows, the measuring chip 1 also has differently shaped, as shown in FIG.
  • measuring chambers 30 are each provided with an oval measuring chamber 30 ', both in the longitudinal and in the transverse direction of the array.
  • These measuring chambers 30 ' serve as visual markings recognizable by the camera and enable a simplified, unambiguous assignment of the position of the measuring chambers 30 as well as a manual or automated correction of lateral displacements of the measuring chip 1 during the measurements.
  • Figure 8a shows a vertical section through a holder 200 for the above
  • the holder 200 comprises a cuboid plate with reservoirs 203 which can be filled through upper openings 205, preferably similar to commercially available microtiter plates, but also similar chambers in length and width suitable for slide format.
  • the holder 200 preferably also has the standardized height of a microtiter plate. in the
  • the reservoirs 203 are continuous channels, i. they have no bottom but a lower opening 210.
  • the bottom of the reservoirs 203 is first secured by a to the bottom 203 of the plate, for example, with a UV-curing adhesive
  • Measuring chip 1 is formed, wherein the adhesive is cured after an adjustment of the measuring chip 1 by means of UV light.
  • the reservoirs 203 form in this way with the microstructured measuring chips 1, a chamber with a desired
  • Measuring liquid can be filled.
  • the measuring chip 1 is arranged so that its upper side 17 faces the reservoirs 203 with the measuring chamber openings 25 (not shown) so that the measuring chambers 30 can be filled by the reservoirs 203.
  • the optical measurement takes place from the lower side 202 of the holder 200 through the lower, transparent carrier layer 10 of the measuring chips 1.
  • FIG. 8b shows a plan view of the upper side 201 of the holder 200 of FIG. 9.
  • the holder 200 has the length and width of a commercial slide. For example, 16 reservoirs 203 are provided with measuring chips 1 glued underneath.
  • the distance between the centers of the upper openings 205 is 9 mm and the diameter of the upper openings 205 6 mm, wherein the diameter tapers down, so that the lower opening 210 has a diameter of 2 mm.
  • Under the lower opening 210 is a
  • square measuring chip 1 side lengths of 3 x 3 mm glued.
  • FIG. 9 shows a vertical section through a further, preferred embodiment of the holder 200b.
  • the holder 200b like the one shown in FIG. 8a, comprises a parallelepiped plate having reservoirs 203 which can be filled through upper openings 205.
  • the bottom of the reservoirs 203 is formed by a cover glass 215 of about 50-200 ⁇ m thickness.
  • cover glass 215 of about 50-200 ⁇ m thickness.
  • the entire cover glass 215 is then glued under the holder 200b and seals off all the reservoirs 203, the measuring chips 1 being sunk in the reservoirs 203 become.
  • the reservoirs 203 form in this way with the cover glass 215 a chamber which can be filled with a desired measuring liquid.
  • the lower opening 210 is somewhat larger than in the case of the holder 200 shown in FIG. 8 a.
  • the cover glass 215 is translucent, so that the optical measurement can be made from below through the cover glass 215 ,
  • FIG. 10 shows a vertical section through an SOI wafer 300 known from the prior art in a partial view. It is used in the prior art as a starting material or substrate for the production of electronic components and integrated circuits. In the present invention, however, it serves as a starting material or substrate for the production of the microstructured measuring chips 1.
  • known methods for producing electronic components such as photolithography and etching are advantageously used.
  • the known SOI wafer 300 is composed of a sandwich of three interconnected layers: a bottom thick opaque silicon layer 31 1, an upper thin opaque silicon layer 320, and a very thin so-called buried layer 312 disposed therebetween (The English term is "buried layer”), the electrically insulating
  • the upper, thin, opaque silicon layer 320 is first deposited by photolithography and suitable etching techniques such as DRIE (Deep Reactive Ion Etching, Bosch Process) or wet chemical etching
  • Chambers serving recesses 30 introduced.
  • alternating alternating recesses 27 and elevations 28 form in the side walls 26, which produce a substantially corrugated or corrugated surface structure, as a result of the usual alternating etching and passivation steps.
  • Etching employs etchants that dissolve only silicon but no silica. Therefore, the etching advantageously takes place only up to the buried silicon dioxide layer 312, which effectively acts as a "stop layer” and stops the etching process
  • Silicon layer 320 If desired, a metallization of, for example, titanium or gold may now be applied to the top silicon layer.
  • Borosilicate glass mounted on top silicon layer 320 by anodic bonding. Then, the lower silicon layer 31 1 is removed by etching, as shown in FIG. Also in this process step, the etching is advantageously carried out only up to the buried silicon dioxide layer 312, which can bring the etching process to a standstill.
  • FIG. 14 shows that the SOI wafer 300 processed in this way is subsequently turned over and is in an "upside down" position, whereby the carrier layer 10 becomes the lowermost layer and the upper silicon layer 320 of the SOI wafer 300 becomes the later main layer 20 of the measuring chips 1.
  • the originally buried layer 312 of the SOI wafer 300 is the uppermost layer and forms the later covering layer 12 of the measuring chips 1.
  • the buried layer 312 forming the covering layer 12 of the measuring chip 1 is photolithographically and with suitable etching methods partially structured or completely removed, so that the apertures 14 acting as apertures are formed, which are preferably arranged centrally above the measuring chambers 30. This is illustrated in FIGURE 15, which corresponds to FIGURE 4.
  • the buried Layer 312 may also be completely removed, thereby producing an embodiment of measuring chip 1, as shown in FIG.

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Abstract

Die Erfindung betrifft einen mikrostrukturierten Messchip (1) zur optischen Messung von Eigenschaften künstlicher oder biologischer Membranen (40) mit einer unteren, lichtdurchlässigen Trägerschicht (10) und mindestens einer darauf angeordneten lichtundurchlässigen Hauptschicht (20), welche als Messkammern ausgebildete Vertiefungen (30) mit einer oberen Öffnung (25) und einer oder mehrerer innerer Seitenwände (26) aufweist. Um Messchip (1) so zu verbessern, dass biologische Systeme mit höherer Messgenauigkeit und höherem Durchsatz gemessen werden können, wird vorgeschlagen, dass die Seitenwand oder die Seitenwände (26) der Messkammern (30) Vertiefungen und/oder Erhebungen (28) aufweisen. Die Erfindung betrifft weiterhin einen Halter (200) für die Messchips (1) sowie ein Verfahren zur Herstellung der Messchips (1) aus einem Silizium-Wafer (300).

Description

Titel: Mikrostrukturierter Messchip zur optischen Messung von Eigenschaften künstlicher oder biologischer Membranen und Verfahren zu dessen Herstellung
Die Erfindung betrifft einen mikrostrukturierten Messchip zur optischen Messung von Eigenschaften künstlicher oder biologischer Membranen mit einer unteren, lichtdurchlässigen Trägerschicht und mindestens einer darauf angeordneten lichtundurchlässigen Hauptschicht, welche als Messkammern ausgebildete
Vertiefungen mit einer oberen Öffnung und einer inneren Seitenwand oder mehreren inneren Seitenwänden aufweist. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung des Messchips und einen Halter für diese Messchips.
Biologische Membranen separieren sowohl Zellen von einem äußeren Medium als auch einzelne Zellkonnpartinnente innerhalb der Zellen. Membrantransportsysteme, wie z.B. Transportproteine, Kanalproteine, sekretorische Systeme und
Membranporen ermöglichen und steuern durch Veränderung der
Membranpermeabilität selektiv den Stoffdurchlass durch diese Membranen.
Rezeptoren dagegen vermitteln Signale, wie z.B. eine extrazelluläre
Ligandenbindung, die intrazellulär zu sekundären Prozessen führt.
Funktionsstörungen der Transporter und Kanäle sind für zahlreiche, verbreitete Krankheiten verantwortlich. Unter den 100 am meisten verkauften Arzneimitteln in den USA im Jahre 2004 waren am häufigsten die, deren pharmakologischer Wirkungsmechanismus auf Membrantransportsystemen beruht. Es sind
mindestens 1 .302 derartige Arzneimittel in den Portfolios von 326 Firmen weltweit vorhanden, und zwar sowohl eingeführte als auch noch in der Entwicklung sich befindende. Insgesamt werden zurzeit mehr als 100 Membrantransportsysteme bei den Pharmafirmen erforscht, was zeigt, welche große wirtschaftliche
Bedeutung diese haben.
Für die Entwicklung neuer Wirkstoffe werden Verfahren und Vorrichtungen benötigt, mit denen Eigenschaften wie die Transportraten von spezifischen
Substratmolekülen durch Membrantransportsysteme und der Einfluss von
Wirkstoffkandidaten evaluiert werden können. Hierbei müssen Membrantransportsystenne automatisiert im Hochdurchsatz charakterisiert werden, um so das Auffinden eines Wirkstoffkandidaten durch statistisch signifikanten Nachweis einer Änderung der Transportrate eines vorgegebenen
Transportsubstrates durch das Target-Protein zu ermöglichen. Die Membranpermeabilität ist beispielsweise entscheidend für die Verfügbarkeit von Wirkstoffen in Zellen, aber auch im Gehirn, da hierfür die Blut-Hirn-Schranke durchdrungen werden muss. In der Wirkstoffentwicklung ist die Verfügbarkeit am Zielort somit eine entscheidende Eigenschaft potentieller Wirkstoffe.
Eine effektive zelluläre Sekretion ist dagegen entscheidend für die Produktion von biopharmazeutischen Produkten wie Antikörpern, Proteinen und dergleichen mittels Kulturen von produzierenden eukaryotischen und prokaryotischen Zellen, wie z.B. Säugerzellen, Ciliaten, Hefen und Bakterien. Da in solchen Kulturen trotz angestrebter Monoklonalität eine Divergenz der Produktionsraten der einzelnen Zellen auftritt, sind das Auffinden und die Selektion von hochproduzierenden Zellen entscheidend für die Produktionsrate der Kultur. Der globale Markt für biopharmazeutische Produkte wird für 2010 auf 70 Milliarden Dollar geschätzt.
Membranrezeptoren spielen eine zentrale Rolle bei der Entstehung vieler volkswirtschaftlich bedeutender Krankheiten wie z.B. Allergien, neurologischen Erkrankungen, Depressionen, Schmerzen, Entzündungen, Diabetes, Epilepsie, Bluthochdruck oder Asthma. Unter den Membranrezeptoren ergab sich in 2002 alleine schon für die Untergruppe der Proteinkinasen ein Marktanteil von 12,7 Mrd. $ und einem prognostizierten Anstieg auf 58,6 Mrd. $ im Jahr 2010 (Biophoenix Consulting).
Rezeptorproteine wie G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (abgekürzt GPCR) besitzen extrazelluläre Bereiche für die Ligandenbindung, transmembrane
Bereiche und intrazelluläre Domänen, die der Weitervermittlung des Signals an zelluläre Signalkaskaden dienen. Für die Charakterisierung der
Rezeptoraktivierung wird eine Detektion des Signals, also der
Konformationsänderung der intrazellulären Domäne oder die Bildung der darauf folgenden Komponenten der Signalkaskade benötigt. Für die Analyse von Transportraten von Ionen und geladenen Teilchen wiederum können elektrische Messungen eingesetzt werden. Dieses Verfahren findet bereits eine Anwendung im höheren Durchsatz in der biotechnologischen und
pharmazeutischen Forschung. Es ist jedoch auf Ionen beschränkt und wird daher nur für die Gruppe der lonenkanäle eingesetzt. Der Transport von Molekülen wie Aminosäuren, Peptiden, Zuckerverbindungen und Fettsäuren, aber auch biologischen Makromolekülen wie RNA, DNA und Proteinen kann nicht oder nur indirekt mit elektrischen Verfahren gemessen werden.
Für die Messung des Transports dieser Moleküle ist dagegen die
Fluoreszenzanalyse sehr gut geeignet. Erste Vorarbeiten dazu wurden von einer akademischen Gruppe für den Transport von Biomolekülen durch den
Kernporenkomplex in Kernhüllen aus Xenopus Laevis durchgeführt. Es wurde auch für die Messung des Transports von Calcium-Ionen durch die a-Hämolysin- Pore angewendet, welche direkt in vorgefertigte, künstliche Lipidmembranen insertiert wurde und sich dabei aus einer denaturierten Struktur in eine funktionale Form rückfaltet. In den Veröffentlichungen wurden dazu lichtdurchlässige
Polycarbonatfilter oder Polycarbonatstrukturen eingesetzt, deren Vertiefungen für die Fluoreszenzmessung von Transportraten mittels konfokaler Laser-Scanning- Mikroskopie genutzt wurden. Dies bedingt schlechte optische Eigenschaften, u.a. auf Grund von Divergenzen in den Brechungsindices von Polycarbonat und Messpuffer.
Es sind weitere Messchips mit Messkammern in lichtdurchlässigem Material bekannt, deren Vertiefungen durch eine obere Membran oder Zellen oder Gewebe abdeckbar sind und so geschlossene Messkammern gebildet werden und der Transport von Substratmolekülen über die Membran oder die Sekretion aus Zellen in die Messkammern gemessen werden kann. Dazu werden die Membran oder die Zellen über die Messkammern im Messchip aufgespannt, so dass diese
verschlossen und abgedichtet werden. Der Messchip ist für die Analyse der Permeabilität durch künstliche oder biologische Membranen oder Zellen geeignet. Durch optische Messungen wie Fluoreszenzmessungen können Substratmoleküle in den Messkammern nachgewiesen und quantifiziert werden. Dabei sollten möglichst wenige Substratmoleküle außerhalb der Messkammern zur Fluoreszenz angeregt werden, um das Messergebnis nicht zu verfälschen.
Aus der Patentanmeldung US 2003/0174992 A1 ist ein nanostrukturierter
Messchip für die Fluoreszenzanalyse biochemischer Vorgänge mit einem lichtdurchlässigen Träger und einer darüber liegenden lichtundurchlässigen Metallschicht bekannt. Die Metallschicht enthält eine Messkammer mit viel geringerem Durchmesser als die Wellenlänge des von unten eingestrahlten Anregungslichts und wirkt dadurch als sogenannter Zero-Mode Waveguide. Das Anregungslicht dringt also nicht in die Vertiefungen ein, wobei aber ein Teil der Lichtenergie in die Messkammern gelangt. Oberhalb der Messkammern werden keine Substratmoleküle angeregt. Ein derartiger Messchip hat jedoch zahlreiche Nachteile. So ist das Volumen der Messkammer mit wenigen Zeptolitern aufgrund ihrer geringen Dimensionen sehr klein, so dass diese nicht für Transportvorgänge genutzt werden können. Zudem kann nur der untere Bereich der Messkammer genutzt werden, da nur dort eine Anregung erfolgt. Dadurch ist das Signal- Rauschverhältnis der Messungen sehr schlecht und es wird eine aufwändige Messvorrichtung benötigt.
Aufgabe der Erfindung ist es, den einen Messchip bereitzustellen, mit dem die Eigenschaften von Membranen oder Transportsystemen mitteis kommerziell erhältlichen, üblichen essvorrichtungen mit höherer Messgenauigkeit und höherem Durchsatz gemessen werden können.
Diese Aufgabe wird durch einen mikrostrukturierten Messchip mit einer unteren, lichtdurchlässigen Trägerschicht und mindestens einer darauf angeordneten, im Wesentlichen lichtundurchlässigen Hauptschicht, welche als Messkammern ausgebildete Vertiefungen mit einer oberen Öffnung und einer inneren Seitenwand oder mehreren inneren Seitenwänden aufweist, dadurch gelöst, dass die
Seitenwand oder die Seitenwände der Messkammern Vertiefungen und/oder Erhebungen aufweisen. Hierdurch kann das Anregungslicht von unten in die Messkammern mit Dimensionen über der Lichtwellenlänge zwar eindringen und ein hohes Fluoreszenzsignal erzeugen, aber es gelangt nur stark abgeschwächt bis zur oberen Öffnung. Unter einer im Wesentlichen lichtdurchlässigen Schicht ist im Sinne der Erfindung zu verstehen, dass die Schicht für Licht überwiegend durchlässig ist. Unter einer lichtundurchlässigen Schicht ist zu verstehen, dass diese für Licht durch Absorption oder Reflektion überwiegend oder vollständig undurchlässig ist. Unter Licht wird vorwiegend der sichtbare Bereich der elektromagnetischen Strahlung von etwa 400 bis 700 nm verstanden; der Begriff ist hierauf aber nicht beschränkt, sondern kann auch die angrenzenden Bereiche der ultravioletten oder infraroten Strahlung umfassen. Für die optischen
Messungen können übliche Fluoreszenzmikroskope mit dem nicht-kohärentem Licht einer Fluoreszenzlampe, aber auch Laser-Scanning-Mikroskope verwendet werden. Die Messung erfolgt von unten durch die lichtdurchlässige Trägerschicht des Messchips. Deshalb ist diese für das Anregungslicht einer Fluoreszenzlampe durchlässig. Durch das Anregungslicht werden beispielsweise geeignete
Substratmoleküle zur Fluoreszenz in der Messkammer bzw. den Messkammern angeregt. Diese Fluoreszenz wird dann mittels einer geeigneten Kamera, die in die Optik des Fluoreszenzmikroskops eingekoppelt ist, gemessen und
anschließend ausgewertet. Die mit dem Messchip erreichbare Messgenauigkeit hängt nun in erheblichem Maße davon ab, inwieweit Emissionslicht gemessen wird, das ausschließlich durch Fluoreszenzanregung innerhalb der Messkammer erzeugt wird. Werden nämlich zusätzlich Emissionen gemessen, die außerhalb der Messkammer erzeugt werden, so sind dies Störemissionen, die das
Messergebnis verschlechtern oder verfälschen. Beispielsweise können
Substratmoleküle in der Membran oder der Messflüssigkeit oberhalb der
Messkammern angeregt werden. Um diese Störemissionen zu vermindern, sind die Seitenwand oder die Seitenwände der Messkammern nicht glatt, sondern weisen erfindungsgemäß Vertiefungen und/oder Erhebungen auf. Glatte spiegelnde Seitenflächen würden die Störemissionen von oberhalb der
Messkammern weiter bis zur Kamera reflektieren, während die Vertiefungen und Erhebungen die Störemissionen streuen und somit eine Ausbreitung innerhalb der Messkammern minimieren. Außerdem wird eine Ausbreitung des
Anregungslichtes aus den Messkammern heraus in die darüber liegende
Membran oder Messflüssigkeit vermindert. Insgesamt wird eine unerwünschte optische Detektion der Emissionen von Substratmolekülen innerhalb und oberhalb der Membran minimiert und eine überwiegende Detektion der Emissionen von Substratmolekülen innerhalb der Messkammern erzielt. Dies ist auch mit herkömmlicher Fluoreszenzmikroskopie möglich.
Vorteilhafte Ausgestaltungen sind in den Unteransprüchen angegeben und werden nachfolgend erläutert.
Eine weitere Verbesserung der Messgenauigkeit ist erreichbar, wenn die
Vertiefungen und Erhebungen alternieren, also rinnenartig ausgebildet sind und die Rinnen in Richtung der Längsachse der Messkammern eine gewellte
Oberflächenstruktur der Seitenwand oder der Seitenwände bilden. In einer bevorzugten Ausführungsform weisen die alternierenden Vertiefungen bzw. Erhebungen bzw. Rinnen zueinander jeweils einen periodischen Abstand von 0,1 bis 0,6 μιτι auf. Der Abstand kann aber auch einige Nanometer bis mehrere Mikrometer betragen. Die Tiefe der Rinnen, d.h. der Abstand zwischen dem höchsten Punkt der Erhebungen und dem niedrigsten Punkt der Vertiefungen beträgt 20 bis 1 10 nm, kann aber auch bis zu einigen Mikrometern betragen.
In einer bevorzugten Ausführungsform weisen die Messkammern jeweils die Grundform eines Kreiszylinders oder eines Kegelstumpfes auf. Da die
Messkammern durch Vertiefungen in der Hauptschicht gebildet werden, weisen sie selbst keine äußere Form auf. Im Sinne der Erfindung ist unter der Grundform der Messkammern deshalb deren Hohlvolumen zu verstehen, dass durch die Hauptschicht umgrenzt wird. In diesem Sinne wird die Seitenwand einer
Messkammer durch die Mantelfläche eines Kreiszylinders oder eines
Kegelstumpfes gebildet. Bei beiden Ausführungsformen umlaufen die die Rinnen bildenden Vertiefungen und Erhebungen die Seitenwand, d.h. sowohl die
Messkammern als auch die Rinnen sind im Schnitt senkrecht zur Längsachse der Messkammern annähernd kreisförmig. Eine solche gewellte Oberflächenstruktur kann durch das reaktive Silizium-Ionen-Tiefenätzen (DRIE, Bosch-Prozess) zur Tiefenätzung von Silizium erreicht werden. Dieses beinhaltet eine alternierende Folge von Ätzprozess und Passivierungsschritt und erzeugt dabei eine solche Wellen- bzw. Kammstruktur der Seitenwände senkrecht zur Ätzrichtung. Form und Abstände der Rinnen variiert je nach Prozesseinstellungen und Ätztiefe. Die Rinnen in den Seitenwänden aus undurchsichtigem, eher spiegelndem Material erzeugen eine Streuung sowohl des eingestrahlten Anregungslichtes als auch des Emissionslichtes in den Messkammern, während glatte Seitenwände eher eine Spiegelung von Licht längs durch die Messkammern und somit eine Weiterleitung wie in einem Lichtleiter ermöglichen würden. Hierdurch wird von der Unterseite des Messchips eingestrahltes Anregungslicht von einem Austritt aus der oberen Öffnung der Messkammer besser abgeschirmt. Ebenso werden Störemissionen oberhalb der Messkammern besser von einem Durchtritt aus dem Boden der Messkammern bis zur Kamera abgeschirmt und die Messgenauigkeit insgesamt weiter verbessert.
Die untere, lichtdurchlässige Trägerschicht besteht z.B. aus Kunststoff oder aus Glas. Es hat sich gezeigt, dass insbesondere Borosilikatglas geeignet ist, welches nach dem Floatverfahren oder als polierter Wafer hergestellt ist. Die lichtundurchlässige, mikrostrukturierte Hauptschicht mit den als Messkammern dienenden Vertiefungen weist Metall, Kunststoff oder Silizium auf. Der Begriff Silizium umfasst auch Siliziumverbindungen. Silizium hat den Vorteil, dass bei der Verarbeitung, also der Herstellung der Vertiefungen, zum Teil bekannte Verfahren aus dem Bereich elektronischer Mikrochips verwendet werden können. Auf der Hauptschicht kann eine Deckschicht, vorzugsweise aus Siliziumdioxid und/oder Metall, angeordnet sein. Die Deckschicht weist dann Öffnungen auf, die über den Öffnungen der Messkammern angeordnet sind. Vorzugsweise ist jeweils eine Öffnung in der Deckschicht über der Öffnung einer Messkammer angeordnet. Die Apertur der Öffnungen der Deckschicht ist dabei kleiner als die Apertur der Öffnungen der Messkammern. Hierdurch werden durch die Deckschicht Blenden gebildet, die von der Unterseite des Messchips eingestrahltes Anregungslicht beim Austritt aus der oberen Öffnung der Messkammer zum Teil abschirmen können. Ebenso werden Störemissionen oberhalb der Deckschicht abgeschirmt. Hierdurch wird die Messgenauigkeit weiter verbessert. Ein weiterer Vorteil liegt darin, dass die Ausführungsform des Messchips für biologische Membranen mit einer biologisch vorgegebenen Transporterdichte geeignet ist. Da sich die Zahl der Transport-Proteine pro Fläche bei biologischen Membranen nicht ohne Weiteres verändern lässt, kann bei unverändertem Messkammervolumen die Apertur der Deckschichtöffnung so gewählt und optimiert werden, dass vorzugsweise nur ein oder nur wenige Transport-Proteine über der Deckschichtöffnung liegen. Dieses ermöglicht genauere Messungen mit einer verlängerten Messdauer.
Die Oberfläche des Messchips kann eine oder mehrere chemisch reaktive und/oder polare Beschichtungen insbesondere Poly-L-Lysin und/oder
Propionsäure und/oder Carboxylgruppen und/oder Lipidderivate und/oder aminoreaktive Linkermoleküle aufweisen, um künstliche oder natürliche
Membranendirekt oder indirekt, kovalent oder nichtkovalent an den Messchip zu binden.
Die Seitenwand oder die Seitenwände der Messkammern und/oder die der Trägerschicht aufliegende Unterseite der Hauptschicht und/oder die den
Messkammern zugewandte Unterseite der Deckschicht und/oder die Oberseite der Hauptschicht können zusätzlich jeweils eine lichtundurchlässige Beschichtung aufweisen, vorzugsweise aus Metall, insbesondere aus Gold oder Titan. Dies erfolgt vorzugsweise mittels bekannter PVD-Verfahren (Abkürzung für„physical vapour deposition"). Die Beschichtung hat mehrere Vorteile. Sofern eine
Restlichtdurchlässigkeit der Hauptschicht besteht, wird diese durch die
Beschichtung vermieden. So ist Silizium für Wellenlängen des sichtbaren Lichts bis 600 nm im Wesentlichen undurchsichtig. Für tiefrotes und infrarotes Licht wird Silizium zunehmend durchlässiger. Dieses wäre dann störend, wenn das
Anregungslicht oder Störemissionen in diesem Wellenlängenbereich liegen. Die zusätzliche lichtundurchlässige Beschichtung verbessert in diesen Fällen die Messgenauigkeit. Ein weiterer Vorteil ist, dass bei einer Beschichtung aus Gold diese kontaktiert und für elektrische Messungen oder Anregungen als Elektrode genutzt werden kann. Noch ein weiterer Vorteil ergibt sich in Kombination mit der oben genannten chemisch reaktiven oder polaren Beschichtung. An eine
Beschichtung aus Gold an der Seitenwand der Messkammern können
standardisiert Thiolverbindungen wie ß-Mercaptoethanol oder
Mercaptopropionsäure, aber auch Komponenten eines Detektionssystems der Rezeptoraktivierung koppeln. Die Schicht aus Silizium oder Siliziumoxid bindet diese nicht und kann dadurch selektiv durch eine Silanisierung modifiziert werden. Dadurch wird eine unterschiedliche Modifikation der Messkammern und der Oberseite des Messchips ermöglicht, was für bestimmte Messaufgaben vorteilhaft ist.
Dadurch dass das Verhältnis von Tiefe zu Durchmesser der Messkammern größer als eins, vorzugsweise größer als fünf und besonders bevorzugt zehn bis fünfzig ist, kann sich nur im Wesentlichen der geringe Anteil des parallel zur Seitenwand der Messkammer eingestrahlten Anregungslichtes durch die obere Öffnung der Messkammer ausbreiten. Der Anteil des nicht parallel zur Seitenwand
eingestrahlten Anregungslichts wird dagegen auf dem Weg durch die
Messkammer an der Seitenwand gestreut oder absorbiert, regt aber im unteren Bereich der Messkammern die Fluoreszenz an. Dieser Effekt wird durch einen nach oben hin verkleinerten Durchmesser der Messkammer verstärkt. Dadurch wird die Messgenauigkeit zusätzlich verbessert.
Die Erfindung umfasst weiterhin einen Halter für den oben beschriebenen mikrostrukturierten Messchip. Der Halter umfasst eine Platte mit einer Oberseite, einer Unterseite und einem oder mehreren von der Oberseite mit Flüssigkeit befüllbaren Reservoir. Der Halter hat eine beispielsweise ähnliche quaderförmige Form wie handelsübliche Mikrotiterplatten und kann auch in ähnlicher Weise verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform hat er hinsichtlich Breite, Länge und/oder Höhe genormte Maße, die die ANSI Standards für
Mikrotiterplatten oder Deckgläser erfüllen. Im Unterschied zu handelsüblichen Mikrotiterplatten sind die Reservoirs jedoch durchgehende Kanäle, d.h. sie weisen zunächst keinen Boden sondern eine untere Öffnung auf. Der Boden eines
Reservoirs wird vielmehr erst durch einen an der Unterseite der Platte befestigten Messchip gebildet. Alle Messchips des Halters können auch erst auf einen dünnen Glasträger in Haltergröße geklebt werden und dann von unten in den Reservoirs versenkt werden, so dass der Glasträger unter den Halter geklebt wird. Die Befestigung kann durch einen wasserfesten und -dichten Klebstoff erfolgen und zwar derart, dass die Messkammern in Richtung der Reservoir weisen. Beim Befüllen der Reservoir mit Messflüssigkeit werden also auch die Messkammern des Messchips befüllt. Vorzugsweise wird der Chip mit einem UV-härtenden Kleber oder einem Klebefilm unter die untere Öffnung eines Reservoirs geklebt, wobei der Kleber nach einer Justierung durch Bestrahlung mit UV-Licht
ausgehärtet wird. Alternativ hat sich bei Verwendung eines zusätzlichen
Glasträgers ein Silikonkleber, vorzugsweise Sylguard 184, zum Aufkleben der Messchips auf den Glasträger als geeignet erwiesen. Die Reservoirs bilden auf diese Weise für die mikrostrukturierten Messchips ein Behältnis für eine geeignete Messflüssigkeit. Die optische Messung erfolgt von der Unterseite des Halters durch die lichtdurchlässige Trägerschicht der Messchips bzw. zusätzlich durch Glasträger und Kleber wie oben beschrieben.
Die Erfindung umfasst außerdem ein Verfahren zur Herstellung mikrostrukturierter Messchips, insbesondere mit den oben beschriebenen Merkmalen. Hierbei wird als Ausgangsmaterial bzw. als Substrat ein Silizium-Wafer verwendet, wie er in der Mikroelektronik zur Produktion integrierter Schaltkreise benutzt wird. Der Vorteil ist, dass bekannte Verfahren zur Mikrostrukturierung wie etwa
Photolithographie und Ätzen angewandt werden können.
Besonders geeignet ist ein„Silicon on Insulator-Wafer" oder abgekürzt„SOI- Wafer". Diese SOI-Wafer sind nach dem Stand der Technik bekannt und bestehen aus drei Schichten: Eine untere Siliziumschicht, eine obere Siliziumschicht und eine dazwischen angeordnete, sogenannte begrabene Schicht (der englische Fachbegriff ist„buried layer"), die elektrisch isolierende Eigenschaften hat. Diese besteht beispielsweise aus Siliziumdioxid oder Siliziumnitrid. Elektrische Bauteile, die aus einem SOI-Wafer hergestellt sind, beispielsweise integrierte Schaltkreise, haben kürzere Schaltzeiten und geringere Leistungsaufnahmen, weil durch die begrabene Schicht Leckströme vermindert werden.
Es hat sich überraschenderweise gezeigt, dass die Verwendung eines SOI- Wafers, insbesondere mit einer begrabenen Schicht aus Siliziumdioxid, Vorteile bei der Herstellung mikrostrukturierter Messchips hat. Das Herstellungsverfahren umfasst im Einzelnen folgende Schritte: Die Messkammern werden in die obere Siliziunnschicht bis zur begrabenen
Schicht des Siliziunn-Wafers geätzt. Mit Vorteil stoppt die begrabene Schicht dabei den Ätzprozess, wenn ein Ätzmittel verwendet wird, dass selektiv nur Silizium angreift und auflöst. Als Ätzmittel kann eine Säure oder ein Gas, vorzugsweise im DRIE-Verfahren (Deep Reactive Ion Etching), verwendet werden.
Wenn es gewünscht wird, wird danach eine zusätzliche lichtundurchlässige
Beschichtung, wie etwa Titan und/oder Gold, auf die obere Silizium-Schicht aufgebracht.
Die obere Siliziumschicht des Silizium-Wafers mit den eingeätzten Messkammern wird dann mit der Trägerschicht, vorzugsweise durch anodisches Bonden, verbunden, wobei die vorherige Öffnung der Messkammer mit der Trägerschicht als Boden zu ihrer Unterseite wird.
Danach wird die untere Siliziumschicht des Silizium-Wafers entfernt, vorzugsweise durch Ätzen. Mit Vorteil stoppt auch bei diesem Verfahrensschritt die begrabene Schicht den Ätzprozess, wenn ein Ätzmittel verwendet wird, dass selektiv nur Silizium angreift und auflöst.
Dann wird die begrabene Schicht vollständig oder teilweise entfernt, vorzugsweise durch Ätzen, wobei ein spezielles Ätzmittel verwendet wird, dass die begrabene Schicht angreift und auflöst, beispielsweise Flusssäure. Bei einer teilweisen Entfernung wird die begrabene Schicht selektiv an den Stellen, an denen sie die Messkammeröffnungen bedeckt, photolithographisch strukturiert. Die begrabene Schicht bildet dann die Deckschicht mit den Deckschichtöffnungen des Messchips.
Zum Schluss werden die einzelnen, mikrostrukturierten Messchips aus dem
Silizium-Wafer gesägt, insbesondere in Größen von 2 mal 2 mm bis 10 mal 10 mm. Eine besonders bevorzugte Größe ist 2,5 mal 2,5 mm. Die Messchips können einzeln verwendet oder insbesondere an den oben beschrieben Halter geklebt werden. Die Erfindung wird unter Bezugnahme auf eine Zeichnung beispielhaft
beschrieben, wobei weitere vorteilhafte Einzelheiten den Figuren der Zeichnung zu entnehmen sind.
Funktionsmäßig gleiche Teile sind dabei mit denselben Bezugszeichen versehen. Die Figuren der Zeichnung zeigen im Einzelnen:
Figur 1 einen Vertikalschnitt durch den Messchip in einer Teilansicht;
Figur 2 eine Detailansicht einer Messkammer einer anderen
Ausführungsform des Messchips im Vertikalschnitt;
Figur 3 den Messchip aus Figur 1 mit einer Lipidmembran; Figur 4 einen Vertikalschnitt durch eine andere Ausführungsform des
Messchips mit einer Deckschicht in einer Teilansicht;
Figur 5 eine Detailansicht einer Messkammer mit Deckschicht und einer
Beschichtung;
Figur 6 einen Vertikalschnitt durch eine weitere Ausführungsform des
Messchips mit kegelstumpfförmigen Messkammern in einer
Teilansicht;
Figur 7 eine Draufsicht des Messchips in einer Teilansicht;
Figur 8a einen Vertikalschnitt durch einen Halter;
Figur 8b eine Draufsicht des Halters aus Figur 8a; Figur 9 einen Vertikalschnitt durch eine andere Ausführungsform des
Halters;
Figur 10 einen Vertikalschnitt durch einen bekannten SOI-Wafer in einer
Teilansicht; einen Vertikalschnitt durch einen SOI-Wafer wie in Figur 10 mit eingeätzten Messkammern; einen Vertikalschnitt durch einen SOI-Wafer wie in Figur 1 1 mit einer oberen, verbundenen Trägerschicht; einen Vertikalschnitt durch einen SOI-Wafer wie in Figur 12 nach Entfernung der unteren Siliziumschicht; einen Vertikalschnitt durch einen SOI-Wafer wie in Figur 13 nach dem Umdrehen; und einen Vertikalschnitt durch einen SOI-Wafer wie in Figur 14 nach der teilweisen Entfernung der verborgenen Schicht.
Figur 1 zeigt eine Teilansicht eines erfindungsgemäßen Messchips 1 im
Vertikalschnitt. In einer (nicht gezeigten) Draufsicht ist er quadratisch und weist eine Gesamtfläche von 2,5 mal 2,5 Millimetern, also 6,25 Quadratmillimetern auf. Der Messchip 1 besteht aus miteinander verbundenen Schichten bzw. Materialien. Als Basis weist er eine untere, lichtdurchlässige Trägerschicht 10 aus gefloatetem oder poliertem Borosilicatglas auf. Bewährt haben sich„Borofloat 30" oder„Pyrex". Die Dicke der Trägerschicht 10 liegt bei etwa 140-200 μιτι, obwohl sie auch dicker oder dünner sein kann. Die Trägerschicht 10 ist für Anregungslicht 80 oder emittiertes Fluoreszenzlicht 81 durchlässig. Auf der Trägerschicht 10 ist eine im Wesentlichen lichtundurchlässige Hauptschicht 20 aus Silizium angeordnet, die die Oberseite 17 des Messchips 1 bildet. Es sei der Vollständigkeit halber angemerkt, dass die Hauptschicht 20 aus Silizium äußerlich an der Luft oxidiert und sich so eine oberflächliche, allerdings nur nanometerdicke
Siliziumdioxidschicht ausbildet.
Die Hauptschicht 20 ist durch anodisches Bonden mit der Trägerschicht 10 fest verbunden. Die Hauptschicht 20 weist kreiszylindrische, durchgehende
Vertiefungen auf. Die Vertiefungen bilden also Messkammern 30 mit einem kreiszylindrischen Hohlvolumen. Die eine, innere Seitenwand 26 der Messkannnnern 30 wird also gewissermaßen durch die Mantelfläche des
Kreiszylinders gebildet und die kreisförmige, obere Öffnung 25 durch seine
Deckfläche. Da die Hauptschicht 20 durchgehende Vertiefungen aufweist, wird der Boden 18 jeder Messkammer 30 von der Oberseite bzw. Oberfläche der lichtdurchlässigen Trägerschicht 10 gebildet. Die Messkammern 30 haben eine Tiefe 33 von 10 bis 30 μιτη, es sind aber auch Tiefen von einigen Nanometern bis Millimetern möglich. Der Durchmesser 31 der Messkammern 30 beträgt etwa 1 μιτη, es sind aber auch Durchmesser 31 von einigen Nanometern bis zu einem Millimeter möglich. Der Abstand 32 zwischen den Längsachsen der einzelnen Messkammern 30 beträgt 2,5 μιτι bis 4 μιτι; es sind aber auch Abstände 32 von einigen Nanometern bis zu einem Millimeter möglich. Die Seitenwand 26 jeder Messkammer 30 ist nicht glatt, sondern weist alternierende Vertiefungen 27 und Erhebungen 28 auf, die eine gewellte bzw. geriffelte Oberflächenstruktur bilden. Die Periode der Wellen liegt in der Größenordnung von 100 - 600 nm, kann aber auch wenige Nanometer bis einige Mikrometer betragen.
Figur 2 zeigt eine Detailansicht einer Messkammer einer anderen
Ausführungsform des Messchips 1 im Vertikalschnitt. Bei dieser Ausführungsform beträgt das Verhältnis von Tiefe 22 zu Durchmesser 31 der Messkammern 30 etwa 1 zu 10. Hierdurch kann sich nur im Wesentlichen parallel zur
Messkammerseitenwand 26 eingestrahltes Anregungslicht 80 durch die Öffnung der Messkammer ausbreiten. Die Seitenwände 26 der Messkammern 30 weisen teilweise eine gewellte Oberflächenstruktur auf, die durch in Richtung der
Mittelachse der Messkammern 30 sich wiederholende Rinnen 27, 28 gebildet wird. Glatte, spiegelnde Seitenflächen würden in die Messkammern 30 eingestrahltes Licht weiter nach oben reflektieren. Durch die gewellte Oberflächenstruktur wird dagegen eine unerwünschte Ausbreitung von Anregungslicht 80 oder von
Störemissionen 82 (nicht gezeigt, siehe Figur 3) innerhalb der Messkammern 30 oder aus den Messkammern 30 heraus vermindert (dies ist deshalb unerwünscht, weil nur Substratmoleküle 60 innerhalb der Messkammern 30 angeregt und detektiert werden sollen). Verdeutlicht wird dieser Effekt durch das gerade von unten eingestrahlte, nicht kohärente Bündel aus Anregungslicht 80 einer (nicht gezeigten) Fluoreszenzlampe, welches von den Vertiefungen 27 und Erhebungen 28 gestreut bzw. abgelenkt wird. Hierdurch wird eine Ausbreitung von
Anregungslicht 80 durch die Messkammern 30 in eine darüber liegende Membran und Messflüssigkeit (nicht gezeigt, siehe Figur 3)) erheblich vermindert. Figur 3 zeigt einen Ausschnitt eines Messchips wie in Figur 1 . Zusätzlich ist eine Lipidmembran 40 gezeigt, die bei Messungen mit dem Messchip 1 verwendet wird. Die Lipidmembran 40 ist auf die Oberseite 17 des Messchips 1 aufgebracht, so dass zumindest einige der Messkammeröffnungen 25 durch die Lipidmembran abgedeckt und verschlossen werden. Die Membran 40 ist aus künstlichen Proteo- Liposomen hergestellt worden, welche bei Zugabe spontan mit der Chipoberfläche fusionieren und so die Membran 40 ausbilden können. Die Membran 40 enthält für Transporter-Analysen einzelne Transport-Proteine 50, beispielsweise
Kanalproteine. Oberhalb der Membran 40 werden optisch detektierbare
Substratmoleküle 60 zugegeben, die entweder intrinsisch fluoreszieren oder mit einem Fluoreszenzfarbstoff kovalent markiert sind. Der Transport 70 der
Substratmoleküle 60 durch die in die Membran 40 eingebrachten Transport- Proteine 50 in die Messkammern 30 des Messchips 1 ist spezifisch für das
Transport-Protein 50 und kann durch Detektion der Fluoreszenz in den
Messkammern 30 gemessen werden. Dies ermöglicht Rückschlüsse auf spezifische Parameter wie Transportraten und Durchlässigkeit und erlaubt beispielsweise die Evaluation von Wirkstoffkandidaten für Arzneimittel. Die
Messung erfolgt in einem wässrigen Medium, d.h. Messkammern 30, Membranen 40, Proteine 50 und Substratmoleküle 60 sind von einer (nicht gezeigten)
Messflüssigkeit umgeben, beispielsweise einer geeigneten salzhaltigen
Pufferlösung. Wird zur Messung ein Halter 200 (nicht gezeigt, siehe Figur 9) verwendet, wie er in gezeigt ist, dann bildet der Messchip 1 den Boden eines Reservoirs 203, das oberhalb des Messchips 1 mit Messflüssigkeit gefüllt ist.
Die Messung erfolgt beispielsweise durch ein Fluoreszenz-Mikroskop (nicht gezeigt), was sowohl eine Fluoreszenzlampe oder auch einen Laser für das Anregungslicht 80 zur Anregung der Fluoreszenz der Substratmoleküle 60 als auch eine vergrößernde Optik bereitstellt. Dabei wird das Anregungslicht 80 (gestrichelt dargestellt) ungefähr orthogonal von unten durch die lichtdurchlässige Trägerschicht 10 in die Messkammern 30 gestrahlt, um die von der Oberseite des Messchips 1 durch die Membran 40 in die Messkammern 30 transportierten Substratmoleküle 60 zur Fluoreszenz anzuregen. Die von den angeregten
Substratmolekülen 60 abgegebenen Fluoreszenzemissionen 81 (gepunktet dargestellt) strahlen von der Messkammer 30 durch die lichtdurchlässige
Trägerschicht 10 und werden von einer geeigneten Kamera oder einen Detektor (nicht gezeigt) des Fluoreszenz-Mikroskops gemessen.
Wie in Figur 2 dargestellt, wird durch die gewellte Oberflächenstruktur eine unerwünschte Ausbreitung von Anregungslicht 80 aus den Messkammern 30 heraus vermindert. Sollte dennoch ein gewisser Restanteil des Anregungslichts 80 durch die Messkammer 30 und durch die Membran 40 hindurchstrahlen, dann werden unerwünschterweise auch die Substratmoleküle 60 oberhalb des
Messchips 1 , also außerhalb der Messkammern 30, die nicht über die Membran 40 in die Messkammern 30 transportiert wurden, angeregt und geben
Störemissionen 82 ab. Durch die gewellte Oberflächenstruktur 27, 28 wird die Ausbreitung der Störemissionen 82 oberhalb des Messchips 1 durch die
Messkammern 30 hindurch auf eine Kamera minimiert. Hierdurch ergibt sich eine wesentliche Verbesserung der Messgenauigkeit. Figur 4 zeigt einen Vertikalschnitt durch eine andere, bevorzugte Ausführungsform des Messchips 1 , die der in Figur 1 dargestellten im Wesentlichen entspricht, aber eine zusätzliche Deckschicht 12 aufweist. Die Deckschicht 12 ist auf der
Hauptschicht 20 angeordnet. Die Deckschicht weist Öffnungen 14 auf, die über den Öffnungen 25 der Messkammern 30 angeordnet sind. Vorzugsweise ist jeweils eine Öffnung 14 in der Deckschicht 12 mittig über der Öffnung einer
Messkammer 30 angeordnet. Die Apertur der Öffnungen 14 der Deckschicht 12 ist dabei kleiner als die Apertur der Öffnungen 25 der Messkammern 30. Der Vorteil liegt darin, dass die in Figur 4 dargestellte Ausführungsform des Messchips 1 besonders für biologische Membranen mit einer biologisch vorgegebenen
Transporterdichte geeignet ist. Da sich die Zahl der Transport-Proteine 50 pro Fläche nicht wie bei künstlichen Membranen 40 verändern lässt, kann bei unverändertem Volumen der Messkammer 30 die Apertur der Deckschichtöffnung 14 so gewählt und optimiert werden, dass vorzugsweise nur ein oder nur wenige Transport-Proteine 50 über der Deckschichtöffnung 14 liegen. Die
Messgenauigkeit lässt sich durch die Deckschicht 12 erhöhen, weil weniger Substratmoleküle pro Zeiteinheit in die Messkammer 30 transportiert werden und es lassen sich zeitaufgelöste Messungen durchführen, die wegen hohen
Transportgeschwindigkeiten ohne Deckschichtöffnungen 14 nicht möglich wären.
Figur 5 zeigt im Vertikalschnitt eine Detailansicht einer weiteren Ausführungsform des Messchips 1 mit einer Messkammer 30 mit Deckschicht 12 aus Siliziumdioxid und einer zusätzlichen lichtundurchlässigen Beschichtung 21 aus Titan und/oder Gold. Sofern Gold verwendet wird, dient Titan als Haftvermittler. Die Bestandteile des Messchips 1 mit Metallbeschichtung 21 sind in der Figur 6 durch fettere Linienstärken dargestellt. Dies sind die Seitenwände 26 der Messkammern 30, die der Messkammer 30 zugewandte Unterseite 16 der Deckschicht 12 und die der Trägerschicht 10 aufliegende Unterseite 24 der Hauptschicht 20.
Die Metallbeschichtung 21 hat mehrere Vorteile. Zum einen kann als Deckschicht 12 lichtdurchlässiges Siliziumdioxid verwendet werden. Dies hat Vorteile bei der Herstellung des Messchips 1 (siehe unten). Die Hauptschicht 20 aus Silizium ist zwar für Wellenlängen des sichtbaren Lichts bis 600 nm im Wesentlichen undurchsichtig. Für tiefrotes und infrarotes Licht wird Silizium jedoch zunehmend durchlässiger. Dieses wäre dann störend, wenn das Anregungslicht 80 oder Störemissionen 82 (nicht gezeigt) in diesem Wellenlängenbereich liegen. Titan und Gold sind jedoch weit bis in den infraroten Wellenlängenbereich
lichtundurchlässig. Dadurch werden durch die beschichtete Deckschicht 12 Blenden gebildet, die von der Unterseite des Messchips 1 eingestrahltes
Anregungslicht 80 (nicht gezeigt, siehe Figur 2) beim Austritt aus der
Messkammer 30 zum Teil abschirmen. Ebenso werden Störemissionen oberhalb der Deckschicht 12 abgeschirmt. Die zusätzliche, lichtundurchlässige
Metallbeschichtung 21 verbessert deshalb die Messgenauigkeit. Alternativ kann der gleiche Effekt durch eine Metallbeschichtung oberhalb der Deckschicht 12 erreicht werden. Ein weiterer Vorteil ist, dass die Metallbeschichtung 21 kontaktiert und für elektrische Messungen oder Anregungen als Elektrode genutzt werden kann (nicht dargestellt). Die Metallbeschichtung 21 kann auf diese Weise zur
Charakterisierung der elektrischen Eigenschaften von Membranen 40,
Zellschichten oder von in der Membran befindlichen Transport-Systemen (nicht gezeigt) verwendet werden. Der Messchip 1 kann dabei so eingesetzt werden, dass die Impedanz einer über ihn gespannten Membran 40 oder Zellen (nicht gezeigt) gemessen werden kann. Hierdurch kann die Dichtigkeit von Membranen 40, Zell- oder Gewebeschichten bestimmt werden. Der Messchip 1 kann mittels der Goldbeschichtung 21 zusätzlich aber auch zur Erzeugung eines elektrischen Feldes verwendet werden, insbesondere zur Steuerung von spannungssensitiven Transport-Systemen. Dies sind
beispielsweise spannungsabhängige lonenkanäle, d.h. lonenkanäle, die sich bei einem bestimmten Grenzwert der Membranspannung öffnen oder schließen.
Durch Veränderung des angelegten elektrischen Feldes können so funktionelle Schaltvorgänge ausgelöst werden, die eine Veränderung des Transports 70 von Substratmolekülen 60 über eine Membran 40 zur Folge haben (nicht gezeigt). Die Substratmoleküle 60 können dann in den Messkammern 30 mittels Fluoreszenz detektiert werden. Eine weitere Anwendung des Messchips 1 besteht darin, dass die obere
Deckschicht 12 des Messchips 1 mit einer Lipidmembran bedeckt ist, die
Porenproteine, beispielsweise lonenkanäle enthält. Für eine Messung wird an die als Goldbeschichtung 21 oder eine zusätzliche Metallisierung auf der
Messchipoberseite 17 des Messchips wirkende Elektrode ein elektrisches Feld angelegt. Eine andere Elektrode in der Lösung oberhalb der Membran erzeugt ein Membranpotential. . Die angelegte Spannung führt zur Aktivierung der
lonenkanäle.
Die gezeigte Ausführungsform des Messchips 1 hat damit den Vorteil, dass biologische Transportsysteme elektrisch funktionell geschaltet und gleichzeitig der dadurch erzeugte Transport über die Membranen 40 optisch mittels Fluoreszenz gemessen werden kann. Noch ein weiterer Vorteil ergibt sich in Kombination mit einer (nicht gezeigten) chemisch reaktiven oder polaren Beschichtung. An eine Goldbeschichtung 21 an der Seitenwand 26 der Messkammern 30 können standardisiert
Thiolverbindungen wie ß-Mercaptoethanol oder Mercaptopropionsäure aber auch Komponenten eines Detektionssystems der Rezeptoraktivierung gebunden werden. Die Hauptschicht 20 aus Silizium oder die Deckschicht 12 aus
Siliziumoxid bindet diese nicht und kann deshalb selektiv durch eine Silanisierung modifiziert werden. Dadurch wird eine unterschiedliche Modifikation der
Seitenwände 26 der Messkammern 30 und der Oberseite 17 des Messchips 1 ermöglicht, was für bestimmte Messaufgaben vorteilhaft ist.
Die Figur 5 zeigt außerdem die Wirkung der Deckschicht 12. Über den Öffnungen 25 der Messkammern 30 sind mittig Öffnungen 14 der Deckschicht 14 angeordnet. Wird von unten ein Bündel aus Anregungslicht 80 eingestrahlt, dann wird es von der Deckschicht 12 zum Teil abgeblendet bzw. von der Goldbeschichtung 21 auf der Unterseite 16 der Deckschicht 12 reflektiert und erreicht nur mit verminderter Intensität den Bereich oberhalb des Messchips 1 , was die Messgenauigkeit erhöht. Störemissionen von oberhalb des Messchips 1 durchdringen bei der gezeigten Ausführungsform zwar die lichtdurchlässige Deckschicht 21 aus
Siliziumdioxid, werden aber von der Goldbeschichtung 21 reflektiert. Figur 6 zeigt einen Vertikalschnitt durch eine weitere Ausführungsform des
Messchips 1 mit einer Hauptschicht 20 aus Silizium, welche kegelstumpfförmige Messkammern 30 aufweist. Unter kegelstumpfförmig ist zu verstehen, dass der untere Durchmesser 35 der Messkammern 30 vom Messkammerboden 18 der Trägerschicht 10 bis zur oberen Messkammeröffnung 25 hin abnimmt. Hierbei wird von der Unterseite des Messchips 1 eingestrahltes Anregungslicht 80 gegen einen Austritt aus der oberen Öffnung 25 der Messkammer 30 besser
abgeschirmt. Die Figur 6 zeigt, dass durch die gewellte Oberflächenstruktur der Seitenwände 26 in Verbindung mit der sich nach oben verjüngenden Messkammer 30 von unten eingestrahltes Anregungslicht 80 die Messkammeröffnung 25 zum überwiegenden Teil nicht mehr verlässt. Ebenso werden Störemissionen 82 (nicht gezeigt) oberhalb der der Hauptschicht 20 durch die kleinere obere Öffnung 25 besser abgeschirmt. Durch die synergistische Wirkung beider Merkmale wird die mit dem Messchip 1 erzielbare Messgenauigkeit weiter erheblich erhöht.
Figur 7 zeigt eine Draufsicht auf den Messchip 1 . Die Zeichnung gibt dabei in einer Teilansicht des Messchips 1 die Messkammern 30, 30' wieder, die in Form eines Arrays angeordnet sind. Die gezeigten Messkammern 30 haben einen
Durchmesser 31 von 1 μιτι, möglich sind aber auch Ausführungsformen mit Durchmessern von wenigen Nanometern bis hin zu mehreren hundert
Mikrometern. Der Abstand 32 der Mittelpunkte der Messkammern beträgt 2,5 - 4 μιτι, möglich sind aber auch wenige Nanometer. Die Messkammern 30 haben die Grundform eines Kreiszylinders. Wie die Figur 8 zeigt, weist der Messchip 1 jedoch auch anders geformte, in der gezeigten
Draufsicht und im Querschnitt ovale Messkammern 30' auf. Dabei ist periodisch nach einer gewählten Anzahl, im gezeigten Messchip elf, Messkammern 30 jeweils eine ovale Messkammer 30' vorgesehen, und zwar sowohl in Längs- als auch in Querrichtung des Arrays. Diese Messkammern 30' dienen als durch die Kamera erkennbare, optische Markierungen und ermöglichen eine vereinfachte, eindeutige Zuordnung der Position der Messkammern 30 sowie eine manuelle oder automatisierte Korrektur lateraler Verschiebungen des Messchips 1 während der Messungen. Figur 8a zeigt einen Vertikalschnitt durch einen Halter 200 für den oben
beschriebenen, mikrostrukturierten Messchip 1 . Der Halter 200 umfasst eine quaderförmige Platte mit durch obere Öffnungen 205 befüllbaren Reservoirs 203, vorzugsweise ähnlich handelsüblichen Mikrotiterplatten, aber auch ähnliche Kammern in Länge und Breite passend zum Objektträgerformat. Der Halter 200 hat vorzugsweise auch die standardisierte Höhe einer Mikrotiterplatte. Im
Unterschied zu herkömmlichen Mikrotiterplatten sind die Reservoirs 203 jedoch durchgehende Kanäle, d.h. sie weisen keinen Boden sondern eine untere Öffnung 210 auf. Der Boden der Reservoirs 203 wird erst durch einen an die Unterseite 203 der Platte beispielsweise mit einem UV-härtenden Kleber befestigten
Messchip 1 gebildet, wobei der Kleber nach einer Justage des Messchips 1 mittels UV-Licht ausgehärtet wird. Die Reservoirs 203 bilden auf diese Weise mit den mikrostrukturierten Messchips 1 eine Kammer, die mit einer gewünschten
Messflüssigkeit befüllt werden kann.
Der Messchip 1 ist dabei so angeordnet, dass dessen Oberseite 17 mit den (nicht gezeigten) Messkammeröffnungen 25 zu den Reservoirs 203 weist, damit die Messkammern 30 durch die Reservoirs 203 befüllt werden können. Die optische Messung erfolgt von der Unterseite 202 des Halters 200 durch die untere, lichtdurchlässige Trägerschicht 10 der Messchips 1 .
Wie Fig. 8a außerdem zeigt, wird das Volumen der Reservoirs 203 dadurch erhöht, das sich deren Durchmesser in ihrem unteren Abschnitt nach oben hin vergrößert, d.h. der Durchmesser der oberen Öffnung 205 der Reservoir 203 ist größer als der Durchmesser ihrer unteren Öffnung 210, der etwas kleiner ist als die Fläche der Messchips 1 , damit diese unter die untere Öffnung 210 abdichtend festgeklebt werden können.
Figur 8b zeigt eine Draufsicht auf die Oberseite 201 des Halters 200 aus Figur 9. Der Halter 200 hat die Länge und Breite eines handelsüblichen Objektträgers. Es sind beispielsweise 16 Reservoir 203 mit darunter geklebten Messchips 1 vorgesehen. Der Abstand der Mittelpunkte der oberen Öffnungen 205 beträgt 9 mm und der Durchmesser der oberen Öffnungen 205 6 mm, wobei sich der Durchmesser nach unten hin verjüngt, so dass die untere Öffnung 210 einen Durchmesser von 2 mm aufweist. Unter die untere Öffnung 210 ist ein
quadratischer Messchip 1 Seitenlängen von 3 mal 3 mm geklebt.
Figur 9 zeigt einen Vertikalschnitt durch eine weitere, bevorzugte Ausführungsform des Halters 200b. Der Halter 200b umfasst wie der in Figur 8a gezeigte eine quaderförmige Platte mit durch obere Öffnungen 205 befüllbaren Reservoirs 203. Der Boden der Reservoirs 203 wird jedoch durch ein Deckglas 215 von etwa 50- 200 μιτι Dicke gebildet. Hierzu werden zunächst alle Messchips 1 auf das
Deckglas 215 mit einem nicht fluoreszierenden, transparenten Kleber,
vorzugsweise einem Silikonkleber, besonders Sylguard 184 vollflächig aufgeklebt. Das gesamte Deckglas 215 wird dann unter den Halter 200b geklebt und dichtet alle Reservoirs 203 ab, wobei die Messchips 1 in den Reservoirs 203 versenkt werden. Die Reservoirs 203 bilden auf diese Weise mit dem Deckglas 215 eine Kammer, die mit einer gewünschten Messflüssigkeit befüllt werden kann. Damit die Messchips 1 in den unteren Öffnungen 21 0 Platz finden, ist die untere Öffnung 210 etwas größer als bei dem in Figur 8a gezeigten Halter 200. Das Deckglas 215 ist lichtdurchlässig, so dass die optische Messung von unten durch das Deckglas 215 hindurch erfolgen kann.
Figur 10 zeigt einen Vertikalschnitt durch einen nach dem Stand der Technik bekannten SOI-Wafer 300 in einer Teilansicht. Er wird nach dem Stand der Technik als Ausgangsmaterial bzw. Substrat zur Produktion elektronischer Bauteile und integrierter Schaltkreise benutzt. Bei der vorliegenden Erfindung dient er jedoch als Ausgangsmaterial bzw. Substrat für die Herstellung der mikrostrukturierten Messchips 1 . Bei der erfindungsgemäßen Herstellung werden vorteilhafterweise bekannte Verfahren zur Herstellung elektronischer Bauteile wie Photolithographie und Ätzen verwendet. Der bekannte SOI-Wafer 300 ist wie ein Sandwich aus drei miteinander fest verbundenen Schichten zusammengesetzt: Eine untere, dicke, lichtundurchlässige Siliziumschicht 31 1 , eine obere, dünne, lichtundurchlässige Siliziumschicht 320 und eine dazwischen angeordnete, sehr dünne, sogenannte„begrabene" Schicht 312 (der englische Fachbegriff ist„buried layer"), die elektrisch isolierende
Eigenschaften hat und aus lichtdurchlässigem Siliziumdioxid besteht.
Das Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen mikrostrukturierten
Messchips 1 aus dem in Figur 10 gezeigten SOI-Wafer 300 umfasst im
Wesentlichen die folgenden Schritte, die nachfolgend anhand der Figuren 1 1 bis 15 erläutert werden. In die obere, dünne, lichtundurchlässige Siliziumschicht 320 werden zuerst mittels Photolithographie und geeigneten Ätzverfahren wie DRIE (Deep Reactive Ion Etching, Bosch Prozess) oder nasschemischem Ätzen die später als
Messkammern dienenden Vertiefungen 30 eingebracht. Bei Verwendung des Bosch-Prozesses bilden sich durch die dabei üblichen abwechselnden Ätz- und Passivierungsschritte alternierenden Vertiefungen 27 und Erhebungen 28 in den Seitenwänden 26 aus, die eine im Wesentlichen gewellte bzw. geriffelte Oberflächenstruktur entstehen lassen. Beim Ätzen werden Ätzmittel verwendet, die nur Silizium aber kein Siliziumdioxid auflösen. Daher erfolgt die Ätzung vorteilhafterweise nur bis zur vergrabenen Siliziumdioxidschicht 312, welche gewissermaßen als„Stoppschicht" wirkt und den Ätzvorgang zum Stillstand kommen lässt. Figur 1 1 zeigt den SOI-Wafer 300 aus Figur 10 mit eingeätzten, geriffelten Messkammern 30 in der oberen
Siliziumschicht 320. Falls gewünscht kann jetzt eine Metallisierung beispielsweise aus Titan oder Gold auf die obere Siliziumschicht aufgebracht werden.
Wie Figur 12 zeigt, wird danach die lichtdurchlässige Trägerschicht 10 aus
Borosilicatglas auf der oberen Siliziumschicht 320 durch anodisches Bonden befestigt. Dann wird die untere Siliziumschicht 31 1 durch Ätzen entfernt, wie Figur 13 zeigt. Auch bei diesem Verfahrenschritt erfolgt die Ätzung vorteilhafterweise nur bis zur vergrabenen Siliziumdioxidschicht 312, welche den Ätzvorgang zum Stillstand kommen lässt.
Figur 14 zeigt, dass der auf diese Weise bearbeitete SOI-Wafer 300 danach umgedreht wird und sich in einer„upside down"-Position befindet. Dadurch wird die Trägerschicht 10 zur untersten Schicht und die obere Siliziumschicht 320 des SOI- Wafers 300 zur späteren Hauptschicht 20 der Messchips 1 . Die ursprünglich begrabene Schicht 312 des SOI-Wafers 300 ist die oberste Schicht und bildet die spätere Deckschicht 12 der Messchips 1 . Danach wird die begrabene Schicht 312, die die Deckschicht 12 des Messchips 1 bildet, photolithographisch und mit geeigneten Ätzverfahren teilweise strukturiert oder vollständig entfernt, so dass die als Blenden wirkenden Öffnungen 14 gebildet werden, die vorzugsweise mittig über den Messkammern 30 angeordnet sind. Dies verdeutlicht die Figur 15, die der Figur 4 entspricht. Die begrabene Schicht 312 kann auch vollständig entfernt werden, wodurch eine Ausführungsform des Messchips 1 hergestellt wird, wie sie in Figur 1 dargestellt ist.
Zuletzt werden einzelne Messchips 1 aus dem SOI-Wafer gesägt. Die Messchips 1 können einzeln verwendet oder unter den oben beschrieben Halter 200 geklebt werden, wie in Figur 8 dargestellt ist.
Bezugszeichenliste
Messchip
Vesikel
Trägerschicht
Deckschicht
Deckschichtöffnung
Biologische Zelle
Deckschichtunterseite
Messchipoberseite
Messkammerboden
Hauptschicht
Beschichtung
Hauptschichtunterseite
Messkammeröffnung
Messkammerseitenwand
Vertiefungen
Erhebungen
Messkammer
Ovale Messkammer
Messkammerdurchmesser
Abstand benachbarter Messkammermittelpunkte
Messkammertiefe
Unterer Messkammerdurchmesser
Membran
Transportermolekül
Substratmolekül
Transport bzw. Diffusion durch Membran
Anregungslicht
Emission
Störemission
Membranrezeptor
Sekretiertes Protein
Sekretion
Nachweissystem
Fluoreszentes Molekül eines Nachweissystems
Ligand
Umwandlung in fluoreszentes Molekül durch Nachweissystem Halter
Oberseite
Unterseite
Reservoir
Obere Reservoiröffnung
Untere Reservoiröffnung
Deckglas
Kontrollsubstrat
Silizium-Wafer
Untere Siliziumschicht
Begrabene Schicht
Obere Siliziumschicht

Claims

Patentansprüche
1 . Mikrostruktunerter Messchip (1 ) zur optischen Messung von Eigenschaften künstlicher oder biologischer Membranen (40) mit einer unteren, lichtdurchlässigen Trägerschicht (10) und mindestens einer darauf angeordneten, im Wesentlichen lichtundurchlässigen Hauptschicht (20), welche als Messkammern ausgebildete Vertiefungen (30) mit einer oberen Öffnung (25) und einer inneren Seitenwand (26) oder mehreren inneren Seitenwänden (26) aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass die
Seitenwand (26) oder die Seitenwände der Messkammern (30)
Vertiefungen (27) und/oder Erhebungen (28) aufweisen.
2. Mikrostrukturierter Messchip (1 ) nach Anspruch 1 , dadurch
gekennzeichnet, dass die Vertiefungen (27) und Erhebungen (28) in Richtung der Längsachse der Messkammern (30) alternieren und die Seitenwand (26) oder die Seitenwände durch die so gebildeten Rinnen eine im Wesentlichen gewellte Oberflächenstruktur aufweisen.
3. Mikrostrukturierter Messchip (1 ) nach Anspruch 1 oder 2, dadurch
gekennzeichnet, dass die alternierenden Vertiefungen (27) bzw.
Erhebungen (28) bzw. Rinnen einen Abstand von 0,1 bis 0,6 μιτι und/oder eine Tiefe von 20 bis 1 10 nm aufweisen.
4. Mikrostrukturierter Messchip (1 ) nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Messkammern (30) die Grundform eines Kreiszylinders oder eines Kegelstumpfes haben und die die Rinnen bildenden Vertiefungen (27) und Erhebungen (28) die
Seitenwand (26) kreisförmig umlaufen.
5. Mikrostrukturierter Messchip (1 ) nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die untere, lichtdurchlässige Trägerschicht (10) aus Kunststoff oder aus Glas, insbesondere aus
Borosilicatglas besteht, welches vorzugsweise nach dem Floatverfahren hergestellt ist.
6. Mikrostrukturierter Messchip (1 ) nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die lichtundurchlässige
Hauptschicht (20) Silizium oder Metall oder Kunststoff aufweist.
7. Mikrostrukturierter Messchip (1 ) nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass auf der Hauptschicht (20) eine Deckschicht (12), vorzugsweise aus Siliziumdioxid oder Siliziumnitrid, angeordnet ist, die über den Öffnungen (25) der Messkammern (30) Deckschichtöffnungen (14) aufweist, deren Apertur kleiner ist als die der Öffnungen (25) der Messkammern.
8. Mikrostrukturierter Messchip (1 ) nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass dessen Oberfläche eine oder mehrere chemisch reaktive und/oder polare Beschichtungen insbesondere Poly-L-Lysin und/oder Propionsäure und/oder Carboxylgruppen und/oder Lipidderivate und/oder aminoreaktive Linkermoleküle aufweist, um
geeignete Bestandteile einer Membran oder des Transportsystems kovalent oder nichtkovalent an den Messchip (1 ) zu binden.
9. Mikrostrukturierter Messchip (1 ) nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Seitenwand oder die Seitenwände (26) der Messkammern (30) und/oder die der Trägerschicht (10) zugewandte Unterseite der Hauptschicht (20) und/oder die den
Messkammern (30) zugewandte Unterseite der Deckschicht (12) und/oder die Oberseite der Hauptschicht (20) jeweils eine zusätzliche,
lichtundurchlässige Beschichtung (21 ) aufweisen, vorzugsweise aus Metall, insbesondere aus Gold oder Titan.
10. Mikrostrukturierter Messchip (1 ) nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Verhältnis von Tiefe (33) zu Durchmesser (31 ) der Messkammern (30) größer als eins, vorzugsweise größer als fünf und besonders bevorzugt zehn bis fünfzig ist.
1 1 . Mikrostrukturierter Messchip (1 ) nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Messkammern (30) als Array angeordnet sind und vorzugsweise optische Markierungen aufweisen, die insbesondere als oval geformte Messkammern (30') oder
Messkammeröffnungen (25) ausgebildet sind.
12. Halter (200) für mikrostrukturierte Messchips (1 ) nach einem der
vorhergehenden Ansprüche, wobei der Halter (200) eine Platte mit einer Oberseite (201 ), einer Unterseite (202) und einem oder mehreren von der Oberseite mit Flüssigkeit befüllbaren Reservoir (203) umfasst und der Boden jeweils eines Reservoirs (201 ) durch jeweils einen an der Unterseite (202) der Platte (200) befestigten Messchip oder ein Deckglas mit aufgeklebten Messchips (1 ) gebildet wird.
13. Verfahren zur Herstellung mikrostrukturierter Messchips (1 ) zur optischen Messung von Eigenschaften künstlicher oder biologischer Membranen (40), vorzugsweise nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Substrat ein Wafer (300) verwendet wird, der Silizium aufweist.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass ein Silizium- Wafer verwendet wird, der eine untere Siliziumschicht (31 1 ), eine obere Siliziumschicht (320) und eine dazwischen angeordnete, begrabene Schicht (312) aufweist und insbesondere ein Silicon on Insulator-Wafer ist und die begrabene Schicht (312) vorzugsweise aus Siliziumdioxid oder
Siliziumnitrid besteht.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die
Messkammern (30) in die obere Siliziumschicht (320) bis zur begrabenen Schicht (312) geätzt werden, vorzugsweise im DRIE-Verfahren.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass eine lichtundurchlässige Beschichtung (21 ), vorzugsweise gemäß Anspruch 8, auf den Silizium-Wafer (300) aufgebracht wird.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die obere Siliziumschicht (320) des Silizium-Wafers (300) mit den eingeätzten Messkammern (30) mit der Trägerschicht (10) vorzugsweise durch anodisches Bonden verbunden wird.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die untere Siliziumschicht (31 1 ) des Silizium-Wafers (300) entfernt wird, vorzugsweise durch Ätzen.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die begrabene Schicht (312), vorzugsweise durch Ätzen, vollständig oder selektiv an den Stellen entfernt wird, die die Messkammern (30) bedecken, so dass Deckschichtöffnungen (14), vorzugsweise mit den Merkmalen nach Anspruch 7, gebildet werden.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass einzelne, mikrostrukturierten Messchips (1 ) aus dem Silizium-Wafer (300) gesägt werden und insbesondere an den (200) Halter nach Anspruch 12 geklebt werden.
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