WO2012025110A1 - Verfahren zur gewinnung von hoch-produzierenden zelllinien - Google Patents

Verfahren zur gewinnung von hoch-produzierenden zelllinien Download PDF

Info

Publication number
WO2012025110A1
WO2012025110A1 PCT/DE2011/075156 DE2011075156W WO2012025110A1 WO 2012025110 A1 WO2012025110 A1 WO 2012025110A1 DE 2011075156 W DE2011075156 W DE 2011075156W WO 2012025110 A1 WO2012025110 A1 WO 2012025110A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
measuring
cells
protein
chips
proteins
Prior art date
Application number
PCT/DE2011/075156
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Guido BÖSE
Original Assignee
Nanospot Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanospot Gmbh filed Critical Nanospot Gmbh
Publication of WO2012025110A1 publication Critical patent/WO2012025110A1/de

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/4833—Physical analysis of biological material of solid biological material, e.g. tissue samples, cell cultures
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/508—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above
    • B01L3/5085—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above for multiple samples, e.g. microtitration plates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6452—Individual samples arranged in a regular 2D-array, e.g. multiwell plates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6486—Measuring fluorescence of biological material, e.g. DNA, RNA, cells
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0809—Geometry, shape and general structure rectangular shaped
    • B01L2300/0829—Multi-well plates; Microtitration plates
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0848—Specific forms of parts of containers
    • B01L2300/0858—Side walls
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/16—Surface properties and coatings
    • B01L2300/168—Specific optical properties, e.g. reflective coatings
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T156/00—Adhesive bonding and miscellaneous chemical manufacture
    • Y10T156/10—Methods of surface bonding and/or assembly therefor
    • Y10T156/1052—Methods of surface bonding and/or assembly therefor with cutting, punching, tearing or severing
    • Y10T156/1062—Prior to assembly

Definitions

  • the invention relates to a method for obtaining high-producing, therapeutic or diagnostic proteins secreting cell lines.
  • Therapeutic proteins for a variety of diseases make up a quarter of all new pharmaceuticals. Its market share was approximately $ 33 billion in 2007, and $ 70 billion is expected in 2010 (Walsh, G. (2006) Biopharmaceutical benchmarks, 2006, Nat. Biotechnol., 24, 769-776.). In 2007, there were 600 new biopharmaceuticals in pharmaceutical development alone. They include monoclonal antibodies, protein-nucleic acid complexes and products of recombinant proteins. For the production of various expression systems such as mammalian cell lines, bacteria, yeasts, ciliates, plant cells or insect cells can be used. Due to a great similarity to human proteins in posttranslational
  • the limiting factor here is the genetic and phenotypic variance of industrially used cell lines.
  • increased numbers of clonal cell lines are used from individual cells (Barnes, LM et al. (2006). Phenotypic Variation during cloning procedures: analysis of the growth behavior of clonal cell lines. Biotechnol. Bioeng. 94, 530-537).
  • the cells of a cell clone are genetically and phenotypically identical.
  • many industrially relevant cell lines such as CHO or NSO cells as well as hybridoma cells show no homogeneous cell clone, but a large variance in their growth behavior, in the maximum cell density and the specific
  • LDC Linear Dilution Cloning
  • cell sorting by flow cytometry has been used.
  • LDC Linear Dilution Cloning
  • up to a few thousand individual cells in individual fields of a microtiter plate are multiplied to form a clone.
  • the content of protein product is detected in the supernatant of the culture by ELISA.
  • Antibody is captured the protein produced and extensively detected by a second fluorescently labeled antibody.
  • the selection can be automated by removing non-producing cells with one
  • Bioproc Int. 4 (Suppl. 3), 32-35). However, these systems are not used because of very high costs in small and medium-sized biotechnology companies and academic institutions.
  • the object of the invention is therefore to propose a method for obtaining high-producing, therapeutic or diagnostic proteins secreting cell lines.
  • high-producing cells or cell lines used here is derived from the English term “high-producer” and refers to cells which secrete a large amount of protein into the surrounding medium and therefore yield high yields when the protein is produced in the fermenter.
  • a measuring chip is provided which has a layer with depressions, which are formed as micro- or nanostructured, optical measuring chambers.
  • the measuring chambers of the measuring chip are open at the top.
  • the secreting cells to be examined are applied to the surface of the measuring chip, so that individual or several measuring chambers or their upper openings are sealed by the cells and the secreted proteins are released into the measuring chambers.
  • the proteins released into the measuring chambers are then determined quantitatively by means of an optical signal measurement, in particular a fluorescence measurement. Since the measured fluorescence intensity is directly proportional to the protein concentration, the production rate of the cells can be determined from this measurement.
  • the measuring chip is transparent in whole or in part at suitable points in order to be transparent to the excitation light and / or the fluorescent light.
  • the measuring chip may have an upper layer with the measuring chambers and a lower carrier layer which is transparent.
  • the quantitative, optical signal measurement of the proteins secreted into the measuring chambers then takes place by irradiating the fluorescence-exciting light from below and detecting the light emitted downwards by fluorescence.
  • the high secretion rate cells are then selected.
  • the quantitative, optical signal measurement is carried out by an imaging and / or time-resolved measuring device with which the change in the signal intensity of each measuring chamber is determined within a certain period of time.
  • Imaging measuring device is to be understood that the optical measuring signal is detected, for example with a CCD camera and thus resolved into individual pixels.
  • the optical measurement signal can be measured time-resolved, whereby the kinetics of the protein secretion can be determined.
  • the method further comprises the following steps: a) an amount of preferably about one million producing cells is distributed and applied to several, especially about a thousand Messchips and determines their production rate, as above
  • step b) from step a those measuring chips, preferably five to ten, are selected with comparatively high-producing cells and those
  • the high-producing cells are detached from the selected measuring chips, preferably by trypsinization, and
  • the detached cells are distributed over several measuring chips, their production rates are measured and the measuring chips with the comparatively high-producing cells are in turn selected to be another
  • the quantitative fluorescence measurement is determined by exciting the intrinsic fluorescence of the amino acids contained in the protein, in particular tyrosine by UV light in the range of 270-310 nm, preferably 280 nm, or tryptophan by UV light in the range of 295 nm not necessary to label the proteins with an additional fluorophore.
  • the cells or cell lines may be genetically engineered to secrete, in addition to the therapeutic or diagnostic target protein, a fluorescent indicator protein, particularly GFP, BFP or YFP, and quantitatively determine its fluorescence.
  • a fluorescent indicator protein particularly GFP, BFP or YFP
  • Cell lines are preferably carried out by a polycistronic expression vector, a cistron for the target protein and a cistron for the fluorescent
  • Indicator protein has.
  • the target protein encoded by the expression vector and the fluorescent indicator protein are both expressed and then
  • the amount of the target protein can be optically determined and, accordingly, a selection made.
  • the surface of the measuring chip is preceded by a covalent or noncovalent
  • Coating provided, preferably with poly-lysine or N-hydroxysuccinimide.
  • the measuring chambers of the measuring chip can with linker molecules and / or
  • Further optimization of the yield of fermentative protein production can be achieved by adding the selected, high-production cells to several measuring chips, each with different culture conditions, in order to determine those culture conditions in which the highest possible production rate is achieved. This is preferably done by varying the type, concentration and / or composition of additives in the nutrient medium, such as pH, CO2, sugars or amino acids.
  • the method described is used, in which the production rate of cells of precultures for fermenter runs is determined so as to save the costs for a fermenter run at a poor production rate.
  • the invention also includes a polycistronic expression vector for carrying out the method. This has a) a base sequence for a
  • Target protein b) a base sequence for a fluorescent indicator protein, in particular GFP, BFP or YFP (green, blue or yellow fluorescent Protein), c) a base sequence that causes the base sequences of the target protein and the indicator protein to transcribe to a common mRNA and thus express both proteins in equal proportion, and d) a base sequence encoding the secretion of the target protein and the fluorescent indicator protein causes.
  • a fluorescent indicator protein in particular GFP, BFP or YFP (green, blue or yellow fluorescent Protein
  • FIG. 1 shows a vertical section through a measuring chip with a cell in one
  • Figure 2a is a plan view of the measuring chip with a cell
  • Figure 2b is a bottom view of the measuring chip of Figure 2a;
  • FIG. 3a shows a plurality of measuring chips with cells in a first measuring cycle
  • FIG. 3b shows several measuring chips with cells in the second measuring cycle
  • FIG. 4 shows a vertical section through a measuring chip with a cell which secretes a fluorescent indicator protein
  • FIG. 5 shows a polycistronic expression vector for carrying out the
  • FIG. 1 shows a schematic partial view of a measuring chip 20 suitable for the method with a producing cell 4 in vertical section.
  • the measuring chip 20 has a lower, transparent carrier layer 3, which
  • the thickness of the carrier layer 3 is typically about 140-200 ⁇ .
  • the carrier layer 3 is permeable to the excitation light 1 1 irradiated from below and the fluorescent light 12 emitted from the measuring chambers 1.
  • a layer 2 is firmly connected, which forms the surface 10 of the measuring chip 20.
  • the layer 2 has through recesses, which are open at the top and form measuring chambers 1 with a circular cylindrical volume.
  • the measuring chambers 1 have a depth of 10 to 30 ⁇ ; But it is also possible depths of a few nanometers to millimeters.
  • the diameter of the measuring chambers 1 is about 1 ⁇ ; However, it is also possible diameters of a few nanometers to a few micrometers.
  • Measuring chambers 1 is 2.5 ⁇ to 4 ⁇ ; but it is also distances 32 from a few nanometers to a millimeter possible.
  • the surface 10 of the measuring chip 20 can be provided with a covalent or noncovalent coating, preferably with poly-lysine or N-hydroxysuccinimide ester.
  • transfected cells 4 are applied with a cell nucleus 6 from a cell suspension to the surface 10 of the measuring chip 20.
  • the cells 4 bind with their cell membrane 5 to the coated measuring chip surface 10, whereby the underlying measuring chambers 1 are sealed. Since the cells 4 have been transfected with an expression vector for a desired target protein 7, this is expressed in the interior of the cell 4 and secreted by the cell membrane 5 to the outside.
  • the cell 4 and the surface 10 of the measuring chip 20 are surrounded by a nutrient medium 9.
  • the secreted proteins 7 are in both the nutrient medium 9 and in the
  • Measuring chambers 1 delivered. Since the volume of a respective measuring chamber 1 is in the range of a few Femtolitern and thus is considerably smaller than the volume of the entire, surrounding nutrient medium 9, the concentration of secreted proteins 7 remains in the nutrient medium 9 and in the open measuring chambers V very small, whereas in the measuring cans 1 sealed by a cell 4 it is relatively high and in the micromolar range.
  • the emitted into the measuring chambers 1 target proteins 7 are determined quantitatively by means of a fluorescence measurement.
  • the intrinsic fluorescence 12 of the amino acids contained in the protein 7 by UV light 1 1 is more suitable
  • Wavelength is excited, which is irradiated from below through the translucent support layer 3.
  • Wavelength 295 nm are excited.
  • the excited amino acids then emit fluorescent light 12, which is detected with a (not shown) CCD camera below the measuring chip 20 and a quantitative measurement of
  • Protein concentration allows. Although this is not absolutely necessary for the selection process, a calibration can be performed for each cell line in order to:
  • Assign measured fluorescence intensities 12 absolute protein concentrations This is by measuring series of the fluorescence intensities 12 of measuring chips 20 without cells 4 but with nutrient medium 9 and added
  • Target protein 7 in different, defined concentrations possible.
  • the measured intensity of the fluorescent light 12 is accordingly high in the sealed ones
  • Measuring chambers 1 very high and the measured intensity of the fluorescent light 12 'in the open measuring chambers V very low. As a result, open measuring chambers V can be automatically identified and are not taken into account in the evaluation.
  • a control dye 8 (shown as "x") may be added to the nutrient medium 9.
  • This is preferably a fluorophore 8 which emits fluorescent light 13 (shown in phantom) at a different wavelength than the fluorescent light 12, 12 'of the target protein 7 Since the fluorophore 8 does not diffuse into the measuring chambers 1 covered and sealed by the cells 4 can, a unique optical identification of open measuring chambers 1 'is possible.
  • FIG. 2 a shows a top view of the measuring chip 20 with a cell 4. A portion of the circular-cylindrical measuring chambers 1 is spanned and sealed by the cell 4 (these are illustrated by dashed lines). The target protein 7 (not shown) accumulates in the measuring chambers 1.
  • FIG. 2b shows a bottom view of the measuring chip from FIG. 2a (mirrored for reasons of clarity).
  • enriched target proteins 7 can be quantified by means of fluorescence detection upon excitation with a UV laser and imaging detection by means of a CCD camera (the fluorescence measuring chambers 1 are for reasons of
  • the cell 4 itself is not optically detected. However, if desired, this can be done indirectly by adding a fluorophore 8, which penetrates into the measuring chambers 1 'next to the cell 4 (see FIG. 1).
  • FIG. 3 a shows a plurality of measuring chips 20 with cells 4, 4 'in a first measuring cycle
  • FIG. 3 b shows a plurality of measuring chips 20 with cells 4, 4' in a second measuring cycle.
  • Disposable measuring chips 20 with cells 4 'that produce little protein 7 are marked with a "cross", measuring chips 20 with cells 4 that produce a lot of protein 7, with a "check mark”.
  • the high-producing cells 4 are surrounded by a circle.
  • the method further comprises the following steps (the following description also refers to Figure 1): a) Approximately 10 6 transfected producing cells 4, 4 'become approximately one thousand measuring chips 20 applied. On average, each measuring chip 20 is therefore given about a thousand cells 4, 4 '. Although up to 7 ⁇ 10 4 cells 4, 4 'fit at the measuring chip surface 10 at 100% confluency, their number should be selected such that there are still spaces between the cells 4, 4'. The cells 4, 4 'bind after a few minutes through the cell-compatible coating to the surface 10 of the measuring chips 20 and seal the following steps (the following description also refers to Figure 1): a) Approximately 10 6 transfected producing cells 4, 4 'become approximately one thousand measuring chips 20 applied. On average, each measuring chip 20 is therefore given about a thousand cells 4, 4 '. Although up to 7 ⁇ 10 4 cells 4, 4 'fit at the measuring chip surface 10 at 100% confluency, their number should be selected such that there are still spaces between the cells 4, 4'. The cells 4, 4 'bind after a few
  • the cells 4, 4 'or the measuring chip surfaces 10 are covered by a nutrient medium 9.
  • the measuring chips 20 are analyzed by imaging measurement of the fluorescence 12 of the measuring chambers 1. b) By the automated evaluation of all fluorescence images obtained, five to ten cells of all 10 6 cells with the strongest fluorescent signal 12 and thus the highest protein secretion on the measuring chips 20 are located and the corresponding measuring chips 20 are selected.
  • the cells 4, 4 'of the selected biochips are briefly cultivated for regeneration until they have multiplied two to three times.
  • the twice-selected, highest-producing cells 4 are in turn replaced by the measuring chips 20.
  • an enrichment of 100 ⁇ 100 has occurred in two cycles
  • FIG. 4 shows a vertical section through a measuring chip 20 with a cell 4 which secretes a fluorescent indicator protein 14.
  • the measuring chip 20 corresponds in its construction to that of FIG. 1. Likewise, the cells bind 4 with theirs
  • the cells 4 were transfected with a polycistronic expression vector 15 (not shown, see FIG. 5), so that not only a desired target protein 7, but also a fluorescent indicator protein 14, namely GFP, is expressed in the interior of the cell 4 and secreted by the cell membrane 5 to the outside.
  • the target proteins 7 (shown filled in black) emitted into the measuring chambers 1 are determined quantitatively by means of the fluorescent indicator proteins 14 likewise emitted into the measuring chambers 1.
  • the indicator proteins 14 are excited by light 1 1 in the wavelength range of 488 nm, which is radiated from below through the measuring chip 20. The excited ones
  • Indicator proteins 14 then give green fluorescent light 15 im
  • Wavelength range from 505 to 550 nm from that below the measuring chip 20th is detected. Since the target protein 7 and the indicator protein 14 are expressed and secreted in proportional amounts, this enables an indirect but quantitatively accurate measurement of the target protein concentration. Since the measured intensity of the fluorescent light 15 'in the open measuring chambers V is very small, they can be automatically identified during the measurement and are not taken into account in the evaluation.
  • FIG. 5 shows a polycistronic expression vector 16 for carrying out the method according to the invention. This has different, functional
  • MCS encodes a target protein, "TagBFP” for a blue fluorescent indicator protein
  • the base sequences "P CMV IE”, “Kozak” and “SV 40 polyA” ensure a high expression of the proteins
  • the "Ig kappa chain leader sequence” leads to the secretion of the proteins
  • the IRES base sequence ensures that the two proteins " MCS “and” TagBFP "are formed bicistronically starting from an mRNA and thus expressed in the same ratio
  • the origin of replication" f1 o allows insertion of the vector into
  • the elements "SV40 o" and “psv4o” facilitate the generation of a cell line that stably secrete the proteins
  • the elements "P”, “Kan r / Neo r” and “HSV TK poly A” cause the Vector confers resistance to the selection antibiotics kanamycin and neomycin on the cells carrying it so that they can be separated from cells that do not carry the vector and the origin of replication "pUC o" makes it possible to propagate the vector in bacteria, so that easily high levels of the vector can be obtained.
  • the section "P C MV IE” (cytomegalovirus immediate early gene enhancer / promoter) is one
  • the "Kozak sequence” is a short base sequence that causes the ribosome to recognize the following start codon, thereby initiating translation: the "Ig kappa chain leader sequence” encodes the secretion signal of the following fluorescent protein. "IRES" (Internal ribosome entry site) is from
  • the TagBFP section encodes a monomeric, fluorescent protein derived from the GFP-like protein from the sea anemone Entacmea quadricolor, which has 99% of the brightness of GFP, and the SV 40 polyA section forms the polyadenylation signal for the mRNA formed of the large T antigen from Simian vacuolating virus 40.
  • "f1 ori” allows single stranded replication and packaging into phage particles for viral transfection.
  • P is a bacterial promoter for the expression of kanamycin / neomycin resistance.
  • SV40 ori and “Psv4o” is the origin of replication and promotor reg ion of the large T-antigen from Siminan vacuolating virus 40. These cause the vector in CHO cells episomally, ie without integration into the genome, and propagates can be transcribed and promote the generation of a stable cell line.
  • the section "Kan r / Neo r” is a kanamycin / neomycin resistance gene and allows selection in bacteria and mammalian cells.
  • HSV TK poly A herepes simplex virus thymidine kinase polyadenylation signal
  • pUC ori is the origin of replication and promotor reg ion of the large T-antigen from Siminan vacuolating virus 40. These cause the vector in CHO cells episomally, ie without integration into the genome, and propagates can be transcribed and promote the generation of a stable cell line.
  • the section “Kan r / Neo r” is a kana

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von hoch-produzierenden, therapeutische oder diagnostische Proteine (7) sezernierenden Zelllinien. Um ein Verfahren vorzuschlagen, mit dem hoch-produzierende, therapeutische oder diagnostische Proteine sezernierende Zelllinien gewonnen werden können, wird vorgeschlagen, dass ein Messchip (20) bereitgestellt wird, der eine Schicht (2) mit Vertiefungen aufweist, welche als mikro- oder nanostrukturierte, optische Messkammern (1) ausgebildet sind, wobei sezernierende Zellen (4) auf die Oberfläche (10) des Messchips (20) aufgebracht werden, so dass einzelne oder mehrere Messkammern (1) von den Zellen (4) abgedichtet und die sezernierten Proteine (7) in die Messkammern (1) abgegeben werden. Die Erfindung umfasst außerdem einen polycistronischen Expressionsvektor (15) zur Durchführung des Verfahrens.

Description

Titel: Verfahren zur Gewinnung von hoch-produzierenden Zelll
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von hoch-produzierenden, therapeutische oder diagnostische Proteine sezernierenden Zelllinien.
Therapeutische Proteine für eine Vielzahl von Krankheiten machen ein Viertel aller neuen Pharmazeutika aus. Ihr Marktanteil betrug im Jahr 2007 bereits ungefähr $33 Milliarden und für 2010 werden $70 Milliarden erwartet (Walsh, G. (2006). Biopharmaceutical benchmarks 2006. Nat. Biotechnol. 24, 769-776.). 2007 befanden sich alleine 600 neue Biopharmazeutika in der pharmazeutischen Entwicklung. Sie beinhalten monoklonale Antikörper, Protein-Nukleinsäure- Komplexe und Produkte aus rekombinanten Proteinen. Für die Herstellung können verschiedene Expressionssysteme wie Säugetierzelllinien, Bakterien, Hefen, Ciliaten, Pflanzenzellen oder Insektenzellen genutzt werden. Auf Grund einer großen Ähnlichkeit zu menschlichen Proteinen bei posttranslationalen
Modifikationen werden therapeutische Proteine trotz kleinerer Ausbeuten bevorzugt in Säugetier-Zellen hergestellt (Gerngross, T. U. (2004). Advances in the production of human therapeutic proteins in yeasts and filamentous fungi. Nat. Biotechnol. 22, 1409-1414; Wurm, F. M. (2005). Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nat. Biotechnol. 22, 1393-1398).
Durch die erforderlichen hohen klinischen Dosen wird momentan eine weltweite Zellkulturkapazität von 500.000 Litern eingesetzt (Butler, M. (2005). Animal cell cultures: recent achievements and perspectives in the production of
biopharmaceuticals. Appl. Micorbiol. Biotechnol. 68, 283-291 ). Die spezifische Produktivität von momentan 15-60 pg pro Zelle und Tag muss für eine
wirtschaftliche Produktion des zunehmenden Bedarfs weiter gesteigert werden (Butler, M. (2005). Animal cell cultures: recent achievements and perspectives in the production of biopharmaceuticals. Appl. Micorbiol. Biotechnol. 68, 283-291 ). Der limitierende Faktor ist hierbei die genetische und phänotypische Varianz von industriell eingesetzten Zelllinien. Für die industrielle Zellkultur werden aus einzelnen Zellen vermehrte, klonale Zelllinien eingesetzt (Barnes, L. M. et al. (2006). Phenotypic Variation during cloning procedures: analysis of the growth behaviour of clonal cell lines. Biotechnol. Bioeng. 94, 530-537). In der Theorie sind die Zellen eines Zellklons genetisch und phänotypisch identisch. In der Praxis zeigen viele industriell relevante Zelllinien wie CHO- oder NSO-Zellen sowie Hybridomzellen keinen homogenen Zellklon, sondern eine große Varianz in ihrem Wachstumsverhalten, in der maximalen Zelldichte und der spezifischen
Produktivität des therapeutischen Proteins (Barnes, L. M. et al. (2001 ).
Characterization of the stability of recombinant protein production in the GS-NSO expression System. Biotechnol. Bioeng. 73, 261 -270; Kim, N. S. (2001 ). Key determinants in the occurrence of clonal Variation in humanized antibody expressin of CHO cells during dihydrofolate reductase mediated gene
amplification. Biotechnol. Prog. 17, 69-75). Auch in einmal stabilen Produktions- Zelllinien treten mit zunehmender Kulturdauer vermehrt wenig oder nicht- produzierende Zellpopulationen auf (Kromenaker, S.J. and Seiend, F. (1994). Stability of producer hybridoma cell lines after cell sorting: a case study.
Biotechnol. Prog. 10, 299-307). Die Detektion von einzelnen hoch-produzierenden Zellen ist entscheidend für ihre Selektion und eine ausreichende Produktivität und damit Rentabilität der Produktion von therapeutischen Proteinen.
Traditionell werden LDC (Limited Dilution Cloning) oder Zellsortierung durch Durchflusszytometrie eingesetzt. Bei der LDC werden bis zu wenige tausend einzelne Zellen in einzelnen Feldern einer Mikrotiterplatte zu einem Klon vermehrt. Der Gehalt an Proteinprodukt wird im Überstand der Kultur mittels ELISA nachgewiesen. Es können nur wenige Zellen in mehreren Wochen auf ihre
Produktivität getestet werden (Puck, T. T. and Marcus, P. I. (1955). A rapid method for viable cell titration and clone production with HeLa cells in tissue culture: the use of x-irradiated cells to supply conditioning factors. Proc. Natl.
Acad. Sei. U. S.A. 41 , 432-43). Mit der Durchflusszytometrie können zwar deutlich mehr Zellen analysiert werden, es bedarf aber einer Fluoreszenzmarkierung der Zellen (Al-Rubeai, M. and Emery, A. N. (1993). Flow cytometry in animal culture. Nat. Biotechnol. 1 1 , 572-579). Diese kann z.B. über den Nachweis einer
Oberflächenexpression mit fluoreszenten Antikörpern erfolgen, sofern diese mit der Sekretionsrate korreliert. Neuere Methoden wie die Gel-Mikrotropfen-Technik oder matrixbasierte
Techniken weisen die Sekretion des Proteins nach. Um die schnelle Diffusion des produzierten Proteins von der produzierenden Zelle weg zu vermeiden, werden hierbei einzelne Zellen in viskose Geltropfen eingeschlossen (Hammiii, L. et al. (2000). The gel microdrop secretion assay: Identification of a low productivity of human antibody in CHO cells. Cytotechnol. 34, 27-37) oder mit einer künstlichen Matrix auf der Zelloberfläche versehen (Manz, R. et al. (1995) Analysis and sorting of live cells according to secreted molecules, relocated to a cell-surface affinity matrix. Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 92, 1921 -1925). Hierdurch wird eine
Erkennung von hoch-produzierenden Zellen ermöglicht. Über gekoppelte
Antikörper wird das produzierte Protein gefangen und durch einen zweiten fluoreszenzmarkierten Antikörper aufwendig nachgewiesen. Die Selektion kann automatisiert durch eine Entfernung nicht produzierender Zellen mit einem
Lasersystem (Koller, M. R. et al. (2004) High-throughput laser-mediated in situ cell purification for rapid cloning of highly-secreting producers. Biotechnol. Bioeng. 91 , 872-876) oder durch Entnahme einzelner Zellen durch Picken von Klonen erfolgen (Lee, C. et al. (2006). High-throughput Screening of cell lines expressing
monoclonal antibodies. Bioproc Int. 4 (Suppl. 3), 32-35). Diese Systeme finden jedoch auf Grund sehr hoher Kosten in Biotechnologie-Firmen kleinerer und mittlerer Größe und in akademischen Einrichtungen keinen Einsatz.
Alle beschriebenen und nach dem Stand der Technik bekannten
Selektionsmethoden sind sehr zeitaufwendig und somit kostenintensiv.
Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Verfahren zur Gewinnung von hochproduzierenden, therapeutische oder diagnostische Proteine sezernierenden Zelllinien vorzuschlagen.
Der hier verwendete Begriff„hoch-produzierende" Zellen bzw. Zelllinien leitet sich vom englischen Begriff„high-producer" ab und bezeichnet Zellen, die viel Protein in das umgebende Medium sekretieren und deshalb bei einer Proteinproduktion im Fermenter hohe Ausbeuten liefern. Diese Aufgabe wird dadurch gelöst, dass ein Messchip bereitgestellt wird, der eine Schicht mit Vertiefungen aufweist, welche als mikro- oder nanostrukturierte, optische Messkammern ausgebildet sind. Die Messkammern des Messchips sind nach oben hin geöffnet. Die zu untersuchenden, sezernierenden Zellen werden auf die Oberfläche des Messchips aufgebracht, so dass einzelne oder mehrere Messkammern bzw. deren obere Öffnungen von den Zellen abgedichtet und die sezernierten Proteine in die Messkammern abgegeben werden.
Die in die Messkammern abgegebenen Proteine werden dann quantitativ mittels einer optischen Signalmessung, insbesondere einer Fluoreszenzmessung, bestimmt. Da die gemessene Fluoreszenzintensität der Protein konzentration direkt proportional ist, kann anhand dieser Messung die Produktionsrate der Zellen ermittelt werden. Hierzu ist der Messchip insgesamt oder teilweise an geeigneten Stellen transparent, um für das Anregungslicht und/oder das Fluoreszenzlicht durchlässig zu sein. Beispielsweise kann der Messchip eine obere Schicht mit den Messkammern und eine untere Trägerschicht aufweisen, die lichtdurchlässig ist. Die quantitative, optische Signalmessung der in die Messkammern sezernierten Proteine erfolgt dann, indem das die Fluoreszenz anregende Licht von unten eingestrahlt und das durch Fluoreszenz nach unten abgegebene Licht detektiert wird. Die Zellen mit hoher Sekretionsrate werden dann ausgewählt.
Die quantitative, optische Signalmessung erfolgt durch eine bildgebende und/oder zeitauflösende Messvorrichtung, mit der die Veränderung der Signalintensität jeder Messkammer innerhalb eines bestimmten Zeitraums bestimmt wird. Unter bildgebender Messvorrichtung ist zu verstehen, dass das optische Messsignal beispielsweise mit einer CCD-Kamera detektiert und somit in einzelne Bildpunkte aufgelöst wird. Außerdem kann das optische Messsignal zeitaufgelöst gemessen werden, wodurch die Kinetik der Proteinsezernierung bestimmt werden kann.
Hierdurch wird die Messgenauigkeit verbessert.
Um ein effektives Screening zu erreichen, umfasst das Verfahren weiterhin folgende Schritte: a) eine Menge von vorzugsweise etwa einer Million produzierender Zellen wird auf mehrere, insbesondere etwa tausend Messchips, verteilt und aufgebracht und ihre Produktionsrate bestimmt, wie es oben
beschrieben wurde,
b) aus Schritt a werden diejenigen Messchips, vorzugsweise fünf bis zehn, mit vergleichsweise hoch-produzierenden Zellen ausgewählt und diejenigen
Messchips mit vergleichsweise nicht- oder wenig-produzierenden Zellen
verworfen, um eine Anreicherung von hoch-produzierenden Zellen zu erreichen, c) die hoch-produzierenden Zellen werden von den ausgewählten Messchips abgelöst, vorzugsweise durch Trypsinisierung, und
d) die abgelösten Zellen werden auf mehrere Messchips verteilt aufgebracht, ihre Produktionsraten gemessen und die Messchips mit den vergleichsweise hochproduzierenden Zellen werden wiederum ausgewählt, um eine weitere
Anreicherung und Selektion von hoch-produzierenden Zellen zu erreichen. Die so zweimal selektionierten, höchst-produzierenden Zellen werden wiederum von den Messchips abgelöst. Im genannten Beispiel hat sich eine Anreicherung von 100 x100 = 10000 der höchst-produzierenden Zellen unter den wenigerproduzierenden Zellen ergeben. Durch weitere Zyklen bis hin zum Single Cell Cloning können Zelllinien dieser höchst-produzierenden Zellen gewonnen werden, welche dann zur industriellen Produktion der gewünschten, sezernierten Proteine verwendet werden.
Vorteilhafterweise wird die quantitativen Fluoreszenzmessung durch Anregung der intrinsischen Fluoreszenz der im Protein enthaltenden Aminosäuren bestimmt, insbesondere Tyrosin durch UV-Licht im Bereich von 270-310 nm, vorzugsweise 280 nm, oder Tryptophan durch UV-Licht im Bereich von 295 nm. Hierdurch ist es nicht notwendig, die Proteine mit einem zusätzlichen Fluorophor zu markieren.
Als Alternative oder zusätzlich zur Messung der intrinsischen Fluoreszenz können die Zellen oder Zelllinien gentechnisch so modifiziert werden, dass sie neben dem therapeutischen oder diagnostischen Zielprotein ein fluoreszentes Indikatorprotein, insbesondere GFP, BFP oder YFP, sezernieren und dessen Fluoreszenz quantitativ bestimmt wird. Die gentechnische Modifizierung der Zellen oder
Zelllinien erfolgt vorzugsweise durch einen polycistronischen Expressionsvektor, der ein Cistron für das Zielprotein und ein Cistron für das fluoreszente
Indikatorprotein aufweist. Das durch den Expressionsvektor kodierte Zielprotein und das fluoreszente Indikatorprotein werden beide exprimiert und dann
sezerniert, so dass die gemessene Fluoreszenzintensität des Indikatorproteins der sezernierten Menge des Zielproteins proportional ist. Hierdurch kann die Menge des Zielproteins optisch bestimmt und dementsprechend eine Selektionierung vorgenommen werden.
Um eine Bindung der Zellen an die Oberfläche des Messchips und damit eine bessere Abdichtung der Messkammern zu erreichen, wird die Oberfläche des Messchips vor der Messung mit einer kovalenten oder nichtkovalenten
Beschichtung versehen, vorzugsweise mit poly-Lysin oder N- Hydroxysuccinimidester.
Die Messkammern des Messchips können mit Linkermolekülen und/oder
Molekülen eines biochemischen Nachweissystems beschichtet werden, so dass sezernierte Proteine gebunden und/oder detektiert werden können.
Eine weitere Optimierung der Ausbeute einer fermentativen Proteinproduktion lässt sich dadurch erreichen, dass die selektierten, hoch-produzierenden Zellen auf mehrere Messchips mit jeweils unterschiedlichen Kulturbedingungen gegeben werden, um so diejenigen Kulturbedingungen zu ermitteln, bei denen eine möglichst hohe Produktionsrate erreicht wird. Dieses erfolgt vorzugsweise durch Variation der Art, Konzentration und/oder Zusammensetzung von Zusätzen im Nährmedium, wie beispielsweise pH, CO2, Zuckern oder Aminosäuren.
Erfindungsgemäß wird das beschriebene Verfahren angewandt, in dem die Produktionsrate von Zellen von Vorkulturen für Fermenterläufe bestimmt wird, um so bei schlechter Produktionsrate die Kosten für einen Fermenterlauf zu sparen.
Die Erfindung umfasst außerdem einen polycistronischen Expressionsvektor zur Durchführung des Verfahrens. Dieser weist a) eine Basensequenz für ein
Zielprotein, b) eine Basensequenz für ein fluoreszentes Indikatorprotein, insbesondere GFP, BFP oder YFP (grünes, blaues oder gelbes fluoreszierendes Protein), c) eine Basensequenz, die bewirkt, dass die Basensequenzen des Zielproteins und des Indikatorproteins auf eine gemeinsame mRNA transkribiert und so beide Proteine in gleichem Verhältnis exprimiert werden, und d) eine Basensequenz auf, die die Sekretion des Zielproteins und des fluoreszierenden Indikatorproteins bewirkt. Es konnte gezeigt werden, dass die Expression des Indikatorproteins proportional zur Expression des Zielproteins ist und das Indikatorprotein folglich als Marker dienen kann.
Die Erfindung wird unter Bezugnahme auf eine Zeichnung beispielhaft beschrieben, wobei weitere vorteilhafte Einzelheiten den Figuren der Zeichnung zu entnehmen sind.
Gattungs- oder funktionsmäßig gleiche Objekte sind dabei mit denselben Bezugszeichen versehen.
Die Figuren der Zeichnung zeigen im Einzelnen:
Figur 1 einen Vertikalschnitt durch einen Messchip mit einer Zelle in einer
Teilansicht;
Figur 2a eine Draufsicht auf den Messchip mit einer Zelle;
Figur 2b eine Untersicht des Messchips aus Figur 2a;
Figur 3a mehrere Messchips mit Zellen in einem ersten Messzyklus;
Figur 3b mehrere Messchips mit Zellen im zweiten Messzyklus;
Figur 4 einen Vertikalschnitt durch einen Messchip mit einer Zelle, die ein fluoreszierendes Indikatorprotein sezerniert; und
Figur 5 einen polycistronischen Expressionsvektor zur Durchführung des
Verfahrens. Figur 1 zeigt eine schematische Teilansicht eines für das Verfahren geeigneten Messchips 20 mit einer produzierenden Zelle 4 im Vertikalschnitt. Als Basis weist der Messchip 20 eine untere, lichtdurchlässige Trägerschicht 3 auf, die
beispielsweise aus Borosilicatglas besteht. Die Dicke der Trägerschicht 3 liegt typischerweise bei etwa 140-200 μιτι. Die Trägerschicht 3 ist für das von unten eingestrahlte Anregungslicht 1 1 und das aus den Messkammern 1 abgegebene Fluoreszenzlicht 12 durchlässig. Auf der Trägerschicht 3 ist eine Schicht 2 fest verbunden, die die Oberfläche 10 des Messchips 20 bildet. Die Schicht 2 weist durchgehende Vertiefungen auf, die nach oben geöffnet sind und Messkammern 1 mit einem kreiszylindrischen Volumen bilden. Die Messkammern 1 haben eine Tiefe von 10 bis 30 μιτι; es sind aber auch Tiefen von einigen Nanometern bis Millimetern möglich. Der Durchmesser der Messkammern 1 beträgt etwa 1 μιτι; es sind aber auch Durchmesser von einigen Nanometern bis einigen Mikrometern möglich. Der Abstand 32 zwischen den Längsachsen der einzelnen
Messkammern 1 beträgt 2,5 μιτι bis 4 μιτι; es sind aber auch Abstände 32 von einigen Nanometern bis zu einem Millimeter möglich.
Vor der Messung kann die Oberfläche 10 des Messchips 20 mit einer kovalenten oder nichtkovalenten Beschichtung versehen werden, vorzugsweise mit poly-Lysin oder N-Hydroxysuccinimidester. Danach werden transfizierte Zellen 4 mit einem Zellkern 6 aus einer Zellsuspension auf die Oberfläche 10 des Messchips 20 aufgebracht. Die Zellen 4 binden mit ihrer Zellmembran 5 an die beschichtete Messchipoberfläche 10, wodurch die darunter liegenden Messkammern 1 abgedichtet werden. Da die Zellen 4 mit einem Expressionsvektor für ein gewünschtes Zielprotein 7 transfiziert wurden, wird dieses im Innern der Zelle 4 exprimiert und durch die Zellmembran 5 nach außen sezerniert. Die Zelle 4 und die Oberfläche 10 des Messchips 20 sind von einem Nährmedium 9 umgeben. Die sezernierten Proteine 7 werden sowohl ins Nährmedium 9 als auch in die
Messkammern 1 abgegeben. Da das Volumen jeweils einer Messkammer 1 im Bereich von wenigen Femtolitern liegt und damit erheblich kleiner als das Volumen des gesamten, umgebenden Nährmediums 9 ist, bleibt die Konzentration der sezernierten Proteine 7 im Nährmedium 9 und in den offenen Messkammern V sehr gering, wohingegen sie in den von einer Zelle 4 abgedichteten Messkannnnern 1 verhältnismäßig hoch ist und im mikromolaren Bereich liegt.
Die in die Messkammern 1 abgegebenen Zielproteine 7 werden quantitativ mittels einer Fluoreszenzmessung bestimmt. Hierzu wird die intrinsische Fluoreszenz 12 der im Protein 7 enthaltenden Aminosäuren durch UV-Licht 1 1 geeigneter
Wellenlänge angeregt, das von unten durch die lichtdurchlässige Trägerschicht 3 hindurchgestrahlt wird. Beispielsweise kann die Aminosäure Tyrosin mit UV-Licht der Wellenlänge 280 nm und die Aminosäure Tryptophan mit UV-Licht der
Wellenlänge 295 nm angeregt werden. Die angeregten Aminosäuren geben dann Fluoreszenzlicht 12 ab, das mit einer (nicht gezeigten) CCD-Kamera unterhalb des Messchips 20 detektiert wird und eine quantitative Messung der
Protein konzentration ermöglicht. Obwohl dies für den Selektionsprozess nicht unbedingt nötig ist, kann für jede Zelllinie eine Kalibrierung erfolgen, um
gemessene Fluoreszenzintensitäten 12 absoluten Proteinkonzentrationen zuzuordnen. Dies ist durch Messreihen der Fluoreszenzintensitäten 12 von Messchips 20 ohne Zellen 4 aber mit Nährmedium 9 und zugegebenem
Zielprotein 7 in unterschiedlichen, definierten Konzentrationen möglich.
Da, wie oben beschrieben, die Konzentration der sezernierten Proteine 7 in den offenen Messkammern V sehr gering und im Verhältnis dazu in den von einer Zelle 4 abgedichteten Messkammern 1 sehr hoch ist, ist dementsprechend auch die gemessene Intensität des Fluoreszenzlichts 12 in den abgedichteten
Messkammern 1 sehr hoch und die gemessene Intensität des Fluoreszenzlichts 12' in den offenen Messkammern V sehr gering. Dadurch lassen sich offene Messkammern V automatisiert identifizieren und werden bei der Auswertung nicht berücksichtigt.
Alternativ oder zusätzlich kann ein Kontrollfarbstoff 8 (als„x" dargestellt) in das Nährmedium 9 gegeben werden. Dies ist vorzugsweise ein Fluorophor 8, welches Fluoreszenzlicht 13 (gestrichelt dargestellt) mit einer anderen Wellenlänge als das Fluoreszenzlicht 12, 12' des Zielproteins 7 abgibt. Da das Fluorophor 8 nicht in die von den Zellen 4 abgedeckten und abgedichteten Messkammern 1 diffundieren kann, ist eine eindeutige optische Identifizierung von offenen Messkammern 1 ' möglich.
Figur 2a zeigt eine Draufsicht auf den Messchip 20 mit einer Zelle 4. Durch die Zelle 4 wird ein Teil der kreiszylindrischen Messkammern 1 überspannt und abgedichtet (diese sind gestrichelt dargestellt). Das (nicht gezeigte) Zielprotein 7 reichert sich in den Messkammern 1 an.
Figur 2b zeigt eine (aus Gründen der Anschaulichkeit gespiegelt dargestellte) Untersicht des Messchips aus Figur 2a. Die in den Messkammern 1
angereicherten Zielproteine 7 können mittels Fluoreszenzdetektion bei Anregung mit einem UV-Laser und bildgebender Detektion mittels CCD-Kamera quantifiziert werden (die fluoreszierenden Messkammern 1 sind aus Gründen der
Anschaulichkeit schwarz ausgefüllt dargestellt). Die Zelle 4 selbst wird nicht optisch erfasst. Dies kann aber, falls gewünscht, indirekt über Zugabe eines Fluorophors 8 erfolgen, welches in die Messkammern 1 ' neben der Zelle 4 eindringt (siehe Figur 1 ).
Die Messung erfolgt in einem bildgebenden Fluoreszenzlesegerät, so dass bei entsprechender Klimatisierung die Sekretionsrate der einzelnen Zellen 4 über mehrere Stunden gemessen werden kann. Dadurch werden in einer Zellpopulation für alle einzelnen Zellen 4 die Sekretionsraten bestimmt. Die Selektion der am meisten sezernierenden Zellen 4 kann durch wiederholte Zyklen mit Aufbringen der Zellpopulation auf viele Messchips 20, Detektion und Auswahl der höchst produzierenden Zellen 4 und dazugehörigen Messchips 20, Ablösen aller Zellen 4 dieser Messchips 20 und wiederum verdünntem Aufbringen auf Messchips 20 erfolgen. Zur Veranschaulichung zeigen Figur 3a mehrere Messchips 20 mit Zellen 4, 4' in einem ersten Messzyklus und Figur 3b mehrere Messchips 20 mit Zellen 4, 4' in einem zweiten Messzyklus. Zu verwerfende Messchips 20 mit Zellen 4', die wenig Protein 7 produzieren, sind mit einem„Kreuz" gekennzeichnet, Messchips 20 mit Zellen 4, die viel Protein 7 produzieren, mit einem„Häkchen". Die hoch- produzierenden Zellen 4 sind mit einem Kreis umrandet. Die schematischen Darstellungen dienen zur Veranschaulichung und geben nicht die wahren
Größenverhältnisse wieder.
Um ein effektives Screening mit einem hohen Durchsatz zu erreichen, umfasst das Verfahren weiterhin folgende Schritte (die folgende Beschreibung nimmt auch Bezug auf die Figur 1 ): a) Ungefähr etwa 106 transfizierte, produzierende Zellen 4, 4' werden auf etwa tausend Messchips 20 aufgebracht. Im Durchschnitt werden auf jeden Messchip 20 also etwa tausend Zellen 4, 4' gegeben. Auf die Messchipoberfläche 10 passen bei 100% Konfluenz zwar bis zu 7 x 104 Zellen 4, 4', deren Anzahl sollte aber so gewählt werden, dass sich noch Zwischenräume zwischen den Zellen 4, 4' ergeben. Die Zellen 4, 4' binden nach wenigen Minuten durch die zellkompatible Beschichtung an die Oberfläche 10 der Messchips 20 und dichten die
Messkammern 1 ab. Die Zellen 4, 4' bzw. die Messchipoberflächen 10 sind von einem Nährmedium 9 bedeckt. Nach einer ausreichenden Produktionszeit von ungefähr ein bis drei Stunden werden die Messchips 20 durch bildgebende Messung der Fluoreszenz 12 der Messkammern 1 analysiert. b) Durch die automatisierte Auswertung aller erhaltenen Fluoreszenzbilder werden fünf bis zehn Zellen von allen 106 Zellen mit dem stärksten Fluoreszenzsignal 12 und somit der höchsten Proteinsekretion auf den Messchips 20 lokalisiert und die entsprechenden Messchips 20 ausgewählt. Von den fünf bis zehn Biochips mit den ausgewählten fünf bis zehn Zellen erhält man also maximal 10.000 Zellen 4, 4' (zehn ausgewählte Messchips 20 mit jeweils eintausend Zellen 4, 4') inklusive der fünf bis zehn am höchsten sezernierenden Zellen 4. Die restlichen 990 Messchips 20 mit den vergleichsweise nicht- oder wenigproduzierenden Zellen 4' werden verworfen. Dieses Verfahren benötigt wenige Stunden und erreicht bereits eine etwa einhundertfache Anreicherung von hochproduzierenden Zellen 4. c) Die hoch-produzierenden Zellen werden von der Oberfläche 10 der
ausgewählten Messchips 20 durch Trypsinisierung abgelöst. d) Die Zellen 4, 4' der ausgewählten Biochips werden zur Regenerierung kurzzeitig kultiviert, bis sie sich zwei- bis dreifach vermehrt haben. Die Zellen 4, 4' werden auf Messchips 20 aufgebracht, ihre Produktionsraten gemessen und die Messchips 20 mit den höchst-produzierenden Zellen 4 werden wiederum ausgewählt, um eine weitere Anreicherung und Selektion von hochproduzierenden Zellen 4 zu erreichen. Die so zweimal selektionierten, höchstproduzierenden Zellen 4 werden wiederum von den Messchips 20 abgelöst. Im genannten Beispiel hat sich in zwei Zyklen eine Anreicherung von 100 x100 =
10000 der höchst-produzierenden Zellen unter den weniger-produzierenden Zellen ergeben. Durch weitere Zyklen bis hin zum Single Cell Cloning können Zelllinien dieser höchst-produzierenden Zellen gewonnen werden, welche dann zur industriellen Produktion der gewünschten Proteine 7 verwendet werden. Figur 4 zeigt einen Vertikalschnitt durch einen Messchip 20 mit einer Zelle 4, die ein fluoreszierendes Indikatorprotein 14 sezerniert. Der Messchip 20 entspricht in seinem Aufbau dem aus Figur 1 . Ebenfalls binden die Zellen 4 mit ihrer
Zellmembran 5 an die beschichtete Messchipoberfläche 10, wodurch die darunter liegenden Messkammern 1 abgedichtet werden. Im Unterschied zur Figur 1 wurden die Zellen 4 jedoch mit einem polycistronischen Expressionsvektor 15 (nicht gezeigt, siehe Figur 5) transfiziert, so dass im Innern der Zelle 4 nicht nur ein gewünschtes Zielprotein 7, sondern auch ein fluoreszierende Indikatorprotein 14, nämlich GFP, exprimiert und durch die Zellmembran 5 nach außen sezerniert werden. Die in die Messkammern 1 abgegebenen Zielproteine 7 (schwarz ausgefüllt dargestellt) werden quantitativ mittels der ebenfalls in die Messkammern 1 abgegebenen fluoreszierenden Indikatorproteine 14 bestimmt. Hierzu werden die Indikatorproteine 14 durch Licht 1 1 im Wellenlängenbereich von 488 nm angeregt, das von unten durch den Messchip 20 gestrahlt wird. Die angeregten
Indikatorproteine 14 geben dann grünes Fluoreszenzlicht 15 im
Wellenlängenbereich von 505 bis 550 nm ab, das unterhalb des Messchips 20 detektiert wird. Da das Zielprotein 7 und das Indikatorprotein 14 in proportionalen Mengen exprimiert und sezerniert wird, wird auf diese Weise eine indirekte aber quantitativ genaue Messung der Zielproteinkonzentration ermöglicht. Da die gemessene Intensität des Fluoreszenzlichts 15' in den offenen Messkammern V sehr gering ist, lassen sich diese bei der Messung automatisiert identifizieren und werden bei der Auswertung nicht berücksichtigt.
Figur 5 zeigt einen polycistronischen Expressionsvektor 16 zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Diese weist verschiedene, funktionelle
Basensequenzen auf:„MCS" kodiert für ein Zielprotein,„TagBFP" für ein blau fluoreszierendes Indikatorprotein; die Basensequenzen„P CMV I E",„Kozak" und„SV 40 polyA" sorgen für eine hohe Expression der Proteine, die„Ig kappa chain leader sequence" führt zur Sekretion der Proteine, die IRES Basensequenz sorgt dafür, dass die beiden Proteine„MCS" und„TagBFP" ausgehend von einer mRNA bicistronisch gebildet und so in gleichem Verhältnis exprimiert werden, der Replikationsursprung„f1 o " ermöglicht das Einbringen des Vektors in
Säugerzellen mittels Viren, die Elemente„SV40 o " und„Psv4o" erleichtern die Generierung einer Zelllinie, die die Proteine stabil sezernieren, die Elemente„P", „Kan r/Neo r" und„HSV TK poly A" bewirken, dass der Vektor den Zellen, die ihn tragen, eine Resistenz gegen die Selektionsantibiotika Kanamycin und Neomycin vermittelt, so dass sie von Zellen, die den Vektor nicht tragen, getrennt werden können und der Replikationsursprung„pUC o " ermöglicht es, den Vektor in Bakterien zu vermehren, so dass sich leicht hohe Mengen des Vektors gewinnen lassen.
Im Einzelnen handelt es sich um folgende Basensequenzen: Der Abschnitt„P CMV IE" (Cytomegalovirus immediate early gene enhancer/promoter) ist eine
Promotorregion, die für die Anbindung der RNA-Polymerasen in Säugerzellen sorgt. Die„Kozak-Sequenz" ist eine kurze Basensequenz, die dafür sorgt, dass das Ribosom das folgende Startcodon erkennt und so die Translation einleitet. Die „Ig kappa chain leader sequence" kodiert das Sekretionssignal des folgenden Fluoreszenzproteins.„IRES" (Internal ribosome entry site) stammt vom
Encephalomyocarditis Virus und erlaubt die bicistronische Expression, also die Translation zweier offener Leserahmen von einer mRNA. Der Abschnitt„TagBFP" kodiert ein monomeres, fluoreszentes Protein, das aus dem GFP-ähnlichen Protein aus der Seeanemone Entacmeaea quadricolor entwickelt wurde. Es besitzt 99 % der Helligkeit von GFP. Der Abschnitt„SV 40 polyA" bildet das Polyadenylierungssignal für die gebildete mRNA des large T-Antigens aus dem Simian vacuolating Virus 40.„f1 ori" erlaubt die Einzelstrang-Replikation und das Verpacken in Phagen-Partikel für die virale Transfektion.„P" ist ein bakterieller Promoter für die Expression des Kanamyin/Neomycin-Resistenz-Gens.„SV40 ori" und„Psv4o" ist der Replikationsursprung und die Promoterreg ion des large T- Antigens aus dem Siminan vacuolating Virus 40. Diese bewirken, dass der Vektor in CHO-Zellen episomal, also ohne Integration in das Genom, vermehrt und transkribiert werden kann und fördern die Generierung einer stabilen Zelllinie. Der Abschnitt„Kan r/Neo r" ist ein Kanamyin/Neomycin-Resistenz-Gen und ermöglicht die Selektion in Bakterien und Säugerzellen. Der Abschnitt„HSV TK poly A" (Herpes Simplex virus thymidine kinase polyadenylierungs-Signal) sorgt für die Poyladenylierung der mRNA des Resistenzgens.„pUC ori" ist der
Replikationsursprung des Plasmids in Bakterien.
Bezugszeichenliste
1 . Messkammer
2. Messkammerschicht
3. Trägerschicht
4. Transfizierte Zelle
5. Zellmembran
6. Zellkern
7. Protein
8. Kontrollfarbstoff
9. Nährmedium
10. Messchipoberfläche
1 1 . Anregungslicht
12. Fluoreszenzlicht des Zielproteins
13. Fluoreszenzlicht des Kontrollfarbstoffs
14. Indikatorprotein
15. Fluoreszenzlicht des Indikatorproteins
16. Expressionsvektor
20. Messchip
32. Abstand der Messkammern

Claims

Patentansprüche
1 . Verfahren zur Gewinnung von hoch-produzierenden, therapeutische oder diagnostische Proteine (7) sezernierenden Zelllinien, dadurch
gekennzeichnet, dass ein Messchip (20) bereitgestellt wird, der eine Schicht (2) mit Vertiefungen aufweist, welche als mikro- oder
nanostrukturierte, optische Messkammern (1 ) ausgebildet sind, wobei sezernierende Zellen (4) auf die Oberfläche (10) des Messchips (20) aufgebracht werden, so dass einzelne oder mehrere Messkammern (1 ) von den Zellen (4) abgedichtet und die sezernierten Proteine (7) in die
Messkammern (1 ) abgegeben werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die in die Messkammern (1 ) abgegebenen Proteine (7) quantitativ mittels einer optischen Signalmessung, insbesondere einer Fluoreszenzmessung, bestimmt werden und anhand der Messung die Sekretionsrate der Zellen (4) ermittelt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass Zellen (4) mit hoher Produktionsrate ausgewählt werden.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, dass die optische, quantitative Signalmessung durch eine bildgebende und/oder zeitauflösende Messvorrichtung erfolgt, mit der die Veränderung der Signalintensität (12, 15) jeder Messkammer (1 ) innerhalb eines bestimmten Zeitraums bestimmt wird.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, dass
a) eine Menge von vorzugsweise etwa einer Million produzierender Zellen (4, 4') auf mehrere, insbesondere etwa tausend Messchips (20), verteilt und aufgebracht und ihre Sekretionsrate bestimmt wird,
b) davon diejenigen Messchips (20), vorzugsweise fünf bis zehn, mit vergleichsweise hoch-produzierenden Zellen (4) ausgewählt und diejenigen Messchips (20) mit vergleichsweise nicht- oder wenig-produzierenden Zellen (4') verworfen werden, c) die hoch-produzierenden Zellen (4) von den ausgewählten Messchips abgelöst werden, vorzugsweise durch Trypsinisierung, und
d) die abgelösten, hoch-produzierenden Zellen (4) wiederum auf Messchips (20) aufgebracht, ihre Sekretionsraten gemessen und die Messchips (20) mit den vergleichsweise hoch-produzierenden Zellen (4) ausgewählt werden, um eine weitere Anreicherung und Selektion von hochproduzierenden Zellen (4) zu erreichen.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, dass die quantitativen Fluoreszenzmessung durch Anregung der intrinsischen Fluoreszenz (12) der im Protein (7)
enthaltenden Aminosäuren bestimmt wird, insbesondere Tyrosin durch UV- Licht (1 1 ) im Bereich von 270-310 nm, vorzugsweise 280 nm, oder
Tryptophan durch UV-Licht im Bereich von 295 nm.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, dass die Zellen (4) oder Zelllinien gentechnisch so modifiziert werden, dass sie neben dem therapeutischen oder
diagnostischen Zielprotein (7) ein fluoreszentes Indikatorprotein (14), insbesondere GFP, BFP oder YFP, sezernieren und dessen Fluoreszenz (15) quantitativ bestimmt wird.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, dass die Oberfläche (10) des Messchips (20) vor der Messung mit einer kovalenten oder nichtkovalenten Beschichtung versehen wird, vorzugsweise poly-Lysin oder N-Hydroxysuccinimidester, um eine Bindung der Zellen (4) an die Oberfläche (10) des Messchips (20) und damit eine bessere Abdichtung der Messkammern (1 ) zu erreichen.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, dass die Messkammern (1 ) des Messchips (20) mit Linkermolekülen und/oder Molekülen eines biochemischen
Nachweissystems beschichtet werden, so dass sezernierte Proteine (7) gebunden und/oder detektiert werden können.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, dass die selektierten, hoch-produzierenden Zellen (4) auf mehrere Messchips (20) mit jeweils unterschiedlichen Kulturbedingungen gegeben werden, um so diejenigen Kulturbedingungen zu ermitteln, bei denen eine möglichst hohe Produktionsrate erreicht wird, vorzugsweise durch Variation der Art, Konzentration und/oder Zusammensetzung von Zusätzen im Nährmedium (9), wie beispielsweise pH, CO2, Zuckern oder Aminosäuren.
1 1 .Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, dass die Produktionsrate von Zellen (4) von Vorkulturen für Fermenterläufe bestimmt wird, um bei schlechter Produktionsrate die Kosten für einen Fermenterlauf zu sparen.
12. Polycistronischer Expressionsvektor (15) zur Durchführung des Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend
a) eine Basensequenz für ein Zielprotein,
b) eine Basensequenz für ein fluoreszentes Indikatorprotein, insbesondere GFP, BFP oder YFP,
c) eine Basensequenz, die bewirkt, dass die Basensequenzen des
Zielproteins und des Indikatorproteins auf eine gemeinsame mRNA transkribiert und so beide Proteine in gleichem Verhältnis exprimiert werden, und
d) eine Basensequenz, die die Sekretion des Zielproteins und des fluoreszierenden Indikatorproteins bewirkt.
PCT/DE2011/075156 2010-07-12 2011-07-05 Verfahren zur gewinnung von hoch-produzierenden zelllinien WO2012025110A1 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102010036344.8 2010-07-12
DE102010036344 2010-07-12

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2012025110A1 true WO2012025110A1 (de) 2012-03-01

Family

ID=44280649

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/DE2011/075041 WO2012006995A1 (de) 2010-07-12 2011-03-10 Mikrostrukturierter messchip zur optischen messung von eigenschaften künstlicher oder biologischer membranen und verfahren zu dessen herstellung
PCT/DE2011/075156 WO2012025110A1 (de) 2010-07-12 2011-07-05 Verfahren zur gewinnung von hoch-produzierenden zelllinien

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/DE2011/075041 WO2012006995A1 (de) 2010-07-12 2011-03-10 Mikrostrukturierter messchip zur optischen messung von eigenschaften künstlicher oder biologischer membranen und verfahren zu dessen herstellung

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20140134711A1 (de)
EP (1) EP2593772A1 (de)
JP (1) JP2013540986A (de)
DE (1) DE102011051723A1 (de)
WO (2) WO2012006995A1 (de)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015194442A (ja) * 2014-03-31 2015-11-05 株式会社ニコン 支持装置
CN107709223B (zh) * 2015-06-08 2020-11-03 国立研究开发法人科学技术振兴机构 高密度微腔阵列以及使用了该高密度微腔阵列的测定方法
DE102020100244A1 (de) 2020-01-08 2021-07-08 X-FAB Global Services GmbH Verfahren zur Herstellung eines Membran-Bauelements und ein Membran-Bauelement

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10200541A1 (de) * 2002-01-09 2003-07-24 Zeiss Carl Jena Gmbh Mikrotiterplatte
US20040148647A1 (en) * 2002-11-29 2004-07-29 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg Expression vector, methods for the production of heterologous gene products and for the selection of recombinant cells producing high levels of such products
US20050054028A1 (en) * 2003-09-10 2005-03-10 Thermogenic Imaging Method and device for measuring multiple physiological properties of cells

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0131957Y2 (de) * 1980-03-28 1989-10-02
JPS6117651U (ja) * 1984-07-07 1986-02-01 株式会社 堀場製作所 ガス分析計
CA2348493C (en) * 1998-10-28 2010-08-24 Ashby Scientific Limited Textured and porous silicone rubber
US6917726B2 (en) 2001-09-27 2005-07-12 Cornell Research Foundation, Inc. Zero-mode clad waveguides for performing spectroscopy with confined effective observation volumes
US20040058385A1 (en) * 2000-11-17 2004-03-25 Abel Andreas Peter Kit and method for determining multiple analytes, with provisions for refrencing the density of immobilised recognition elements
JP2003075440A (ja) * 2001-06-19 2003-03-12 Fuji Photo Film Co Ltd 生化学解析用ユニット
US7335153B2 (en) * 2001-12-28 2008-02-26 Bio Array Solutions Ltd. Arrays of microparticles and methods of preparation thereof
US20060275182A1 (en) * 2002-05-24 2006-12-07 Hudson Gordon S Fluorescence validation microplate and method of use
JP2003344276A (ja) * 2002-05-30 2003-12-03 Fuji Photo Film Co Ltd 測定装置
US7422911B2 (en) * 2002-10-31 2008-09-09 Agilent Technologies, Inc. Composite flexible array substrate having flexible support
US20050266582A1 (en) * 2002-12-16 2005-12-01 Modlin Douglas N Microfluidic system with integrated permeable membrane
WO2008103339A2 (en) * 2007-02-22 2008-08-28 Corning Incorporated Substrates useful for cell culture and methods for making and using same
DE102007016699A1 (de) * 2007-04-04 2008-10-09 Synentec Gmbh Biochip für die Fluoreszenzanalyse von einzelnen Transportern
JP5349016B2 (ja) * 2008-11-20 2013-11-20 日本電信電話株式会社 膜タンパク質機能測定基板及び膜タンパク質機能測定方法
US20110011157A1 (en) * 2009-07-16 2011-01-20 Bertrand Bourlon Gas chromatograph column with carbon nanotube-bearing channel

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10200541A1 (de) * 2002-01-09 2003-07-24 Zeiss Carl Jena Gmbh Mikrotiterplatte
US20040148647A1 (en) * 2002-11-29 2004-07-29 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg Expression vector, methods for the production of heterologous gene products and for the selection of recombinant cells producing high levels of such products
US20050054028A1 (en) * 2003-09-10 2005-03-10 Thermogenic Imaging Method and device for measuring multiple physiological properties of cells

Non-Patent Citations (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AI-RUBEAI, M., EMERY, A. N.: "Flow cytometry in animal culture", NAT. BIOTECHNOL., vol. 11, 1993, pages 572 - 579, XP002116068, DOI: doi:10.1038/nbt0593-572
AL-RUBEAI M ET AL: "Flow cytometry in animal cell culture", BIO/TECHNOLOGY, NATURE PUBLISHING CO. NEW YORK, US, vol. 11, 1 May 1993 (1993-05-01), pages 572 - 579, XP002116068, ISSN: 0733-222X, DOI: 10.1038/NBT0593-572 *
BARNES, L. M. ET AL.: "Characterization of the stability of recombinant protein production in the GS-NSO expression system", BIOTECHNOL. BIOENG., vol. 73, 2001, pages 261 - 270, XP001152689, DOI: doi:10.1002/bit.1059
BARNES, L. M. ET AL.: "Phenotypic variation during cloning procedures: analysis of the growth behaviour of clonal cell lines", BIOTECHNOL. BIOENG., vol. 94, 2006, pages 530 - 537
BUTLER, M.: "Animal cell cultures: recent achievements and perspectives in the production of biopharmaceuticals", APPL. MICORBIOL. BIOTECHNOL., vol. 68, 2005, pages 283 - 291
GERNGROSS, T. U.: "Advances in the production of human therapeutic proteins in yeasts and filamentous fungi", NAT. BIOTECHNOL., vol. 22, 2004, pages 1409 - 1414, XP002377616
HAMMILL, L. ET AL.: "The gel microdrop secretion assay: identification of a low productivity of human antibody in CHO cells", CYTOTECHNOL., vol. 34, 2000, pages 27 - 37
KIM, N. S.: "Key determinants in the occurrence of clonal variation in humanized antibody expressin of CHO cells during dihydrofolate reductase mediated gene amplification", BIOTECHNOL. PROG., vol. 17, 2001, pages 69 - 75, XP002273808, DOI: doi:10.1021/bp000144h
KOLLER, M. R. ET AL.: "High-throughput laser-mediated in situ cell purification for rapid cloning of highly-secreting producers", BIOTECHNOL. BIOENG., vol. 91, 2004, pages 872 - 876
KROMENAKER, S.J., SCIEND, F.: "Stability of producer hybridoma cell lines after cell sorting: a case study", BIOTECHNOL. PROG., vol. 10, 1994, pages 299 - 307, XP002350921, DOI: doi:10.1021/bp00027a010
LEE, C. ET AL.: "High-throughput screening of cell lines expressing monoclonal antibodies", BIOPROC INT., vol. 4, no. 3, 2006, pages 32 - 35, XP009139314
MANZ, R. ET AL.: "Analysis and sorting of live cells according to secreted molecules, relocated to a cell-surface affinity matrix", PROC. NATL. ACAD. SCI. U. S. A., vol. 92, 1995, pages 1921 - 1925, XP002007404, DOI: doi:10.1073/pnas.92.6.1921
PUCK, T. T., MARCUS, P. I.: "A rapid method for viable cell titration and clone production with HeLa cells in tissue culture: the use of x-irradiated cells to supply conditioning factors", PROC. NATL. ACAD. SCI.U.S.A., vol. 41, 1955, pages 432 - 43
WALSH, G.: "Biopharmaceutical benchmarks", NAT. BIOTECHNOL., vol. 24, 2006, pages 769 - 776
WURM, F. M.: "Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells", NAT. BIOTECHNOL., vol. 22, 2005, pages 1393 - 1398

Also Published As

Publication number Publication date
US20140134711A1 (en) 2014-05-15
DE102011051723A1 (de) 2012-03-01
EP2593772A1 (de) 2013-05-22
JP2013540986A (ja) 2013-11-07
WO2012006995A1 (de) 2012-01-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69717856T2 (de) Methoden und zusammensetzungen zur empfindlichen und schnellen funktionellen identifizierung genomischer polynukleotide und ihre anwendung in zelltests zum auffinden von medikamenten
US20200156071A1 (en) Devices and methods for cellular secretion analysis
EP1295105A1 (de) Verfahren zur selektion von partikeln
DE102007016699A1 (de) Biochip für die Fluoreszenzanalyse von einzelnen Transportern
WO2012025110A1 (de) Verfahren zur gewinnung von hoch-produzierenden zelllinien
Peter et al. Transgenic mouse models enabling photolabeling of individual neurons in vivo
EP3615680B1 (de) Verfahren und vorrichtung zur bereitstellung einer eine gewünschte zielprotein-expression aufweisenden zelllinie
DE102014106916A1 (de) Vorrichtung zur automatisierten Bestimmung von mindestens zwei unterschiedlichen Prozessparametern
DE602004007429T2 (de) Verfahren zur Zellselektion
EP1007968B1 (de) Verfahren und kit zur identifizierung von wechselwirkungen zwischen proteinen bzw. peptiden
Jontes et al. Fluorescence imaging of transgenic zebrafish embryos
WO2009071065A2 (de) Vorrichtung zur messung von transportsystemen
WO2018234257A1 (de) Verfahren zur verifizierung des erfolgs von einzelzellaussaaten in nanowellarrays sowie vorrichtung und nanowellarray
DE60110598T2 (de) Quantitatives fluoreszenz-bestimmungsverfahren für transportproteinenaktivität
DE10062302A1 (de) Sekretionssignalpeptide, deren DNA-Sequenzen, damit herstellbare Expressionsvektoren für eukaryotische Zellen und deren Verwendung zur biotechnologischen Herstellung von Proteinen
EP1311851B1 (de) Screeningverfahren zur findung von die endocytose fördernden hilfsstoffen
DE102018216872A1 (de) Analyseverfahren für mRNA einzeln lichtbestrahlter Zellen
DE4410882A1 (de) Verfahren zur permanenten Expression von Glutamatrezeptoren
EP1527344A2 (de) Verfahren und kit zur durchf hrung funktioneller tests an biologischen zellen, die an ein array von fängermolekülen immobilisiert werden
EP3706560A1 (de) Transgenes insekt und dessen verwendung in verfahren zur testung von natürlichen oder synthetischen substanzen
DE102020129009A1 (de) Nachweis von umwelteinflüssen mittels biolumineszenz
DE10105711A1 (de) Probenträger für chemische und biologische Proben
DE102016121808A1 (de) Verfahren zur Bestimmung der Zellviabilität
Dubuis et al. Quantifying the Bicoid morphogen gradient in living fly embryos
WO2002081675A2 (de) Nachweisverfahren für homologe rekombinationsereignisse

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 11770326

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

32PN Ep: public notification in the ep bulletin as address of the adressee cannot be established

Free format text: NOTING OF LOSS OF RIGHTS PURSUANT TO RULE 112(1) EPC (EPO FORM 1205A DATED 21.03.2013)

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1120111042558

Country of ref document: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 11770326

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1