DE60110598T2

DE60110598T2 - Quantitatives fluoreszenz-bestimmungsverfahren für transportproteinenaktivität

Info

Publication number: DE60110598T2
Application number: DE60110598T
Authority: DE
Inventors: Lászlη HOMOLYA; Balázs SARKADI; Raymond Evers
Original assignee: Solvo Biotechnologial Zrt
Current assignee: Solvo Biotechnologial Zrt
Priority date: 2000-07-03
Filing date: 2001-07-03
Publication date: 2006-01-19
Anticipated expiration: 2021-07-04
Also published as: AU7656901A; HU0002557D0; HUP0002557A3; EP1299723B1; WO2002003066A3; EP1299723A2; CA2417556C; AU2001276569B2; US7122329B2; DE60110598D1; US20040033508A1; JP2004502433A; HUP0002557A2; ATE294958T1; CA2417556A1; WO2002003066A2

Description

Die Erfindung betrifft ein einfaches quantitatives Fluoreszenzassayverfahren zur Bestimmung der Aktivität von Transportproteinen von Interesse, insbesondere von Multi-Wirkstoffresistenz-assoziierten Proteinen (multi-drug resistance associated proteins, MRPs).
Das Verfahren der Erfindung wird mit einer gut versiegelten (sealed) Kultur polarisierter Zellen durchgeführt, die ein Transportprotein von Interesse exprimieren, die auf einem permeablen Träger bis zur Konfluenz angezogen werden, wobei die konfluente Zellkultur deutlich getrennte apikale und basolaterale Kompartimente ausbildet. Die Zellen werden in einem Kompartiment mit einem zellpermeablen nicht-fluoreszierenden Derivat einer fluoreszierenden Verbindung (z.B. Calcein AM) in Kontakt gebracht, und nach einer bestimmten Inkubationsperiode zeigt die in einer Probe, welche dem gegenüberliegenden Kompartiment entnommen wurde, detektierte Fluoreszenzintensität die Aktivität des Transportproteins von Interesse an, das in den Zellen exprimiert wird.
Die Erfindung betrifft ferner Verfahren zur qualitativen und quantitativen Bestimmungen von Inhibitoren und Aktivatoren der Transportproteine von Interesse und Verfahren zur Beurteilung der basolateralen und/oder apikalen Lokalisation von plasmamembran-gebundenen Transportproteinen von Interesse in polarisierten Zellen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Multi-Wirkstoffresistenzproteine (multi-drug resistance proteins, MDRs) und Multi-Wirkstoffresistenz- assoziierten Proteine MRP1 und MRP2 sind Mitglieder der ABC-Transporter Superfamilie und können in malignen Tumoren multiple Wirkstoffresistenz erzeugen. Bislang wurden mindestens sechs MRP-ähnliche Proteine identifiziert. Die physiologische Rolle dieser Proteine kann von der Elimination toxischer Agenzien bis zu diversen sekretorischen Funktionen reichen, vorzugsweise in epithelialen Zellen. MRP1 wird in verschiedenen Geweben verbreitet exprimiert, während MRP2 vorzugsweise in Hepatozyten und epithelialen Zellen proximaler Nierentubuli (renal proximal tubules) exprimiert wird. Die Identifikation neuer Verbindungen, welche solche Transportproteine effektiv hemmen, ist daher von hohem Interesse beim Versuch, effektivere chemotherapeutische Behandlungsverfahren für einen wirkstoffresistenten Typ maligner Fehlfunktionen zu entwickeln. Die Identifikation von Aktivatoren dieser Transportproteine könnte ebenfalls in weiteren Anwendungen von Interesse sein, bei denen die Erhöhung ihrer Aktivität bei der Eliminierung einiger unerwünschter physiologischer Zustände helfen könnte.
Es wurde früher gezeigt, dass MRP1 negativ geladene fluoreszierende Verbindungen, wie z.B. die freie Säure von Calcein, aus den Zellen verdrängt [Feller er al. FEBS Lett. 368, 358–388 (1995); Holló et al. FEBS Lett. 383, 99–104 (1996)]. Wir haben vor kurzem gefunden, dass dieser Farbstoff von MRP2 ebenfalls schnell aus den Zellen ausgestoßen wird. Es ist ferner möglich, dass auch andere Mitglieder dieser Proteinfamilie diese Verbindung transportieren. In polarisierten Zellen ist die Verteilung dieser Proteine nicht homogen. Die Expression von MRP1 ist auf die basolaterale Oberfläche beschränkt, während MRP2 ausschließlich in der apikalen Membran exprimiert wird.
Dieses Merkmal ermöglicht die Beurteilung der Funktion dieser und anderer ähnlicher Proteine in einem so genannten vektoriellen Transportassay, der mit konfluenten Kulturen polarisierter Zellen durchgeführt wird, die auf einem permeablen festen Träger (z.B. auf porösen Membranen) angezogen werden. Obwohl der bislang beschriebene vektorielle Transportassay [Evers, R. et al. J. Clin. Invest. 97, 1211–1218 (1996)] geeignet ist, um die Lokalisation und Aktivität von Transportproteinen wie MRP1 und MRP2 experimentell zu untersuchen, leidet er an dem schwerwiegenden Nachteil der ausschließlichen Verwendung radioaktiv markierter Substrate zur Detektion, die natürlich die Anwendung einer besonderen Laborsicherheitsausrüstung und besonderer Vorschriften erfordern. Ein weiterer Nachteil des zuvor beschriebenen vektoriellen Transportassays besteht darin, dass bestimmte markierte Substrate, die zur Beurteilung der Aktivität der intrazellulären Transportproteine von Interesse verwendet werden, in der Lage sein könnten, die engen Kontaktverbindungen zwischen den Zellen (tight junctions contacting the cells) der verwendeten konfluenten Kultur zu passieren, und dadurch in das gegenüberliegende Kompartiment gelangen könnten, ohne transportiert zu werden, was es sehr schwierig macht, einen geeigneten quantitativen Assay zur exakten Bestimmung der Aktivität der Transportproteine von Interesse zu entwickeln.
Es ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung, einfache qualitative und quantitative vektorielle Transportassayverfahren bereitzustellen, die signifikant einfacher durchzuführen und zu automatisieren sind als die zuvor beschriebenen, und die weiterhin quantitativ gemacht werden können, indem nur der transzelluläre Export dedektiert wird (und nicht der Transport, der möglicherweise durch die engen Verbindungen (tight junctions) der polarisierten Kultur geht, und dadurch die Aufnahme und die Exkretion durch die Zellen vermeidet). Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Assayverfahren zur Identifikation von Inhibitoren und Aktivatoren der Transportproteine von Interesse und weiterhin von Assayverfahren für die schnelle und einfache Beurteilung der Lokalisation der Transportproteine von Interesse in der basolateralen und/oder apikalen Plasmamembran.
Calcein ist eine bekannte fluoreszierende Substanz (vermarktet von Molecular Probes, Inc., USA), und das nicht-fluoreszierende Acetoxymethylesterderivat dieser Verbindung (Calcein AM) ist bekanntermaßen aufgrund seines hydrophoben Charakters zellpermeabel. Wir haben bislang verschiedene Assayformate unter Verwendung von Calcein AM für die Beurteilung der Aktivität von MDR1 und anderer Transportproteine entwickelt, welche Calcein AM aus Zellen verdrängen können, Calcein selbst aber nicht verdrängen können (U.S. Patent Nr. 5,872,014; Europäisches Patent Nr. 0,784,699). Wir haben nun erkannt, dass Calcein und Calcein AM (und andere Verbindungen ähnlicher Charakteristik) ebenfalls verwendet werden können, um Assayverfahren für die Beurteilung der Aktivität von MRP1, MRP2 und ähnlicher Transportproteine auszuarbeiten, welche Calcein effektiv aus den Zellen verdrängen können.
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Das Verfahren der Erfindung wird mit einer gut versiegelten Kultur polarisierter Zellen durchgeführt, die ein Transportprotein von Interesse exprimieren, und die bis zur Konfluenz (wobei sich enge Verbindungen (tight junctions) ausgebildet haben) auf permeablen Trägern (z.B. auf porösen Membranen oder Kollagenmatrizen) angezogen wurden, und die dabei deutlich getrennte apikale und basolaterale Kompartimente ausbilden. Die Zellkultur wird mit einem zellpermeablen nicht-fluoreszierenden Derviat einer fluoreszierenden Verbindung (z.B. Calcein AM) in einem Kompartiment in Kontakt gebracht, wobei das Derivat im Anschluss von den Zellen aufgenommen und in den Zellen gespalten wird, um eine fluoreszierende Verbindung (z.B. Calcein) zu erzeugen, wobei die fluoreszierende Verbindung ein Substrat des membrangebundenen Transportproteins von Interesse ist. Die in einer Probe, welche dem gegenüberliegenden Kompartiment entnommen wurde, dedektierte Fluoreszenzintensität zeigt im Anschluss die tatsächliche Aktivität des membrangebundenen Transportproteins von Interesse an, das die fluoreszierende Verbindung aus den Zellen exkretiert (siehe 1). Es können Kontrollexperimente mit ähnlichen Kulturen durchgeführt werden, welche keine MRPs exprimieren. Die Erfindung betrifft ferner Verfahren für die qualitative und quantitative Bestimmung der Lokalisation von Tnhibitoren und/oder Aktivatoren von Transportproteinen von Interesse. Um die Interaktion zwischen bestimmten Verbindungen und Transportproteinen von Interesse zu bestimmen, wird das Verfahren der Erfindung in der Gegenwart der zu untersuchenden Verbindung durchgeführt. Die untersuchte Verbindung kann in Abhängigkeit von der zu beantwortenden Frage entweder auf der apikalen oder der basolateralen oder auf beiden Seiten der Zellkultur zugegeben werden.
Die vorliegende Erfindung stellt daher ein Verfahren zur Bestimmung der Aktivität und/oder der Quantität eines Transportproteins von Interesse bereit, welches entweder an der basolateralen oder an der apikalen Plasmamembran polarisierte Zellen lokalisiert ist, das die Schritte umfasst

(a) Bereitstellen einer gut versiegelten konfluenten Kultur polarisierter Zellen, von denen vermutet wird, dass sie das Transportprotein von Interesse exprimieren, wobei die Bildung enger Verbindungen zwischen den Zellen der Kultur gewährleitstet wird, und die auf einem permeablen Träger angezogen werden, wodurch getrennte basolaterale und apikale Kompartimente auf den gegenüberliegenden Seiten der konfluenten Zellkultur gebildet werden;
(b) Zugeben eines zellpermeablen nicht-fluoreszierenden Derivats einer fluoreszierenden Verbindung in eines der Kompartimente, das der Plasmamembran der polarisierten Zellen gegenüberliegt, an der das Transportprotein von Interesse lokalisiert ist, wobei das Derivat durch intrazelluläre Enzyme spaltbar ist, um eine fluoreszierende Verbindung zu bilden, die ein Substrat des Transportproteins von Interesse ist;
(c) Inkubieren der Zellen in der Gegenwart des nicht-fluoreszierenden Derviats;
(d) Messen der Fluoreszenzintensität einer Probe, die dem Kompartiment entnommen wurde, das gegenüber demjenigen liegt, zu dem das nicht-fluoreszierende Derivat gegeben wurde, wobei die Intensität die Gegenwart und Aktivität des Transportproteins von Interesse anzeigt; und optional
(e) Berechnen des Ausmaßes der Aktivität und/oder Quantität des Transportproteins von Interesse, das in den Zellen vorliegt, auf Basis des in Schritt (d) gemessenen Werts der Fluoreszenzintensität und von Kalibrierungskurven und/oder empirischen Korrelationen, die zuvor etabliert wurden.

Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Bestimmung der Fähigkeit einer Testverbindung von Interesse bereit, die Aktivität eines Transportproteins von Interesse zu hemmen oder zu fördern, das entweder an der basolateralen oder an der apikalen Plasmamembran polarisierter Zellen lokalisiert ist, das die Schritte umfasst:

(a) Bereitstellen einer gut versiegelten konfluenten Kultur polarisierter Zellen, welche das Transportprotein von Interesse exprimieren, und die auf einem permeablen Träger angezogen werden, wobei die Bildung enger Verbindungen zwischen den Zellen der Kultur gewährleistet wird, wodurch separate basolaterale und apikale Kompartimente auf den gegenüberliegenden Seiten der konfluenten Zellkultur gebildet werden;
(b) Zugeben eines zellpermeablen nicht-fluoreszierenden Derivats einer fluoreszierenden Verbindung in eines der Kompartimente, das der Plasmamembran der polarisierten Zellen gegenüberliegt, an der das Transportprotein von Interesse lokalisiert ist, wobei das Derivat durch intrazelluläre Enzyme spaltbar ist, um eine fluoreszierende Verbindung zu bilden, die ein Substrat des Transportproteins von Interesse ist;
(c) Inkubieren der Zellen in der Gegenwart des nicht-fluoreszierenden Derivats;
(d) Messen der Fluoreszenzintensität einer Probe, die dem Kompartiment entnommen wurde, das demjenigen gegenüberliegt, in welches das nicht-fluoreszierende Derivat gegeben wurde, wobei die Intensität die Gegenwart und Aktivität des Transportproteins von Interesse anzeigt, und optional Berechnen des Ausmaßes der Aktivität des Transportproteins von Interesse, das in den Zellen vorliegt, auf Basis des in Schritt (d) gemessenen Werts der Fluoreszenzintensität und Kalibrierungskurven und/oder empirischen Korrelationen, die zuvor etabliert wurden;
(e) Wiederholen der Schritte (b) bis (d) unter Verwendung der gleichen polarisierten Zellkultur, die in Schritt (a) bereitgestellt wurde, oder einer damit im Wesentlichen identischen polarisierten Zellkultur, während sicher gestellt wird, dass die Testverbindung von Interesse oder jedweder Metabolit von Interesse, der aus der Testverbindung von Interesse erzeugt wird, innerhalb der Zellen während des wiederholt ausgeführten Schritts (c) mit dem Transportprotein von Interesse in Kontakt gebracht wird; und
(f) Vergleichen der Werte der Fluoreszenzintensität, die in Schritt (d) und im wiederholt ausgeführten Schritt (d) gemessen wurden, und/oder Vergleichen der Aktivitätswerte, die in Schritt (d) und im wiederholt ausgeführten Schritt (d) gemessen wurden und Bestimmen, ob die Testverbindung von Interesse die Aktivität des Transportproteins von Interesse hemmt oder fördert.

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Beurteilung der basolateralen und/oder apikalen Lokalisation eines plasmamembran-gebundenen Transportproteins von Interesse in polarisierten Zellen, das die Schritte umfasst:

(a) Bereitstellen einer gut versiegelten konfluenten Kultur polarisierter Zellen, die das Transportprotein von Interesse exprimieren, und die auf einem permeablen Träger angezogen werden, wobei die Ausbildung enger Verbindungen zwischen den Zellen der Kultur gewährleistet wird, wodurch separate basolaterale und apikale Kompartimente auf den gegenüberliegenden Seiten der konfluenten Zellkultur gebildet werden;
(b) Zugeben eines zellpermeablen nicht-fluoreszierenden Derivats einer fluoreszierenden Verbindung sowohl in das apikale als auch das basolaterale Kompartiment, wobei das Derivat durch intrazelluläre Enzyme spaltbar ist, um eine fluoreszierende Verbindung zu bilden, die ein Substrat des Transportproteins von Interesse ist;
(c) Inkubieren der Zellen in der Gegenwart des nicht-fluoreszierenden Derivats;
(d) Messen der Fluoreszenzintensität von Proben, die aus beiden Kompartimenten entnommen wurden;
(e) Vergleichen der Werte der Fluoreszenzintensität, die in den verschiedenen Kompartimenten gemessen wurden, wobei der Vergleich die apikale und/oder basolaterale Lokalisation des Transportproteins von Interesse anzeigt; und optional
(f) Berechnen des Prozentanteils der apikalen und/oder basolateralen Lokalisation des Transportproteins von Interesse, das in den Zellen vorliegt, auf Basis der in Schritt (d) gemessenen Werte der Fluoreszenzintensität und von Kalibrierungskurven und/oder empirischen Korrelationen, die zuvor etabliert wurden.

Die in dem Verfahren der Erfindung verwendete fluoreszierende Verbindung ist vorzugsweise Calcein, und das nicht-fluoreszierende Derivat der fluoreszierenden Verbindung ist ein zellpermeables nicht-fluoreszierendes Derivat von Calcein, bevorzugt Calcein AM.
Das Verfahren der Erfindung wird vorzugsweise mit polarisierten Nierenzellen durchgeführt, noch bevorzugter mit MDCK II Zellen, wobei die Inkubation bei etwa 37°C für etwa 30 Minuten erfolgt.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt schematisch den Assay zur Transportmessung gemäß der Erfindung (Abkürzungen: C: fluoreszierende Verbindung; C-AM: nicht-fluoreszierendes Derivat von C).
2 zeigt den inhibitorischen Effekt von zwei MRP2 Substraten auf dem vektoriellen transzellulären Calceintransport, bestimmt mit Hilfe des Assays der Erfindung.
3 zeigt den Export von Calcein durch MDCK II Zellmonohayer. Calcein AM wurde sowohl zum apikalen als auch zum basolateralen Medium gegeben, und die im Medium auftretende Menge an Calcein wurde gemessen. Proben wurden nach einer und nach zwei Stunden entnommen. Quadrate: Export zum apikalen Kompartiment. Kreise: Export zum basolateralen Kompartiment.
Mehrere vorteilhafte Ausführungsformen der Erfindung werden in den nachfolgenden experimentellen Beispielen dargestellt, die als nicht einschränkend hinsichtlich des Schutzumfangs der Erfindung zu verstehen sind, der wiederum durch die beigefügten Ansprüche definiert ist.
Beispiel 1
Inhibitorischer Effekt von MRP2 Substraten auf den vektoriellen Calceintransport
Polarisierte Hundenierenzellen (MDCK II) und eine davon abgeleitete Zelllinie, welche stabil das humane MRP2 exprimiert, wurden auf Traswell-Col Membranträger (4 μm Porengröße) ausgesät, und die Kulturen wurden sieben Tage in D-MEM Medium kultiviert, das 10% FBS und Antibiotika enthielt. Nach dem Waschen der Kulturen wurden 200 μl bzw. 400 μl Ringer's Puffer zu dem oberen bzw. unteren Kompartiment gegeben. Die Zellen wurden bilateral 5 Minuten mit den untersuchten Wirkstoffen präinkubiert, wie angegeben. Die Zellen wurden im Anschluss für 30 Minuten bei 37°C mit 5 μM Calcein AM auf der basolateralen Seite (untere Kammer) inkubiert. Dem apikalen Kompartiment (obere Kammer) wurde eine 100 μl Probe entnommen, und deren Fluoreszenz wurde bestimmt. In 2 zeigen die linken Säulen die Ergebnisse mit den parentalen Zellen, während die rechten Säulen die mit dem MRP2-exprimierenden Zellen erhaltenen Ergebnisse darstellen. Ausgefüllte Balken stellen die Fluoreszenz in willkürlichen Einheiten dar, die bei Fehlen jedweden Wirkstoffes gemessen wurde, offene und graue Balken zeigen die in Gegenwart von 25 μM Benzbromaron bzw. 1 mM Probenizid erhaltenen Ergebnisse.
Beispiel 2
Export von Kalzein durch MDCK II-Zellmonolär
Polarisierte Zellen wurden auf mikroporösen Polykarbonatfiltern (3 μm Porengröße, 24.5 mm Durchmesser) ausgesät und 3 Tage mit täglichem Mediumwechsel kultiviert. Das Experiment wurde durch Ersetzen des Mediums entweder an der apikalen oder an der basalen Seite der Zellschicht gestartet. Der Export von Calcein wurde durch Inkubieren der Monolayer in HBSS mit Calcein AM (1 μM) bei Raumtemperatur bestimmt. Proben (200 μl) aus jedem Kompartiment wurden zu den angegebenen Zeitpunkten entnommen. 800 μl HBSS wurde zugegeben, und die Fluoreszenz wurde bestimmt. Die Menge an exportiertem Calcein wurde mit Hilfe einer Kalibrierungskurve berechnet, die mit freiem Calcein erzeugt wurde. Die Ergebnisse sind in 3 dargestellt.
Wie oben mit Hilfe vorteilhafter Ausführungsformen der Erfindung gezeigt, sind die Verfahren der Erfindung geeignet für die einfache qualitative und quantitative Beurteilung der Aktivität MRP-ähnlicher Transportproteine von Interesse, für die Identifizierung von Inhibitoren und Aktivatoren dieser Transportproteine und für die schnelle und einfache Beurteilung der Lokalisation solcher Proteine an der basolateralen und/oder apikalen Plasmamembran. Fachleute werden erkennen, dass zahlreiche Variationen und Modifikationen der beschriebenen Verfahren der Erfindung durch Anwendung alternativer Lösungen ausgearbeitet werden können, welche äquivalent zu den hier beschriebenen sind. Solche Variationen und Modifikationen weichen jedoch nicht von der ursprünglichen Erfindung ab und verbleiben daher innerhalb des ursprünglichen Schutzbereichs der Erfindung, der durch die beigefügten Ansprüche definiert ist.

Claims

Verfahren zur Bestimmung der Aktivität und/oder Quantität eines Transportproteins von Interesse, das entweder an der basolateralen oder an der apikalen Plasmamembran polarisierter Zellen lokalisiert ist, das die Schritte umfasst: (a) Bereitstellen einer gut versiegelten konfluenten Kultur polarisierter Zellen, von denen vermutet wird, dass sie das Transportprotein von Interesse exprimieren, und die auf einem permeablen Träger angezogen werden, wobei die Bildung enger Verbindungen zwischen den Zellen der Kultur gewährleistet wird, wodurch separate basolaterale und apikale Kompartimente auf den gegenüberliegenden Seiten der konfluenten Zellkultur gebildet werden; (b) Zugeben eines zellpermeablen nicht-fluoreszierenden Derivats einer fluoreszierenden Verbindung in eines der Kompartimente, das der Plasmamembran der polarisierten Zellen gegenüberliegt, an der das Transportprotein von Interesse lokalisiert ist, wobei das Derivat durch intrazelluläre Enzyme spaltbar ist, um eine fluoreszierende Verbindung zu bilden, die ein Substrat des Transportproteins von Interesse ist; (c) Inkubieren der Zellen in der Gegenwart des nicht-fluoreszierenden Derivats; (d) Messen der Fluoreszenzintensität einer Probe, die dem Kompartiment entnommen wurde, das gegenüber demjenigen liegt, zu dem das nicht-fluoreszierende Derivat gegeben wurde, wobei die Intensität die Gegenwart und Aktivität des Transportproteins von Interesse anzeigt; und optional (e) Berechnen des Ausmaßes der Aktivität und/oder Quantität des Transportproteins von Interesse, das in den Zellen vorliegt, auf Basis des Werts der Fluoreszenzintensität, der in Schritt (d) gemessen wurde, und von Kalibrierungskurven und/oder empirischen Korrelationen, die zuvor etabliert wurden.
Verfahren zur Bestimmung der Fähigkeit einer Testverbindung von Interesse, die Aktivität eines Transportproteins von Interesse zu inhibieren oder zu fördern, das entweder an basolateralen oder an der apikalen Plasmamembran polarisierter Zellen lokalisiert ist, das die Schritte umfasst: (a) Bereitstellen einer gut versiegelten konfluenten Kultur polarisierter Zellen, die das Transportprotein von Interesse exprimieren, und die auf einem permeablen Träger angezogen werden, wobei die Bildung enger Verbindungen zwischen den Zellen der Kultur gewährleistet wird, wodurch getrennte basolaterale und apikale Kompartimente auf den gegenüberliegenden Seiten der konfluenten Zellkultur gebildet werden; (b) Zugeben eines zellpermeablen nicht-fluoreszierenden Derivats einer fluoreszierenden Verbindung in eines der Kompartimente, das der Plasmamembran der polarisierten Zellen gegenüberliegt, an der das Transportprotein von Interesse lokalisiert ist, wobei das Derivat durch intrazelluläre Enzyme spaltbar ist, um eine fluoreszierende Verbindung zu bilden, die ein Substrat des Transportproteins von Interesse ist; (c) Inkubieren der Zellen in der Gegenwart des nicht-fluoreszierenden Derivats; (d) Messen der Fluoreszenzintensität einer Probe, die dem Kompartiment entnommen wurde, das gegenüber demjenigen liegt, zu dem das nicht-fluoreszierende Derivat gegeben wurde, wobei die Intensität die Gegenwart und Aktivität des Transportproteins von Interesse anzeigt, und optional Berechnen des Ausmaßes der Aktivität des Transportproteins von Interesse, das in den Zellen vorliegt, auf der Basis des gemessenen Werts der Fluoreszenzintensität und von Kalibrierungskurven und/oder empirischen Korrelationen, die zuvor etabliert wurden; (e) Wiederholen der Schritte (b) bis (d) unter Verwendung der gleichen polarisierten Zellkultur, die in Schritt (a) bereitgestellt wurde, oder einer mit dieser im Wesentlichen identischen polarisierten Zellkultur, während sichergestellt wird, dass die Testverbindung von Interesse oder jedweder Metabolit von Interesse, der aus der Testverbindung von Interesse erzeugt wurde, innerhalb der Zellen während des wiederholt ausgeführten Schritts (c) mit dem Transportprotein von Interesse in Kontakt gebracht wird; und (f) Vergleichen der Werte der Fluoreszenzintensität, die in Schritt (d) und im wiederholt ausgeführten Schritt (d) gemessen wurden, und/oder Vergleichen der Aktivitätswerte, die optional in Schritt (d) und im wiederholt ausgeführten Schritt (d) berechnet wurden, und Bestimmen, ob die Testverbindung von Interesse die Aktivität des Transportproteins von Interesse hemmt oder fördert.
Verfahren zur Beurteilung der basolateralen und/oder apikalen Lokalisation eines plasmamembran-gebundenen Transportproteins von Interesse in polarisierten Zellen, das die Schritte umfasst: (a) Bereitstellen einer gut versiegelten konfluenten Kultur polarisierter Zellen, die das Transportprotein von Interesse exprimieren, und die auf einem permeablen Träger angezogen werden, wobei die Bildung enger Verbindungen zwischen den Zellen der Kultur gewährleistet wird, wodurch separate basolaterale und apikale Kompartimente auf den gegenüberliegenden Seiten der konfluenten Zellkultur gebildet werden; (b) Zugeben eines zellpermeablen nicht-fluoreszierenden Derivats einer fluoreszierenden Verbindung sowohl in das apikale als auch in das basolaterale Kompartiment, wobei das Derivat durch intrazelluläre Enzyme spaltbar ist, um eine fluoreszierende Verbindung zu bilden, die ein Substrat des Transportproteins von Interesse ist. (c) Inkubieren der Zellen in der Gegenwart des nicht-fluoreszierenden Derivats; (d) Messen der Fluoreszenzintensität in Proben, die beiden Kompartimenten entnommen wurden; (e) Vergleichen der Werte der Fluoreszenzintensität, die in den verschiedenen Kompartimenten gemessen wurden, wobei der Vergleich die apikale und/oder basolaterale Lokalisation des Transportproteins von Interesse anzeigt; und optional (f) Berechnen des Prozentanteils der apikalen und/oder basolateralen Lokalisation des Transportproteins von Interesse, das in den Zellen vorliegt, auf der Basis der Werte der Fluoreszenzintensität, die in Schritt (d) gemessen wurden, und Kalibrierungskurven und/oder empirische Korrelationen, die zuvor etabliert wurden.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–3, wobei die fluoreszierende Verbindung Calcein ist, und wobei das nicht-fluoreszierende Derivat der fluoreszierenden Verbindung ein zellpermeables nicht-fluoreszierendes Derivat von Calcein ist, vorzugsweise Calcein AM.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–4, wobei die polarisierten Zellen Nierenzellen sind, vorzugsweise MDCK II Zellen.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–5, wobei die Inkubation in Schritt (c) bei etwa 37°C für etwa 30 Minuten durchgeführt wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–6, wobei das Transportprotein von Interesse ein Mitglied der ABC-Transporter Superfamilie ist.
Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei das Transportprotein von Interesse ein Multi-Wirkstofftransporter (multi-drug transporter) oder ein multi-Wirkstofftransporter- verwandtes Protein (multi-drug transporter related protein) ist.
Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei das Transportprotein von Interesse MRP1 oder MRP2 ist.