DE4137220C2 - Verfahren und Mittel zur in vitro-Bestimmung der Toxizität von Substanzen oder Substanzgemischen - Google Patents
Verfahren und Mittel zur in vitro-Bestimmung der Toxizität von Substanzen oder SubstanzgemischenInfo
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Description
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren
gemäß Oberbegriff des Anspruchs 1 sowie ein Mittel zur
Durchführung dieses Verfahrens gemäß Anspruch 9.
Für die Bewertung der Einwirkung von Einzelchemikalien und/
oder komplexen Substanzgemischen auf biologische Systeme
gibt es verschiedene Testmethoden. Als biologische Systeme
werden dabei Säugetiere wie Mäuse, Fische wie Goldorfen,
als Einzelzelle wachsende Grünalgen, Hefen, immortalisierte
Fisch- bzw. Säugetierzellen (Zell-Linien) oder humane Blut
leukozyten (sogenannte suborganische Testverfahren) her
angezogen. Bei diesen Methoden wird eine Letalitätsrate von
Tieren oder Zellen in einen Zusammenhang zur eingesetzten
absoluten oder relativen Substanzkonzentration gesetzt (zum
Beispiel LD50, Endpunktkonzentration).
Die Bedeutung von in vitro-Zellkultursystemen zur Bestim
mung der Toxizität nimmt in jüngster Zeit immer stärker zu.
Beschleunigt wird diese Entwicklung durch Tierschutzgeset
ze, steigende Häufigkeit der Beprobung aufgrund des Chemi
kaliengesetzes und dem damit verbundenen Kostendruck.
Toxizitätsparameter sind ein unverzichtbarer Bestandteil
einer Chemikalienbewertung, insbesondere, wenn analytische
Verfahren unzureichend sind. Dies ist regelmäßig dann der
Fall, wenn Substanzgemische vorliegen, die analytisch
schwer oder gar nicht zugänglich sind wie beispielsweise
bei Abwässern von Klärwerken und bei denen sich Aussagen
über das integrale Wirken der Stoffe auf Biosysteme nur
schwer machen lassen.
Die eingangs erwähnten Testorganismen sind teilweise
schon recht lange zur zuverlässigen Bestimmung der
Toxizität bzw. Zytotoxizität anerkannt. Die Bestimmung
der Toxizität in vitro wird durch verschiedene Test
systeme mit unterschiedlichen Zelltypen und Nachweis
systemen durchgeführt. Eine Möglichkeit zur Bestimmung
der Zytotoxizität von Abwasser ist die Verwendung von
immortalisierten Leberzellen der Regenbogenforelle. An
dieser Zell-Linie sind umfangreiche Untersuchungen
durchgeführt worden (siehe P.-D. Hansen, I. Schwanz-
Pfitzner und G. M. Tillmanns: Ein Fischzellkulturtest als
Ergänzungs- oder Ersatzmethode zum Fischtest, Bundesge
sundheitsblatt 8/89, Seiten 343-346).
Diese Toxizitätsuntersuchungen sind eigens dafür einge
richteten Laboratorien vorbehalten. Die Standardisierung
und Vergleichbarkeit der Testsysteme ist unbefriedigend.
Beides sind Ursachen für die geringe Akzeptanz und den
noch geringen Verbreitungsgrad von in vitro-Toxizitäts
tests.
Ein weiterer Nachteil der in vitro-Toxizitätstests beruht
auf der aufwendigen Lagerung und Pflege der Zellen. Dazu
ist größtenteils eine spezifische Laborausstattung er
forderlich. Zwar ist die Lagerung eingefrorener Zellen
prinzipiell möglich, jedoch ist zur Verwendung von solchem
Material eine entsprechende Laborausstattung erforderlich
sowie mit der Handhabung von Zellkulturen gut vertrautes
Personal.
In Biological Abstract 73 21521; Analytical Biochemistry
113 (1), 1981, Seiten 85 bis 92 wird eine sensitive Methode
zum Nachweis der zytolytischen Aktivität von extrem gerin
gen Gehalten von stabilen oder von sehr instabilen Zytoto
xinen beschrieben. Dieses Verfahren zur in vitro-Bestimmung
der Toxizität von Substanzen und Substanzgemischen ist
dadurch gekennzeichnet, daß man die Substanz oder das Sub
stanzgemisch auf immobilisierte Erythrozyten einwirken läßt
und danach zum Nachweis der Erythrozytenzahl den Hämoglo
bingehalt oder den Gehalt an anderen Zellbestandteilen
bestimmt.
In CA 72 (15:) 75628f werden zwei Schnell-Assays beschrie
ben, die auf der hämolytischen Aktivität und der Fischtoxi
zität von Alfalfa Saponinen beruht. Bei diesem Untersu
chungsverfahren wird die Verdünnung der Probe gemessen, bei
welcher die komplette Hämolyse eintritt, und zwar in Rea
genzgläsern, in denen 2% humane Erythrozyten mit variie
renden Mengen unreinen Saponins enthaltend sind.
Die DE 33 27 691 C2 beschreibt ein Verfahren zur Ermittlung
von Umweltschadstoffen, bei dem pflanzliche Zellen einem
Schadstoffe enthaltenden Medium ausgesetzt und die Intensi
tät des Meßsignals von durch die Einwirkung der Schadstoffe
veränderten biochemisch-physiologischen Vorgänge der Zellen
bestimmt wird. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet,
daß man als pflanzliche Zellen zur Verzögerung ihrer Se
neszenz in einer gas- und wasserdurchlässigen Matrix immo
bilisierte Protoplasten einsetzt.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht also darin,
die Nachteile des oben genannten Standes der Technik zu
vermeiden und ein einfaches, gut lagerfähiges und repro
duzierbares Testsystem zu schaffen, welches mit einem Mini
mum an Laborausstattung und Personal einsetzbar ist und
damit die Voraussetzung für eine breite Anwendung bietet.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst durch ein Verfahren
gemäß den Merkmalen des Anspruchs 1 sowie ein Mittel zur
Durchführung des Verfahrens mit den Merkmalen des Anspruchs
9. Die jeweiligen Unteransprüche betreffen bevorzugte Aus
führungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens bzw. erfin
dungsgemäßen Mittels.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren zur in vitro-Bestimmung
der Toxizität von Substanzen oder Substanzgemischen durch
Messung von Einwirkungen der Substanz oder des Substanz
gemisches auf Zellen oder Zellorganellen, werden Erythro
zyten an aktivierten Mikrotitrationsplatten immobilisiert.
Die zu untersuchende Probe wird mit den immobilisierten
Erythrozyten unter definierten Bedingungen inkubiert. Nach
einer bestimmten Inkubationszeit werden die zu prüfenden
Lösungen ausgewaschen und danach die Zahl der verbliebenen
intakten Erythrozyten über den Proteingehalt photometrisch
bestimmt. Der Parameter "intakte Zahlen" wird über den
Proteingehalt bestimmt.
Die Erythrozyten werden an herkömmlichen Mikrotitrations
platten vorzugsweise mit Flachboden immobilisiert. Dies
kann in an sich bekannter Weise durch Aktivierung der Pla
stikoberflächen mittels Alzianblau geschehen. Vorzugsweise
bilden die Erythrozyten einen einheitlichen Rasen auf dem
Flachboden der Kavität der Mikrotitrationsplatte (sogenann
ter Monolayer). Es ist dabei möglich, zur Aufbewahrung die
Erythrozyten mit autologem Zitratplasma, welches Glukose,
Antibiotika und Fungistatika enthält, zu versetzen. So
können die so vorbereiteten Platten mehrere Wochen bei er
niedrigten Temperaturen, vorzugsweise 4°C, gelagert werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht in vorteilhafter
Weise die parallele Bestimmung von zellmembran- und zell
plasma-toxischer Substanzen oder Substanzgemischen mit
Hilfe der präparierten Mikrotitrationsplatten. Die Bestim
mung der Toxizitätsparameter erfolgt nach Inkubation der
Zellen mit den zu prüfenden Substanzen oder Substanzgemi
schen.
Dazu wird gegebenenfalls von den Zellen zunächst das Kon
servierungsmedium entfernt. Die Zellen werden mindestens
einmal mit einem verträglichen Medium gewaschen und dann
mit Kulturmedium bedeckt. Die Bestimmung der Toxizität der
Prüfsubstanzen kann vorzugsweise über eine Verdünnungsreihe
erfolgen. Je nach den Erfordernissen kann die Ausgangskon
zentration gewählt werden. Die Verdünnungsreihe kann vor
zugsweise so ausgestaltet werden, wie in Tabelle 1 angege
ben.
Solche Verdünnungsreihen der zu untersuchenden Substanzen
oder Substanzgemische werden in den Kavitäten der Mikro
titrationsplatte, vorzugsweise in Dreifachbestimmungen oder
mindestens Doppelbestimmungen pipettiert. Vorzugsweise
beträgt die einzupipettierende Menge 100 µl pro Kavität.
Nach einer bestimmten Einwirkungszeit, vorzugsweise 5
Minuten, insbesondere bei Raumtemperatur werden die zu
prüfenden Lösungen ausgewaschen. Es werden vorzugsweise
zunächst zusätzliche Mengen Kulturmedium hineinpipettiert
und danach entfernt. Danach werden Waschschritte je nach
Erfordernis mehrfach wiederholt. Zur Bestimmung der Zell
membrantoxizität können folgende Methoden angewendet wer
den.
Als Mittel zur Durchführung des erfindungsgemäßen Ver
fahrens läßt sich in besonders bevorzugter Weise ein
Test-Kit bereitstellen. Der Test-Kit enthält trägerge
bundene Erythrozyten und/oder lyophilisierte Erythro
zyten, Chemikalien zur Durchführung der Bestimmung des
Proteingehaltes der Zellen, zur Bestimmung der Aktivität
bestimmter Enzyme sowie Lösungsmittel und Referenzsub
stanzen. Es ist ebenfalls möglich, den Test-Kit so auszu
gestalten, daß er unbehandelte Mikrotitrationsplatten oder
aktivierte Mikrotitrationsplatten als Erythrozytenträger ent
hält, wobei die Immobilisierung der Erythrozyten dann
beim Anwender selbst erfolgt. Als Referenzproben enthält
der Test-Kit vorzugsweise je eine Positivkontrolle für
Zellmembrantoxizität bzw. Zellplasmatoxizität, also eine
Substanz, die toxisch auf Erythrozyten einwirkt, um ein
Maß für den "Cut Off" zu liefern.
Das erfindungsgemäße Mittel ermöglicht sowohl die Be
stimmung der 50%-igen zytotoxischen Wirkung (ED50) einer
Prüfsubstanz als auch eine sogenannte Endpunkt-Bestimmung.
Im ersten Fall wird der ED50-Wert aus den Meßwerten der
Verdünnungsreihe ermittelt. Dies geschieht vorzugsweise
mittels rechnerunterstützten Kurvenanpassungsverfahren. Vor
teilhaft daran ist, daß die alle Meßpunkte aus den
Verdünnungsreihen der zu untersuchenden Substanz in die
Auswertung einbezogen werden.
Bei der Endpunktbestimmung wird die erste Verdünnungsstufe
oder Molarität angegeben, bei der die Vitalität der Zellen
auf entweder < 10% oder 5%, je nach Anforderungen, redu
ziert ist. Durch die Anwendung des erfindungsgemäßen
Mittels wird weniger die Viabilität sondern eher die Mem
branstabilität der Erythrozyten bei Einwirkung bestimmter
zu prüfender Substanzen bestimmt. Die durch eine Noxe
nicht geschädigten Erythrozyten werden integral durch die
Eiweißbestimmung photometrisch erfaßt.
Die Fig. 1 beschreibt eine Eichkurve für Erythrozyten.
Die Bestimmung der Proteinmasse von an die Mikrotitrations
platte gebundenen Erythrozyten geschieht wie folgt. Die
Zellzahlen von 1·105/mm bis 2·106/mm stellen sich als
optische Dichte (der Proteinbestimmung) in mOD über 250
bis 1250 dar. Bei logarithmischer Auftragung der Zellzahl
gegen die optische Dichte wird für die Gerade regelmäßig
ein Regressionskoeffizient von < 0,95 ermittelt. Die Ei
weißbestimmung erfolgt nach der Originalvorschrift des
sogenannten BCA-Proteinnachweises (Firma Pierce, USA) bei
Verwendung von einem Reaktionsvolumen von 100 µl/Kavität
der Mikrotitrationsplatte.
Die Fig. 2 zeigt nun die Zytotoxizitätskurve eines kom
plexen Noxengemisches in verschiedenen Konzentrationen.
Die Ordinate gibt dabei die Erythrozytenzahl pro ml an,
wohingegen die Verdünnungsreihe logarithmisch auf der
Abszisse eingetragen ist (Emsal, 1/n).
Der EC50-Wert wird durch ein Kurvenanpassungsprogramm
ermittelt und beträgt 98,14 1 < n.
Claims (10)
1. Verfahren zur in vitro-Bestimmung der Toxizität von
Substanzen oder Substanzgemischen durch Messung von
Einwirkungen der Substanz oder des Substanzgemisches
auf Erythrozyten, dadurch gekennzeichnet, daß man
Erythrozyten an aktivierten Mikrotitrationsplatten
immobilisiert, die Erythrozyten mit der zu untersu
chenden Probe inkubiert, nach erfolgter Inkubation die
zu prüfenden Lösungen ausgewäscht werden und danach
die Zahl der verbliebenen intakten Erythrozyten über
den Proteingehalt photometrisch bestimmt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Immobilisierung
der Erythrozyten an aktivierten Oberflächen erfolgt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und/oder 2, wobei eine par
allele Bestimmung der Zellmembrantoxizität und Zell
plasmatoxizität der Probe erfolgt.
4. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3,
wobei die Ermittlung der Toxizität der zu untersuchen
den Probe durch eine Verdünnungsreihe erfolgt.
5. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4,
wobei zur Messung der Zellmembrantoxizität und Zell
plasmatoxizität nach Inkubation der Erythrozyten mit
der zu untersuchenden Probe, zum Beispiel mit einer
photometrischen Messung der optischen Dichte, die
Restzellenzahl in der Probe bestimmt wird und an
schließend die Enzymaktivität des Zellplasmas, unter
Verwendung eines digitalen Mikrotitrationsplattenpho
tometers, gemessen wird.
6. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5,
wobei die Bestimmung der Zellplasmatoxizität durch eine Bestimmung
der Enzymaktivität vor und nach der Inkubation er
folgt.
7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei als Enzym zur Aktivi
tätsbestimmung Esterase herangezogen wird.
8. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7,
wobei die Bestimmung der Zellplasmatoxizität einer zu untersuchenden
Probe mit dem Esterasetest nach Mossman erfolgt.
9. Mittel zur Durchführung des Verfahrens nach mindestens
einem der Ansprüche 1 bis 8 mit an aktivierten Mikro
titrationsplatten gebundenen Erythrozyten und/oder
kryokonservierten Erythrozyten, Chemikalien zur Durch
führung der Bestimmung des Proteingehaltes der Zellen,
zur Bestimmung der Aktivität bestimmter Enzyme sowie
Lösungsmittel und Referenzsubstanzen.
10. Mittel nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß
die die Erythrozyten aufnehmenden Träger Mikrotitra
tionsplatten mit Erythrozyten oder aktivierte Mikroti
trationsplatten sind.
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