DD256190A1 - Multifunktionelle optische perifusionskuevette fuer partikel - Google Patents

Abstract

Die multifunktionelle optische Perifusionskuevette gestattet die optische Messung von optischen Groessen gemeinsamen oder unterschiedlichen Ursprungs an perifundierten Partikeln, die Temperierung sowie die gute Durchmischung des Perifusionsansatzes. Weiterhin ist die Probennahme aus der Perifusionskammer sowie der Zusatz in die Perifusionskammer waehrend des laufenden Betriebes ohne nennenswerte Stoerungen der Messung moeglich und ausserdem laesst sich das effektive Kammervolumen sowie die optische Kuevettenlaenge diskontinuierlich an die experimentellen Bedingungen anpassen. Daher eignet sich die optische Perifusionskuevette gut fuer die Vermessung von perifundierbaren Partikeln speziell biologischer Herkunft. Das Perifusionsystem besteht aus einer temperierbaren Perifusionskammer, in der in der Regel die perifundierten Partikel am Verlassen der Kammer durch ein Filter gehindert werden. Durch selbstdichtende Dichtungssysteme in der Kammer sowie im Zuleitungssystem fuer die Perifusionsfluessigkeit ist die Zugabe oder die Abnahme zur oder aus der Kammer moeglich. Die Perifusionskammer wird vornehmlich in Verbindung mit einer optischen 2-Kanal-Mehrzweckmasseinrichtung (M. Markefski, 1983, Patentanmeldung G 01 N - 255 455 6), die aber nicht unbedingt erforderlich ist, eingesetzt. Die chemische oder physikochemische Analyse des Perifusates erfolgt nach Verlassen der Kammer vorzugsweise mittels Elektroden z. B. O2-Elektrode CLARK-Typ, Ionen sensitive - sowie Enzymelektroden oder konventionellen chemischen Analysenverfahren. Ausserdem ist das System als Durchflussreaktor fuer die Untersuchung chemischer Reaktionen von Fluessigkeiten oder perifundierter Partikel einsetzbar.

Description

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Bisherige Perifusionssysteme für isolierte Ganzzellen oder immobilisierte Partikel, die mittels geeigneter Techniken unter Perifusionsbedingungen gehalten werden können, erlauben nicht die mit der vorzustellenden optischen Perifusionskammer möglichen komplexen experimentellen Meßmöglichkeiten. Speziell die gleichzeitige Ermittlung von 2 optischen Größen unterschiedlicher Natur, die Möglichkeit der Probennahme aus der Perifusionskammer ohne Unterbrechung des Experiments, sowie die Variation des Kammervoiumens entsprechend den experimentellen Anforderungen in Kombination mit einer Vielzahl von Analysenmöglichkeiten des Perifusates (nach Passieren der Perifusionskammer) mit nur einem Perifusionssystem war bisher nicht möglich

Die nachteiligen Verfahren zur Perifusion sind in folgenden Patentschriften und Literaturstellen beschrieben:

US-PS 3519538 US-PS 3930951 US-PS 4078971 US-PS 3652761 US-PS 3983000 GB-PS 1491 261 BRD-PS 141 035

Alonso, G.L.; Arrigo, D.M.; Terradas, S.E.; Nikonov, J.M.; Nespral, D.; Palomba, S.E. (1977) Biochim.Biophys.Acta Bd.468,

Panten, U.; Ishida, H.; Schauder, P.; Frerichs, H.; Hasselblatt, A. (1977) Analyt. Biochemistry Bd. 82, S.317-326 Gronow, G.and Weiss, Ch. (1976) in: Use of Isolated Liver Cells and Kidney Tubules in Metabolie Studies (J. M.Tager, H. D. Soiling and J.R.Williamson, eds.)

S. 391-394, North Holland, Amsterdam

Van der Meer, R.; De Haan, E. J. and Tager, J. M. (1976) in: Use of Isolated Liver Cells and Kidney Tubules in Metabolic Studies

(J.M.Tager, H.D.Soiling and J.R.Williamson eds.)

S. 159-164, North Holland, Amsterdam

Schönfeld, P. and Küster, U. (1979) Acta biol.med.germ. Bd.38, S. 1307-1314 Van der Meer, R. and Tager, J. M. (1974) FEBS Lett. Bd.67, S.36-40

Allen, D. D.; Largis, E. E.; Miller, E. A. and Ashmore, J. (1973) J. Appl. Physiol. Bd.34, S. 125-127 Mac Menamy; Kleinecke, J.; Rail, W. and Soiling, H. B. (1981) Analyt, Biochem. Bd. 112, S. 117-127 Lowry, P. J. and Mc Martin, C. (1974) Biochem. J.Bd. 142, S.287-294

Katocs, Jr., A.S.; Largis, E.E.; Allen, D.O. and Ashmore, J. (1973) J.Biol.Chem.Bd.248, S.5089

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung ist es, eine gut temperierte und gut gerührte Perifusionskammerzu entwickeln, die eine Variation des Kammervolumens, die gleichzeitige Messung von optischen Größen unterschiedlicher Natur in der Perifusionskammer, die Probennahme aus der Perifusionskammer, sowie die Analyse des die Perifusionskammer durchflossenen Perifusates simultan erlaubt. Dabei werden die perifundierten Partikel zweckmäßig mittels Filter am Verlassen der Kammer gehindert. Diese Perifusionskammer wurde speziell für die komplexe optische Messung von biologischen Fluorchromen isolierter Zellen sowie deren Absorptionsverhalten vorzugsweise in Kombination mit einer optischen 2-Kanal-Mehrzweckmeßeinrichtung (Patentanmeldung 1983 Nr.G 01 N255456) entwickelt. Durch die gleichzeitige Messung von optischen, chemischen sowie physikalischen Parametern ist eine Vielzahl von Untersuchungen möglich, die mit bisherigen und bekannten Perifusionssystemen nicht durchführbar waren. Daher kann mit dem neuen System simultan eine Vielzahl von Parametern, speziell optischer Parameter, aus dem gleichen biologischen Untersuchungsmaterial gewonnen werden und biologisch bedingte Streuungen des Untersuchungsmaterials fallen somit nicht so so sehr ins Gewicht, so daß die Vergleichbarkeit von komplexen Größen unterschiedlicher Natur gesichert ist

Weiterhin ist die Perifusionskammer auch als Durchflußreaktor für die Vermessung von chemischen Reaktionen einsetzbar.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Biochemische Untersuchungen lassen es oft sinnvoll erscheinen, isolierte Zellen, subzellulare oder immobilisierte Enzyme mittels der Perifusionstechnik zu untersuchen. Die Perifusionssysteme erlauben ein Simulation von physiologischen Bedingungen, wie sie bei nicht desintegrierten biologischen Systemen zum Beispiel beim ganzen Organ vorliegen. Mittels dieser Perifusionstechnik ist es möglich, Konzentrationen von physiologisch wichtigen Stoffen einzusetzen, die denen im Organ entsprechen. Dabei werden in einer Kammer befindliche Partikel oder an Träger gebundene Perifusionsflüssigkeit umspült. Somit ergeben sich alle Vorteile eines Durchströmungsreaktors sowie quasi „natürliche" Bedingungen für kompartimentierte biologische Funktionseinheiten. Ziel der neuen Perifusionsküvette ist es, speziell die Messung von optischen Parametern zu erlauben. In Kombination mit der optischen 2-Kanal-Mehrzweckmeßeinrichtung oder ähnlicher Meßanordnungen aus handelsüblichen Geräten ist die simultane Messung von

a) 2 Fluoreszenzsignalen von 2 Fluorochromen

b) 2 Absorptionssignalen von

2 absorbierenden Substanzen oder

c) 1 Fluoreszenzsignal plus

1 Absorptionssignal bei elektronischer Ausgabe von Fluoreszenz/Absorption Quantenausbeute

d) 1 Fluoreszenzsignal plus TReflektionssignal

möglich. Weiterhin kann die Probennahme aus der Kammer ohne Unterbrechung der Messungen, sowie die Analyse des aus der Kammer ausgeströmten Perifusates durchgeführt werden. Vor allem die optischen Messungen erlauben es, unmittelbar während des Versuches Ergebnisse zu erhalten, die Aussagen über den energetischen Status von Zellen oder biologischen Funktionseinheiten erlauben. Somit kann der Einfluß von Substraten, Perkusoren, Effektoren oder Hemmstoffen, soweit sie auf das energieumwandelnde System einwirken, sofort erfaßt werden. Außerdem können zahlreiche Untersuchungsvarianten für die Untersuchung chemischer Reaktionen in diesem Durchflußreaktor gewählt werden.

Ausführungsbeispiel

Die Perifusionskammer besteht aus einem zentralen Block Fig. 1; A der von axialen Bohrungen durchbrochen ist, in denen Temperierflüssigkeit zirkuliert Fig. 1; B. Die in den zentralen Block eingearbeitete Perifusionskammer ist 35 mm hoch und besitzt einen Durchmesser von 20 mm Fig. 1; C. Die zur Durchmischung des Inhaltes der Perifusionskammer einsetzbaren Rührer Fig. 1; D besitzen unterschiedliche Volumen, so daß das Volumen der Perifusionskammer zwischen 2 und 10 ml Kammervolumen variiert werden kann. Die in diesen Rührern eingearbeiteten Magnete sowie die zentrale Führung der Rührer mittels eines zentralen Führungszapfeh aus V₂A, der in einer im Boden eingearbeiteten Kanüle geführt wird, ermöglichen in Kombination mit einem handelsüblichen Laborrührer UR2/VEB Labortechnik llemnau oder ähnlicher Laborwerke, die zuverlässige ' Durchmischung des Kammerinhaltes. In den Seiten der Rührer eingearbeitete schneckenartige Einfräsungen (nicht dargestellt) verhindern das Absetzen von perifundierten Partikeln am Boden der Kammer, da durch die Rotation der Rührer eine Pumpwirkung in Richtung Filter erzeugt wird Fig. 1; E. Die Zuführung der Perifusionslösung erfolgt zeitlich in die Perifusionskammer nach Passieren einer Blasenfalle Fig. 1; F, die weiterhin die Möglichkeit von Zusätzen während der Perifusion

sowie das Eintragen der zu perifundierenden Partikel vermittel der Perifusionslösung erlaubt/Dabei wird mittels einer Kanüle der Dichtungsgummi durchstoßen. Die in der Perifusionskammer perifundierten Partikel werden zweckmäßig durch Filter am Verlassen der Perifusionskammer gehindert. Normalerweise erfolgt der Einsatz der Filter zwischen 2 Siebplatten von 25mm Durchmesser, die diese zuverlässig vor mechanischen Verletzungen beim Einspannen mit Hilfe des Filterwiderlagers schützen Fig. 1; G. Nach Passieren des Filters sowie des Filterwiderlagers kann die Analyse der Penfusionsflüssigkeit durch Elektroden z. B. CLARK-Elektrode oder chemischer Analyse erfolgen. Zwei axial, das heißt genau gegenüberliegende Bohrungen, die sich oberhalb des Rührers befinden, dienen zur Aufnahme der optischen Sensoren aus Quarz Fig. 1; H und Fig. 2; H. Mit Hilfe der optischen 2-Kanal-Mehrzweckmaßeinrichtung (Patentanmeldung Q 01 2554556) ist die gleichzeitige Messung von wahlweise zwei optischen Parameternbei optischer Kopplung mittels Lichtleitkabel möglich:

a) 2mal die Fluoreszenz von zwei verschiedenen Fluorochromen oder

b) 2mal die Absorption bei 2 verschiedenen Wellenlängen oder

c) 1 mal die Fluoreszenz plus

1 mal die Absorption sowie der daraus elektronisch berechnete Quotient (Quantenausbeute) oder

d) 1 mal die Fluoreszenz und 1mal die Reflektion.

Die optische 2-Kanal-Mehrzweckmaßeinrichtung kann durch andere optische Meßeinrichtungen ersetzt werden. Die Quarzkoni Fig. 2; H werden von je einem Sp^anr|stück Fig. 2; I, die jeweils einen O-Ring fest an das Perifusionsgehäuse drücken sowohl flüssigkeits- als auch gasdicht in das Perifusionsgehäuse eingepaßt. Weiterhin ist die Distanz zwischen den Quarzkoni und somit die optische Länge variabel einstellbar. Die Lichtführung von der optischen Meßeinrichtung zur Perifusionskammer erfolgt zweckmäßig mittels Lichtleitkabel. Vermittels einer seitlich bis in das Innere der Perifusionskammer reichenden Probennahme— Vorrichtung mit einer Bohrung Fig. 1; J — können Proben aus der Perifusionskammer genommen werden. Dabei wird die Gummidichtung mit einer Spritzenkanüle durchstoßen und ein definiertes Probenvolumen aus der Kammer entnommen. Da in der Kammer während der Perifusion ein leichter Überdruck herrscht (Filterwiderstand), wird der Spritzenstempel durch die in die Spritze eindringende Perifusion ein leichter Überdruck herrscht (Filterwiderstand), wird der Spritzenstempel durch die in die Spritze eindringende Perifusionssuspension verdrängt, so daß eine luftblasenfrei zuverlässige Probennahme von perifundierten Partikeln möglich ist. Nach Herausziehen der Spritzenkanüle dichtet der Dichtungsgummi, der durch die einmal festgezogene Druckschraube stets unter Druck steht, die Kammer wieder zuverlässig ab. Das gesamte Perifusionssystem wird von einem undurchsichtigen 2teiligen Schutzmantel vor dem Eindringen von Fremdlicht geschützt Fig. 1 und 2; K.

Claims (2)

1. Multifunktionelle optische Perifusionsküvettefür Partikel, dadurch gekennzeichnet, daß mit Hilfe einer rührbaren temperierten Perifusionskammer, bei der die perifundierten Partikel zweckmäßig mittels eines Filters, das aber nicht erforderlich ist, in der Kammer zurückgehalten werden, die Bestimmung von optischen Parametern unterschiedlichen Ursprungs, vornehmlich, aber nicht notwendiger Weise, in Verbindung mit einer optischen
2. 2-Kanal-Mehrzweckmeßeinrichtung, bei zweckmäßiger aber nicht erforderlicher Kopplung Perifusionskammer/optisches Meßgerät mittels Lichtleitkabel und Lichtleitkonus erfolgt, die Veränderung des effektiven Kammervolumens, die Veränderung der optischen Küvettenlänge sowie die Probennahme aus der Kammer, die Analyse des die Kammer passierenden Perifusionsmediums, der Zusatz von Effektoren oderzu perifundierenden Partikeln in die Kammer bei laufenden Perifusionsregime mit nur einem Perifusionssystem möglich ist, das gleichzeitig alsfilterfreierDurchströrnungsreaktorfürchemische Reaktionen fluidersöwie partikulärer Systeme genutzt werden kann.

   Hierzu 2 Seiten Zeichnungen

   Anwendungsgebiet der Erfindung

   Die Erfindung betrifft eine Perifusionsküvette, die vornehmlich zur Messung optischer Parameter von in der Perifusionskammer perifundierten Partikeln dient. Weiterhin gestattet diese Perifusionskammer die Probennahme aus der Kammer, den Zusatz von Effektoren und die meßtechnische (chemische) Analyse des Perifusates nach Durchströmen der Perifusionskammer mittels spezifischer Elektroden oder geeigneter chemischer quantitativer Analyseverfahren. Eine solche Perifusionsküvette ist somit für die gleichzeitige Bestimmung von optischen, einigen physikalischen und chemischen Parametern von perifundierten Partikeln, speziell biologischer Natur, geeignet. Somit ist es zum Beispiel möglich, an perifundierten Zellen gleichzeitig wichtige optische Parameter des energiewandelnden Systems, sowie mittels spezifischer Elektroden oder nachfolgender chemischer Analyse Aussagen von chemischen Umsätzen zu erhalten, die aus gleichen Bedingungen resultieren, da sie simultan gemessen werden. Dabei dient z. B. bei Zellen die Messung von optischen Parametern bevorzugt der Sofort-Ermittlung des Red/Ox-Status von Zellen, also deren energetischen Lage, während die Analyse des Perifusates Aussagen über die Syntheseleistung von Zellen zuläßt. Anwendungsgebiete dieser Erfindung sind somit vornehmlich biochemische und physiologische Untersuchungen von isolierten Zellen sowie von subzellulären Partikeln, soweit diese unter Perifusionsbedingungen gehalten werden können. Dabei können Bedingungen simuliert werden, die physiologischen Normzuständen oder auch Grenzbedingungen weitgehend entsprechen und mildern nach dem geschlossenen Prinzip arbeitenden Systemen nicht simuliert werden können. Weiterhin können in dem gut gerührten Durchfluß-Reaktor chemische Umsätze anhand von optischen oder anderen Parametern meßtechnisch verfolgt werden.