DD227446A1

DD227446A1 - Selektionsverfahren fuer phytoeffektoren auf basis des ionenumsatzes von mikroalgenkulturen

Info

Publication number: DD227446A1
Application number: DD26746484A
Authority: DD
Inventors: Horst Arndt; Claus-Ruediger Kramer; Heinz Boehm; Ehrhardt Tschirner
Original assignee: Paedagogische Hochschule W Rat
Priority date: 1984-09-21
Filing date: 1984-09-21
Publication date: 1985-09-18

Abstract

Die Erfindung "Selektionsverfahren fuer Phytoeffektoren auf Basis des Ionenumsatzes von Mikroalgenkulturen" dient der Suche nach Pflanzenschutzmitteln. Sie verfolgt das Ziel, ein Verfahren vorzuschlagen, das die Erfassung der biologischen Aktivitaet applizierter Substanzen vermittels Messungen des Ionenumsatzes geeigneter Mikroorganismen schnell, sicher sowie auf einfacher messtechnischer Grundlage an in vivo-Material zulaesst, Dosis-Wirkungs-Analysen und Zeitverlaufsstudien erlaubt und fuer vertiefende Nachfolgeuntersuchungen wertvolle Hinweise liefert.

Description

Titel der Erfindung

Selektionsverfahren für Phytoeffektoren auf Basi3 des Ionenumsatzes von Mikroalgenkulturen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Pflanzenschutzmittelforschung, Umweltschutz, Mikroalgen Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Es ist bekannt, daS sich Suspensionen einzelliger Mikroalgen bei Belichtung und Durchsatz von CCU-haltiger Luft in rein anorganischem Nährmedium, kultivieren lassen. Sie nehmen alle für das Wachstum benötigten Stoffe auf und scheiden nicht gebrauchte Substanzen an das Medium ab. Teilweise ist die Substanzaufnahme an eine Stoffabscheidung gebunden. Damit ergeben sich prinzipiell verschiedene Möglichkeiten, das Wachstum und den Stoffwechsel der Algen zu erfassen. So können nach dem Patent DD Nr. 94 234 mittels autotroph kultivierter einzelliger Algensuspensionen diejenigen Chemikalien aus einer Stichprobe selektiert werden, die den fundamentalen Prozeß des autotrophen Zellwachstums, die Photosynthese, unmittelbar oder mittelbar beeinträchtigen. Praxisübliche physiologische, biochemische oder enzymologische Untersuchungen zur Substanzaufnahme oder -abgabe durch Organismen,

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erfordern neben entsprechenden Sestimmungsverfahren, wie das Kjeldahl-Verfahren zur Bestimmung des Stickstoffgehaltes in organischem Material oder photometrische Methoden nach Lowry bzw. das Biuratverfahren zur Proteinbestimmung u.a. in der Regel den Zellaufschluß sowie geeignete Extraktions- und ReiniguηgeProzeduren.

Sie sind sehr geräte-, zeit- und arbeitsaufwendig. Damit ist die Durchführung großer'Versuchsserien im Rahmen von Tests zur Wirkung von Phytoeffektoren sowie eine exakte, auf vielen Meßpunkten beruhende Dosis-Wirkungs-Analyse für interessierende -Verbindungen stark eingeschränkt. Wirkungsverlaufstudien zur Erfassung der Zeitabhängigkeit der Effekte substanzinitierter Beeinflussungen der Substanzaufnahme und/oder -abgabe durch Organismen sind praktisch unausführbar oder werden infolge eingeschränkter Reproduziarbarkait der Ergebnisse infolge der notwendigen Zellaufschlüsse modifiziert oder verfälscht. Infolge der Nachteile solcher in ν i t r o-Untersuchungen ergibt sich der Wunsch nach einem in ν i ν o-Verfahren, das vermittels einfacher Meßtechnik mit geringem Arbeits- und Zeitaufwand, manuell oder automatisiert betreibbar ist und das gestattet, die Wirkung von Phytoeffektoren auf der Grundlage der Analyse das Ionenumsatzes wie Nitrat- oder Ammoniumionenaufnahme und/oder Hydroxyd- oder Wasserstoffionenabgabe pflanzlicher Organismen schnell, sicher und zuverlässig anzuzeigen und sowohl allgemeine Aussagen im Rahmen eines Screenings als auch vertiefende Antworten nach distinkten oder kontinuierlichen Messungen erlaubt, Wirkungsverlaufsstudien zuläßt sowie die Möglichkeit zum Vergleich der Befunde mit denen anderer Meßverfahren, weiterer Parameter oder Metabolismen eröffnet.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung verfolgt das Ziel, die Wirkung von Phytoeffektoren auf den assimilatorischen Stoffwechsel von Pflanzen anhand eines einfachen in ν i ν o-Tests auf der Basis des

Ionenumsatzes, d.h. der Aufnahme und/oder der Abscheidung insbesondere von Nitrat-, Ammonium-, Wasserstoff- bzw. Hydroxylionen etc. durch geeignete Mikroorganismen zu erfassen, zu quantifizieren und Dosis-Wirkungs-Analysen zu unterziehen, um eine Selektion von Effektoren in solche, die auf Pflanzen wirken oder aber nicht wirken vornehmen zu können und die Effektoren anhand von Wirkungsverläufen näher charakterisieren und differenzieren zu können.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein methodisch einfaches Verfahren vorzuschlagen, welches durch die Wahl geeigneten Testmateriäls, geeigneter Testbedingungen, geeigneter Meßverfahren einschließlich einer geeigneten Testmethodik sowie der zweckmäßigen Kombination dieser Faktoren distinkte oder kontinuierliche, manuell oder automatisiert betriebene in ν i ν o-Untersuchungen zur Wirkung von Phytoeffektoren auf pflanzliche Organismen zuläßt, aufgrund der Ergebnisse eine sichere Selektion wirksamer Verbindungen und deren zweifelsfreie Abgrenzung von unwirksamen gestattet, darüberhinaus eine Vergleichbarkeit der erzielten Meßergebnisse mit denen aus der Untersuchung anderer Parameter oder Metabolismen erlaubt.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß definierte Mengen chemischer Verbindungen mit autotroph kultivierten Zellsuspensionen einzelliger Grünalgen in unmittelbarem Kontakt gebracht und diese Proben parallel mit unbehandelten Vergleichskulturen bei einheitlicher Temperatur zwischen 20 ⁰C und 38 ⁰C im Licht belüftet werden, so daß sie auf der Grundlage des sich vollziehenden Photosyntheseprozesses wachsen und sich entwickeln. Zu festgelegten Zeitpunkten oder kontinuierlich werden dann mittels pH-Meßketten der pH-Wert und/oder mittels Ionensensitiver Elektroden der Nitrat- und/oder Ammoniumionengehalt der Proben und Vergleichskulturen oder Anteilen von beiden analysiert und

dia dabei gewonnenen Ergebnisse vergleichenden Betrachtungen unterzogen,

Vorteile des Verfahrens sind:

I« pH-Messung eignen sich zum Phytopharmakon-Scraening. Sie zeigen die· Wirkung sicher, schnell und unmittelbar oder mittelbar an, wenn die Noxe selbst den pH-Wert oder das lonengefüge der Nährlösung beeinflußt.

Der Applikationszeitpunkt ist frei wählbar.

2. Dar lonenumsatz erlaubt in vivo-Messungen, d.h. zerstörungsfreie Untersuchungen ohne eine Rückwirkung auf das Testmaterial.

3. Die Messungen können kontinuierlich oder distinkt erfolgen. Sie sind dynamisier- und automatisierbar.

4. Die Meßtechnik ist einfach, leicht handhabbar und eichbar. Dia Meßsicherheit ist hoch.

5. Es gibt keinen unmittelbaren Einfluß von trübenden oder färbenden Substanzen auf die Meßgröße wie etwa bei photometrischen Verfahren. Rückwirkungen solcher Noxen bestehen lediglich nie direkt über das Lichtangebpt für die Zellen, wie das auch für sämtliche anderen Maßverfahren gilt.

Messungen auf Basis, anderer geeigneter lonensensitiver Elektroden weisen analoge Vorteile auf.

Au s f ü h ru ng sbeis ρ i e1e 1. Ausführungsbeispiel

Suspendiert man eine Synchronkultur von Chlorella vulgaris in einem Nährmedium nach KUHL und "LORENZEN und zieht die Zellen in einer dafür geeigneten Anzuchtapparatur autotroph bei einer Temperatur von 37,5 ⁰C unter Belüftung mit 15 1 Luft pro Stunde an, der 2 Vol% kohlendioxid beigemischt sind, nehmen die Algen proportional zum Wachstum Nitrationen aus dem Medium auf und scheiden dafür Hydroxylionen ab. Letztere führen trotz einer

erheblichen Pufferkapazität das Nährmediums, die verhindern soll, daß die für das Wachstum und die Entwicklung bestehenden organismischen Grenzen überschritten werden, zu einer physiologisch bedingten Alkalisierung des Dispersionsmittels. Die Größe der Änderung des pH-Wertes ist außer vom Wachstum der Zellen noch von der eingesetzten Zellzahl und der verwendeten Puffermenge abhängig. Bei zahlkonstanten Synchronkulturen, die in einem standardisierten Nährmedium wachsen, korreliert die pH-Änderung mit dem Zellwachstum.

Konfrontiert man einen Teil der einheitlich angesetzten und parallel angezogenen Chargen der Algensuspensionen zur Zyklusstunde 0 mit abgestuften Konzentrationen des bekannten Herbizides Amitrol, so ergeben sich im Wachstumsverhalten der tangierten Proben zu den unbehandelten Kontrollen Unterschiede, die sich im Ionenaustausch mit dem Medium niederschlagen und vermittels pH-Msßketten oder ionenselektiven Elektroden erfaßt werden können. Ergebnisse dieser Untersuchung sind der Fig. zu entnehmen. Die mit K gekennzeichnete Kurve zeigt den pH-Wert der unbehandelten Kontrolle.

Die mit 1 bis 4 bezeichneten Kurven veranschaulichen das Ver-

—2 —2 —3

halten der Meßgröße nach Zugabe von 5x10 , 1x10 , 5X10 bzw. 1^10 Amitrol. Die Messungen werden distinkt im Abstand von 15 min vorgenommen. Die Abstufung der Meßgrößen spiegelt die Konzentrationsstufen unmittelbar wider. Die stärkste Veränderung des pH-Wertes ergibt sich bei der Kontrolle. Alle behandelten Chargen sind gegenüber der Kontrolle gehemmt. Die erzielten Meßdaten bilden die Grundlage für Dosis-Wirkungsanalysen, deren Ergebnisse im Vergleich mit denen anderer Parameter in der Figur 2 dargestellt sind. Sie zeigt die prozentuale Hemmung des jeweiligen Metabolismus auf der Ordinate als Funktion des dekadischen Logarithmus der in Prozent bemessenen Amitrolkonzentrationen auf der Abszisse. Die Dosis-VVirkungskurven, die mit den Ziffern 1 bis 3 gekennzeichnet sind, verdeutlichen in dieser Reihenfolge die Beeinflussung der Chlorophyllsynthese, der pH-Wertänderung und der Photosynthese.

Die Inhibition des Ionenaustausches bzw. des pH-Zuwachses ordnet sich in das gesamte Wirkspektrum der Substanz auf einzelne Metabolismen gut ein.

Damit wird illustriert, daß pH-Messungen zur Kennzeichnung der Wirkung von Phytoeffektoren beispielsweise in einem Scraening-Test gut geeignet sind.

2. Ausführungsbeispiel

Verfährt man wie im Ausführungsbeispiel 1 und versetzt einzelne Chargen von Algensuspensionen frisch angesetzter Synchronkulturen von Chlorella vulgaris zur Zyklusstunde O mit abgestuften Konzentrationen der nachfolgend aufgeführten Phytopharmaka, kann man deren Wirksamkeit sowohl über die Änderungen des pH-Wertes als auch die der chlorophyllproportionalen Extinktion bei 680 nm und die der Volumenproportionalen Trübung bsi 545 nrn erfassen und die erhaltenen Ergebnisse nach Dosis-Wirkungsanalysen miteinander vergleichen.

Nach Temperierung der Proben und Sättigung dar Lösung mit Kohlendioxid infolge der Einspeisung des Luft-Kohlendioxid-Geraisches werden die Ausgangswerte der einzelnen Parameter gemessen. Danach erfolgt eine autotrophe Anzucht der Kulturen bis zur Zyklusstunde 5, worauf eine Endmessung durchgeführt wird. Aus dem Zuwachs des jeweiligen Parameters einer behandelten Probe, der zu dem der Kontrollen prozentual ins Verhältnis gesetzt wird, ergibt sich die prozentuale Inhibition des Wachstums durch die eingesetzte Wirkstoffdosis als Ergänzung des berechneten prozentualen Zuwachses zu 100 Prozent. Analog ermittelt man auch Stimulationen oder Zellzerstörungan durch die Wirkstoffs. Bei Auftragung der prozentualen Hemmwerte gegen den dekadischen Logarithmus der jeweiligen Konzentration erhält man aus einer hinreichenden Zahl von Meßpunkten Dosis-Wirkungskurven, aus denen man durch Inter- oder Extrapolation alle erforderlichen Daten ablesen kann.

In den nachfolgenden Tabellen 1 und 2 werden für einige Substanzen die ED__n-Werte der erfaßten Parameter miteinander verglichen. Si© machen auch hier deutlich, daß Messungen des pH-Wertes an wachsenden Synchronkulturen von Chlorella vulgaris als Meßverfahren im Screening für phytoaktive Substanzen gut geeignet sind. Die wirksamen Konzentrationen liegen im allgemeinen im gleichen Bereich wie bei anderen tangierten Metabolismen, können bei spezifischer Beeinflussung der den Ionenaustausch zugrunde liegenden Prozesse aber auch höher oder niedriger sein, was jedoch die Nutzbarkeit dieses Parameters im Screening nicht beeinflußt.

Tabelle 1: Untersuchte Herbizide

1. N,N-Dimethyl-N-phenylharnstoff

2. 2-Chlor—4,6-bisethylamino-l,3,5-triazin

3. Ethyl-N,N-dipropylthiocarbamat

4. Pentamethylendithiocarbamat 5« Pentamethylendiamin

6. o-Isopropyl-phenylcarbamat

7. Acetyl-4-PAP-amid

8. Morpholinodithiocarbamat

9· Benzyl-4-phenyl-azophenylcarbamat

10. 4-Methyl-PAP-carbamat

11. N,N-Dimethyldithiocarbamat

12. 3-Amino-l,2,4-triazol

Tabelle 2: ED --Werte für die substanzinitierten Beeinflussungen der pH-Werte, der Extinktionen bei 680 nm und der Trübungen bei 545 nm der Algensuspensionen.

Nr. des pH-Änderung Ee_pn Trübung Wirkstoffs _

1. 5 . 1O^-6M5 . 10"⁶M5 . 10~⁶M

2. 4 . 10"⁷M 4 . 10"⁷M 4 . 10~⁷M

3. 2 . 10"⁵M 2 . 10"⁶M 2 . 10"⁶M

4. 3 . 10"⁴M 3 · 10"⁴M 3 . 10"⁴M

5.	4	. 10'⁵M	4	. 10"⁵M	4	. 10"⁵M
6.	1	. 10"⁴M	5	. 10"⁵M	5	. 10"⁵M
7.	1	. 10"⁴M	4,5	. 10"⁵M	2,5	. 10"⁵M
8_β	2	. 10"³M	5	. 10"⁴M	1	. 10"⁴M
9.	2	. 10"³M	3	. 10"⁴M	1	• 10"⁴M
10.	2	. 10"⁵M	2	. 10"⁵M	7	♦ 10"⁵M
11.	1	. 10"⁶M	3	. 10"⁶M	3	. 10"⁵M
12.	2,7	. 10"⁴M	2,4	. 10"⁴M	1,3	. 10"³M

Während bei den ersten 5 Wirkstoffen die ED^_n bei allen Parametern gleich sind, ergeben sich bei allen weiteren gewisse Unterschiede, die die vorherigen Aussagen unterstreichen.

Claims

Patentansprüche

1. Selektionsverfahren für Phytoeffektoren auf Basis des lonenumsatzes von Mikroalgenkulturen, dadurch gekennzeichnet, daß Bestimmungen des Nitrat-, Ammonium- und/oder des Wasserstoffs- bzw. Hydroxylionengehaltes und gegebenenfalls weiterer dissoziierter Bestandteile des Nährmediums autotroph kultivierter Mikroalgensuspensionen, die mit zu prüfenden Substanzen gegebenenfalls in abgestuften Konzentrationen unter konstanten Umweltbedingungen konfrontiert werden, genutzt werden, um aus den substanzinitiierten Unterschieden in den kontinuierlich oder distinkt erfaßten Änderungen des entsprechenden Ionenumsatzes durch Vergleich mit denen der unbehandelten Kontrollen Schlußfolgerungen über die Wirksamkeit von Effektoren zu ziehen und eine Selektion in wirksame oder aber nicht wirksame vornehmen zu können,
2. Verfahren nach Punkt 1 dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroalgensuspension alle suspendierbaren, autotroph anziehbaren eukaryotischen Mikroalgen verwendet werden können*
3. Verfahren nach Punkt 1 u/id 2 dadurch gekennzeichnet, daß die Änderungen der Ionenkonzentrationen in den Suspensionen und alle gängigen Meßverfahren, wie z.B. pH-Meßketten, andere ionenselektive bzw. ionensensitive Elektroden etc. analysiert werden können.

Hierzu Q^...S8itan Zeichnungen