DE2155060A1 - Verfahren zur kontinuierlichen bestimmung der toxizitaet von wasser, abwasser und anderen fluessigkeiten unter verwendung von mikroorganismen und vorrichtung zur durchfuehrung des verfahrens - Google Patents

Verfahren zur kontinuierlichen bestimmung der toxizitaet von wasser, abwasser und anderen fluessigkeiten unter verwendung von mikroorganismen und vorrichtung zur durchfuehrung des verfahrens

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DE2155060A1 DE19712155060 DE2155060A DE2155060A1 DE 2155060 A1 DE2155060 A1 DE 2155060A1 DE 19712155060 DE19712155060 DE 19712155060 DE 2155060 A DE2155060 A DE 2155060A DE 2155060 A1 DE2155060 A1 DE 2155060A1
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Description

DR. INQ. HANS LICHTI · DIPL.-INQ. HEINER LICHTI
PATENTANWÄLTE
KARLSRUHE-Dl/RLACH · QRÖTZINQER STRASSE 61
TELEFON (O7£1) 4 11 24
2228/71
Or. Günther Axt, 75 Karlsruhe«Durlach, Strählerweg 93
Verfahren zur kontinuierlichen Bestimmung der Toxizität von Wasser, Abwasser und anderen Flüssigkeiten unter Ver« Wendung von Mikroorganismen und Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens»
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur konti«* nuierlichen Bestimmung der pauschalen Toxizität von Wasser, Abwasser und anderen Flüssigkeiten unter Verwendung von Mi·, kroorganismen, sowie auf eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens. Es ist bekannt, daß es Parallelen gibt zwi«· sehen der Wirkung von Giftstoffen auf Mikroorganismen (Bak« terien, Algen, Protozoen) und der Wirkung auf höhere Tiere und Menschen. Daher können viele unspezifische Toxizität β·· Untersuchungen in vivo mit Mikroorganismen an Stelle höhe« rer Tiere ausgeführt werden·
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Es sind auch schon Untersuchungsmethoden ausgearbeitet und beschrieben worden, mit denen die Schädlichkeit von Abwässern unbekannter Zusammensetzung für Flüsse und Seen dadurch festgestellt wird, daß die Schadwirkung auf einige für die Vorfluter typische Mikroorganismen festgestellt wird. Obgleich die Ergebnisse von Untersuchungen nach - bekannt* ten Untersuchungemethoden im Prinzip auch Schlüsse auf die Giftigkeit gegenüber höheren Tieren und Menschen zulassen, so sind diese doch nicht darauf angelegt, solche Schlüsse tat·-· sächlich zu ziehen« Davon abgesehen haben diese Methoden auch einige Nachteile, die ihrer verbreiteten Anwendung bisher im Wege standen. Ihre Durchführung ist langwierig und aufwendig und ihre Aussagekraft ist durch die Schwierigkeiten begrenzt, die die Züchtung und Bereithaltung von Mikroorganismen mit hinreichend reproduzierbaren Eigenschaften mit sich bringen. Diese Schwierigkeiten werden in Fachkreisen so hoch einge·* schätzt, daß man allgemein die Verwendung von Mikroorganismen für meßtechnische Methoden bei normalen Anforderungen an deren Reproduzierbarkeit, Eichfähigkeit und Störunanfälligkeit für grundsätzlich unmöglich hält·
Der Erfindung ist hiervon ausgehend die Aufgabe gestellt, ein Verfahren zur Bestimmung der Toxizität von Flüssigkeiten» insbesondere von Abwässern vorzuschlagen, das gegenüber den bekannten Methoden dadurch entscheidend verbessert ist, daß es unter Verwendung von Mikroorganismen ausreichend reprodu·» zierbare Ergebnisse liefert, und daß es gegebenenfalls konti*.
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nuierlich ausgeübt werden kann.
Gemäß der Erfindung wird diese Aufgabe dadurch gelöst, daß mit Hilfe einer Nährlösung kontinuierlich gezüchtete Mikro** Organismen im stationären Gleichgewichtszustand eines Durch» Laufsystems als Stammlösung unter Einhaltung konstanter Mengen*· Verhältnisse und Bedingungen kontinuierlich mit der zu unter*« suchenden Flüssigkeit und mit neuer Nährstofflösung vermischt werden, und daß die giftbedingte Schädigung der Mikroorganis« men über die Messung eines von der Lebenstätigkeit der Mikro** Organismen abhängigen Parameter erfaßt wird« Als eine solche meßbare Größe kann beispielsweise in vielen Fällen die Trübung oder eine Farbänderung dienen· Universeller anwendbar ist jedoch die Messung des pH«-iWertes oder der bei den sich abspielenden Oxydationsvorgängen gebildeten Kohlensäure, oder die Messung der Sauerstoffkonzentration,'welche besonders vorteilhaft er*· scheint. Dabei ist zu beachten, daß sich eine Vergiftung der Mikroorganismen in einer Abnahme des Kohlensäuregehalts der Stammlösung, bzw. einer Zunahme dt;. Sauerstoffgehalts (Abnahme der Sauerstoffzehrung) auswirkt«
Das Verfahren gemäß der Erfindung .-zeichnet sich vor den erwähnten bekannten Untersuchungsmethoden vor allem dadurch aus, daß es sich zur kontinuierlichen Erfassung von Meßwerten eignet, und daß es bei entscheidender Verbesserung der Repro·* duzierbarkeit der Eigenschaften der verwendeten Mikroorganismen auch deren Züchtung und Bereithaltung entscheidend vereinfacht.
Die Züchtung geschieht erfindungsgemäß in einem Durchlauf*« gefäß, das bei konstanter Temperatur kontinuierlich mit defiw nierten Mengen von für die zu züchtenden Organismen spezifischen Nährstoffen versorgt wird» Durch intensives Rühren bei freiem Luftzutritt werden sowohl die Mikroorganismen, als auch deren StoffWechselprodukte und eventuell vorhandene ungelöste Nährstoffe ständig in Schwebe gehalten, und es wird eine aus*· reichende Versorgung der Mikroorganismen mit Sauerstoff einer« seits, die Ausgasung der gebildeten CO„ andererseits gewähr« leistet ο
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Ein solches Durchlaufsystem strebt wie jedes konstant beschickte Durchlaufsystem einem stationären Gleichgewichts·« Zustand zu, in welchem sowohl die chemischen Stoffe, als auch die Mikroorganismen nach Arten und Konzentrationen konstant sind und bleiben. Die Artenzahl der Mikroorganismen sind da*· bei umso stärker eingeschränkt und ihre Eigenschaften umso schärfer definiert, je schärfer auch die gesamten chemischen und physikalischen Bedingungen (Zusammensetzung und Kon ζ en«-· tration der Nährstoffe, Zusammensetzung und Konzentration der Stoffwechselprodukte einschließlich CO-, Konzentration des 0-, Temperatur) definiert sind.
Diese Milxeubedingungen sind « abgesehen von der Tempera»· tür « im stationären Gleichgewichtszustand eines Durchlauf*« systems wesentlich besser definiert als in den geschlossenen Systemen, die normalerweise zur Züchtung von Mikroorganismen verwendet werden» Dieser Vorteil wird erfindungsgemäß noch da«« durch entscheidend vergrößert, daß die mittlere Verweil«zeit der Flüssigkeit im Durchlaufgefaß durch Festlegung von Gefäß« größe und Durchflußgeschwindigkeit genau definiert und der Generationszeit der zu züchtenden Mikroorganismen angepaßt ist· Diese Anpassung geschieht derart, daß die mittlere Ver« weilzeit zwar deutlich größer als die Generationszeit in der
wird exponentiellen Vermehrungsphase eingestellt, aber in der glei»
chen Größenordnung wie jene bleibte
Etwas jenseits der exponentiellen Vermehrungsphase ergibt sich dabei eine effektive Generationszeit, die genau gleich der mittleren Verweilzeit ist, eine aus theoretischen Grün** den unerläßliche Voraussetzung für die dauernde Existenz der Mikroorganismen im stationären Gleichgewicht. In diesem Zustand des Durchlaufsystems gewinnen schließlich den Existenzkampf
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solche Arten von Mikroorganismen, die die Voraussetzung: effektive Generationszeit » mittlere Verweilzeit auch c unter den ungünstigsten Milieubedingungen bezüglich Verknappung der Nährstoffe und Anreicherung von Stoffwechselprodukten noch erfüllen»
Dieses Ausleseprinzip wirkt so scharf« daß das Durchlauf*· gefäß dauernd mit unsteriler Luft in Berührung kommen kann, ohne daß die durch die Luft eingebrachten Bakterien das biolo« gischwchemische Gleichgewicht merklich beeinflussen könnten« Durch passende Wahl der Nährstoff« und Temperaturbedingungen läßt sich die Selbstselektion sogar soweit treiben, ,daß schon nach einigen Tagen nur eine einzfge/BaRterienart, also eine Monokultur im Durchlaufgefäß verbleibt, ganz gleich ob und womit die Flüssigkeit ursprünglich geimpft wurdeβ Eine solche Einschränkung der Artenzahl ist für toxikologische Untersu« chungen insofern erwünscht, als verschiedene Arten auf ver*· schiedene Gifte unterschiedlich reagieren· Definierte Aussa» gen setzen also definierte Arten von Mikroorganismen, im Extrem« fall Monokulturen, voraus·
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur kontinuierlichen Toxizitätsbestimmung wird die Stammlösung der nach der beschrie» benen Art im stationären Gleichgewichts«* Zu st and eines Durch«« laufsystems gezüchteten Mikroorganismen sofort nach dem Verlas·« sen des Durchlaufgefäßes zur Messung der Toxizität weit erver»· wendet·
Weitere Einzelheiten, Merkmale und Vorzüge des erfindungsge« mäßen Verfahrens werden nachstehend anhand der Zeichnung erläu«* tert, in der eine zur Durchführung des erfindungsgemäßen Ver»-
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fahrens geeignete Vorrichtung im Aufriß in schematisch vern einfachter Darstellung wiedergegeben ist.
Ein Durchlaufgefäß 1 wird zweckmäßig mit einer hochkon« zentrierten Nährlösung und getrennt davon mit Verdünnungs» wasser beschickt.
-Zur Zucht von beispielsweise Bact. coil. Esch. kann die konzentrierte Nährlösung z.B. aus 10 % Pepton, 10 % Milch«« zucker, 20 % Kochsalz und 60 % Wasser bestehen. Aufgrund des hohen KochsalzwGehaltes ist sie fast autosteril und bleibt mehrere Wochen unverändert haltbar, selbst wenn sie offen und ungeschützt in unsteriler Luft stehen bleibt, was ihre prakti«* sehe Handhabung etehr erleichtert. -
Erst im Durchlauf gefäß wird die konzentrierte Lösung mit Wasser verdünnt, und zwar vorzugsweise im Verhältnis 1 : 50, so daß die Kochsalz«*Konzentration in eine Größenordnung kommt, dijg für das Wachstum und die Vermehrung der Mikroorganismen nicht mehr hinderlich ist.
Die das Durchlaufgefäß 1 verlassende Stammlösung mit den Mikroorganismen gelangt kontinuierlich in ein kleineres gegen»· über Luftzutritt abgeschlossenes Meßgefäß 2 mit einem Magnet«-· Rührstäbchen 3 und von da zum Überlauf 4, wo sie die Apparatur verläßt. Eine Sauerstoff »Elektrode 5 reagiert in bekannter Wei« se auf die Jeweils in dem Meßgefäß herrschende 0„«Konzentration, die hier *· anders als im offenen Durchlaufgefäß » wegen des stoffwechselbedingten ständigen 0--Verbrauchs durch die Orga« nismen in der Regel unterhalb der LuftSättigungskonzentration liegt.
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Die auf Toxizität zu untersuchende Flüssigkeit (meist Was·» ser oder Abwasser) muß zwecks Vermeidung von Meßfehlern beim Eintritt in das Meßgefäß 2 ebenfalls mit Luftsauerstoff ge«· sättigt sein. Hierzu gelangt sie zunächst in das Vorgefäß 6, wo durch intensives Rühren oder durch andere geeignete Belüf« tungsmaßnahmen, wie Durchblasen von Luft., das OgwSättigungs*· gleichgewicht mit der AthmoSphäre genau wie im Gefäß 1 herge« stellt wird, falls nicht ohnehin schon LuftSättigung herrscht. Gleichzeitig wird ihr in dem Vorgefäß 6 Nährstofflösung zudo« siert, und zwar zweckmäßig die gleiche, die auch laufend in das Durchlaufgefäß 1 eingespeist wird.
Die mit Nährstofflösung versehene zu untersuchende Flüssig« keit gelangt ebenso wie die Stammlösung in das Meßgefäß, wo sich beide Flüssigkeiten vermischen, und das sie gemeinsam durch den Überlauf verlassen.
Ein wichtiger Unterschied zwischen den Gefäßen 1 und 6 be» steht erfindungsgemäß darin, daß die Mittlere Yerweilzeit der Flüssigkeit im Durchlauf gefäß 1 ·* wie erwähnt » deutlich gros« ser, im Vorgefäß 6 aber deutlich kleiner gehalten wird, als die ' Generationszeit' der Mikroorganismen in der exponentiell len Vermehrungsphase. Da die kleinste bekannte 'Generations·· zeit «· die des Bact. coil. Esch. ·» bei guten Lebensbedingungen etwa 20 min. beträgt, genügt es, die Verweilzeit im Vorgefäß 6 auf etwa 10 oder 5 min. zu halten, um zu gewährleisten, daß alle Mikroorganismen das Gefäß schneller verlassen müssen, als sie sich vermehren können. Daher bleibt die Untersuchungsflüs·* sigkeit im Vorgefäß 6 stets keimarm, theoretisch sogar keimfrei, letzteres allerdings nur dann, wenn sie auch keimfrei zugegen ben wird.
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Die aus dem Durchlaufgefäß 1 ständig in das Meßgefäß 2 gelangenden Mikroorganismen der Stamtnlösung sind «war durch den selbsterseugten Nährstoff mangel schon etwas in ihrer Vermehrung gehemmt, aber gleichwohl noch sehr Jung (mittleres Lebensalter-«. Mittlere Verweilzeit) und sehr lebensbegierig. In Meßgefäß 2 erhalten sie über das Vorgefäß 6 ständig neue Nährlösung, die sie sofort zu intensiver Lebenstätigkeit an*· regen, erkenntlich an einem entsprechenden 0,,·»Verbrauch, der von der (^«-Elektrode als Verringerung der (^«Konzentration er« faßt wird und an einem angeschlossenen Anzeige« oder Schreib» gerät abgelesen werden kann. Anstelle des 02«Verbrauchs kann auch ein anderer stoffwechselbedingter Vorgang (z.B. die CO0-.
Zunahme, oder eine Färb« oder Trübungsänderung) zur Messung herangezogen werden.
Enthält nun die über das Vorgefäß 6 in das Meßgefäß 2 gelangende zu untersuchende Flüssigkeit giftige Stoffe, die die über das Durchlaufgefäß 1 ebenfalls hineingelangenden Mikroorganismen abtöten oder auch nur in ihrer Lebenstätigkeit hem·· men, so macht sich dies dadurch bemerkbar, daß die 0„«Zehrung im Meßgefäß 2 geringer wird oder ganz aufhört· Die dabei ge« messene 0-«Konzentration im Meßgefäß nähert sich der Luftsät·» tigungskonzentration und erreicht sie dann ganz, wenn das Gift so stark bzw. konzentriert ist, daß es sofort alle Mikroorga« nismen abtötet.
Durch das Verhältnis der Strömungsgeschwindigkeiten der Stammlösung zu der zu untersuchenden Flüssigkeit sowie durch die Zusammensetzung und Konzentration der Nährlösung bzw. der dadurch bedingten Art und Konzentration der Mikroorganismen sind die Mittel zur Festlegung der Meßempfindlichkeit des Verfahrens in die Hand gegeben« Die Nullpunktslage, d.h. die
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O-«+Konzentrat ion, die sich im Meßgefäß einstellt, trenn kei«· nerlei auf Mikroorganismen wirkende Schadstoffe in der zu untersuchenden Flüssigkeit vorhanden sind, erhält man dadurch, daß als zu untersuchende Flüssigkeit reines Wasser verwandet wird.
Als Beispiel sei etwas näher auf die Änderung der 0_·»Κοη·* zentration eingegangen, die bei der Verwendung von Bact· coli Ssen, zweckmäßig verfolgt wird· Sie läßt sich durch passende Wahl der Nährstoffzufuhr der Verweilzeiten und des Mischungsver·· hältnisses Zuchtlösung/Untersuchungslösung z.B. auf 20 % der Luftsättigung einstellen und halten« Das ist ein bevorzugter Wert für den Skalenendpunkt bei völliger Abwesenheit von Gift** stoffen·
Einem auf diese Weise festgelegten 02«»Meßbereich von vor«· zugsweise 20 % bis 100 % der Luftsättigung läßt sich sinnge« maß eine Giftwirkung von 0 bis 100 % zuordnen· Anstelle einer willkürlichen (z,B, linearen) Zuordnung kann man aber auch Ver** dünnungsreihen von besondere interessanten Giftstoffen als Un«· tersuchungslösungen verwenden und die sich jeweils dabei ein«· stellenden 0o« Konzentrationen den Giftkonzentrationen zuordnen *· d.h. die ganze Anordnung eichen·
Diese Eichfähigkeit und die jederzeit leicht durchführ»· bare Nachprüfung der beiden Skalenendpunkte durch Verwendung von giftfreiem bzw· hochgiftigem Untersuchungswasser machen die Anordnung zu einem echten Meßgerät·
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Claims (1)

  1. «10 - 2228/71
    Patentansprüche
    1. Verfahren zur Bestimmung der Toxizität von Flüssigkeiten, insbesondere von wässrigen Flüssigkeiten, trie Abwässern, unter Verwendung von Mikroorganismen, dadurch gekennzeich·* net, daß nit Hilfe einer Nährstofflösung kontinuierlich gezüchtete Mikroorganismen int stationären Gleichgewichts*« zustand eines Durchlat&ystems als Stamntlösung unter Ein·« haltung konstanter Mengenverhältnisse und Bedingungen kon·* tinuierlich mit der zu untersuchenden Flüssigkeit und mit neuer Nährstoff lösung vermischt werden, und daß die gift«· bedingte Schädigung der Mikroorganismen über die Bestirnt« mung eines von der Lebenstätigkeit der Mikroorganismen ab*» hängigen Meßwertes, z.B. einer Trübung, einer Farbänderung des pHwWertes, der Menge gebildeter Kohlensäure etc·, vorzugsweise des Rückgangs der Sauerstoff zehrung, als Pa<* rameter der Giftwirkung erfaßt wird·
    2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
    die Artenzahl der gezüchteten Mikroorganismen in der Stamm»· lösung durch Einhaltung scharf definierter chemischer und physikalischer Bedingungen (Zusammensetzung und Konzentrat tion der Nährstoffe, des Sauerstoffs und der Stoffwechsel*« produkte! Temperatur) und durch Einhaltung einer definier» ten mittleren Verweilzeit begrenzt wird·
    3· Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2y dadurch gekennzeich** net, daß die mittlere Verweilzeit der Stammlösung während der kontinuierlichen Züchtung der Mikroorganismen deutlich größer als die Generationszeit der zu züchtenden Mikroor«-» ganismen, jedoch nicht um Größenordnungen größer als jene eingestellt wird·
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    k. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekenn·· zeichnet, daß die Stammlösung einem lebhaften Gasaus«· tausch mit der Atmosphäre unterzogen wird·
    5· Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekenn** zeichnet, daß der zu untersuchenden Flüssigkeit die glei* chen Nährstoffe zugesetzt werden, wie der Stammlösung, und daß sie im Bedarfsfall mit Luftsauerstoff gesattigt wird.
    6. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Nährstofflösung als weitgehend selbststeriles Konzentrat zubereitet und in Vorrat gehal« ten wird, das allein durch die für die Herstellung der Stammlösung vorzunehmende Verdünnung seine Sterilität verliert.
    7. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 6,
    gekennzeichnet durch ein im wesentlichen aus drei in Flüe« sigkeitsverbindung miteinander stehenden und mit Rührein*· richtungen ausgerüsteten Gefäßen mit Zusatzgerätschaften bestehende Einrichtung, nämlich:
    a) einem Durchlauf gefäß (l) zur Herstellung der Mikroor*· ganismen enthaltenden Stammlösung aus mittels Leitun» gen zugeführter konzentrierter Nährstofflösung und Verdünnungswasser, dessen Flüssigkeit »«»Oberfläche im Gasaustausch mit der freien At«moSphäre steht j
    b) einem unter Luftabschluß stehenden Meßgefäß (2), das mit einer Meßeinrichtung zur Erfassung der Sauerstoff·· Sättigung der zu untersuchenden Flüssigkeit ausgerü«· stet ist}
    Ls/g ~ 12 .
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    c) einem Vorgefäß (6) asur Vorbereitung und Sauerstoff* Sättigung der zu untersuchenden Flüssigkeit, das mit einer Zuführungsleitung für Luft ausgerüstet ist und dessen Flüssigkeits^Oberflache in Gasaustausch mit der freien Atmosphäre steht;
    d) einem an das Meßgefäß (2) angeschlossenen Überlauf·· rohr (4), dessen Höhe das Flüssigkeitsniveau in «de« offenen Gefäßen bestimmt.
    8« Vorrichtung nach Anspruch 7» dadurch gekennzeichnet, daß die Größe der drei Gefäße auf die Generationszeit der zur Verwendung kommenden Mikroorganismen der Stamralösung und deren in kontinuierlichem Fluß zu verwendende Menge der« art abgestimmt .ist, daß sich in dem Durchlaufgefäß (l) eine die Generationszeit deutlich überschreitende, in dem Vorgefäß (2) eine die Generationszeit beträchtlich unterschreitende Verweilzeit einstellt.
    9· Vorrichtung nach den Ansprüchen 7 und 8, dadurch gekenn·-*
    zeichnet, daß das Durchlaufgefäß (l) und das Vorgefäß (6) Wk in gleicher Höhe angeordnet und gleich hoch ausgebildet
    und mit bodenseitig angebrachten Fallc*Leitungen zu dem tiefer stehenden Meßgefäß (2) versehen sind.
    10. Vorrichtung nach Anspruch 7t dadurch gekennzeichnet, daß das Durchlaufgefäß (l) mit einem mechanischen Rührer, das Meßgefäß (2) mit einem Magnetrührer (3) ausgestaltet ist.
    11. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Meßgefäß (2) mit einer Sauerstoff«Elektrode (5) zur laufenden Erfassung der Sauerstoffkonzentration ausgestal* tet ist.
    Ls/g 309819/109S
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