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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Diese
Erfindung betrifft allgemein Verfahren zur Herstellung von experimentellen
Biofilmmatrizes auf ausgewählten
Oberflächen.
Noch spezieller betrifft diese Erfindung die Herstellung von simulierten natürlichen
Biofilmen zum Testen der Aktivitäten
von formulierten Produkten auf Inhibierung oder Abtrennung der simulierten
Biofilme aus einem Drainagesystem.
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Seit
1943 gibt es eine enorme Entwicklung der technischen Literatur im
Zusammenhang mit Fortschritten in der Biofilmforschung. Das Verständnis von
Biofilmprozessen hat in der letzten Dekade rasche Fortschritte gemacht.
Eines der grundlegenden Ziele bei der Untersuchung von Biofilmen
ist es, Möglichkeiten
zur Handhabung dieser Prozesse zum technischen und ökologischen
Vorteil zu entwickeln. Überblicke über die
Biofilmwissenschaft gibt es in Veröffentlichungen, wie beispielsweise
Food Reviews International, 8 (4), 573 (1992); Microbial Ecology
in Health and Disease, 8 305 (1995); Annu. Rev. Microbial., 49 711
(1995); Applied and Environmental Microbiology, 4014 (Nov. 1996);
und "Biofilms" von W. G. Characklis
und K. C. Marshall (John Wiley & Sons,
Inc., New York, 1989).
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Wie
in der technischen Literatur ausgeführt ist, besteht ein Biofilm
aus Zellen, die auf einem Substrat immobilisiert und in einer organischen
Polymermatrix mikrobiellen Ursprungs eingebettet sind. Ein Biofilm
ist eine Oberflächenansammlung,
die in Zeit oder Raum nicht notwendigerweise einheitlich ist. Ein Biofilm
kann aus einem erheblichen Anteil an anorganischen oder abiotischen
Substanzen zusammengesetzt sein, die durch die biotische Matrix
kohäsiv
zusammengehalten werden. Ein Biofilm ist eine Schutzmatrix für Bakterien,
mit dem essentiellen Zweck des Überlebens
in einer Umgebung mit begrenzter Nährstoffzufuhr.
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Biofilme
bestehen sowohl aus Wirtsmikroben und deren extrazellulären Produkten,
normalerweise Exopolysacchariden. Mikroben zeigen eine Tendenz zur
Bildung dieser schützenden
Exopolysaccharidmatrizes, nachdem sie an einer Oberfläche haften. Die
Bildung von Biofilmkomplexen erfordert nur feuchte Bedingungen und/oder
Wassersysteme und den Kontakt mit einer Trägeroberfläche und/oder Grenzfläche. Im
Hinblick auf Nährstoffe
kann ein Nährstoffmangel
sogar die Biofilmbildungsfähigkeit von
Mikroben erhöhen,
wie beschrieben in Adv. Appl. Microbiol., 29 93 (1983).
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Biofilme
können
generell von nahezu allen Mikroben unter geeigneten Bedingungen
gebildet werden. Die häufigsten
Biofilmerzeuger gehören
zu den Gattungen Pseudomonas, Enterobacter, Flavobacterium, Alcaligenes,
Staphylococcus und Bacillus. Es gibt auch Anaerobier, die korrosive
Biofilme aufbauen können.
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Zusätzlich zu
Problemen bei der Reinigung und Hygiene können Biofilme Energieverluste
und Verstopfungen in Kühl-
und Wärmeaustauscherrohren
hervorrufen, Wasser- und Abwassersysteme stören, und Verkrustungen an Schiffsrümpfen bilden,
die einen Fahrtwiderstand verursachen. In den medizinischen Disziplinen
kann ein Biofilm (auch als "Glycocalyx" bezeichnet), der
durch Bakterien, wie beispielsweise eine Pseudomonas-Spezies, gebildet wird,
die systemische Ursache von Krankheiten der Lunge oder des Magen-Darm-Trakts
und der Harnwege sein. Darüber
hinaus kann ein Biofilm, der durch Bakterien, wie beispielsweise
Staphylococcus-Spezies, gebildet wird, ein ernstes Kontaminationsproblem
bei Fremdkörperinstrumenten,
wie beispielsweise Herzschrittmachern, Kathetern, Prothesen, künstlichen
Klappen und ähnlichem,
darstellen. Zahnbelag ist auch eine typische Form eines Biofilms.
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Einer
der Hauptzwecke der natürlichen
Biofilmbildung ist der Schutz der Wirtsmikroben in einer feindlichen
Umgebung. Als Folge gibt es eine kämpferische Wechselwirkung zwischen
Mikroben in Biofilmen und bioziden Trägern, wie beispielsweise Konservierungsmitteln,
Desinfektionsmitteln und Antibiotika. Die sessile Art von Bakterienwachstum
in Biofilmen unterscheidet sich auch von der der gleichen Bakterienspezies,
die als planktonartige Zellen in einem zirkulierenden wässrigen
Medium vorhanden sein können,
das an den Biofilm angrenzt. Biofilme wirken auch als Falle für den Nährstofferwerb,
was ein wichtiger Faktor ist, wenn das Bakterienwachstum auf Oberflächen und
die Nährstoffzufuhr
oligotroph sind.
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Wegen
der vielfältigen
Auswirkungen der Biofilmbildung gibt es eine ernsthafte Verpflichtung
zur Biofilmforschung in einem weiten Bereich wissenschaftlicher
Untersuchungen. Methoden zur Untersuchung der Biofilmbildung umfassen
mikrobiologische, physikalische und chemische Methoden. Wenn Mikroben
aus extremen natürlichen
Umgebungen gezüchtet
werden, liefern standardmäßige Plattenauszählungen
normalerweise keine akkuraten Schätzungen. Die klassischen Evaluationsmethoden,
die auf dem mikrobiologischen Anlegen von Plattenkulturen beruhen,
haben bei der Laboruntersuchung von Biofilmen, die einen authentischen
Zusammenhang mit natürlichen
Biofilmen, die in der Biosphäre
existieren, erzielen sollen, einen fragwürdigen Wert. Darüber hinaus
ist die Bildung eines Biofilms vom natürlichen Typ in der Laborumgebung
schwierig, insbesondere da gegenwärtig keine standardisierten
Methoden verfügbar
sind.
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Es
gibt ein wachsendes Interesse an der Forschung und Entwicklung von
Methoden zur Herstellung und Untersuchung von Biofilmen in der Laborumgebung.
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Veröffentlichungen
von Hintergrundinteresse mit Bezug auf die vorliegende Erfindung
umfassen Water Research Pergamon Press, 2 597 (1968); Corrosion
97, Veröffentlichung
Nr. 405 von M. L. Ludyanskiy und F. J. Himpler (NACE Int., Conf.
Div., Houston, Texas); und darin zitierte Literaturstellen.
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WO
93 01 497 (KIWA N.V.) beschreibt ein Verfahren zur Überwachung
der Bildung von Ablagerungen auf Oberflächen, die einer Flüssigkeit
ausgesetzt sind, die im wesentlichen Wasser enthält.
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US 5 873 997 (Kaplan) betrifft
ein Verfahren und eine Apparatur zur Messung der Konzentration von
Kontaminationen in einem wässrigen
Wassersystem.
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EP-A-0
165 801 (KYOWA HAKKO KOGYO CO., LTD.) beschreibt ein Verfahren zur
aseptischen Probenahme einer Flüssigkeitskultur
aus einem Fermentationsbehälter,
der ein Fermentationsmedium enthält.
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EP-A-0
561 549 (COBE LABORATORIES, INC) beschreibt ein Verfahren zum Konzentrieren von
Zellclustern, die in einer Flüssigkeit
enthalten sind.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Demgemäß stellt
die Erfindung ein Verfahren zum Bereitstellen eines Drainagesystems
(10) bereit, umfassend einen Biofilm, umfassend
- (1) Bereitstellen eines Drainagesystems (10),
das eine Leitung (14) mit einem Zuflussende und einem Abflussende
umfasst, worin die Leitung (14) einen mittleren Durchmesser
von 0,9 bis 5 cm hat;
- (2) Einbringen eines ersten wässrigen Nährstoffmediums und eines Inoculums,
das die Bakterienart Sphaerotilus-Leptothrix umfasst, in das Zuflussende
der Leitung bis zur vollständigen
Volumenauslastung ohne Entwässerung;
- (3) Halten des wässrigen
Suspensionsmediums in der Leitung (14) über einen Inkubationszeitraum, der
ausreicht, um die Bakterienbesiedlung an der Innenfläche der
Leitung zu initiieren;
- (4) Ablassen der Suspension aus dem Abflussende der Leitung
(14);
- (5) Wiederauffüllen
und Ablassen der Leitung (14) mit einem zweiten wässrigen
Nährstoffmedium mindestens
einmal alle 24 Stunden im Gesamtzeitraum unter simulierten Bedingungen
der Drainageanwendung, um die Biofilmbildung an der Innenfläche der
Leitung zu unterstützen;
und
- (6) Wiederholen des Wiederauffüll- und Ablasszyklusschrittes
aus Schritt (5) über
einen Gesamtzeitraum von bis zu etwa 40 Tagen, der ausreicht, um
eine Biofilmmasse zu erhalten, die mindestens etwa 20% des Leitungsvolumens
ein nimmt; wobei das erste wässrige
Nährstoffmedium
und das zweite wässrige
Nährstoffmedium
gleich oder verschieden sein können.
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Die
Erfindung stellt auch ein Drainagesystem bereit, das einen Biofilm
umfasst, der durch das Verfahren der Erfindung erhältlich ist.
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Die
Erfindung stellt weiterhin die Verwendung des Drainagesystems der
Erfindung zum Testen der Aktivität
eines Reinigungsprodukts oder einer Reinigungsvorrichtung zur Verfügung.
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Darüber hinaus
stellt die Erfindung die Verwendung des Drainagesystems gemäß der Erfindung
zum Testen der Aktivität
eines Produkts zum Öffnen
von Rohrleitungen, die mit Biomasse verstopft sind, zur Verfügung.
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Umhüllte Bakteriengattungen
und -spezies sind beschrieben in "Bergey's Manual of Systemic Bacteriology" (Band 3; Williams & Wilkins; Baltimore); "Biology of Microorganisms" (7. Auflage; Prentice Hall,
Englewood Cliffs, N.J.); und Microbiological Reviews, S. 329–356 (Juni
1978).
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Für die Zwecke
der vorliegenden Erfindung wird die Sphaerotilus-Leptothrix-Gruppe von umhüllten Bakterien
verwendet. Gattungsarten umfassen Sphaerotilus natans, Leptothrix
lopholea, Leptothrix ochracea, Leptothrix cholodnii und Leptothrix
discophora.
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BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNG
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1 ist
eine seitliche Aufrissansicht eines Drainagesystems der Erfindung.
Wie gezeigt, umfasst das Drainagesystem 10 einen Ausguss 12,
der sich am Zuflussende der Leitung 14 befindet. In der Zeichnung
ist die Leitung 14 so konstruiert, dass sie eine P-Falle 20,
eine Entlüftungsleitung 21 und
ein Magnetventil 22 umfasst. Der Abfluss aus der Leitung 14 fließt durch
Leitung 24 in den Ausflussaufnahmebehälter 25. Wässriges
Nährmedium
wird durch die Pumpe 18 aus dem Zufuhrbehälter 15 über die
Leitung 16 zur Leitung 14 bereitgestellt. Der
Timer 19 kontrolliert den Fluss der wässrigen Nährstoffzufuhr und den Abfluss
des Systems durch das Magnetventil 22.
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Wie
gezeigt, hat die Leitung 14 einen Innendurchmesser von
1,5 cm und ist aus transparentem Polyvinylchlorid konstruiert. Die
Leitung 14 kann einen In nendurchmesser von etwa 0,9 bis
5 cm haben, und kann aus anderen Materialien, wie beispielsweise
Metall oder Glas, konstruiert sein.
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BESCHREIBUNG DER SPEZIELLEN
AUSFÜHRUNGSFORMEN
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Ein
standardisiertes Nährmedium
kann für die
bakteriellen Biofilmwachstumszyklen verwendet werden. Geeignete
Nährmedien
für die
Biofilmbildung sind in technischen Veröffentlichungen beschrieben,
wie beispielsweise Biotechnol. Bioeng., 53 (5), 459 (1997); auf
die hiermit Bezug genommen wird. Ein typisches Nährmedium enthält Quellen
für Kohlenstoff,
Stickstoff, Phosphat und Spurennährstoffe.
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Ein
entscheidender Aspekt des Drainagesystems der vorliegenden Erfindung
ist das Einbringen eines Inoculums, das die Bakterienart Sphaerotilus-Leptothrix
umfasst. S. Natans veranschaulicht eine bevorzugte Spezies von umhüllten Bakterien
in der vorliegenden Erfindung. Umhüllte Bakterien sind fadenförmige Organismen
mit einem einzigartigen Lebenszyklus, der die Bildung von geisseltragenden Schwärmzellen
in einer langen Röhre
oder Umhüllung
beinhaltet. Unter günstigen
Bedingungen geschieht das Wachstum im Faden, was zur Bildung von
langen, zellbepackten Umhüllungen
führt.
Unter ungünstigen
Bedingungen entweichen die Schwärmzellen
und werden in neuen Umgebungen dispergiert, wobei sie die leere
Umhüllung
zurücklassen. Umhüllte Bakterien
sind häufig
in Frischwasserlebensräumen,
die reich sind an organischer Materie, wie beispielsweise verschmutzten
Flüssen,
tropfenden Filtern und aktivierten Klärschlammanlagen, und sie werden
hauptsächlich
in fließenden
Gewässern gefunden.
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S.
Natans ist ein wertvoller Träger
für die Zwecke
der vorliegenden Erfindung, und zwar wegen seiner Fähigkeit,
sich unter natürlichen
oder simulierten Nährstoffbedingungen
rasch fortzupflanzen. Ein wichtiges Merkmal des Drainagesystems
der vorliegenden Erfindung ist die rasche Bildung eines Biofilms
in einer Abflussleitung zum Zwecke des Testens der Aktivität eines
Produkts in Abhängigkeit
vom simulierten Biofilm.
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Während der
Bildung des Biofilms im Drainagesystem kann das umlaufende Nährmedium
Haushalts-, Gewerbe- und Industrieabwasserverunreinigungen enthalten,
wie beispielsweise Rasiercreme, Haare, Hautzellen, Fett, Papier,
Nahrungsmittel, Leitungswasser und ähnliches. In einer bevorzugten Ausführungsform
wird ein bakterielles Inoculum aus einem natürlichen Biofilm zusammen mit
dem S. Natans verwendet. Ein Beispiel dafür ist ein bakterielles Inoculum,
das aus einem Haushaltsabfluss-Biofilm extrahiert wird. Das aufgezeichnete
Protokoll des Drainagesystems ist so ausgelegt, dass es eine wesentliche Übereinstimmung
mit simulierten Haushaltsabflussbedingungen bereitstellt, wodurch
die Bildung eines simulierten Biofilms im Reaktor gefördert wird,
der eine große Übereinstimmung
mit einem natürlichen
Haushaltsabfluss-Biofilm besitzt.
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Wie
hier verwendet, bedeutet der Begriff "simulierter Biofilm" einen abgeleiteten Biofilm, der eine wesentliche
phänotype Übereinstimmung
mit der bakteriellen Gemeinschaft in einem natürlichen Biofilm in Abflüssen hat.
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Wie
hier verwendet, bedeutet der Begriff "natürlicher
Biofilm" eine oberflächenvermittelte
bakterielle Gemeinschaft einer Biosphäre, die mit Umgebungsparametern
in einer dynamischen Beziehung steht.
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Das
Verfahren der vorliegenden Erfindung hat besondere Vorteile bei
der Herstellung von simulierten Biofilmen, die ein beguemer und
zuverlässiger Träger zum
Testen der Aktivitäten
von formulierten Produkten sind, wobei die Produkte zur Inhibierung oder
Abtrennung von natürlichen
Biofilmen dienen sollen, die eine phänotype Beziehung zu den jeweiligen
simulierten Biofilmen haben.
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Das
Verfahren der vorliegenden Erfindung kann in Bezug auf einen simulierten
Haushaltsabfluss-Biofilm veranschaulicht werden, der aus einem Inoculum
mit S. Natans und einem natürlichen
Haushaltsabfluss-Biofilm hergestellt wird.
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In
Bezug auf das Drainagesystem, das in 1 gezeigt
ist, werden das Inoculum und das wässrige Nährmedium in die Leitung 14 eingebracht, und
das enthaltene Flüssigkeitsvolumen
wird ohne Ablassen über
einen Inkubationszeit raum von etwa 2–48 Stunden bei einer Temperatur
von etwa 15°–45°C durch die
Leitung 14 im Kreis geführt.
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Nach
dem Inkubationszeitraum und Ablassen des Inkubationsmediums wird
wieder frisches Nährmedium
eingefüllt
und in zeitlich begrenzten Zyklen abgelassen, um die Bedingungen
bei der Verwendung von Haushaltsabflüssen zu simulieren. Normalerweise
wird der Zyklus aus Wiedereinfüllen des
Nährmediums
und Ablassen mindestens einmal alle drei Stunden während des
verstrichenen Zeitraums wiederholt.
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Innerhalb
eines Zeitraums von etwa 15 Tagen nimmt die simulierte Biofilmmasse
in der Leitung 14 mindestens etwa 20–30 Prozent des Innenvolumens
der Leitung 14 ein.
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Das
Verfahren der vorliegenden Erfindung stellt somit ein Drainagesystem
bereit, das eine Leitung mit einem mittleren Innendurchmesser von
etwa 0,9–5
Zentimetern umfasst, und eine Biofilmmasse auf der Innenfläche der
Leitung hat, die Sphaerotilus-Leptothrix-Kolonien (z.B. S. Natans)
umfasst, und die mindestens etwa 20% des Leitungsvolumens einnimmt.
Vorzugsweise enthält
der Biofilm weitere Bakterienkolonien, die aus Leitungswasser unter
simulierten Bedingungen der Verwendung von Haushaltsabflüssen abstammen,
und/oder Bakterienkolonien, die aus einem natürlichen Biofilminoculum abstammen.
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Das
Drainagesystemverfahren der vorliegenden Erfindung ist allgemein
verwendbar für
die Herstellung von simulierten Biofilmen, die in einem weiteren
Protokoll zum Testen der Aktivität
eines experimentellen Produkts oder eines kommerziellen Produkts
verwendet werden sollen. Das weitere Protokoll kann das Testen der
Aktivität
von Produkten, wie beispielsweise Bioziden und Reinigern, sowie Produkten
zur Öffnung
von Leitungen, die mit Biomasse verstopft sind, und ähnliches
umfassen.
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Das
folgende Beispiel soll die vorliegende Erfindung weiter veranschaulichen.
Die Komponenten und speziellen Bestandteile werden als typisch dargestellt,
und verschiedene Modifikationen können mit Bezug auf die oben
stehende Beschreibung innerhalb des Umfangs der Erfindung gemacht
werden.
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BEISPIEL
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Dieses
Beispiel veranschaulicht das Verfahren zum schnellen Biofilmwachstum
in einem Drainagesystem und die Anwendung des Systems zum Testen
eines Abflussreinigungsprodukts gemäß der vorliegenden Erfindung.
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Eine
Kolonie von S. natans (ATCC 15291) wird auf einer CGY-Platte ausgestrichen,
und die Platte wird 48 Stunden lang bei 28°C inkubiert. Eine Kolonie aus
der frisch gewachsenen Platte wird in 100 mL CGY-Medium geimpft
und über
Nacht in einem Schüttelinkubator
inkubiert.
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Das
CGY-Medium hat die folgende Zusammensetzung: Casitone
(Difco 0259) 5 g
| Glycerin | 10
g |
| Hefeautolysat | 1
g |
| Destilliertes
Wasser | 1
L |
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Ein
Drainagesystem gemäß 1 wird
verwendet, zusammen mit Zusatzausrüstung, die in 1 nicht
gezeigt ist. Das Drainagesystem wird mit 115 mL CGY-Medium gefüllt, und
das Medium wird mit 10 mL des S. natans-Präparats inoculiert. Es werden
Kreislaufrohrleitungen verwendet, um 125 mL des flüssigen Drainagesystemmediums 24 Stunden lang
zu zirkulieren. Nach 24 Stunden wird das CGY-Medium abgelassen,
und es wird mit dem zeitgesteuerten Wiederauffüllen und Ablassen des Mediums
im Drainagesystem begonnen. CGY-Medium wird in die Drainagesystemleitung
eingefüllt,
und nach 40 Sekunden wird das Medium abgelassen. Dieser Zyklus wird
einmal in jeder Stunde über
10 Stunden am Tag über
einen Zeitspanne von etwa 10–20
Tagen wiederholt, bis das freie Volumen der Abflussleitung um etwa
30% reduziert ist.
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Wahlweise
umfasst das Inoculum authentische natürliche Abflussbiofilmbakterien,
und das Nährmedium
umfasst Rasiercreme, Haare, Hautzellen und andere Verunreinigungen
von Haushaltsabflüssen,
die speziell von Interesse sind.
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Volumenmessung
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Es
wird ein Gummistopfen verwendet, um das Abflussende des Drainagesystems
zu verschließen.
Entionisiertes Wasser (200 g) wird in die Zuflussleitung gegossen,
bis der Wasserspiegel den Seitenabschnitt füllt und das Abluftrohr erreicht.
Das Gewicht des zugegebenen Wassers wird bestimmt, und dieses wird
in einen Volumenwert umgerechnet (bei einer Dichte von 1 g/mL).
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Der
Gummistopfen wird abgenommen, und der Wasserinhalt wird abgelassen.
Es werden drei Volumenmessungen durchgeführt und ein Mittelwert der
Ergebnisse gebildet.
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Wenn
die Bildung des Biofilms beginnt, werden die Volumenmessungen einmal
alle 2–3
Tage durchgeführt.
Mit der Flussratenmessung wird nicht begonnen, bevor es mindestens
eine 30 prozentige Reduktion des gemessenen Volumens gibt.
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Flussratenmessung
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Es
wird ein Gummistopfen verwendet, um das Abflussende des Drainagesystems
zu verschließen.
Entionisiertes Wasser (1500 mL) wird in den Abflussabschnitt gegossen.
Der Stopfen wird abgenommen, und die Zeit für das Auslaufen aus dem Abfluss wird
aufgezeichnet.
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Die
Flussrate wird einmal täglich
gemessen, und die Messung wird fünfmal
wiederholt, um einen statistischen Mittelwert zu berechnen.
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Behandlung von Biofilm
in einem Drainagesystem
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Zum
Testen der Aktivität
eines Reinigungsprodukts werden mindestens zwei identische Drainagesysteme
gleichzeitig betrieben, um einen Biofilm in den jeweiligen Abflussleitungen
wachsen zu lassen.
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Eine
Probe eines Reinigungsprodukts (Liquid DRANO®, 113,4
g (4 ounces)) wird in ein Drainagesystem gegeben, und eine gleiche
Menge entionisiertes Wasser wird in das Vergleichs-Drainagesystem
gegeben.
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Die
Anwendungen werden 15 Minuten lang in den Leitungen gehalten. Die
Anwendungen werden dann abgelassen, und die Leitungen werden mit 3,785 Liter
(1 Gallone) warmem Wasser (45°C)
gespült.
Direkt danach werden Flussraten- und Volumenmessungen durchgeführt, um
die Wirkungen der Reinigeraktivität auf die Biofilmmasse des
Drainagesystems zu bestimmen. Die Messungen werden etwa 24 Stunden
nach der Behandlung wiederholt.
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Wenn
erneutes Wachstum des Biofilms bestimmt werden soll, wird wieder
mit der Prozedur der Nährstoffzufuhr
begonnen, und die entsprechenden Protokolle werden durchgeführt.