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Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur kontinuierlichen Messung der Toxizität von wässerigen
Flüssigkeiten, insbesondere von Abwässern, unter Verwendung von Mikroorganismen sowie auf eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens.
Es ist bekannt, dass es Parallelen gibt zwischen der Wirkung von Giftstoffen auf Mikroorganismen (Bakterien, Algen, Protozoon) und der Wirkung auf höhere Tiere und Menschen. Daher könen viele unspezifische
Toxizitäts-Untersuchungen in vivo mit Mikroorganismen an Stelle höherer Tiere ausgeführt werden.
Es ist bei Anlagen zur Abwasserreinigung bekannt, den Abwasserschlamm durch eine möglichst wirtschaftliche Sauerstoffzuführung zu beleben und damit dessen Reinigung zu beschleunigen. Bei einer bekannten derartigen Anlage wird in einem Mischgefäss kontinuierlich Abwasser, Rücklaufschlamm und Luft eingebracht und die Effizienz der Belüftung in Abhängigkeit von wechselnden Schlammkonzentrationen, und damit in Abhängigkeit von wechselnden Konzentrationen der Mikroorganismen gemessen. Hiebei erfolgt jedoch keine Züchtung von Mikroorganismen auf eine definierte und konstant bleibende Konzentration und im
Durchflussbetrieb ist diese bekannte Anlage nicht an die Einhaltung bestimmter Verweilzeiten im Sinne der
Erfindung gebunden.
Es sind auch schon Untersuchungsmethoden ausgearbeitet und beschrieben worden, mit denen die
Schädlichkeit von Abwässern unbekannter Zusammensetzung für Flüsse und Seen dadurch festgestellt wird, dass die Schadwirkung auf einige für die Vorfluter typische Mikroorganismen festgestellt wird. Obgleich die
Ergebnisse von Untersuchungen nach solchen bekannten Untersuchungsmethoden im Prinzip auch Schlüsse auf die Giftigkeit gegenüber höheren Tieren und Menschen zulassen, so sind diese doch nicht darauf angelegt, solche
Schlüsse tatsächlich zu ziehen. Davon abgesehen haben diese Methoden auch einige Nachteile, die ihrer verbreiteten Anwendung bisher im Wege standen.
Ihre Durchführung ist langwierig und aufwendig und ihre
Aussagekraft ist durch die Schwierigkeiten begrenzt, die die Züchtung und Bereithaltung von Mikroorganismen mit hinreichend reproduzierbaren Eigenschaften mit sich bringen. Diese Schwierigkeiten werden in Fachkreisen so hoch eingeschätzt, dass man allgemein die Verwendung von Mikroorganismen für messtechnische Methoden bei normalen Anforderungen an deren Reproduzierbarkeit, Eichfähigkeit und Störunanfälligkeit für grundsätzlich unmöglich hält.
Der Erfindung ist die Aufgabe gestellt, ein Verfahren zur Messung der Toxizität von wässerigen
Flüssigkeiten, insbesondere von Abwässern vorzuschlagen, das gegenüber den bekannten Methoden dadurch entscheidend verbessert ist, dass es unter Verwendung von Mikroorganismen ausreichend reproduzierbare
Ergebnisse liefert, und dass es gegebenenfalls kontinuierlich ausgeübt werden kann.
Gemäss der Erfindung wird diese Aufgabe dadurch gelöst, dass in einem durchströmten Züchtungsgefäss eine konstante Konzentration eines durch die Zuchtbedingungen definierten Mikroorganismus bzw. einer Mischkultur durch kontinuierliche Züchtung und konstanten Zufluss und ebenso grossen Abfluss aufrechterhalten wird, und dass der Abfluss dieser Kulturflüssigkeit kontinuierlich einem Mess- bzw. Mischgefäss zugeführt und dort mit der ebenfalls konstant strömenden zu untersuchenden Flüssigkeit unter Einhalten definierter Verweilzeiten vermischt wird, wobei die Schädigung des Wachstums bzw. Stoffwechsels der eingesetzten Mikroorganismen als Mass für die Toxizität der zu untersuchenden Flüssigkeit messtechnisch erfasst wird.
Als Mass für die Toxizität kann beispielsweise in vielen Fällen die Trübung oder eine Farbänderung dienen.
Universeller anwendbar ist jedoch die Messung des pH-Wertes oder der bei den sich abspielenden Oxydationsvorgängen gebildeten Kohlensäure, oder die Messung der Sauerstoffkonzentration, welche besonders vorteilhaft erscheint. Dabei ist zu beachten, dass sich eine Vergiftung der Mikroorganismen in einer Abnahme des Kohlensäuregehaltes der Stammlösung bzw. einer Zunahme des Sauerstoffgehalts (Abnahme der Sauerstoffzehrung) auswirkt.
Das Verfahren gemäss der Erfindung zeichnet sich vor den erwähnten bekannten Untersuchungsmethoden vor allem dadurch aus, dass es sich zur kontinuierlichen Erfassung von Messwerten eignet, und dass es bei entscheidender Verbesserung der Reproduzierbarkeit der Eigenschaften der verwendeten Mikroorganismen auch deren Züchtung und Bereithaltung entscheidend vereinfacht.
Die Züchtung geschieht erfindungsgemäss in einem Züchtungsgefäss, da bei konstanter Temperatur kontinuierlich mit derfinierten Mengen von für die zu züchtenden Organismen spezifischen Nährstoffen versorgt wird. Durch intensives Rühren bei freiem Luftzutritt werden sowohl die Mikroorganismen, als auch deren Stoffwechselprodukte und eventuell vorhandene ungelöste Nährstoffe ständig in Schwebe gehalten, und es wird eine ausreichende Versorgung der Mikroorganismen mit Sauerstoff einerseits, die Ausgasung der gebildeten CO2 anderseits gewährleistet.
Ein solches Züchtungssystem strebt wie jedes konstant, beschickte Durchlaufsystem einem stationären Gleichgewichts-Zustand zu, in welchem sowohl die chemischen Stoffe, als auch die Mikroorganismen nach Arten und Konzentrationen konstant sind und bleiben. Die Artenzahl der Mikroorganismen ist dabei umso stärker eingeschränkt und ihre Eigenschaften umso schärfer definiert, je schärfer auch die gesamten chemischen und physikalischen Bedingungen (Zusammensetzung und Konzentration der Nährstoffe, Zusammensetzung und Konzentration der Stoffwechselprodukte einschliesslich CO2, Konzentration des 2, Temperatur) definiert sind.
Diese Milieubedingungen sind-abgesehen von der Temperatur-im stationären Gleichgewichts-Zustand
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eines Durchlaufsystems wesentlich besser definiert als in den geschlossenen Systemen, die normalerweise zur
Züchtung von Mikroorganismen verwendet werden. Dieser Vorteil wird erfindungsgemäss noch dadurch entscheidend vergrössert, dass die mittlere Verweilzeit der Flüssigkeit im Züchtungsgefäss durch Festlegung von
Gefässgrösse und Durchflussgeschwindigkeit genau definiert und der Generationszeit der zu züchtenden
Mikroorganismen angepasst ist. Diese Anpassung geschieht derart, dass die mittlere Verweilzeit zwar deutlich grösser, z. B. etwa 2-bis 10fach, als die Generationszeit in der exponentiellen Vermehrungsphase eingestellt wird, aber in der gleichen Grössenordnung wie jene bleibt.
Etwas jenseits der exponentiellen Vermehrungsphase ergibt sich dabei eine effektive Generationszeit, die genau gleich der mittleren Verweilzeit ist, eine aus theoretischen Gründen unerlässliche Voraussetzung für die dauernde Existenz der Mikroorganismen im stationären Gleichgewicht. In diesem Zustand des Züchtungssystems gewinnen schliesslich den Existenzkampf solche Arten von Mikroorganismen, die die Voraussetzung : effektive Generationszeit = mittlere Verweilzeit auch unter den ungünstigsten Milieubedingungen bezüglich Verknappung der Nährstoffe und Anreicherung von Stoffwechselprodukten noch erfüllen.
Dieses Ausleseprinzip wirkt so scharf, dass das Züchtungsgefäss dauernd mit unsteriler Luft in Berührung kommen kann, ohne dass die durch die Luft eingebrachten Bakterien das biologisch-chemische Gleichgewicht merklich beeinflussen könnten. Durch passende Wahl der Nährstoff-und Temperaturbedingungen lässt sich die Selbstselektion sogar so weit treiben, dass schon nach einigen Tagen nur eine einzige bestimmte Bakterienart, also eine Monokultur im Züchtungsgefäss verbleibt, ganz gleich ob und womit die Flüssigkeit ursprünglich geimpft wurde. Eine solche Einschränkung der Artenzahl ist für toxikologische Untersuchungen insofern erwünscht, als verschiedene Arten auf verschiedene Gifte unterschiedlich reagieren. Definierte Aussagen setzen also definierte Arten von Mikroorganismen, im Extremfall Monokulturen, voraus.
Bei dem erfindungsgemässen Verfahren zur kontinuierlichen Toxizitätsmessung wird die Kulturflüssigkeit der nach der beschriebenen Art im stationären Gleichgewichts-Zustand eines Durchlaufsystems gezüchteten Mikroorganismen sofort nach dem Verlassen des Züchtungsgefässes zur Messung der Toxizität weiterverwendet.
Weitere Einzelheiten, Merkmale und Vorzüge des erfindungsgemässen Verfahrens werden nachstehend an Hand der Zeichnung erläutert, in der eine zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens geeignete Vorrichtung im Aufriss in schematisch vereinfachter Darstellung wiedergegeben ist.
Ein Züchtungsgefäss -l-wird zweckmässig mit einer hochkonzentrierten Nährlösung und getrennt davon mit Verdünnungswasser beschickt.
Zur Zucht von beispielsweise Bact. coli. Esch. kann die konzentrierte Nährlösung z. B. aus 10% Pepton, 10% Milchzucker, 20% Kochsalz und 60% Wasser bestehen. Auf Grund des hohen Kochsalz-Gehaltes ist sie fast autosteril und bleibt mehrere Wochen unverändert haltbar, selbst wenn sie offen und ungeschützt in unsteriler Luft stehen bleibt, was ihre praktische Handhabung sehr erleichtert.
Erst im Züchtungsgefäss-l--wird die konzentrierte Lösung mit Wasser verdünnt, u. zw. vorzugsweise im Verhältnis 1 : 50, so dass die Kochsalz-Konzentration in eine Grössenordnung kommt, die für das Wachstum und die Vermehrung der Mikroorganismen nicht mehr hinderlich ist.
Die das Züchtungsgefäss--l--verlassende Kulturflüssigkeit mit ihren Mikroorganismen gelangt über die Ableitung--7--kontinuierlich in ein kleineres gegenüber Luftzutritt abgeschlossenes Messgefäss--2--mit
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Die auf Toxizität zu untersuchende Flüssigkeit (meist Wasser oder Abwasser) muss zwecks Vermeidung von Messfehlern beim Eintritt in das Messgefäss --2-- ebenfalls mit Luftsauerstoff gesättigt sein. Hiezu gelangt sie zunächst in das Vorbereitungsgeäss --6--, wo durch intensives Rühren oder durch andere geeignete Belüftungsmassnahmen, wie Durchblasen von Luft über Zuleitung-8-, das O2-Sättigungsgleichgewicht mit
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wie die Kulturflüssigkeit über die Leitung --7-- in das Messgefäss--2--, wo sich beide Flüssigkeiten vermischen, und das sie gemeinsam durch den überlauf verlassen.
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und 6-bestehtVorbereitungsgefäss--6--aber deutlich kleiner gehalten wird, als die "Generationszeit" der Mikroorganismen in der exponentiellen Vermehrungsphase.
Da die kleinste bekannte"Generationszeit'-die des Bact. coli.
Esch.-bei guten Lebensbedingungen etwa 20 min beträgt, genügt es, die Verweilzeit im Vorbereitungsgefäss --6-- auf etwa 10 oder 5 min zu halten, um zu gewährleisten, dass alle Mikroorganismen das Gefäss schneller verlassen müssen, als sie sich vermehren können. Daher bleibt die Untersuchungsflüssigkeit im Vorbereitungsgefäss --6-- stets keimarm, theoretisch sogar keimfrei, letzteres allerdings nur dann, wenn sie auch keimfrei
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zugegeben wird.
Selbstverständlich muss die "Mittlere Verweilzeit" der Flüssigkeit im Messgefäss -2-- zur Vermeidung von Messfehlern ebenfalls deutlich unterhalb der"Generationszeit"der Mikroorganismen liegen.
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gelangenden Mikroorganismen der Kulturflüssigkeit sind zwar durch den selbsterzeugten Nährstoffmangel schon etwas in ihrer Vermehrung gehemmt, aber gleichwohl noch sehr jung (mittleres Lebensalter = mittlere
Verweilzeit) und sehr lebensgierig. Im Messgefäss --2-- erhalten sie über das Vorbereitungsgefäss--6-- ständig neue Nährlösung, die sie sofort zu intensiver Lebenstätigkeit anregen, erkenntlich an einem entsprechenden 02-Verbrauch, der von der 02-Elektrode als Verringerung der 02-Konzentration erfasst wird und an einem angeschlossenen Anzeige- oder Schreibgerät abgelesen werden kann.
An Stelle des 02-Verbrauches kann auch ein anderer stoffwechselbedingter Vorgang (z. B. die CO2-Zunahme, oder eine Farb- oder Trübungsänderung) zur Messung herangezogen werden.
Enthält nun die über das Vorbereitungsgefäss--6-in das Messgefäss --2-- gelangende zu untersuchende Flüssigkeit giftige Stoffe, die die über das Züchtungsgefäss-l-ebenfalls hineingelangenden Mikroorganismen abtöten oder auch nur in ihrer Lebenstätigkeit hemmen, so macht sich dies dadurch bemerkbar, dass die 02-Zehrung im Messgefäss --2-- geringer wird oder ganz aufhört. Die dabei gemessene 02-Konzentration im Messgefäss nähert sich der Luftsättigungskonzentration und erreicht sie dann ganz, wenn das Gift so stark bzw. konzentriert ist, dass es sofort alle Mikroorganismen abtötet.
Durch das Verhältnis der Strömungsgeschwindigkeiten der Stammlösung zu der zu untersuchenden Flüssigkeit sowie durch die Zusammensetzung und Konzentration der Nährlösung bzw. der dadurch bedingten Art und Konzentration der Mikroorganismen sind die Mittel zur Festlegung der Messempfindlichkeit des
Verfahrens in die Hand gegeben. Die Nullpunktslage, d. h. die 02-Konzentration, die sich im Messgefäss einstellt, wenn keinerlei auf Mikroorganismen wirkende Schadstoffe in der zu untersuchenden Flüssigkeit vorhanden sind, erhält man dadurch, dass als zu untersuchende Flüssigkeit reines Wasser verwendet wird.
Als Beispiel sei etwas näher auf die Änderung der 02-Konzentration eingegangen, die bei der Verwendung von Bact. coli Esch. zweckmässig verfolgt wird. Sie lässt sich durch passende Wahl der Nährstoffzufuhr der Verweilzeiten und des Mischungsverhältnisses Zuchtlösung/Untersuchungslösung z. B. auf 20% der Luftsättigung einstellen und halten. Das ist ein bevorzugter Wert für den Skalenendpunkt bei völliger Abwesenheit von Giftstoffen.
Einem auf diese Weise festgelegten 02-Messbereich von vorzugsweise 20 bis 100% der Luftsättigung lässt sich sinngemäss eine Giftwirkung von 0 bis 100% zuordnen. An Stelle einer willkürlichen (z. B. linearen) Zuordnung kann man aber auch Verdünnungsreihen von besonders interessanten Giftstoffen als Untersuchungslösungen verwenden und die sich jeweils dabei einstellenden 02-Konzentrationen den Giftkonzentrationen zuordnen-d. h. die ganze Anordnung eichen.
Diese Eichfähigkeit und die jederzeit leicht durchführbare Nachprüfung der beiden Skalenendpunkte durch Verwendung. von giftfreiem bzw. hochgiftigem Untersuchungswasser machen die Anordnung zu einem echten Messgerät.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur kontinuierlichen Messung der Toxizität von wässerigen Flüssigkeiten, insbesondere von
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durchströmten Züchtungsgefass (l) eine konstante Konzentration eines durch die Zuchtbedingungen definierten Mikroorganismus bzw. einer Mischkultur durch kontinuierliche Züchtung und konstanten Zufluss und ebenso grossen Abfluss aufrechterhalten wird, und dass der Abfluss dieser Kulturflüssigkeit kontinuierlich einem Messbzw. Mischgefäss (2) zugeführt und dort mit der ebenfalls konstant strömenden zu untersuchenden Flüssigkeit unter Einhalten definierter Verweilzeiten vermischt wird, wobei die Schädigung des Wachstums bzw. Stoffwechsels der eingesetzten Mikroorganismen als Mass für die Toxizität der zu untersuchenden Flüssigkeit messtechnisch erfasst wird.
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