DE3404441A1 - Vorrichtung zur bestimmung von mikroorganismen - Google Patents

Vorrichtung zur bestimmung von mikroorganismen

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Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Be- x ' Stimmung von Mikroorganismen auf der Grundlage biochemischer Tests. Insbesondere betrifft die Erfindung eine Vorrichtung zur Bestimmung bzw. Identifizierung von Mikroorganismen, die aus einer Anzahl Behälter besteht, von denen jeder Reagenzien zur Bestimmung bzw. Identifizierung dieser Mikroorganismen enthält und die auf einem einzigen tragenden Element angeordnet sind, auf dem sich ebenfalls eine Anzahl von Markierungseinheiten befinden, welche alle diejenigen Behälter verbinden, in denen sämtliche biochemischen Tests stattfinden, die zur Identifizierung eines spezifischen Mikroorganismus ausreichen.
Die Markierungen haben unterschiedliche Länge, Farbe und/oder Aussehen bzw. graphische Form und können auch teilweise durch Symbole und/oder Ziffern ersetzt werden.
Die Vorrichtung ist vorzugsweise kreisförmig angeordnet und die Behälter bestehen vorzugsweise aus Reagenzgläsern bzw. sind in der Form von Reagenzgläsern. Um den Gebrauch der Vorrichtung zweckmäßig zu gestalten, kann der Name des zu bestimmenden Mikroorganismus längs der Bestimmungsmarkierung geschrieben werden.
Die Reagenzien für die biochemischen Tests bzw. Analysen in den Behältern können getrocknet, gefriergetrocknet, fest, gepreßt oder in Form einer Lösung vorliegen. Die Behälter können ein wesentlicher Bestandteil der Vorrichtung selbst sein, oder sie können auf der Oberseite der Vorrichtung durch Adhäsion oder Einsetzen befestigt werden. Die Vorrichtung kann auch mit einer ZKntralein Vertiefung versehen r.i:in, die vorzugsweise kreisförmig ist.
,Ira vorliegenden Fall wird beispielhaft und ohne Beschränkung - die Anwendung einer solchen Vorrichtung zur Bestimmung bzw. Identifizierung der pathogenen Arten der Gattung Candida beschrieben.
Viele Candlda-Arten und unter ihnen alle pathogenen Arten sind häufig vorkommende Kommehsalen in den menschlichen Körperhöhlen. Solche Arten können bei vorliegender Empfänglichkeit des .Systems durch einen endogenen Vorgang eine Anzahl krankhafter Ereignisse bewirken.
Zusätzlich zu der am häufigsten isolierten Art, Candida albicans, besitzen mindestens sechs verschiedene Arten gewisse pathogene Eigenschaften, viz.: Candida stellatoidea, Candida krusei, Candida tropicalis, Candida pseudotropicalis, Candida guillermondii, Candida parapsilosis.
Daher ist es für die Diagnostik notwendig, nach der Isolierung des Candida-Stammes zu bestimmen, ob eine humanpathogene Art vorliegt.
Die Bestimmung bzw. Identifizierung der Arten, zu denen der betreffende Mikroorganismus gehört, wird durch die Anwendung biochemischer Analysen erreicht, z.B.:
a) Assimilation einiger Zucker in einem Kulturmedium, das keine andere Kohlenstoffquelle besitzt (C-auxanogram);
b) Fermentationstest einiger Zucker, und
c) Wachstum In Gegenwart bestimmter Substanzen.
Die Assimilationstests werden durchgeführt, indem mit der Aufschwemmung des zu bestimmenden Stammes und.einem besonderen C-auxanogramen Medium ein Bakterienagar hergestellt wird. Auf den letzteren werden entweder(Filter)papierscheiben gelegt, die unmittelbar vor Gebrauch mit den verschiedenen Zuckerlösungen getränkt wurden, oder es werden (Filter)papierscheiben mit den Zuckern in getrockneter Form aufgelegt, oder auch Porzellanbe-
- 5 hälter oder Porzellaneinsätze mit den Zuckerlösungen.
Es ist möglich, Platten für besonderen Gebrauch mit zonaler Unterteilung am Boden zu verwenden. Wird eine besondere Platte mit bereits vorhandener Unterteilung in Sektoren benutzt, muß der Benutzer sie nicht mehr unterteilen und es ist nur noch erforderlich, die Symbole der zu testenden Zucker einzutragen.
Die Ergebnisse der Assimilationstests werden nach 24 bis 48 Std. Bebrütung bei 25°C bis 37°C ermittelt. Werden Wachstumshöfe um die Assimilationszucker beobachtet, werden diese Höfe als positive Reaktion bzw. Testergebnisse betrachtet und mit dem Symbol (+) versehen, im Gegensatz dazu wird das Fehlen der Höfe mit (-) bezeichnet.
Fermentationstests werden normalerweise nach den auxanogram Tests durchgeführt, da sie die letzteren vervollständigen: tatsächlich kann ein Zucker, der nicht assimiliert wurde, nicht fermentiert werden. Somit werden nur die assimilierten Zucker getestet.
Die Tests bzw. Analysen können in Hefe-Wasser oder in Lösungen durchgeführt werden, die Vitaminfaktoren in einer bestimmten vorgewählten Konzentration enthalten und mit einer geeigneten Menge des zu testenden Zuckers. Um Gasbildung festzustellen, können Durham-Kapseln verwendet werden, oder eine Mischung aus Paraffinwachs und Petroleumgel.
Die Durchführung dieser Tests bzw. Analysen erfordert die An-. impfung des zu testenden Stammes, seine Inkubation bei 25°C bis 370C und tägliche Probeentnahmen bzw. Ablesungen bis zu 10 Tagen Inkubation.
Danach ist es möglich, die Arten mit Hilfe der Tabellen, die in vielen Lehrbüchern wid'ergegeben sind, wie z.B. J. Lodder, 197 0 Edn., The Yeast, North Holland Publishing Co., Amsterdam, zu bestimmen.
Kohlehydratassimilations- und Fermentationsanalysen können mit käuflichen gebrauchsfertigen Kits durchgeführt werden. Z.B. können "API 20 C Yeast System" (Analytab Products, Inc., New York) und "Uni-Yeast Tek System" (Flow Diagnostic) genannt werden.
API 20 C besteht aus 20 Zellkammern, in denen sich die dehydratisierten Kohlehydrate für die Assimilations- und Fermentationsanalysen befinden.
Die Zellkammern werden mit einer Aufschwemmung des zu testenden Pilzes gefüllt, wie hergestellt in einem Agar, der gelöst und auf 500C abgekühlt wird, der mit der Ausrüstung mitgeliefert wird. Nach Inkubation für 48 bis 72 Std. bei 300C kann die Zukkerfermentation am Farbumschlag eines Indikators und die Gasbildung an der Blasenbildung abgelesen werden.
Die Assimilation der Kohlehydrate wird durch das Wachstum der Stämme in den Zellen (Kammern) verdeutlicht.
Das Uni-Yeast Tek System besteht dagegen aus zwei Reagenzgläsern und einer vielfach unterteilten Petrischale. Die Reagenzgläser enthalten Nährmedien zum Auffinden der entwicklungsfähigen Pseudotubuli bzw. zur Assimilation von Saccharose und erlauben die Bestimmung von Candida stellatoidea.Die Petrischale enthält 11 periphere Unterteilungen, die festes Nährmedium für die Kohlehydratfermentation, den Ureasenachweis und für die Kohlehydrat- und Nitratassimilation enthalten. In der Mitte befindet sich ein kleiner Behälter mit Maismehl-Agar zum Nachweis des Mycels und der' Chlamydosporen.
Die Petrischale wird mit einem Tropfen der Aufschwemmung des zu testenden Pilzes in destilliertem Wasser beimpft und 2 bis 7 Tage lang bei 25°C bebrütet.
Es wurde eine Vorrichtung entwickelt, die es ermöglicht, auf
einfache und wirksame Art einen Mikroorganismus einer bestimmten Art zu identifizieren.,-im. vorliegenden Fall einen Mikroorganismus der Gattung Candida, die auf den Assimilations- und Fermentationstest einiger Zucker hinsichtlich der Möglichkeit des Wachstums in Gegenwart von-KNO- und Cycloheximid und der Fähigkeit zur üreasebildung basiert.
Die vorliegende Vorrichtung, vorzugsweise von kreisförmigem Umriß, hat an ihrer Oberseite bzw. Oberfläche eine Anzahl Behälter, die weise die Form von Reagenzgläsern haben, oder eine Anzahl leerer Zwischenräume, deren Zahl im vorliegenden Fall bei der Gattung Candida wenigstens 16 sein sollte.
Die Behälter enthalten Reagenzien für die biochemischen Analysen in eigendeiner der oben erwähnten Formen. Auf der Oberseite befinden sich Markierungen unterschiedlicher Länge, Farbe und/ oder Aussehen oder graphischer Form (auch teilweise ersetzt durch Symbole und/oder
Ziffern), die alle Behälter verbinden, in denen die biochemischen Tests stattfinden, die zur Bestimmung eines speziellen Mikroorganismus ausreichen. Entlang der Markierung kann der Name der zu bestimmenden Candida-Art eingetragen werden.
Eine solche Vorrichtung ermöglicht es, gleichzeitig die Assimilation und Fermentation der Zucker, das Wachstum in Gegenwart von KNO3 und Cycloheximid und die Ureaseproduktion zu testen.
Es ist somit möglich, die zu identifizierenden Arten schnell und wirksam zu bestimmen.
Figur 1 zeigt eine mögliche Ausführungsart der Vorrichtung zur Bestimmung der pathogenen Candida-Arten.
Auf der Vorrichtung befinden sich 7 Kreisbogenmarkierungen 17 bis 23 von unterschiedlicher Lär.cte und Farbe: die Farbgebung ist rein zufällig und in der nachstehenden Liste sind die Farben angegeben, die den zu bestimmenden Arten zugeordnet sind:
Gelb - Candida guillermondii (17)
Rot Candida albicans (20)
Grün Candida parapsilosis (21)
Weiß Candida pseudotropicalis (19)
Himmelblau Candida tropicalis (18)
Violett Candida krusei (23)
Orange Candida stellatoidea (22)
Zusätzlich gilt: ist die Markierung durchgehend ( ), ist
das Testergebnis positiv, ist sie unterbrochen ( ), variiert das Ergebnis und fehlt sie, ist das Ergebnis negativ.
Die Vorrichtung enthält auch Symbole der folgenden Bedeutungen:
f Fermentation
a Säurebildung
f/a Fermentation oder Säurebildung
-/a negativ oder Säurebildung
f/- Fermentation oder negativ
ν variabel
Ein Zucker wird fermentiert, wenn Säure und Kohlendioxid gebildet wird.
Ein Zucker wird angesäuert, wenn nur Säure gebildet wird.
In der Mitte der Vorrichtung befindet sich eine Vertiefung (24), die bei Verwendung einer Petrischale eine bestimmte Menge Wasser zur Anfeuchtung der Umgebung aufnimmt. Die Reagenzien für_ die biochemischen Tests werden in die 16 Behälter von 1 bis 16 einschließlich gefüllt in irgendeiner der schon beschriebenen Form und können anhand der Symbole der Reagenzien bestimmt werden.
Die 16 Behälter enthalten folgende Substanzen bzw.Reagenzien: Fermentationstests: Glukose (GLU) (13)
Maltose (MAL) (14) Saccharose (SAC) (15)
Lactose (LAT) (16) Wachstumstests: . KNO3 (1)
Cycloheximid + Glukose (CEX.) (12) üreasebildung: Harnstoff (URE) (3) Assimilationstests: Inosit (4)
Maltose (5)
Trehalose (TRE) (6)
Glukose (GLU) (7)
Saccharose (SAC) (8)
Cellobiose (CEL) (9)
Raffinose (RAF) (10)
Lactose (LAT) (11)
Kontrolle: kein Reagenz (2)
(für den Stickstoffassimilationstest)
pH-Indikatoren können den Substanzen beigefügt werden, um die Reaktionen deutlicher zu machen.
Zur Bestimmung der pathogenen Candida-Arten wird folgendermaßen vorgegangen:
Die Vorrichtung gemäß Figur 1 wird in eine Petrischale gestellt und die 8 Behälter, die die Zucker für die Assimilationstests wie oben erwähnt enthalten, und der Behälter mit dem Cycloheximid werden mit einem aushärtbaren bzw. verfestigenden Nährmedium ohne weitere Kohlenstoffquelle mit oder ohne pH-Indikator gefüllt. Der Behälter für den Nitrogenassimilationstest und der Kontrollbehälter (Vergleich) werden mit einem anderen aushärtbaren bzw. verfestigenden Nährmedium mit oder ohne einen pH-Indikator und ohne andere Stickstoffquelle gefüllt.
Dann wird die Aufschwemmung des zu testenden Mikroorganismus vorbereitet: die Kolonien werden von einer Isolationsplatte (z.B. Sabouraud) entnommen und damit werden alle Behälter für die Fermentationstests wie oben aufgezählt und auch der Harnstoff enthaltende Behälter beimpft. Zusätzlich wird ein Tropfen
COPV «
der Aufschwemmung in die Behälter mit dem bereits verfestigten Nährmedium gegeben.
Anschließend werden die Behälter für die Fermentationstests mit zuvor verflüssigtem Petroleumgel versiegelt. Der gesamte Einsatz wird dann bei 250C bis 300C bebrütet. Nach Abschluß der Bebrütung werden die Zückerassimilationstests ausgewertet: enthält die Testanordnung den erwarteten Mikroorganismus, findet man Wachstum oder Farbwechsel bei den pH-Indikatoren vor, an- · dernfalls kann keine Änderung beobachtet werden.
Die Farbe der Markierung wird beobachtet, die den Assimilationstest mit dem Cycloheximid-Wachstumstest, die positive Ergebnisse ergaben, (Wachstum oder Farbwechsel des pH-Indikators) verbindet und die Art der Gattung Candida ist bestimmt.
Zum Beispiel:sind die Assimilationstests für Maltose (MAL), Trehalose (TRE), Glukose (GLU) und das Wachstum in Cycloheximid positiv, bedeutet es, daß der Stamm Candida stellatoidea (durchgehende orangene Linie) vorliegt.
Folgt man der farbigen Markierung entlang ihres Umfangs, so kann man die Ergebnisse der biochemischen Tests, welche die Identifizierung bestätigen, ablesen- Im Falle von Candida stellatoidea sind die Fermentationstests für Glukose (GLU) und Maltose (MAL) positiv (f) , während derjenige von Saccharose (SAC) negativ (-/a) ist.
Der Kontrolltest dient als Hinweis für den Stickstoffassimilationstest (KNO3) .
Die Vorrichtung, Gegenstand der vorliegenden Anwendung, bzw. Erfindung, wie z.B. die in Figur 1 dargestellte, kann auch zur Bestimmung bzw. Identifizierung anderer pathogener Hefen herangezogen werden. Ihre Bestimmung basiert auf ähnlichen Tests mit der gleichen Verfahrensweise und wird mittels einer Tabelle
durchgeführt, worin die Ergebnisse solcher Tests eingetragen wurden. Solche Tabellen sind in vielen Nachschlagewerken, wie z.B. J. Lodder, 1970 Edn., The Yeast, North Holland Publishing Co., Amtsterdam, angegeben.
Beispiel
In der Vorrichtung gemäße Figur 1 bestehen die Reagenzien für , die Zuckerassimilationstests aus Lösungen der verschiedenen Zucker (20 % bis 40 %) in destilliertem Wasser mit Polyvinyl- alkohol (1 % bis 0,5 %). Das Reagenz für den Kaliumnitratassimilationstest ist eine Lösung von KNO3 der Konzentration 10 % in 1 % bis 0,5 % Polyvinylalkohol.
in der Kontrollösung für die Stickstoffassimilation liegen keine Reagenzien vor.
Das Reagenz für den Cycloheximidsensitivitätstest ist eine Glukoselösung von 20 % Konzentration in destilliertem Wasser und Polyvinylalkohol (1 % bis 0,5 %) und Cycloheximid (0,5 %).
Für den Ureaseproduktionstest ist das Reagenz eine besondere Christensentyp-Nährlösung mit pH-Indikator.
Die Reagenzien für die Fermentationstests sind übliche Spezialnährlösungen auf der Grundlage von Ochsenfleischextrakt, Natriumchlorid und destilliertem Wasser, die einzelnen Zucker liegen je in einer Konzentration von 2 % vor und Bromthymolblau ist der pH-Indikator. Anteile von 100 Mikroliter jeder Lösungwerden in die entsprechenden Behälter abgesetzt bzw. pipettiert, Jetzt wird die Vorrichtung in ein Gerät zum Trocknen der Reagenzien gestellt, z.B. unter ein Vacuum.
Anschließend kann die Vorrichtung (alleine oder in einer Petrischale) in eine Hülle aus entsprechendem Material, wie z. B. ein Plastikmaterial,gestellt werden, das dann versiegelt wird.
"··■ : 3 4 O A 4 A 1
JDie Sterilisation erfolgt entweder mit Äthylendioxid oder Gammastrahlen. Anschli.eJ5.end wird die Vorrichtung (alleine oder in einer Petrischale) in eine Hülle aus einem Material gegeben, das genügend Schutz gegen Feuchtigkeitseinwirkung bietet.
So vorbereitet kann die Vorrichtung eine, lange Zeit bei +20C" bis +80C aufbewahrt werden, bevor sie zur Bestimmung von Mikroorganismen herangezogen wird.
Das Nährmedium für die Zuckerassimilationstests basiert auf Y.B.N. (Difco), 2 % Agar-Agar und Bromkresolviolett als pH-Indikator. Das Nährmedium für die Stickstoffassimilationstests beruht auf Y.C.B. (Difco), 2 % Agar-Agar und Bromthymolblau als pH-Indikator.

Claims (11)

  1. 340U41
    Dr. F. Zumstein sen. - Dr. E. Assmann Dipl.-Ing. F. Klingseisen - Dr. F. Zumstein jun.
    PATENTANWÄLTE
    ZUGELASSENE VERTRETER BEIM EUROPÄISCHEN PATENTAMT REPRESENTATIVES BEFORE THE EUROPEAN PATENT OFFICE
    Case 1563/1876
    SCLAVQ S.p.A., Siena / Italien
    ■ ■ · · :ίI
    ■ Vorrichtung zur Bestimmung von Mikroorganismen
    PATENTANSPRÜCHE
    .1 .j Vorrichtung zur Bestimmung bzw. Identifizierung von Mikroorganismen auf der Grundlage von biochemischen Tests, bestehend aus einer Reihe von Behältern, von denen jeder ein Reagenz zur Bestimmung solcher Mikroorganismen enthält und auf einem einzigen tragenden Element bzw. Glied angebracht ist, auf dem sich eine Reihe Markierungen befinden, die alle Behälter verbinden, in denen alle zur Bestimmung eines spezifischen Mikroorganismus ausreichenden biochemischen Tests durchgeführt werden.
  2. 2. Vorrichtung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagenzien zur Bestimmung bzw. Identifizierung der Mikroorganismen in getrockneter, gefriergetrockneter oder fester Form, auch tablettenförmig vorliegen.
  3. 3. Vorrichtung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Markierungen verschiedene Längen, Farben und/oder Aussehen haben und auch teilweise durch Symbole und/oder Ziffern
    _ τ —
    ' ersetzt sein können.
  4. 4. Vorrichtung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß solche Behälter ein integraler Bestandteil der Vorrichtung sein können, oder daß sie auf der Oberseite durch Adhäsion be- :v festigt oder eingefügt sein können.
  5. A 5. Vorrichtung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, "f< daß sie eine zentrale Vertiefung aufweisen kann.
  6. ?'; 6. Vorrichtung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, "i daß der Mikroorganismus eine Hefe ist.
  7. 7. Vorrichtung gernäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus zu den pathogenen Arten der Gattung Candida gehört.
    —————
  8. 8. Vorrichtung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Arten der Gattung Candida, die normalerweise als pathogen gelten, folgende sind: Candida albicans, Candida stellatoidea, Candida krusei, Candida tropicalis, Candida guillermondii, Candida parapsilosis und Candida pseudotropicalis.
  9. 9. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 7 und/oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Anzahl der Behälter der Vorrichtung 16 ist.
  10. 10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 7 und/oder 8, da-_ durch gekennzeichnet, daß die Behälter KNO3, Cycloheximid plus Glukose, Harnstoff, Glukose allein, Saccharose, Lactose, Maltose, Raffinose, Cellobiose, Inosit, Trehalose enthalten'.
  11. 11. Verfahren zur Bestimmung von Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung gemäß den Ansprüchen 1 bis 10 verwendet wird.
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