DE2803358C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft Medien zum Nachweis von Acetoin-bildenden Enterobakterien, sowie Verfahren, bei denen solche Medien verwendet werden.

Die vorliegende Erfindung befaßt sich mit der Identifizierung von Bakterien und insbesondere von Enterobakterien oder Darmbakterien, sowie mit Medien zur Identifizierung der Bakterien, die für die Identifizierung mit Hilfe der Mikromethode geeignet sind.

Derzeit erfolgt die Identifizierung der Enterobakterien täglich in medizinischen und veterinärmedizinischen Biologielaboratorien oder in bakteriologischen Nahrungsmittellaboratorien.

Im allgemeinen erfolgt diese Identifizierung durch den Nachweis einer Vielzahl von biochemischen Eigenschaften der Bakterie mit Hilfe von speziellen Kulturmedien, die auch als Identifizierungsmedien bezeichnet werden.

In der Vergangenheit handelte es sich bei diesen Medien um komplizierte Agar(-agar)-medien, die in Glaskolben enthalten waren, die mit Hilfe eines großen Gewindestopfens verschlossen wurden. Zur Animpfung dieser Kolben war es notwendig, einen Stamm in Reinkultur zur Verfügung zu haben, der im Verlaufe von 24 Stunden durch Überpflanzen der isolierten Kolonie auf ein Isoliermedium erhalten worden ist.

Diese Identifizierungsmedien besitzen jedoch unter anderem den Nachteil, daß sie sperrig, für Reihenuntersuchungen wenig geeignet und arbeitsaufwendig sind.

Es bestehen auch andere Einrichtungen zur Identifizierung von Enterobakterien, die es ermöglichen, die Bakterie ausgehend von dem Isoliermedium zu identifizieren und die es gestatten, Zeit und Material einzusparen.

Eine derartige Identifizierungseinrichtung umfaßt einen mehrere Behälter aufweisenden Zylinder, der verschiedene Agarmedien enthält, und eine spitze Stange, die in Längsrichtung durch das Rohr verläuft und es ermöglicht, durch Kontakt der Spitze mit der zu identifizierenden Kolonie und durch Bewegung der Stange jedes Medium bei der Hindurchbewegung anzuimpfen.

Eine andere Vorrichtung umfaßt eine Vielzahl von kleinen, besonders geformten Näpfchen, die in einer Trageeinrichtung aus einem synthetischen Material angeordnet sind, und die Identifizierungsmedien in getrockneter Form enthalten. Diese Näpfchen werden dann mit einer Suspension der zu identifizierenden Bakterie in Wasser gefüllt.

Es sind noch weitere Verfahren und Vorrichtungen zur Identifizierung bekannt, die jedoch sämtlich die Anwendung eines besonderen Behälters erforderlich machen und hohe Kosten verursachen.

Die Erfindung hat daher zum Ziel, flüssige Medien zur Identifizierung von Acetoin-bildenden Enterobakterien bereitzustellen, die für die Durchführung im Mikromaßstab geeignet sind.

Dieses Ziel wird erfindungsgemäß durch die in den Ansprüchen definierten Maßnahmen erreicht.

Erfindungsgemäße, für den Mikromaßstab geeignete Medien weisen vorzugsweise die Eigenschaft auf,
daß das Ergebnis der biochemischen Reaktion aufgrund der Färbung eines internen Indikators ohne Zugabe eines speziellen Entwicklers gegen Ende der Inkubation im allgemeinen direkt abgelesen werden kann;
daß die Reaktionen schnell ablaufen und in Abhängigkeit von dem biochemischen Charakter und der untersuchten Bakterie im Verlaufe von 3 bis 18 Stunden durchgeführt werden können;
daß die Mikromethode in irgendwelchen in biologischen Laboratorien üblichen Behältern, wie Hämolyseröhrchen oder Näpfchenplatten für die Mikrotitration, durchgeführt werden kann; und daß das Endreaktionsvolumen 150 bis 650 µl beträgt, was 100 bis 500 µl Identifizierungsbrühe oder Identifizierungsmedium entspricht.

Wie andere Mikromethoden wendet die Mikromethode, die insbesondere zur Identifizierung von Enterobakterien geeignet ist, eine Bakterienkolonie an, die auf dem Isoliermedium gewonnen worden ist. Hierbei wird zur erfindungsgemäßen Durchführung der Diagnose der Gattung und in gewissen Fällen zur Ermittlung der Art der Enterobakterie eine Bakterienkolonie verwendet, die man auf dem Isoliermedium in Abhängigkeit oder in Gegenwart der folgenden Reagentien bzw. Medien erhalten hat:

Medien zum Nachweis der Gärung von Glucose, Melibiose, Rhamnose, ein Medium zur Bildung von Acetoin, ein Medium zum Nachweis von Aminosäure-oxidasen, ein Medium zum Nachweis der Bildung von Indol, ein Medium zum Nachweis von β-Galactosidase und Nitrat-reduktase, Medien zum Nachweis von Urease, von Lysin-decarboxylase und von Ornithin-decarboxylase, ein Nitratmedium und ein Medium zum Nachweis von Schwefelwasserstoff, wobei die Diagnose in gewissen Fällen auch durch die Verwendung einers Mediums zum Nachweis von Arginin-dihydrolase, eines Mediums zur Untersuchung des Malonat-Verbrauchs bzw. der Malonat-Verwertung und gegebenenfalls anderen Medien für die Gärung von Zuckern, sowie eines Mediums zum Nachweis von Gelatinase ergänzt werden kann.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Verfahren derart durchgeführt, daß man in 2,5 ml Salzwasser, das 9 g/l Natriumchlorid enthält, eine Kolonie oder eine Fraktion einer Kolonie der zu untersuchenden Enterobakterie suspendiert, dann einen Tropfen dieser Suspension mit einem Volumen von etwa 50 µl in den Identifizierungsbrühen oder Identifizierungsmedien suspendiert, die man zuvor in den Näpfchen der Platte für die Mikrotitration verteilt hat, wonach man die Näpfchen mit Hilfe eines klebenden Papiers oder Klebstreifens verschließt und die Näpfchen, die die Medien zum Nachweis von Acetoin, enthalten, mit einem klebenden Papier oder Klebstreifen verschließt, das bzw. der mit einem Loch mit einem Durchmesser von mindestens 1 mm versehen ist, worauf man die in dieser Weise angeimpfte Platte während 12 bis 18 Stunden in einen Wärmeschrank oder Brutschrank mit einer Temperatur von 35°C einbringt und anschließend die Ergebnisse abliest.

Die bei den erfindungsgemäßen Mikromethoden verwendeten Medien werden im folgenden näher erläutert.

Medium zum Nachweis von Acetoin

Die Enterobakterien säuern das Kulturmedium durch Vergären der darin enthaltenen Glucose an, wobei einige dieser Bakterien dazu in der Lage sind, diese Azidität zu korrigieren, indem sie das aus der Glucose gebildete Pyruvat gemäß der folgenden Gleichung in Acetylmethylcarbinol umwandeln, eine Substanz, die hinsichtlich des pH-Werts neutral ist:

Das Acetylmethylcarbinol kann mit Hilfe der Vosges-Proskauer- Reaktion nachgewiesen werden, die das Ergebnis hat, daß 30 Minuten nach der Zugabe einer Lösung von Kaliumhydroxid und von α-Naphthol, eine johannisbeerrote Färbung auftritt. Ein Nachteil dieser Reaktion ist in der Tatsache zu sehen, daß man mit Bakterien, von denen angenommen wird, daß sie nicht dazu in der Lage sind, Acetoin zu bilden, stark verzögerte hellrosa Färbungen erzielt, wobei angenommen wird, daß diese Verfärbung durch die Reagentien als solche oder wahrscheinlicher durch eine sehr geringe Bildung von Acetoin bedingt ist.

Wegen der Änderung der Azidität, die sich durch die Umwandlung von Pyruvat in Acetylmethylcarbinol ergibt, wurde bereits vorgeschlagen, einen pH-Indikator zuzugeben, der eine verschiedene Färbung in Abhängigkeit von der Tatsache annimmt, ob die Bakterien Acetylmethylcarbinol bilden oder nicht. Dieses Vorgehen wurde in Form des Methylrot-tests angewandt, welcher Indikator bei einem pH-Wert von unterhalb 2 rot und bei einem pH-Wert von mehr als 6,3 gelb gefärbt ist. In allen Fällen sind die in dieser Weise erzielten Reaktionen nicht deutlich, da der Mittelwert des pH-Werts, den man mit kein Acetoin bildenden Bakterien erzielt, 4,70 beträgt, während man im Fall von Bakterien, die Acetoin zu bilden vermögen, einen pH-Wert von 5,50 erzielt. Dies ist der Grund dafür, daß die Färbung, die Acetoin⊖-bakterien mit Methylrot liefern, sich nur sehr wenig von der Färbung unterscheidet, die man mit Acetoin⊕- bakterien erhält. Hierdurch ergibt sich die Schwierigkeit der Anwendung des Methylrot-tests, die noch dadurch erschwert wird, daß dieser Indikator nur schlecht löslich ist und daß die Bakterien ihn reduzieren, wodurch er gegenüber Änderungen des pH-Werts noch unempfindlicher wird, was es unmöglich macht, diesen Indikator von Anfang an in die Identifizierungsbrühe oder das Identifizierungsmedium einzubringen.

Es wurde nunmehr gefunden, daß wenn das Medium neben Glucose Pyruvat oder Lactat enthält, der Mittelwert der pH-Werte der mit Acetoin⊖-bakterien angeimpften Medien 5,4 beträgt, während der der Medien, die mit Acetoin⊕-bakterien angeimpft worden sind, 6,9 beträgt, so daß der Unterschied zwischen diesen beiden Mittelwerten etwa doppelt so groß ist, wie bei dem Medium, das nur Glucose enthält. Unter diesen Bedingungen ist es möglich, als pH-Indikator Bromthymolblau zu verwenden, dessen Umschlag von gelb bei einem pH-Wert von weniger als 6 über grün zu blau bei einem pH-Wert von oberhalb 6 verläuft. Dieser Indikator ist leicht löslich und wird durch die Bakterien nicht umgewandelt. Weiterhin lassen sich die Ergebnisse sofort ablesen, ohne daß es erforderlich ist, nach dem Inkubieren Entwickler oder Indikatoren zuzusetzen, wobei die Übereinstimmung der Ergebnisse dieser neuen Methode und der Methode, bei der die Vosges-Proskauer-Reaktion angewandt wird, vollständig ist.

In diesem Medium zum Nachweis von Acetoin werden erfindungsgemäß Substanzen verwendet, die die Bildung von Acetoin aktivieren, d. h. eine erhebliche Menge Hefeextrakt und eine geringe Menge Kreatin, Arginin oder einer Mischung aus beiden Bestandteilen.

Das Medium zum Nachweis von Acetoin besitzt vorzugsweise folgende Zusammensetzung:

10 g Hefeextrakt,
50 mMol Trihydroxymethylaminomethan/Chlorwasserstoffsäurepuffer mit einem pH-Wert von 7,2,
100 mg Bromthymolblau,
20 mMol Kreatin oder 10 mMol Arginin oder
20 mMol Kreatin und 10 mMol Arginin,
20 bis 100 mMol Glucose,
200 mMol Pyruvat oder 100 mMol Lactat und
destilliertes Wasser ad 1000 ml.

Andere Bakterien als die Enterobakterien bilden Acetoin in weniger starkem Ausmaß und sind daher nicht dazu in der Lage, den pH-Wert der durch die Vergärung von Glucose gebildeten sauren Produkte in die Nähe des Neutralpunkts zu bringen. Die den Farbindikator anwendende Methode ist daher nicht anwendbar, so daß das Acetoin mit Hilfe der Vosges-Proskauer-Reaktion nachgewiesen werden muß.

In diesem Fall besitzt das Medium zum Nachweis von Acetoin vorzugsweise folgende Zusammensetzung:

10 g Hefeextrakt,
50 mMol Trihydroxymethylaminomethan/Chlorwasserstoffsäurepuffer mit einem pH-Wert von 7,2,
20 mMol Kreatin oder 10 mMol Arginin oder
20 mMol Kreatin und 10 mMol Arginin,
20 bis 100 mMol Glucose,
200 mMol Pyruvat oder 100 mMol Lactat und
destilliertes Wasser ad 1000 ml.

Claims (3)

1. Medium zum Nachweis von Acetoin-bildenden Enterobakterien, dadurch gekennzeichnet, daß es Bromthymolblau, Glucose und Pyruvat oder Lactat enthält.

2. Medium nach Anspruch 1 zum unmittelbaren Nachweis der Bildung von Acetoin, dadurch gekennzeichnet, daß es Bromthymolblau, Glucose und entweder Pyruvat oder Lactat enthält.

3. Verfahren zum Nachweis von Acetoin-bildenden Enterobakterien, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Glucose, Bromthymolblau, Pyruvat oder Lactat enthaltendes Medium mit den nachzuweisenden Bakterien impft und mittels der Indikatorfarbe den pH-Wert bestimmt.