DE1673307C2 - Teststreifen aus saugfähigem Material zur schnellen Erkennung für von Mikroorganismen gebildetem Acetylmethylcarbinol - Google Patents

Description

System von 7 gPepton, 5 g Dextrose und 5g K₈HPO₄ zuziehen vermag, beispielsweise ^F}^itetP^' oder von 7 g Polypepton, 5 g Dextrose und 5 g poröse Keramikstreifen, gewebte oder vermzie Kaliumphosphat, bestehen. Diese Nährmedien, von fasern u. dgl. _oi_ör,,.„;cp in

denen das erstere bevorzugt wird, weiam einen hohen Das saugfähige Material wird norma erweise_ m

Glukoseanteil auf, da eine optimale Reaktion (nur) 5 schmale Streifen zerschnitten, damit es ^icn eoier dann stattfindet, wenn das Stoffwechselprodukt der in kleine Flaschen oder sonstige Behalter verpacken Glukose, Acetylmethylcarbinol, im Reaktionsmedium und bei Bedarf daraus entnehmen lauι reichlich vorhanden ist Beim praktischen Gebrauch bring man^ das m

Als Argininsalz verwendet man vorzugsweise das dem Kulturmedium imprägnierte Te*t^st™e"enae m Monohydrochlorid, kann aber auch dessen Di- oder xo einer Suspension einer in einem 'f'^on™;". Trihydrochlorid oder andere saure Salze, wie z. B. haltenen Reinkultur des unbekannten Baktenums das Nitrat, benutzen. in Kontakt und unterwirft ^ώωJf^^V^.

An Stelle des bevorzugten Natriumsalzes der Brenz- Streifen einer 4- bis 5stundigen, gemeinsamen initu traubensäure kann man auch deren Lithiumsalz oder bation bei 37°C Die Baktenensuspens.on brauch.tür andere Salze verwenden. >5 diesen Test nicht auf einem S^¹*¹™⁰¹™je™™

Bezüglich der 1-Naphtholsulfonsäure arbeitet man oder langzeitig inkubiert zu sein wenng ie cn am. vorzugsweise mit dem Natriumsalz der 1-Naphthol- in glukosereichem Medium wie etwa ucnim-ri 8-sulfonsäure. Man kann aber auch Salze anderer Infusionsagar, gewachsene Ze Hen reaktionsireua gcr Sulfonsäuren, wie etwa sind. Nach erfolgter Inkubation w.id der Steifen

20 herausgenommen, und in das Rohrchen werden

Natrium-l-naphthol-5-suifonat, einige Tropfen 4ö°/₀iger Alkalihydroxidlosung cin-

Kalium-l-naphthol-2-sulfonut, gegeben. Dann steckt man den Streifen erneut, und

Dinatrium-l-naphthol^o-disulfonat, zwar so tief in das Röhrchen hinein, daß seine Rea-

Natrium-l-naphthol-4-sulfonat, genzicnzone mit der alkalibehandelten Suspension

benutzen ²5 ^m Kontakt kommt. ..

Die die Nährmedium- und Reagenzienzone tren- Man kann statt dessen die Entwicklung der l-arbung

nende hydrophobe Sperrsubstanz besteht beispiels- auch so durchführen, daß man nach erfolgter IInkuweise aus einem Lack. bation einige Tropfen der Alkai.hydrox.dlosi

Wie in der Zeichnung schematisch dargestellt ist, das Teströhrchen eingibt, ohne dabei die Kc enthält der aus saugfähigem Material bestehende 3» zone des Teststreifen* zu befeuchten, waui Teststreifen gemäß der Erfindung an seinem einen tigern Durchmischen des ganzen Systems lau man Ende eine mit einer wäßrigen Lösung eines Nähr- die Reaktionszone mit der Suspension ™ ^Konla" mediums imprägnierte Nährmediumzone. Um ein kommen. Das Vorliegen von AMC u^rt ^s.ch η Wandern des Nährmediums aus der Nährmedium- einer Purpurrot-K.rschrot-Farbung, die ⁱⁿ«™^onae™ zone zu verhindern, ist neben der Nährmediumzone 35 in der Auswanderungszone ziemlich ausgeprägt eine Sperrzone aus einem hydrophoben Material, und nach etwa 5 bis 30 Minuten erscheint z. B. einem Lack oder einem handelsüblichen Chrom- Die besonderen Vorteile von Teststreifen gemäß

komolex der Formel der Erfindung liegen in ihrer leichten Handhabung

komplex der Formel ^^ .^ ^ _{Vergleich zu übHchen DiagnoscV}er-

40 fahren weit kürzeren Inkubationszeit und weit große-

C₁₇H₃₅ ren Empfindlichkeit.

I Das folgende Beispiel soll die Erfindung naher

C veranschaulichen.

" \ Beispiel

j] ⁴⁵ A. Reagenzienlösung

Cl₂Cr CrCl₂ Man löst 2,65 g !.-Arginin in etwa 100 ml Wasser

\ / und setzt der Lösung unter Umrühren 3,3 g Natrium-

O l-naphthol-8-sulfonat zu.

_H ⁵° B. Nährmedium

Man löst unter schwachem Erwärmen 7 g wasser-

aneeordnet ^{freies Pe}P^ton' ⁵ B ^w<^lsseifreie Dextrose, 5 g wasser-

Auf der anderen Seite der Sperrzone wird durch freies K₂HPO₁, 15 g Natriumpymvat "Jd 37^8 Applizieren einer Lösung von z. B. 2 bis 3 Gewichts- ₅₅ »-Glukose in 150 ml destilliertem Wasser ruckstandsprozent L-Argininmonohydrochlorid und etwa 3 bis los auf.

4 Gewichtsprozent Natrium-l-naphthol-^e-sulfonat in C. Herstellung des Teststreifens

destilliertem Wasser die Reagenzienzone ausgebildet. ,„„fahim* Material zwei

Vorzugsweise beträgt in einer solchen Reagenzien- Zunächst werden auf das saugfah ¹^ ^N1^l ^

zone das Gewichtsverhältnis Argininsalz zu Naphthol- 6o Sperrzonen aufgebracht, de ^da» A^ndcrn der sulfonsäuresalz etwa 1 0 zu etwa 1,2. Jenseits der anschließend aufzubringenden, wäßrigen Losungen

^ZUAUsäugfahiges Material ist jedes Material geeignet, gestellt. Nachdem die Lackschichten getrocknet sind das durch ^Kapillarwirkung eine Flüssigkeit hoch- werden die in der geschilderten Weise hergestellten

lösungen A und B (auf die aus der Zeichnung ersichtichen Stellen des streifenförmigen Materials) appliriert und trocknen gelassen.

D. Benutzung des Teststreifens

Eine oder zwei Ösen eines zu identifizierenden Bakteriums, das man vorher auf schrägem Agarnährmedium wachsen ließ, werden in 0,4 ml isotonischer Salzlösung suspendiert. In das diese Suspension enthaltende Röhrchen taucht man einen in der geschilderten Weise hergestellten Teststreifen so weit ein, daß seine untere oder Nährmediumzone in die Suspension eintaucht: Teststreifen nebst Bakteriumsuspension werden dann etwa 4 bis 5 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubationsperiode wird der Papierstreifen herausgenommen, worauf in das Teströhrchen 2 Tropfen einer 40gewichtsprozentigen wäßrigen Kaliumhydroxidlösung eingebracht werden. Dann wird die alkalisch gemachte Bakteriumsuspension mit der Reagenzienzone des Teststreifens in Berührung gebracht. Statt dessen kann man den Teststreifen auch nach erfolgter Inkubation im Röhrchen belassen und bei der tropfenweisen Zugabe

ίο der Kaliumhydroxidlösung dafür sorgen, daß die Reagenzienzone unbefeuchtet bleibt. Dann schütteli man das Röhrchen vorsichtig und läßt danach die Reagenzienzone mit der Suspension in Berühruni kommen. Die Bildung von AMC äußert sich in dei Ausbildung einer Rosa- bis Rotfärbung.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims (4)

1 2 hierbei im Laufe von 30 Minuten bis 4 Stunden zu Patentansprüche: einer Rosa- oder Rotfärbung. Eine weitere bekannte Modifikation ist das von

1. Teststreifen aus saugfähigem Material zur M. A. de Guzman, B. C. und A. J. Weil in schnellen Erkennung für von Mikroorganismen 5 »J. BacL«, 87 (1964), S. 234,235, beschriebene Bengebildetem Acetylmethylcarbinol, dadurchge- jaminson-Verfahren. Bei diesem Verfahren werden auf kennzeichnet, daß das saugfähige Material· schiefstehendem »Triple-Zucker-Eisen« (TZE)- Agarmit einer Nährmediumzone, die ein Pepton oder Nährboden gewachsene Isolate in 0,5 ml 0,5%>g^er Polypepton, Dextrose und Kaliumphosphat. d-GIu- wäßriger Kreatininlösung suspendiert und dann mit kose und ein Brenztraubensäuresalz enthält, ferner io 1-Naphthol und 40°/oiger Kalilauge versetzt. Eine mit einer Reagenzienzone, die ein saures Salz im Laufe von 5 Minuten auftretende Rosa- oder des L-Arginins und ein 1-Naphtholsulfonat ent- Rotfärbung deutet auf die Anwesenheit von AMC hin. hält, und mit einer die beiden vorstehend genann- Beide Bestimmungsverfahren sind jedoch mit zahlten Zonen trennenden hydrophoben Sperrzone reichen Nachteilen behaftet. Beim Barritt-Verfahren imprägniert ist. 15 hängt die Inkubationszeit vom Reagenzienvolumen

2. Teststreifen nach Anspruch 1, dadurch ge- ab und ist daher kritisch. Außerdem müssen zunächst kennzeichnet, daß die Nährmediumzone ein ge- in Spezialmedien Reinkulturen gezüchtet werden, puffertes System, das aus 7 g Pepton, 5 g Dextrose worauf erst die eigentliche Isolierung der erhaltenen und 5 g K₂HPO₄ besteht, d-Glukose und Natrium- Kultur stattfindet. Beim Benjaminson-Verfahren könpyruvat und die Reagenzienzone L-Argininmono- ao nen andererseits die Organismen nur dann direkt hydrochlorid und Natrium-l-naphthol-8-sulfonat von dom geneigten TZE-Agar-Nährboden enliiuinenthält. men werden, wenn sich Säure gebildet hat. Die Ver-

3. Teststreifen nach Anspruch 1 oder 2, dadurch wendung von Organismen von einem geneigten TZE-gekennzeicrnet, daß er an der der Sperrzone Nährboden ist deshalb als vorteilhaft anzusehen, gegenüberliegenden Seite der Reagenzienzonc eine as weil man sich dieses Mediums üblicherweise beim weitere hydrophobe Sperrzone aufweist. Trennungsgang für Enterobacteriaceen bedient. Wenn

4. Teststreifen nach einem der Ansprüche 1 bis 3, sich jedoch auf diesem Nährboden keine Säure dadurch gekennzeichnet, daß die Nährmedium- gebildet hat, wird die Untersuchung auf diese Nichtzone etwa 5 bis etwa 25 Gewichtsteile eines ge- Lactose-Bildner unpraktisch. Infolgedessen ist dieser pufferten Systems, das aus 7 g Pepton, 5 g Dex- 30 Test in der Praxis auf die Aerobacter-Klebsiellatrose und 5 g K₂HPO₄ besteht, 5 bis etwa 25 Ge- Gruppe unter Ausschluß anderer AMC-Bildner bewichtsteile Natriumpyruvat und etwa 25 Gewichts- schränkt. Bei allen bakteriellen Infektionen kommt teile d-Glukose und die Reagenzienzonc etwa es entscheidend auf die schnelle und genaue Identi-1 bis 5 Gewichtsteile Natrium-l-naphthol-8-sulfo- fizierung des infizierenden Mikroorganismus an, damit nat und an Stelle eines sauren Salzes des L-Argi- 35 sofort mit der richtigen Therapie begonnen werden nins 1 Gewichtsteil i.-Arginin enthält. kann. Daher sind die geschilderten Diagnoseverfahren

offensichtlich unbrauchbar, wenn es auf eine schnelle Diagnose ankommt. Darüber hinaus wird die Eignung

der geschilderten Diagnoseverfahren zu schneller

40 Identifizierung auch dadurch beeinträchtigt, daß man

verschiedene Speziaireagenzien herstellen muß.

Die Bildung und anschließende Erkennung von Der Erfindung lag somit die Aufgabe zugrunde,

Acetylmethylcarbinol (AMC) aus Glykolyseprodukten eine Möglichkeit zur schnellen Erkennung von durch gewisser Enterobacteriaceen-Vertreter bildet dieGrund- Mikroorganismen gebildetem Acetylmethylcarbinol, lage des Voges-Proskauer- oder V-P-Tests. Dieser 45 d. h. ein Mittel zur raschen Unterscheidung von Test stellt ein bekanntes Laboratoriums-Diagnose- AMC-Bildnern von Nicht-AMC-Bildnern, zu schaffen, verfahren zur Unterscheidung und Identifizierung Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß

der verschiedenen, zu dieser Gruppe gehörenden sich die gestellte Aufgabe mit einem Teststreifen Organismen dar. Beispielsweise erzeugen zwei Orga- aus saugfähigem Material lösen läßt, welcher dadurch nismen dieser coliartigen Gruppe, nämlich Aero- 50 gekennzeichnet ist, daß das saugfähige Material mit bacter und Klebsieila, Acetylmethylcarbinol und einer Nährmediumzone, die ein Pepton oder Polylassen sich dadurch von den nicht Acetylmethyl- pepton, Dextrose und Kaliumphosphat, d-Glukose carbinol produzierenden Escherichia coli und Esche- und ein Brenztraubensäuresalz enthält, ferner mit richia freundii, unterscheiden. Die Durchführung einer Reagenzienzone, die ein saures Salz des L-Argidiescs klassischen Tests oder seiner moderneren Ab- 55 nins und ein 1-NaphthoJsulfonat enthält, und mit Wandlungen erfordern jedoch Inkubationszeiten, die einer die beiden vorstehend genannten Zonen trenzur Schnellidentifizierung dieser Organismen zu lang nenden hydrophoben Sperrzone imprägniert ist.
sind. Die besonders gut haltbaren Teststreifen gemäß

Ein bevorzugtes Erkennungsverfahren für AMC der Erfindung enthalten, mit Ausnahme des Alkaliist beispielsweise das in »J. Path.«, 42 (1936), S. 441 60 hydroxide, sämtliche Reagenzien für den V-P-Test bis 454, beschriebene Barritt-Verfahren. Hierbei wird zweckmäßigerweise in einer Menge, bezogen auf das der z. B. aus Stuhl, Blut oder Urin in Reinkultur Gewicht des Nährmediums, von 5 bis 25%. Die isolierte, unbekannte Organismus 48 Stunden lang Glukosemenge soll hierbei zwecks Erzielung optiin einer Glukosc-Pepton-Phosphatpuffer-Brühe wach- maler Ergebnisse vorzugsweise etwa 25 Gewichtssen gelassen, worauf 1 ml dieses Mediums mit 0,6 ml 65 prozent betragen.

5"/<jiger 1-Naphthollösung in Alkohol und 0,2 ml Das zum Imprägnieren des saugfähigen Materials

40%iger Kalilauge versetzt wird. Sofern durch den dienende Nährmedium kann aus einem handels-Mikroorganismus AMC gebildet wurde, kommt es üblichen Nährmedium, z. B. aus einem gepufferten