DE2653047C2 - Herstellung eines Testsystems zum Nachweis gramnegativer Bakterien - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren gemäß dem Oberbegriff des Patentanspruchs.

Das von H. CH. Gram eingeführte Färbeverfahren ist mehrstufig, erfordert mehrere Reagentien und ist nur mikroskopisch auswertbar. Nach der Gramfärbung erscheinen grampositive Bakterienzellen blau, gramnegative hingegen roL

Aridere Unterscheidungsmethoden zwischen grampositiven und gramnegativen Bakterien, z. B. chemische Zellwandanalysen, sind für Routinetests wegen des großen Zeit- und Materialaufwandes undenkbar.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung tines Testsystems; dieses Testsystem gestattet auf einfache Weise eine rasche Unterscheidung zwischen grampositiven und gramnegativen Bakterienkolonien auf festen Bakteriennährböden und ermöglicht in flüssigen Medien den Nachweis gramnegativer Keime.

Bei diesem neuen Testsystem werden gramnegative Bakterien über ihre Aminopepiidase-Aktiviiät nachgewiesen.

Die Aminopeptidase wurde bei Ecoli und vier weiteren gramnegativen Bakterienstämmen von Teuber und Cerny erstmals beschrieben (Arch. Mikrobiol. Bd. 91. S. 235-240 [1973]) und konnte bei zehn untersuchten grampositiven Bakterienstämmen nicht oder nur mit erheblich verminderter Aktivität aufgefunden werden. Das Enzym wurde in der Folge auch von Lazdunski und Mitarbeitern(Eur.J. Biochem. Bd.60, 349—369 [1975]) unter dem Namen »Amincendopeptidase« beschrieben.

Als Enzymsubstrate der Aminopeptidase eignen sich vornehmlich Verbindungen, die dadurch charakterisiert sind, daß eine α-Aminosäure über eine Peptidverbindung mit einer Komponente verknüpft ist, welche in freiem Zustand (d. h. nach Spaltung der Peptidbindung) Farbig ist.

Te über und Cerny setzten als Aminopeptidasesubstrate 4-Nitroanilide von Λ-Aminosäuren ein. Diese Verbindungen sind in wäßriger Lösung im mittleren pH-Bereich (5-9) farblos.

Durch die Aminopeptidaseaktivität wird aus diesen Verbindungen p-Nitranilin abgespalten, was durch eine L-Alanin-4-niiroanilid (farblos)

Amino-

peptidase

L-Alanin + p-Nitranilin (farblos) (gelb)

Neben der von Teuber und Cerny und in der Folge auch von Lazdunski und Mitarbeitern eingesetzten handelsüblichen Aminosäurenitroaniliden wurden von Lazdunski und Mitarbeitern auch Aminosäurenaphthylamide (»Eur. J. Biochem.« Bd. 60, 363-369 [1975J eingesetzt Als geeigneteste Verbindung hat sich jedoch das von Teuber und Cerny (Arch. Mikrobiol. Bd. 91, S. 235—240 [1973]) erstmals als Aminopeptidasesubstrat gramnegativer Zellen verwendete L-A'vnin-4-nitroanilidhydrochlorid erwiesen.

Der Enzymnachweis wurde von Teuber und Cerny, sowie von Lazdunski und Mitarbeitern derart durchgeführt, daß die Bakterienzellen mit wässerigen Lösungen der entsprechenden Enzymsubstrate in Berührung gebracht wurden, also durch Zupipettieren zu Bakteriensuspensionen bzw. bei Verwendung fester Bakteriennährböden durch Gießen der Substratlösungen auf die Bakterienkolonien.

Für Routinetests sind diese Methoden wenig geeig-

net: Wegen der Unbeständigkeit der Enzymsubstrate in

μ wäßrigen Medien müßten die Testlösungen ständig neu angesetzt werden. Werden die Enzymsubstrate durch Überschichten der Bakterienkolonien auf festen Nährböden appliziert, besteht bei einigen Bakterienarten (z. B. der Gattung Pseudomonas) die Gefahr des

Zerfließens der Bakterienkoionien.

Störend erweist sich zudem die rasche Diffusion des farbigen Spaltproduktes der Enzymreaktion (vornehmlich p-Nitranilin) in den umliegenden Nähragar. wodurch die Nachweisgenauigkeit erheblich vermindert wird. Kleine Bakterienkolonien (mit Durchmessern unter 2 mm) können aufgrund des geringen Kontrastes meist nicht auf ihr Aminopeptidaseverhalten getestet werden.

Sollte die Aminopeptidasereaktion für Routinetests

■»5 Verwendung finden, war es erforderlich, ein einfach zu handhabendes, beständiges Material hoher Nachweisempfindlichkeit zu entwickeln, das auch ungeübtem Personal eine Auswertung erlaubt. Erfindungsgemäß wird ein Testsystem zum Nachweis aminopeptidasepositiver Mikroorganismen hergestellt, welche den typischen gramnegativen Keimen zuzurechnen .lind.

Umfangreiche Untersuchungen von Cerny (unveröffentlicht) an über 100 Bakterienisolaten aus Lebens- mitteln und Packstoffen haben ergeben, daß, von seltenen Ausnahmen abgesehen, die Aminopeptidase als typisches Merkmal gramnegativer Bakterien betrachtet werden kann. Die Aminopeptidase konnte in eigenen Versuchen bei folgenden gramnegativen Bakteriengat-

W) tungen nachgewiesen werden: Pseudomonas, Escherichia, Proteus. Salmonella (bei allen 12 untersuchten Stämmen), Achromobacter, Alcaligenes, Shigclla, Haemophilus, Arizona, Citrobacter, Enterobacter und Neisseria. Zu den Ausnahmen zählen beispielsweise der

b5 gramnegative Bacillus stearothermophilus, der aminopeptidasenegativ ist, sowie einige Stämme von Bacillus licheniformis (grampositiv), welche eine schwache Aminopeptidaseaktivität besitzen.

Die Erfindung ist durch den Patentanspruch definiert.

Pie Trägermaterialien sollen die Enzymsubstrate über einen längeren Zeitraum in unverändertem Zustand erhalten und ohne weitere Manipulationen direkt einsetzbar sein. Für den Nachweis gramnegativer Bakterienkolonien auf Agarnährböden wird gefordert, daß das Trägermaterial die Diffusion des in der Aminopeptidasereaktion entstandenen Spaltproduktes (z. B. p-NitraniUn) in der Räche des Trägermaterials erschwert, weil dadurch die Nachweisgenauigkeit ι ο erhöht und die Zeit bis zur Auswertung des Tests erheblich verkürzt werden kann.

Das Testsystem läßt sich wie folgt erreichen:

α-Aminosäurenitroanflide oder a-Aminosäurenaphthylamide werden in einem Lösungsmittel in einer Konzentration von 0,1 bis 50% gelöst. Als Lösungsmittel können wässerige Medien sowie organische Lösungsmittel (z. B. Äthanol) dienen. Dieser Lösung werden wässerige Puffersysteme hinzugefügt, die einen pH-Wert zwischen 5 und 9 gewährleisten. Durch Tauchen in diese Testlösungen werden saugfähige Materialien (z. B. Cellulosefilterpapiere, Glasfaserfilter, Porzellanfilter u. ä.) der Dicke 0,1 bis 5 mm und zweckmäßigerweise eines Durchmessers von 10—100 mm mit der Testlösung imprägniert. Das Aufbringen der Testlösung kann auch durch Besprühen des Trägermaterials erfolgen. Das Trägermaterial kann anschließend z.B. in einem Luftstrom bei 10—90°C getrocknet werden. Der Vorgang des Tauchens bzw. Ansprühens kann erforderlichenfalls mehrmals wiederholt werden. Die imprägnierten Trägermaterialien sind im Dunkeln bei Wassergehalten unter 3% mehrere Monate, unter 1,5% jahrelang be. Raumtemperatur haltbar. Die imprägnierten Tes.'roaterialien können auf Bakterienkolonien auf festen Nährböd π gelegt werden. s'> Bei geeigneten Abmessungen des Testmaterials sind u. U. mehrere hundert Bakterienkolonien gleichzeitig auf ihr Gramverhalten prüfbar. Andererseits besteht die Möglichkeit, Bakterien auf den Teststreifen aufzustreichen, um deren Gramverhalten zu prüfen. Letztlich können Teststreifen zum Nachweis gramnegativer Keime auch in Bakteriensuspensionen (z. B. verdorbene Milch u. ä.) getaucht werden.

Zur Erfindungshöhe wird ausgeführt: Die Publikation von Teuber und Cerny (Arch. Microbiol.91 (1973) 235—240) hat bezüglich der Erfindungshöhe keine besonderen Auswirkungen:

1. Wie in der obigen Publikation erwähnt, gaben auch einige grampositive Bakterienstämme eine — wenn zwar auch geringere — Aminopeptidasereaktion. Es war daher nicht klar, ob nicht andere grampositive Bakterienstämme eine den gramnegativen Bakterienstämmen vergleichbare Aminopeptidasereaktion ergeben würden.

2. Die geringe Anzahl der in obiger Publikation a getesteten Stämme ließ nicht zu, daß verallgemeinernde Feststellungen daraus abgeleitet wurden. Dazu war es erforderlich, eine große Anzahl von Bakterienstämmen verschiedenster Gattungen zu überprüfen. Erst die Auswertung mehrerer hundert <κι Bakterienstämme aus den Gattungen Shigella. Klebsieila, Salmonella, EschLMichia, Hafnia, Citrobacter, Proteus, Enterobacter, Pseudomonas. Arizona, Haemophilus, Acineobacter, Flavobacterium. Neisseria, Serratia, Plesiomonas, Achromobacter, Aeromonas, Alcaligenes, Edwardsiella, Yersinia. Bacillus, Diplococcus, Micrococcus, Staphylococcus, Streptococcus, Mycobacteriurr Clostridium, Lactobacillus, Bifidobaeterium, Corynebacterium, Erysipelothrix sowie einiger Hefearten ließ erkennen, daß zwischen dem Gramverhalten und der Aminopeptidasereaktivität eine strenge Korrelation besteht

3. Da die Gramfärbung sehr aufwendig ist, hätte es vielleicht nahegelegen, die Aminopeptidasereaktion als Alternative einzusetzen. Da jedoch in der obigen Publikation zu wenig Stämme unters-jeht wurden und die Aminopeptidasereaktion in ihren biochemischen Grundlagen bislang noch nicht genügend erforscht war, war eine verallgemeinernde Feststellung im Hinblick auf die Unterscheidungsmöglichkeit grampositiver und gramnegativer Bakterien nicht ableitbar. Erst die Untersuchung zahlreicher Bakterienstämme und die gewonnene Erkenntnis, daß die Aminopeptidase ursächlich das Gramverhalten steuert, indem sie die dreidimensionale Vernetzung der Zellwand (Murein) z. B. über Interpeptidbrücken d*T Bakterien unterbindet und so zur Ausbildung einer einschichtigen Mucopolysaccharidzellwand und damit zu gramnegativem Verhalten führt, ließen eine gesicherte Aussage zu.

4. Das Einbringen des Testsubstrates in bestimmte Trägermaterialien erfolgte nach eingehenden Untersuchungen, die gezeigt hatten, daß das Auftropfen einer flüssigen Testsubstratlösung zu einer Verwaschung der Bakterienkolonien auf der Agaroberfläche führen kann und daß bei Aufstreuen des Testsubstrats als Pulver die Reaktion dadurch verfälscht werden kann, als die im Reaktionsverlauf frei werdende Farbkomponente (z. B. p-Nitranilin) von einigen Bakterien (E. coli) wieder in eine farblose, noch nicht identifizierte Verbindung zurückverwandelt wird. Erst das Einbringen der Testsubstanz in Trägermaterialien mitbestimmten Diffusionseigenschaften(z. B.Glasfaserfilter) ermöglicht das Abtliffundieren des farbigen Spaltproduktes und entzieht es damit einer weiteren Umwandlung durch die Bakterienkolonie.

Die gelegentlich bei grampositiven Bakterien auftretende schwache Aminopeptidaseaktivität kann durch Einhaltung bestimmter Reaktionszeiten weitgehend eliminiert werden. Sie ist bei einigen Bacillus-Arten durch die einsetzende Sporulation bedingt. Bei einigen Streptococcen mit geringer Interpeptidbrückenausbildung und bei corynvformen Keimen (Arthrobacter. Corynebacterium), die gramvariables Verhalten zeigen, kann unter bestimmten Wachstumsbedingungen ebenfalls eine schwache Aminopeptidaseaktivität beobachtet werden. Diese ist allerdings mit der Synthese von Lipopolysaccharid (einem typischen Bestandteil gramnegativer Bakterien) korreliert, so daß diese Bakterienarten bei positivem Aminopeptidasetest ohnedies nicht mehr als typisch grampositiv anzusehen sind.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher veranschaulichen:

Beispiel I
Zubereitung der Substratlösung

6,05 g Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan werden in ml destilliertem Wasser gelöst. Mit einer gesättigten Maleinsäurelösunj; wird der pH-Wert auf 7,0 eingestellt. Sodann wird mit destilliertem Wasser auf ml aufgefüllt. Dieser Pufferlösung werden 6 g .AIanin-4-nitroanilidhydrochlorid zugegeben.

Imprägnieren des Trägermaierials

Runde, handelsübliche weiße Glasfaserfilter der Dicke 0,3 mm mit einem Durchmesser von 80 mm werden in die Substratlösung getaucht und im Warmluftstrom bei 40° C gut getrocknet, sowie trocken und dunkel gelagert

Verwendung des Testsystems

Die imprägnierten Glasfaserfilter eignen sich aufgrund ihres Diffusionsverhaltens hervorragend zum Nachweis gramnegativer Bakterien auf festen Standardbakteriennährböden. Sie brauchen nur auf die Nährböden aufgelegt werden. Innerhalb von 5 Minuten sind gramnegative Bakterienkoionien bei 23° C an der Gelbfärbung erkennbar. Die Methode ist nur bei Oberflächenkolonien anwendbar. Bei kleineren Abmessungen des Trägermaterials können selektiv einzelne Bakterienkolonien auf Nähragaroberflächen diagnostiziert werden bzw. besteht die Möglichkeit, mit einer Impföse Bakterienkolonien auf dem Tc-lsystein zu verstreichen, um deren Gramverhalten zu testen.

Beispiel Il
Zubereitung der Substratlösung

Wie unter Beispiel I beschrieben, dem Puffersystem werden jedoch 15 g L-Alanin-4-nitroanilidhydrochlorid pro 100 ml zugegeben.

Zubereitung des Trägermaterials

Ein saugfähiger weißer Papierstreifen der Dicke 1 mm und der Breite 5 mm durchläuft ein Bad der Substratlösung und wird anschließend im Warmluftstrom getrocknet. Aus dem imprägnierten Papierstreifen werden 10 mm lange Abschnitte gefertigt, welche auf 5 mm breite und 03 mm dicke Kunststoffstreifen (z. B. aus Polystyrol) geklebt werden, derart, daß die Indikatonbschnitte am Ende der 50—200 mm langen Kunststoffstreifen befindlich sind. Der verwendete Klebstoff muß wasserfest sein.

Verwendung des Testsystems

Zum Nachweis von gramnegativen Keimen in einer Bakteriensuspension kann der Indikatorteststreifen kurz (1—2 Sekunden) in die Bakteriensuspension getaucht werden. Bestand die Bakteriensuspension überwiegend aus gramnegativen Keimen mit Keimzahlen über 10^l0/ml, trill -nnerhalb von drei Stunden eine Gelbfärbung des Indikatorabschnittes auf. Es empfiehlt sich, der Teststreifen ncch Eintauchen in die Bakteriensuspension in einem dicht verschlossenen Reagenzglas bis zur Auswertung aufzubewahren, um ein Austrocknen des Indikatorabschnittes zu vermeiden.

Beispiel 111
Zubereitung der Pufferlösung

In destilliertes Wasser werden 7,72 g sekundäres H) Natriumphosphat und 3,52 g primäres Kaliumphosphat gelöst und auf 100 ml aufgefüllt

Zubereitung der Substratlösung

20 g L-Alanin-4-nitroanilidhydrochlorid werden in ii 100 ml Äthanol gelöst.

Zubereitung desTrägerrnaterials

Ein saugfähiger weißer Karton aus Cellulose der Dicke 5 mm wird in die Pufferlösung getaucht und im Warmluftstrom getrocknet Anschließend wird der so vorbehandelte Karton beidseitig über Sprühdüsen so lange sukzessive mit der Substratlösung besprüht und getrocknet, bis 50 mg L-Alanin-4-nitroanilidhydrochlorid auf einem Flächenabschnitt von 1 cm² aufgebracht wurden. Sodann wird der präparierte Karton in Abschnitte der Kantenlänge 10 mm zerschnitten.

Verwendung des Testsystems

Die imprägnierten Testabschnitte werden zu 2 ml so einer Bakteriensuspension (z. B. verdorbener Milch) zugegeben und darin belassen. Durch Diffusion wandert das Enzymsubstrat aus der Trägerschicht in die Bakteriensuspension. Bei Anwesenheit gramnegativer Bakterien tritt eine Gelbfärbung auf. Bei Keimzahlen j von 10⁸ bis 10⁹ ml wird eine sechsstündige Bebrütung bei 30⁰C empfohlen.

Eine Erhöhung der Nachweisgenauigkeit (z. B. bei niedrigen Keimzahlen) bietet sich selbstverständlich darin, daß man das in der Enzynireaktion entstandene •40 p-Nitranilin nach gängigen Verfahren (Zugabe von salpetriger Säure und einer Kupplungskomponente, z. B. j9-Naphthol-6,8-disulfonsäure) in einen Azofarbstoff verwandelt, der deutlicher nachweisbar ist.

Die vorstehend aufgeführten Beispiele gestatten 3 einen unkomplizierten Nachweis ,gramnegativer Keime.

Die unter Beispiel I aufgeführte Testmethode ermöglicht einen raschen Test auf das Gramverhalten zahlreicher Bakterienkolonien auf der Oberfläche fester Bakterienstandardnährböden. Selektivnährböden, insbesondere farbige Nährböden (z. B. Endo-Agar) sind für diesen Zweck u. U. ungeeignet.

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur Herstellung eines Testsystems zum Nachweis gramnegativer Keime über deren Aminopeptidaseaktivität durch bakterielle Hydrolyse spezifischer Enzymsubstrate unter Verwendung einer «-Aminosäure, die über eine Peptidverbindung mit einer Komponente verknüpft ist, welche nach Spaltung der Peptidbindung farbig ist, und eines Trägermaterials, dadurch gekennzeichnet, daß man

   a) eine Lösung von 0,1—50% (Gewicht/Volumen) der a-Aminosäure, die über eine Peptidbindung mit einer Komponente verknüpft ist, welche nach Spaltung der Peptidbindung farbig ist, einsetzt,

   b) dieser Lösung wäßrige Puffersysteme hinzugefügt sind, die einen pH-Wert zwischen 5 und 9 gewährleisten und

   c) die Testlösung in üblicher Weise auf bzw. in ein Trägermaterial eingebracht wird.

   Gelbfärbung erkennbar wird. Die Enzymreaktion soll am Beispiel des L-Alanin-4-nitroanilids veranschaulicht werden: