CH662582A5

CH662582A5 - Verfahren zur erhoehung der antibiotikum-produktion durch in vivo genetische rekombination.

Info

Publication number: CH662582A5
Application number: CH2328/84A
Authority: CH
Inventors: Lajos Dr Ferenczy; Antal Mai; Istvan Dr Ott; Gabor Dr Ambrus; Tibor Dr Lang
Original assignee: Biogal Gyogyszergyar
Priority date: 1983-05-16
Filing date: 1984-05-11
Publication date: 1987-10-15
Also published as: FI79551B; US4729951A; HU194306B; FI79551C; BE899661A; HUT34235A; GB2146015B; FI841951A; DE3418187C2; GB8412364D0; FI841951A0; GB2146015A; FR2546180A1; DE3418187A1; FR2546180B1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren für die qualitative und quantitative Erhöhung der Antibiotikum-Produktion von Aminoglykosid-Antibiotika erzeugenden Stämmen durch in vivo Rekombination und Fermentation der erhaltenen genetisch modifizierten Stämme.

Aminoglycosid-Antibiotika werden heute weitgehend in der Humantherapie eingesetzt und sind von grosser wirtschaftlicher Bedeutung. Wegen ihres breiten Wirkungspektrums werden sie nicht nur in der Humantherapie, sondern auch in der tierärztlichen Praxis angewandt.

Es ist bekannt, dass Streptomyces tenebrarius Nebramy-cin, ein Mehrkomponentengemisch von Antibiotika erzeugt [Stark, Hoehn und Know, Antimicrobial Agents and Che-motherapy 1967, S. 314; britische Patentschrift Nr.

1 178 489; US-Patentschrift Nr. 3 691 279 und ungarische Patentschrift Nr. 176 103], Umezawa und Mitarbeiter beschrieben die Herstellung von Kanamycin aus Streptomyces kanamyceticus ATCC 12853 [J. Antibiotics 10A F, 181 (1957), Japanisches Patent Kokai 8695 (1961)]. Die Kana-mycin-Komponenten A, B und C sind auch Aminoglykosid-Antibiotika.

Es ist auch bekannt, dass aus Mikroorganismenzellen der Streptomycetaceae Familie (Streptomyces und Micromonospora Stämme) unter geeigneten Bedingungen Protoplasten gebildet werden (zellwandfreie Form), die nachfolgend zu normalen Zellen regeneriert werden können (US-Patent Nr. 4 294 927; Okanishi, Suzuki und Umezawa, J. Gen. Micro-biol. 80, 389 (1973). Die Fusion von Protoplasten unterschiedlicher Stämme induziert genetische Rekombinationen, wobei Zellen entstehen, die Träger von neuen genetischen Informationen sind (z.B. Hopwood, Wright und Bibb, Nature 268,171 (1977); Alfoldi, Szvoboda und Mitarbeiter, US Patent 4 294 927 (1978); Godfrey, Ford und Huber, Can. J. Microbiol. 24, 994 (1979); Oichi Hitchcock und Katz J. sBact. 139, 984 (1979)). Die Versuche wurden mit aminosäu-re-, nukleotidbase- und vitamindefizienten auxotrophen Stämmen durchgeführt. Die genetische Rekombination selbst wurde erwiesen, indem man Protoplasten, die aus Zellen, die einerseits in minimalem Nährmedium mit Uracilge-10halt gezüchtet wurden, andererseits in Gegenwart von Cy-stein gebildet wurden, fusionierte, und nach Regeneration die nicht aminosäuredefizienten Prototrophe isolierte (Oichi und Mitarbeiter, siehe früheres Zitat).

Baltz und Mitarbeiter beschrieben in Belgischen Patenten i5 Nr. 868 472 und 868 473 ein Verfahren für die Herstellung und Regeneration von Streptomyces Protoplasten sowie für Protoplastfusion, aber erwähnten keine Ergebnisse über die Beeinflussung der Antibiotikum-Biosynthese. Ihre Versuche wurden immer mit auxotrophen Stämmen durchgeführt. 20 Die Beeinflussung der Antibiotikum-Biosynthese durch in vivo genetische Rekombination mittels Protoplastenfu-sion wurde unserem Wissen nach in der Literatur noch nicht beschrieben.

Gegenstand der Erfindung ist ein neues Verfahren zur 25 qualitativen und quantitativen Beeinflussung der Antibioti-kum-Biosynthese durch in vivo Rekombination, worin die Qualität und die Quantität von biologisch aktiven Verbindungen, die durch antibiotikumerzeugende Mikroorganismen biosynthetisiert werden, vorteilhaft beeinflusst wird. 30 Es wurde unerwarteterweise gefunden, dass die antibiotikumerzeugende Fähigkeit eines gewissen Teils von rekombi-nanten Zellen, die durch Protoplastenfusion gemäss dem Verfahren hergestellt wurden, im Vergleich zu der Gesamtzahl der Rekombinantenstämme in einer überraschend gros-35 sen Proportion modifiziert wurden. Ein Teil der Rekombi-nanten erzeugte Antibiotikum-Komplexe mit veränderter Zusammensetzung, in weiteren wurde, im Vergleich zu den Fusionspartnern, die Produktionsfähigkeit entweder beträchtlich erhöht oder vermindert.

40 Weiterhin wurde gefunden, dass die Wirksamkeit der Protoplastenfusion, und noch eher die der Rekombination, durch das erfindungsgemässe Verfahren signifikant erhöht werden kann.

In unseren Versuchen wurde unerwarteterweise gefun-45 den, dass die genetische Rekombination auch dann abläuft, wenn die Protoplasten eines der Fusionspartner durch chemische oder physikalische Behandlung inaktiviert wurden. So ist es nicht nötig, beide Fusionspartner genetisch zu markieren.

50

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren für die Herstellung von Aminoglykosid-Antibiotika enthaltenden Fermentationsbrühen durch in vivo Rekombination von Ami-noglykosid-Antibiotika erzeugenden Stämmen und Fermen-55 tation der erhaltenen genetisch modifizierten Stämme. Erfin-dungsgemäss werden nach einer Vorkultur in einem Saccharose, Calcium- und Magnesium-Ionen enthaltenden Nährmedium Protoplaste aus gegebenenfalls genetisch markierten Zellen verschiedener Streptomyces-Stämme gebildet, dass 6o Protoplaste entweder von zwei verschiedenen genetisch markierten Stämmen oder von einem genetisch markierten Stamm und einem oder mehreren prototrophen Stämmen, welch letztere Protoplasten inaktiviert wurden, fusioniert werden, die fusionierten Protoplasten regeneriert werden, die ßs genetisch modifizierten Stämme, deren Modifikation die An-tibiotika-Produktionsfahigkeit qualitativ oder/und quantitativ beeinflusst isoliert und aerob submers fermentiert werden.

Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden aminosäure- oder nukleotidbasedefiziente, auxotrophe Stämme hergestellt. Die Auxotrophen können durch mutagene Behandlung mit N-Methyl-N'-nitro-N-nitro-soguanidin [Davis, J. Am. Chem. Soc., 70, 4267 (1948)] gewonnen werden. Die Antibiotikum-Produktionsfähigkeit sowie die genetische Stabilität der erhaltenen Auxotrophen wird in Reihenuntersuchungen geprüft. Die genetisch stabilen Isolate werden in flüssigem, organische Karbon- und Stickstoffquellen, Saccharose, Kalcium und Magnesium Ionen und Glycin/Glycin hemmt Zellwachstum] enthaltendem Nährmedium gezüchtet. Diejenige Kultur, wo die wachstumshemmende Wirkung des Glycins die stärkste,

aber noch nicht vollständig war, wird selektiert, die Zellen werden zentrifugiert und gewaschen. Die gewaschenen Zellen werden in Saccharose und Lysozyme enthaltender, physiologischer Salzlösung suspendiert, wobei sich Protoplasten bilden. Die gewonnenen Protoplasten werden gewaschen und ein Teil davon wird auf festes Regenerieragar übertragen. Der andere Teil der Protoplasten wird in einem Verhältnis von 1:1 mit für genetische Rekombination selektierten, aus Partnerzellen ähnlich dargestellten Protoplasten kombiniert. Dem Protoplastengemisch werden Polyäthylenglykol (Molekulargewicht 1000-20 000) und Salze, die zu Magnesium und Kalcium Ionen dissoziieren, zugefügt, um Protoplastenfusion zu induzieren. Nachfolgend werden die Zellen regeneriert. Wird die Regeneration in Minimalnährmedium durchgeführt, so können nur jene Hybridzellen Kolonien bilden, wo die in vivo genetische Rekombination tatsächlich zustande kam. Die Regeneration kann aber auch in organischen Stickstoff enthaltendem Nährmedium durchgeführt werden. Dann kann die Zahl der Prototrophen bestimmt werden, indem die in diesem Medium gezüchteten Kolonien auf Minimalnährmedium übertragen werden.

Mit dem obigen Verfahren werden die prototrophen Re-kombinanten nach der Fusion von Protoplasten, die aus einem oder aus mehreren auxotrophen gebildet wurden, isoliert. Leider verringerte aber die Konversion der antibiotikumerzeugenden Stämme in auxotrophe Stämme beträchtlich ihre Produktionsfahigkeit. Aus wirtschaftlichen Gründen schien es erwünscht, wenn wenigstens einer der Fusionspartner grosse Mengen des Antibiotikums biosynthetisieren kann. So wurde ein Verfahren entwickelt, worin nur einer der Partner ein Auxotroph war, der andere Partner dagegen ein Prototroph, dessen Protoplasten vor der Fusion entweder durch chemische oder physikalische Behandlung lebensunfähig gemacht wurden. Nach der Fusion werden von allen Auxotrophen oder abgetöteten Prototrophen, die zugegen waren, aber weder regenerieren, noch wachsen konnten, allein die Hybridzellen regeneriert, da sie allein Kolonien bildeten.

In dem erfmdungsgemässen Verfahren wird die Protopla-steninaktivierung entweder mit chemischen oder mit physikalischen Methoden erreicht. Jedes chemische Reagens, das zu dem Verlust der Regenerationsfahigkeit der Protoplasten bei gleichzeitigem Bewahren ihrer genetischen Integrität führt, kann angewandt werden, z.B. - ohne den Schutzkreis der Erfindung zu limitieren - Kannabidiolsäure (3-Methyl-6 -isopropenyl-4'-n-pentyl- 2',6'-dihydroxy-l,2,3,6- tetrahydro-diphenyl-3'-karbonsäure) oder ihre Salze, N-Äthyl-maleimid, Pyrrolnitrin, [3-Chlor-4-(3- chlor-2-nitrophenyl)-pyrrol], Brillantgrün [N-(4-)) 4-(diäthylamino)phenyl)-phenylmethy-len)-2,5-cyclohexadien -1 -yliden)-N-äthyl-äthanaminiumsul-fat] und 2-Merkapto-äthanol. Nach beendetem chemischen Inaktivieren werden die Protoplasten gewaschen und als Fusionspartner eingesetzt.

Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens können die Protoplasten auch mit Gamma-Bestrahlung inaktiviert werden. Protoplasten werden mit 60Co-Isotop,

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mit einer Dosis von 30-120 krad, zweckmässig mit 80 krad, bestrahlt, dann werden die Protoplasten zentrifugiert und als Fusionspartner angewandt.

Die Antibiotikum-Produktionsfähigkeit der gewonne-5 nen prototrophen Isolaten wird in Reihenuntersuchungen geprüft. Nach der Fusion wird auch die Produktionsfähigkeit von Doppelauxotrophen und auch von Prototrophen, die aus ihnen durch Ségrégation erhalten wurden, bestimmt.

Die Produktionsfähigkeit der Stämme wird geprüft, in-lo dem sie in zweckmässig organische Karbon- und Stickstoffquellen, anorganische Salze und pflanzliche Öle enthaltende Nährmedien geimpft werden, und die Kulturen inkubiert werden. Nach 16-24 Stunden werden diese Impfkulturen benützt, um das Hauptfermentationsmedium der gleichen Zu-15 sammensetzung zu inokulieren. Die Fermentation wird 140-160 Stunden lang fortgesetzt. Proben werden erst in der 96-sten Stunde, dann in jeder 24-sten Stunde genommen, um den Antibiotikumgehalt und das Komponentenverhältnis der produzierten Antibiotika zu bestimmen.

2c Die mit dem obigen Verfahren gewonnenen Mutanten mit hoher Antibiotikum-Produktionsfähigkeit werden in belüfteten Tiefkulturen in organische Karbon- und Stickstoffquellen, anorganische Salze, Öle pflanzlichen und/oder tierischen Ursprungs und/oder Fette enthaltendem Nährmedium 25 bei 32-40 C, zweckmässig bei 37 °C, so lange gezüchtet, bis sich geeignete Mengen des Antibiotikums bildeten.

Rekombinanten können aus Streptomyces tenebrarius MNG 169 und MNG 204, deponiert in der Stammbank des Landesinstitutes für Gesundheitswesen, Budapest, dargestellt 30 werden. Streptomyces tenebrarius 169 kann Nebramycin-2, Nebramycin-4 und Nebramycin-5' biosynthetisieren, Streptomyces tenebrarius MNG 204 dagegen Nebramycin-5' neben Spuren von Nebramycin-4. Aus diesen Stämmen werden mittels üblicher mutagener Behandlung mit N-Methyl-N'-ni-35 tro-N-nitroso-guanidin auxotrophe Mutanten gebildet, und ihre genetische Stabilität wird durch mehrere Replikationen und ihre Antibiotikum-Produktionsfähigkeit in Reihenuntersuchungen geprüft. Die genetisch stabilen Stämme werden selektiert, und aus ihnen werden Protoplasten gemäss dem in 40 den Beispielen festgelegten Verfahren gebildet. Die Protoplasten werden mit dem ausgewählten Fusionspartner kombiniert und nachfolgend regeneriert. Sowohl Protoplastenbil-dung wie Regeneration sind quantitativ, falls Züchtung, Pro-toplastenbildung und Regeneration in der Gegenwart von 45 Saccharose und Salzen, die in Kalcium- und Magnesiumionen dissoziieren durchgeführt werden. Die regenerierten Hybride werden isoliert und am Schrägagar gezüchtet. Die Häufigkeit der Prototrophbildung aus auxotrophen Stämmen, die bei spontaner Mutation nur 10~8 beträgt, ergibt 50 mit dem erfmdungsgemässen Fusionsverfahren 1 x 10 3 -5 x 10"4.

Die Produktionsfähigkeit der isolierten prototrophen Rekombinanten analysierend wurde gefunden, dass die einzelnen Antibiotika, die Komponenten des vom Elternstamm erzeugten Antibiotikum-Komplexes waren, auch von jedem Rekombinanten biosynthetisiert werden, aber in einem veränderten Komponentenverhältnis und veränderter Produktionskonzentration. Die Elternstämme produzieren zwei (MNG 204), bzw. drei (MNG 169) Nebramycin-Komponen-60ten, bei der Autodiffusion von MNG 204 bzw. MNG 169 Protoplasten und bei der Fusion von MNG 204 und MNG 169 Pro toplasten entstehen dagegen genetische Rekombinanten, welche im Vergleich zu den Elternstämmen entweder a. überhaupt kein Antibiotikum, oder sehr niedrige oder 65sehr hohe Antibiotikum-Konzentrationen biosynthetisieren,

oder b. eine einzige Nebramycin Komponente: Nebramycin-2, Nebramycin-4 oder Nebramycin-5';

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4

c. zwei Nebramycin Komponenten: Nebramycin-2 und Nebramycin-4, oder Nebramycin-2 und Nebramycin-5', oder d. drei Nebramycin Komponenten: Nebramycin-2, Ne-bramycin-4 und Nebramycin-5' biosynthetisieren.

Von den gewonnenen Stämmen wurde der Nebramycin-2 produzierende Streptomyces tenebrarius 35 TL Stamm unter No. MNG 00243, der Nebramycin-4 produzierende Streptomyces tenebrarius F104 unter No. MNG 00244, und der Nebramycin-5' produzierende Streptomyces tenebrarius F77 unter No. MNG 00242 in der Stammbank des Landesinstitutes für Gesundheitswesen, Budapest (National Collection of Microorganismus of the National Institute for Public Health) deponiert.

Die erfmdungsgemässen Stämme können Nebramycin-Komponenten enthaltende Fermentbrühen erzeugen. Die Fermentation selbst kann vorzugsweise mit dem Verfahren des Ungarischen Patentes Nr. 176 103 durchgeführt werden, während die Antibiotika vorzugsweise mit dem Verfahren der Ungarischen Patente Nr. 174 315 und 176 103 isoliert werden können.

Gemäss einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfmdungsgemässen Verfahrens kann für die Bildung von Rekombinanten Streptomyces kanamyceticus angewandt werden. Die Züchtung der Mikroorganismen, die Protoplastenbildung, Protoplastfusion und Regeneration, weiterhin die Reihenuntersuchung der Produktivität der selektierten Stämme kann entweder gemäss dem obigen Verfahren oder gemäss dem in Beispielen 3 und 8 festgelegten Verfahren durchgeführt werden.

Das erfindungsgemässe Verfahren hat viele Vorteile. Die im Verfahren ausgeführten Rekombinationen und Diploidi-sationen beeinflussen die Biosynthese der Stämme entweder durch Veränderung des Komponentenverhältnisses oder durch Erhöhung der Antibiotikum-Produktionsfähigkeit.

Beispiel 1

Protoplastbildung, Protoplastfusion und Regeneration

Schrägagare werden mit einer Sporensuspension oder tiefgefrorenen Kultur von Streptomyces tenebrarius MNG 169 und Streptomyces tenebrarius MNG 204, oder aus ihnen gebildeten auxotrophen Stämmen beimpft. Der Schrägagar hat folgende Zusammensetzung:

Dextrin

1,0

%

Hefeextrakt

0,1

%

Kaseinhydrolysat (10%ig)+

2,0

%

Fleischextrakt

0,1

%

Kobalt-dichlorid-hexahydrat

0.001%

Agar

2,5

%

+enzymatisch hydrolisiert

Vor dem Sterilisieren wird der pH-Wert des Nährbodens mit einer wässrigen Natriumhydroxidlösung auf 7,2 eingestellt, nachfolgend wird bei 121 °C 20 Minuten lang sterilisiert.

Die Kulturen werden 48 Stunden lang bei 37 °C inkubiert, dann werden 0,2 ml Portionen dieses Inokulums in steriles Nährmedium folgender Zusammensetzung geimpft:

s Glykose 1,0 %

Hefeextrakt 1,0 %

Saccharose 20,5 %

Kalcium-dichlorid-dihydrat 0,3 %

Magnesium-dichlorid-hexahydrat 0,6 %

îoGlycin 4,5 oder 6 %

Der pH-Wert der Medien wird auf 7.0-7,2 eingestellt.

Die Kulturen werden in der Schüttelmaschine 48 Stun-15 den lang bei 37 °C inkubiert, dann werden jene Kulturen, in welchen die wachstumshemmende Wirkung des Glycins die stärkste, aber noch nicht vollständig ist, selektiert. Mit diesen Kulturen werden obige Nährmedien mit erhöhtem Gly-cingehalt beimpft. Falls ursprünglich die selektierte Kultur 204% Glycin enthielt, so werden diese in Nährmedien geimpft, welche 5 bzw. 6% Glycin enthalten.

Dann wird das gebildete Mycélium zentrifugiert (15 Minuten 2300 g), und mit einer Lösung der folgenden Zusammensetzung gewaschen:

25

Saccharose

Kalcium-dichlorid-dihydrat Magnesium-dichlorid-hexahydrat Kaliumchlorid

30

pH der Lösung: 7,2, Bezeichnung: M nachfolgend wird wiederholt zentrifugiert.

Die Myceliummasse wird in der obigen Lösung resuspen-35diert und mit 0,5%igem Lysozym versetzt (Serva, Feinbio-chemica, Heidelberg). Das Mycélium wird bei mildem Schütteln inkubiert, und die Protoplastenbildung wird alle 10 Minuten mikroskopisch kontrolliert. Von der Stammart abhängend dauert die quantitative Protoplastenbildung in 40mycelialen Streptomyces Kulturen etwa 1-4 Stunden.

Die Kultur, die quantitativ zu Protoplasten umgewandelt war, wird zentrifugiert (25 Minuten, 2300 g), mit Lösung M gewaschen und wiederholt zentrifugiert.

Der Bodensatz wird vorsichtig in 0,05 ml Lösung M suspendiert, dann werden die Protoplasten regeneriert.

Für die Beseitigung der eventuell zurückgebliebenen My-celiumstücke wird die Protoplastensuspension durch eine 2,5 cm Schicht Watte gefiltert. Das Filtrat wird mit Lösung M verdünnt und auf steriles Regenerieragar der folgenden Zusammensetzung geschichtet:

Glykose 1,0 %

Hefeextrakt 1,0 %

Saccharose 20,5 %

55 Kalcium-dichlorid-dihydrat 0,3 %

Magnesium-dichlorid-hexahydrat 0,6 %

Agar 3,0 %

20,5 % 0,3 % 0,6 % 0.0075%

Die Schrägkulturen werden 4 Tage lang bei 37 "C inkubiert, dann werden sie Sporen von der Oberfläche des Agars mit sterilem, destilliertem Wasser abgewaschen. Mit der erhaltenen Sporensuspension wird ein steriles Inokulumnähr-medium folgender Zusammensetzung beimpft:

Glykose 1,0 %

Hefeextrakt 1,0 %

Der pH-Wert des Mediums wird auf 7,2 eingestellt.

pH der Lösung: 7,0-7,2.

6C

0,1 ml der Protoplastensuspension wird auf die Oberfläche von 25 ml Regenerieragar in einer Petri-Schale geschichtet, dann wird es mit 3 ml des Regenieragars bedeckt. Das Agar das zur Bedeckung benützt wird, hat obige Zusammensetzung, doch wird 1,2% Agar anstatt 3% benützt.

Die Kulturen werden in einer feuchten Kammer bei 35-37 °C inkubiert. Am dritten-vierten Tag können schon die regenerierten Kolonien frei beobachtet werden. In Be

5

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tracht der Protoplastenzàhl, die auf die Regenerierplatte aufgetragen wurde, kann die Regeneration als quantitativ betrachtet werden.

Die aus den beiden auxotrophen Stämmen gewonnenen Protoplasten werden fusioniert. Falls von den Hybriden nur die prototrophen Rekombinanten isoliert werden sollen, so werden sie auf ein Minimalnährboden folgender Zusammensetzung aufgetragen:

Diammonium-sulfat

0,5

%

Kalium-dihydrogen-phosphat

0,1

%

Magnesium-sulfat-heptahydrat

0,05

%

Glykose

1,0

%

Kalcium-chlorid-dihydrat

0,3

%

Magnesium-chlorid-hexahydrat

0,6

%

Saccharose

20,5

%

Wickerham Vitamin Lösung

0,01

%

Agar

3,0

%

pH des Mediums: 7,2

Zusammensetzung der Wickerham Vitamin Lösung:

Folsäure Biotin

Kalcium-pantothenat

Inosit

Niacin p-Amino-benzoesäure Pyridoxin-hydrochlorid Aneurin-hydrochlorid Riboflavin Destilliertes Wasser

0,2 mg 0,2 mg 40,0 mg 200,0 mg 40,0 mg 20,0 mg 40,0 mg 40,0 mg 20,0 mg 100,0 ml

Prototrophe können auch isoliert werden, indem die Kolonien, die auf komplettem Regeneriernährboden ausgewachsen waren, auf Minimalnährboden der obigen oder anderer Zusammensetzung repliziert werden.

5

Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform des erfmdungsgemässen Verfahrens werden die Protoplasten gemäss obiger Methode fusioniert, indem die Protoplasten, die aus zwei oder mehreren Stämmen gebildet wurden, in beliebigem io Verhältnis, zweckmässig 1:1, vermischt werden, und 0,2 ml dieses Protoplastengemisches mit 2 ml Fusionslösung der folgenden Zusammensetzung versetzt wird:

Polyäthylen-glykol, Molekulargewicht 35,0 % i51000-20 000

Kalcium-dichlorid-dihydrat 0,3 %

Magnesium-dichlorid-hexahydrat 0,6 %

pH der Lösung wird mit wässriger Natriumhydroxid-Lö-2osung auf 7,2 eingestellt.

Die Vermischung mit der Fusionslösung induziert die Aggregation der Protoplasten, ihre Membrane verschmelzen, die Fusion kommt zustande. Die DNS von zwei oder mehre-2Sren Zellen, die Träger der genetischen Information sind, kommen näher zueinander, und so kann die genetische Rekombination vor sich gehen.

In Tabelle 1 wird das erfmdungsgemässe Verfahren mit 30 den Verfahren der Belgischen Patente Nr. 868 472 und 868 473 in Bezug der Protoplastbildung und Regenerationshäufigkeit verglichen.

35

Tabelle 1

Bildung und Regeneration von Streptomyces tenebrarius Protoplasten mit bekannten und mit dem erfmdungsgemässen Verfahren

Methoden

Bekannte Erfmdungs-

Protoplast-bildung (90 Minuten) 92,5 99,81

Regeneration Koloniezahl

13 18000

0.065 90,0

Kolonien aus in takten Zellen Koloniezahl °/ 1500 7

38 0

gemässes Verfahren

Aus der Tabelle geht es deutlich vor, dass mit dem erfmdungsgemässen Verfahren, mittels Vorzüchtung in der Gegenwart von Kalcium-chlorid, Magnesium-chlorid und Saccharose, die Wirksamkeit der Protoplastbildung, noch eher aber die der Regeneration wesentlich erhöht werden können.

In den nachfolgenden Beispielen werden einige in vivo genetische Rekombinationsversuche und ihre Ergebnisse erörtert.

Beispiel 2

Fusion von auxotrophen Stämmen und die Antibiotikumbyo-synthese von rekombinanten Stämmen a. Fusion von A222 his~ und 404 ura~ auxotrophen Stämmen

Aus dem neben Spuren von Nebramycin-4 Nebramycin-5' biosynthetisierenden Streptomyces tenebrarius MNG 204 Stamm, und aus dem Nebramycin-2, Nebramycin-4 und Nebramycin-5' produzierenden Streptomyces tenebrarius MNG 169 Stamm werden mittels bekannter, üblicher mutagener Behandlung histidindependente A222 his~ und ura-cildependente 404 ura~ Stämme hergestellt.

',5 »,19

Aus den beiden Stämmen werden mit dem Verfahren von Beispiel 1 Protoplasten gebildet, die Protoplasten werden fu-50 sioniert und regeneriert. Ein Teil der prototrophen Rekombinanten wird isoliert, Rekombinationshäufigkeit: 5 x 10 5.

Die Antibiotikum-Produktionsfähigkeit der isolierten prototrophen Stämme wird gemäss dem Verfahren von Beispiel 8 bestimmt. In Tabelle 2 werden die Ergebnisse der Fer-55 mentation von 147 isolierten Rekombinanten zusammenge-fasst.

Tabelle 2

Antibiotikum-Produktion von Prototrophen, die durch die in 60 vivo DNS Rekombination von Auxotrophen A222 his~ und 404 ura~ gewonnen wurden

Zahl der %

Stämme

16 10,9

24 16,3

11 7,5

57 38,8

Produktionsfähigkeit

65 Keine Antibiotikumproduktion Nebramycin-5'

Nebramycin-4 Nebramycin-4 und -5'

662 582

6

Nebramycin-2 und -5' 7 4,7

Nebramycin-2,-4 und-5' 32 21,8

Produktionsfähigkeit der Fusionspartner:

A222 his"

404ura~:

Nebramycin-2:

Nebramycin-4:

Nebramycin-5':

Nebramycin-2:

Nebramycin-4:

Nebramycin-5':

0 ng/ml 30 (ig/ml 675 ng/ml 1120 (ig/ml 75 ng/ml 145 ng/ml auxotrophen (trp~Iys~). Die Produktionsfähigkeit von 13 Doppelauxotrophen wurde gemäss dem Verfahren von Beispiel 8 geprüft und die Ergebnisse in Tabelle 4 zusammenge-fasst. Nach der Ségrégation wurden aus den Doppelauxotro-5 phen zwei Prototrophen isoliert, ihre Produktionsfähigkeit wird ebenfalls angegeben.

Tabelle 4

Antibiotikum-Produktion von Doppelauxotrophen trp~ lys~ xo und von Segreganten, die aus ihnen isoliert wurden

Gleichzeitig übertrifft die Produktionsfähigkeit von einem Teil der Rekombinanten die der Fusionspartner ganz wesentlich. So biosynthetisiert zum Beispiel Streptomyces tenebrarius F 105 2140 ng/ml Nebramycin-2, 380 ng/ml Nebramycin-4 und 1510 ng/ml Nebramycin-5', Streptomyces tenebrarius F 88 0 (ig/ml Nebramycin-2, 140 ng/ml Nebramycin-4 und 1440 (ig/ml Nebramycin-5', Streptomyces tenebrarius F 77 840 [ig/ml Nebramycin-5' und Streptomyces tenebrarius F 104 neben Spuren von Nebramycin-5' (weniger als 1%) 1520 (ig/ml Nebramycin-4.

Die Produktionsfähigkeit der Stämme, die nach der Au-tofusion von aus Elternstämmen hergestellten Protoplasten isoliert wurden, blieb unverändert.

Mit dem Stamm Streptomyces tenebrarius F 104 werden gemäss dem Verfahren von Beispiel 8 10 Liter Fermentbrühe und die biologisch aktiven Verbindungen werden gemäss dem Ungarischen Patent Nr. 174 315 isoliert. Ausbeute: 13,8 g Nebramycin-5 (Kanamycin-B) und 9 mg Nebramycin-6 (Tobramycin).

Streptomyces tenebrarius F 77 und F 104 wurden unter Nr. MNG 00242 und MNG 00244 in der Stammbank des Landesinstitutes für Gesundheitswesen, Budapest, deponiert.

b. Fusion der auxotrophen Stämme 7-34 trp~ und 73 lys~

Aus dem tryptophandependenten Streptomyces tenebrarius 7-34 trp~ Stamm und aus dem lysindependenten Streptomyces tenebrarius 73 lys~ Stamm, die mit üblicher mutagener Behandlung aus Streptomyces tenebrarius MNG 169 gewonnen wurden, werden gemäss dem Verfahren von Beispiel 1 Protoplasten gebildet, die Protoplasten werden fusioniert und nachfolgend regeneriert. Ein Teil der Prototrophen wird isoliert, und ihre Produktionstätigkeit wird gemäss der Methode von Beispiel 8 geprüft. Rekombinationshäufigkeit: 1 x IO"5.

Tabelle 3

Antibiotikum-Produktion von Prototrophen, die durch in vivo DNS-Rekombination aus Auxotrophen 7-34 trp~ und 73 lys" gewonnen wurden

Produktionsfähigkeit

Keine Antibiotikumproduktion Nebramycin-2 Nebramycin-2 und -5' Nebramycin-2, -4 und -5'

Zahl der Stämme

1

2 16 15

%

2,9 5,9 47,3 43,9

Die Fusionspartner selbst biosynthetisieren alle drei Ne-bramycin-Komponenten.

Nach der Fusion und Regeneration wurde beobachtet, dass es einige Stämme gibt, die im Minimalnährmedium, in der Gegenwart von Lysin oder Tryptophan nicht wachsen konnten, in der gleichzeitigen Gegenwart von Tryptophan und Lysin aber schnell wuchsen. Die ursprünglich auxotrophen Stämme wurden durch die Rekombination zu Doppel-

Stamm ls Streptomyces tenebrarius trp~lys~

Streptomyces 20 tenebrarius 35 W und 40 W

Biosynthetisierte Nebramycin-Komponente Nebramycin-2 Nebramycin-2 und -4 Nebramycin-2 und -5' Nebramycin-2, -4 und -5' Nebramycin-4 und -5'

%

23,1 7,7 30,7 38,5 100,0

Die Tabelle zeigt eindeutig, dass die Produktionsfahigkeit der Stämme, die nach in vivo genetischer Rekombina-25 tion isoliert wurden, wesentlich geändert ist. Es ist besonders bemerkenswert, dass die aus Doppelauxotrophen isolierten Prototrophen ihre Fähigkeit, Apramycin zu biosynthetisieren, verloren hatten, gleichzeitig aber wurde ihre Antibioti-kum-Produktionsfähigkeit, im Vergleich zu den Elternstäm-30 men, wesentlich höher. So produzieren die Stämme 7-34 trp~ und 73 lys- 1300-1700 Hg/ml Nebramycin-2, 200 ng/ml Nebramycin-4 und 1040 ng/ml Nebramycin-5', während Rekombinanten 35 W und 40 W 1040 ng/ml Nebramycin-4 und 1950 [xg/ml Nebramycin-5'. biosynthetisieren. 35 Der ausschliesslich Nebramycin-2- produzierende Streptomyces tenebrarius 35 TL Stamm wurde unter No. MNG 00243 in der Stammbank des Landesinstitutes für Gesundheitswesen, Budapest, deponiert.

40 c. Fusion der Auxotrophen J1006-3ade~ und J211j2ura~ Streptomyces tenebrarius J1006-3ade" und J21 l/2ura~ wurden mit mutagener Behandlung aus Streptomyces tenebrarius MNG 204 gewonnen. Diese Stämme biosynthetisierten entweder überhaupt kein Antibiotikum oder nur Spuren 45 von Nebramycin-5' (weniger als 5 |xg/ml). Nach ihrer Fusion gemäss dem Verfahren von Beispiel 1 wurde die Produktionsfähigkeit der 150 prototrophen Rekombinanten gemäss der im Beispiel 8 beschriebenen Methode geprüft. Rekombinationshäufigkeit: 1 x 10~4.

50 60% (90) der untersuchten Stämme biosynthetisierten auch weiterhin überhaupt kein Antibiotikum, 40% (60) produzierten dagegen entweder Nebramycin-4 und Nebramycin-5', oder ausschliesslich nur Nebramycin-5'. 13% der produktionsfähigen Stämme (8) biosynthetisierten Nebramy-55 cin-5' in Mengen über 1500 jig/ml.

Diese Ergebnisse erweisen eindeutig, dass die Antibioti-kum-Produktionsfähigkeit der Streptomyces Stämme mit dem erfmdungsgemässen Verfahren beträchtlich erhöht werden kann.

60

Beispiel 3

Fusion der auxotrophen Stämme Streptomyces kanamyceticus leu~ und arg~

Das im Beispiel 1 festgelegte Verfahren wird angewandt 65 mit dem Unterschied, dass die Züchtung der genetisch markierten Stämme bei 28 °C solange fortgesetzt wird, bis in 3% Glycin enthaltendem Nährboden schwaches Wachsen beobachtet werden kann. Die auxotrophen Stämme werden nach

7

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der mutagenen Behandlung von Streptomyces kanamyceticus ATCC 12,853 (Umezawa und Mitarb., J. Antibiotics. 10A, 181-188 (1957) und Jpn. Kokai 8695(1961) isoliert. Der Elternstamm produziert Kanamycin. Die leucindepen-dente Mutante bioxynthetisiert überhaupt kein Antibiotikum, die im Minimalnährmedium in Gegenwart von Argi-nin wachsende Mutante produziert dagegen 15 (xg/ml Kanamycin.

Die Antibiotikum-Produktionsfähigkeit von Streptomyces kanamyceticus wird gemäss der im Beispiel 8 beschriebenen Methode geprüft mit dem Unterschied, dass die Züchtung anstatt 37 °C bei 28 °C durchgeführt wird, und für die biologische Aktivitätsprüfung Bacillus subtilis als Testorga-nismus angewandt wird.

Nach der Fusion und Regeneration der fusionierten Protoplasten werden die Prototrophen isoliert, und die Produktionsfähigkeit von 144 Stämmen geprüft. 12 Stämme können zehnmal mehr (im Durchschnitt 155 |xg/ml Kanamycin) biosynthetisieren, als die arginindependete, auxotrophe Mutante. Rekombinationshäufigkeit: 3-8 x 10-4.

Beispiel 4

Herstellung von intakten, aber lebensunfähigen Protoplasten und ihre Anwendung als Fusionspartner

Aus Streptomyces tenebrarius MNG 169 und aus seinem 404 ura- Auxotrophen werden gemäss dem Verfahren von Beispiel 1 Protoplasten gebildet. Zwecks Inaktivierung des prototrophen Streptomyces tenebrarius MNG 169 wird der aus ihm gebildeten Protoplastsuspenison (108 Protoplasten/ ml Lösung M) 50-100 ng/ml Kannabidio-triäthylamin Salz in einer Lösung von Dimethylsulfoxid, bei 30 °C zugefügt. Nach vierstündiger Behandlung werden die Protoplasten zentrifugiert (2300 g, 25 Minuten), dann werden sie zwecks Beseitigung des überschüssigen Inaktivierungsmittels mit Lösung M gewaschen und wiederholt zentrifugiert. Die Fusion der chemisch inaktivierten und aus dem Streptomyces tenebrarius MNG 169 Prototrophen gebildeten Protoplasten und der aus dem 404 ura- Auxotrophen gebildeten Protoplasten wird gemäss dem Verfahren von Beispiel 1 durchgeführt. Die Fusionsergebnisse sind in Tabelle 5 zusammengefasst.

Tabelle 5

Protoplasten werden gemäss dem Verfahren von Beispiel 3 hergestellt mit dem Unterschied, dass unmarkierte Streptomyces kanamyceticus ATCC 12,853 als Elternstamm angewandt wird. Die gewonnenen Streptomyces kanamyceticus 5 Protoplasten werden gemäss der Methode im Beispiel 4 inaktiviert mit dem Unterschied, dass anstatt Kannabidiolsäure 400 und 800 (ig/ml N-Äthyl-maleimid (EM) als chemisches Inaktivierungsmittel angewandt wird. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 zusammengefasst.

Tabelle 6

Stamm

Regenerierplatte (Koloniezahl/ml)

15

Streptomyces kanamyceticus 2o ATCC 12853

Unbehandelt

3,2 x 106

Behandelt mit 400 (ig/ml EM 4,2 x 105

Behandlung mit 800 Hg/ml EM

25

30

35

Die mit 800 ng/ml N-Äthyl-maleimid behandelten und inaktivierten Protoplasten werden als Fusionspartner benützt.

Beispiel 7

Darstellung von lebensunfähigen Protoplasten durch physikalische Inaktivierung.

Die gemäss Beispiel 1 dargestellte Streptomyces kanamyceticus Protoplastsuspension (108 Zellen/ml) wird in einem Plastikrohr der gamma-Bestrahlung unterworfen (60Co). Die mit einer Dosis von 80 krad inaktivierten Zellen werden als Fusionspartner benützt.

Beispiel 8

Prüfung der Antibiotikum-Produktionsfähigkeit von Stämmen, die Nebramycin-Komponenten biosynthetisieren, und Herstellung von Antibiotikum-Fermentbrühen

Die Sporen oder die vegetative Kultur des zu prüfenden Stammes werden auf Schrägagare, die mit destilliertem Wasser gemacht wurden, geimpft. Zusammensetzung des Schräg-agars:

Regenerierplatte

Minimal

Rekom-

(Koloniezahl/ml)

nährme bina-

Dextrin

1,0 %

Stamm

dium tions-

45 Hefeextrakt

0,1 %

Vor und nach

(Kolonie häuflg-

Kasein-hydrolysat (10%ig)+

2,0 %

Behandlung mit zahl/ml)

keit

Fleischextrakt

0,1 %

KANNABIDIOL

Kobalt-dichlorid-hexahydrat

0,001%

SÄURE

Agar

2,5 %

MNG 169

2 x 104 0

2,1 x 104

-

50

404 ura-

1,5 xlO4

0

-

+enzymatisch hydrolysiert.

MNG 169x404 ura-

30

2 x 103

Beispiel 5

Das im Beispiel 4 festgelegte Verfahren wird durchgeführt mit dem Unterschied, dass anstatt Kannabidiolsäure-triäthylamin Salz 80-240 |xg/ml Pyrrolnitrin oder 100-300 (tg/ml Brillantgrün als chemisches Inaktivierungsmittel angewendet wird. In den Versuchen verlief die Inaktivierung der Protoplasten quantitativ. Die erhaltenen lebensunfähigen Protoplasten werden als Fusionspartner angewandt.

Beispiel 6

60

Der pH-Wert des Nährmediums wird vor dem Sterilisieren mit einer wässrigen Natriumhydroxid Lösung auf 7,2 eingestellt, dann wird 20 Minuten lang bei 121 C sterilisiert.

Die Kulturen werden 4 Tage lang bei 37 C inkubiert, dann werden die Sporen von der Oberfläche des Nährbodens mit sterilem, destilliertem Wasser abgetrennt, und diese Sporensuspension wird in zwei 100 ml, mit Leitungswasser gemachte Inokulumnährmedien, die in 500 ml Erlenmeyerkol-ben sterilisiert wurden, geimpft. Zusammensetzung des Mediums:

Sojamehl

Kasein-hydrolysat (10%ig)H Ammoniumnitrat Ammoniumchlorid Kalcium-karbonat

2,0 3,0 0,1 0,3 0,3

% % % % %

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8

Magnesium-sulfat-heptahydrat 0,5 %

1:1 Gemisch von Palmenöl und Leinöl 3,0 %

Glykose (abgesondert, als 50%ige 2,0 %

Lösung sterilisiert)

+enzymatisch hydrolysiert.

Der pH-Wert des Nährmediums wird mit einer wässrigen Natriumhydroxid Lösung auf 7,2 eingestellt, dann wird bei 121 'C 20 Minuten lang im Autoklaven sterilisiert.

Die beimpften Kulturen werden auf dem horizontalen Schütteltisch (Durchmesser 2,4 cm, 280 min-1) bei 37 °C inkubiert.

Dieses reife Inokulum wird entweder in 100 ml im 500 ml Erlenmeyerkolben sterilisiertem Nährmedium, oder in 5 Liter im 10 Liter Laboratoriumsfermentor 45 Minuten lang bei 121 °C sterilisiertem Medium geimpft. Die Zusammensetzung dieses mit Leitungswasser gemachten Hauptfermentationsmediums ist:

Sojamehl 3,0 %

Kasein-hydrolysat (10%ig)+ 5,0 %

Ammoniumnitrat 0,1 %

Ammoniumchlorid 0,5 %

L-Glutaminsäure 0,8 %

Kalciumkarbonat 0,5 %

Magnesium-sulfat-heptahydrat 0,5 %

Kobalt-dinitrat-hexyhydrat 0,001 %

1:1 Gemisch von Palmenöl und Leinöl 3,0 %

Glykose (abgesondert, in 50%iger 4,2 % Lösung sterilisiert)

+enzymatisch hydrolisiert.

Der pH-Wert des Nährmediums wird vor dem Sterilisieren mit wässriger Ammoniumhydroxid Lösung auf 7,2 eingestellt.

Die Fermentation wird bei 37 °C durchgeführt. Die Zel-slen in den Erlenmeyerkolben werden an der horizontalen Schüttelmaschine gezüchtet. Die Drehzahl des Fermentor-rührers wird auf 360 min-1 eingestellt, und 3 Liter/Minute sterile Luft wird durch das Nährmedium geführt.

Der Antibiotikumgehalt der Kulturen wird mit bekann-îoter Methode biologisch oder nach Dünnschichtchromatographie mit Bioautographie bestimmt. Als Testorganismus der biologischen Bestimmung wird Staphylococcus epidermidis, für die spezifische Bestimmung von Nebramycin-5' neben anderen Nebramycin-Komponenten wird Nebramycin-2 und isNebramycin-4-resistentes Rhizobium meliloti benützt.

Bei der Bestimmung der Komponentenzusammensetzung durch Dünnschichtchromatographie werden Antibiotikummengen von 0,1-0,5 ng/ml auf Silikagel (Merck, Darmstadt) Dünnschichtplatten getropft, und die Platten werden mit ei-2onem 1:1:1 Gemisch von Äthylalkohol, Methyläthylketon und 25%-igem Ammoniumhydroxid enwickelt. Nach vollständigem Trocknen des Gels wird auf die Plattenoberfläche Bacillus subtilis ATCC 6633 enthaltendes Nährmedium geschichtet, dann wird die Platte 16 Stunden lang bei 37 °C in-25kubiert. Nachfolgend wird die Grösse der Hemmungszonen im Vergleich zum Standard bestimmt. Diese Methode ist sowohl für qualitative wie auch für quantitative Bestimmung geeignet.

C

Claims

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1. Verfahren zur Herstellung von Aminoglykosid-Antibiotika enthaltenden Fermentationsbrühen durch in vivo Rekombination von Aminoglykosid-Antibiotika erzeugenden Stämmen und Fermentation der erhaltenen genetisch modifizierten Stämme, dadurch gekennzeichnet, dass nach einer Yorkultur in einem Saccharose, Calcium- und Magne-sium-Ionen enthaltenden Nährmedium Protoplasten aus gegebenenfalls genetisch markierten Zellen verschiedener Streptomyces-Stämme gebildet werden, dass Protoplaste entweder von zwei verschiedenen genetisch markierten Stämmen oder von einem genetisch markierten Stamm und einem oder mehreren prototrophen Stämmen, welch letztere Protoplasten inaktiviert wurden, fusioniert werden, die fusionierten Protoplasten regeneriert werden, die genetisch modifizierten Stämme, deren Modifikation die Antibiotika-Produktionsfähigkeit qualitativ oder/und quantitativ beeinflusst isoliert und aerob submers fermentiert werden.

2.Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Protoplastbildung und Protoplastfusion in 0,1-0,5% Kalciumsalz, 0,3-0,8% Magnesiumsalz und 12-14% Saccharose enthaltendem Nährmedium durchgeführt wird.

2

PATENTANSPRÜCHE

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass für die chemische Inaktivierung Kannabidiol-säure oder ihre Salze, N-Äthylmaleimid, Pyrrolnitrin, Brillantgrün oder 2-Merkaptoäthanol eingesetzt werden.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass für die physikalische Inaktivierung gamma-Bestrahlung benützt wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass Streptomyces tenebrarius zur Bildung von Protoplasten verwendet wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass Streptomyces kanamyceticus zur Bildung von Protoplasten angewandt wird.