DE3418187A1 - Verfahren zur herstellung von aminoglykosid-antibiotica enthaltenden gaerbruehen - Google Patents
Verfahren zur herstellung von aminoglykosid-antibiotica enthaltenden gaerbruehenInfo
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Description
DR.STEPHAN G. BESZEDES
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P 1 94-6
zur Patentanmeldung
BIOGAL GYOGYSZERGYAR
Debrecen, Ungarn
■betreffend
Verfahren zur Herstellung; von Aminoglykosid-Antibiotica
enthaltenden Garbrühen
— 2 —
Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Aminoglykosid-Antibiotica enthaltenden Gärbrühen beziehungsweise
Fermentationsbrühen durch genetische Rekombination in vivo zur qualitativen und quantitativen Erhöhung
der Antibioticumerzeugung in Mikroorganismen.
Aminoglykosid-Antibiotica werden weitgehend in der Humantherapie eingesetzt und sind von großer wirtschaftlicher
Bedeutung. Wegen ihres breiten Wirkungsspektrums werden sie
nicht nur in der Humantherapie, sondern auch in der tierärztlichen
Praxis angewandt.
Es ist bekannt, daß Streptomyces tenebrarius Nebramycin, ein Alehrkomponentengemisch von Antibiotica, erzeugt (Stark,
Hoehn und Know, Antimicrobial Agents and Chemotherapy 1967, Seite 314-, britische Patentschrift 1 178 489, US-Patentschrift
3 691 279 und ungarische Patentschrift 176 103). Von Umezawa und Mitarbeitern wurde die Herstellung von Kanamycin
aus Streptomyces kanamyceticus ATCC 12853 (J· Antibiotics
1OA, [1957], 181 und Japanisches Patent Kokai 8695 [1961]) beschrieben. Die Kanamycin-Bestandteile A, B
und C sind auch Aminoglykosid-Antibiotica.
Es ist auch bekannt, daß aus Mikroorganismenzellen der ßtreptomycetaceae-Familie (Streptomyces- und Micromonospora-Stämme)
unter geeigneten Bedingungen Protoplasten (zellwandfreie Form) gebildet werden, die nachfolgend zu normalen
Zellen regeneriert werden können (US-Patentschrift 4 294 927 und Okanishi, Suzuki und Umezawa, J. Gen. Microbiol.
80 [1973], 389). Die Fusion von Protoplasten unterschiedlicher
Stämme induziert genetische Rekombina-
tionen, wobei Zellen entstehen, die Träger von neuen genetischen Informationen sind (zum Beispiel Hopwood, Wright
und Bibb, Nature 268 [1977], 171; Alföldi, Szvoboda und
Mitarbeiter, US-Patentschrift 4 294 927; Godfrey, Ford und Huber, Can. J. Microbiol. 24 [1978], 994; Oichi, Hitchcock
und Satz, J. Bact. 159 [1979], 984). Die Versuche wurden mit aminosäure-, nukleotidbase- und vitamindefizienten
auxotrophen Stämmen durchgeführt. Die genetische Rekombination selbst wurde nachgewiesen, indem Protoplasten, die
aus Zellen, die einerseits in Minimalnährmedium mit Uracilgehalt gezüchtet wurden und andererseits in Gegenwart
von Cystein gebildet wurden, fusioniert und. nach Regeneration die nicht aminosäuredefizienten Prototrophen isoliert
wurden (Oichi, Hitchcock und Katz, J. Bact. 159 [1979],
984).
Von Baitζ und Mitarbeitern wurde in den belgischen Patentschriften
868 472 und 868 475 ein Verfahren zur mit
vorgeschalteter Vorzüchtung erfolgenden Herstellung von Streptomyces-Protoplasten sowie Protoplastfusion und Regeneration
der fusionierten Protoplasten beschrieben, es wurde jedoch keine Isolierung von Stämmen mit modifiziertem genetischem
Bestand und keine Ergebnisse über die Beeinflussung der Antibioticum-Biosynthese erwähnt. Die Versuche wurden
immer mit auxotrophen Stämmen durchgeführt.
Die Beeinflussung der Antibioticum-Biosynthese durch
genetische Rekombination in vivo mittels Protoplastenfusion wurde noch nicht beschrieben.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein neues Verfahren zur Herstellung von Aminoglykosid-Antibiotica
enthaltenden Gärbrühen mittels genetischer Rekombination in vivo zu antibioticumerzeugenden Stämmen mit modifizier-
tem genetischem Bestand beziehungsweise Material, durch
welches eine qualitative und quantitative Beeinflussung der Antibioticum-Biosynthese in der Weise, daß die Qualität
und Menge von biologisch aktiven Verbindungen, welche durch antibioticumerzeugende Mikroorganismen biosynthetisiert
werden, vorteilhaft beeinflußt wird, zu schaffen.
Das Obige wurde überraschenderweise durch die Erfindung erreicht.
Es wurde nämlich überraschenderweise festgestellt, daß die antibioticumerzeugende Fähigkeit eines bestimmten Teiles
von Rekombinantzellen, die durch Protoplastenfusion gemäß diesem Verfahren hergestellt wurden, im Vergleich zur
Gesamtzahl der Rekombinantstämme in einem überraschend großen Anteil modifiziert wurden. Ein Teil der Rekombinanten
erzeugte Antibloticumkomplexe mit veränderter Zusammensetzung
und weiterhin wurde im Vergleich zu den Fusionspartnern die Erzeugungsfähigkeit entweder beträchtlich erhöht
oder vermindert.
Ferner wurde überraschenderweise festgestellt, daß die
Wirksamkeit der Protoplastenfusion und noch mehr die der Rekombination durch das im folgenden festgelegte erfindungsgemäße
Verfahren signifikant erhöht werden kann.
Außerdem wurde überraschenderweise festgestellt, daß die genetische Rekombination auch dann abläuft, wenn die
Protoplasten eines der Fusionspartner durch chemische oder physikalische Behandlung inaktiviert worden sind. Daher ist
es nicht nötig, beide Fusionspartner genetisch zu markieren.
Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung von Aminoglykosid-Antibiotica enthaltenden
Gärbrühen mittels genetischer Rekombination in vivo zu antibioticumerzeugenden
Stämmen mit modifiziertem genetischem Bestand beziehungsweise Material durch Vorzüchten in einem
Nährmedium, Bilden von Protoplasten aus den Zellen von Streptomyces-Stämmen, Fusionieren beziehungsweise Verschmelzen
der gebildeten Protoplasten und Regenerieren der kombinierten Protoplasten, welches dadurch gekennzeichnet ist,
daß zum Vorzüchten ein Rohrzucker (Saccharose) sowie Calcium-
und Magnesiumionen enthaltendes Nährmedium verwendet wird, als Protoplasten entweder aus 2 oder mehr, vorzugsweise
2, genetisch markierten Stämmen oder aus. 1 oder mehr, vorzugsweise 1, genetisch markierten Stamm beziehungsweise
Stämmen und 1 oder mehreren, vorzugsweise 1, durch chemische oder physikalische Behandlung inaktivierten
prototrophen oder unmarkierten Stamm beziehungsweise Stämmen gebildete fusioniert werden sowie nach dem Fusionieren
und Regenerieren der fusionierten Protoplasten die Stämme mit modifiziertem genetischem Bestand (Prototrophen,
Doppelauxotrophen beziehungsweise Segreganten)
isoliert werden, in an sich bekannter Weise ihre Antibioticumerzeugungsfähigkeit
geprüft wird und die Stämme mit geänderter Antibioticumerzeugungsfähigkeit selektiert werden
sowie mit diesen neuen Stämmen belüftete Gärungen in Tauchkultur beziehungsweise Tiefkultur in einem organische Kohlenstoff-
und Stickstoffquellen, anorganische Salze, Spurenelemente
und/oder tierische oder pflanzliche öle und/oder Fette enthaltenden Nährmedium durchgeführt werden.
Im erfindungsgemäßen Verfahren werden also Aminoglykosid-Antibiotica
enthaltende Gärbrühen durch Züchten von Streptomyces-Stämmen mit modifiziertem genetischem Material
und geänderter Antibioticumerzeugungsfähigkeit hergestellt,
welche durch die genetische Rekombination in vivo von antibioticumerzeugenden
Streptomyces-Stämmen gewonnen werden.
Die Erfindung ist gegenüber den Verfahren des Standes der Technik einschließlich der belgischen Patentschriften
868 472 und 868 473 überraschend, da diese an der Erfindung
vorbeigegangen sind, indem in ihnen keine Rede von der Isolierung von Stämmen mit modifiziertem genetischem Bestand
oder gar der Untersuchung ihrer Antibioticumerzeugungsfähigkeit und Selektierung und Züchtung der Stämme mit besonders
vorteilhaft modifiziertem genetischem Bestand durch Gärung ist.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens werden aminosäure- oder nukleotidbasedefiziente auxotrophe Stämme hergestellt. Die Auxotrophen
können durch mutagene Behandlung mit N-Methyl-N'-nitro-N-
-nitrosoguanidin (Davis, J. Am. Chem. Soc, 70 [1948], 4 267) gewonnen werden. Die Antibioticumer zeugungsfähigkeit
sowie die genetische Stabilität der erhaltenen Auxotrophen werden in Reihenuntersuchungen geprüft. Die genetisch stabilen
Isolate werden in einem organische Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, Rohrzucker, Calcium- und Magnesiumionen
und Glykokoll (Grlykokoll hemmt das Zellwachstum) enthaltendem
flüssigen Nährmedium gezüchtet. Diejenige Kultur, in welcher die wachstumshemmende Wirkung des Glykokolles die
stärkste, aber noch nicht vollständig war, wird selektiert und die Zellen werden zentrifugiert und gewaschen. Die gewaschenen
Zellen werden in Rohrzucker und Lysozyme (siehe beispielsweise Römpp Chemie-Lexikon, 5· Auflage, 1962, Spalten
3 041 bis 3 042) enthaltender physiologischer Salzlösung suspendiert, wobei sich Protoplasten bilden. Die gewonnenen
Protoplasten werden gewaschen und ein Teil davon wird auf festen Regenerieragar übertragen. Der andere Teil der Protoplasten
wird in einem Verhältnis von 1 : 1 mit für genetische Rekombination selektierten, aus Partnerzellen ähnlich
dargestellten Protoplasten kombiniert. Dem Protopla-
stengemisch werden Polyäthylenglykol mit einem Molekulargewicht
von 1 000 bis 20 000 und Salze, die zu Magnesium- und Calciumionen dissoziieren, zugesetzt, um eine Protoplastenfusion
zu induzieren. Nachfolgend werden die Zellen regeneriert. Wenn die Regeneration in einem Minimalnährmedium
durchgeführt wird, können nur diejenigen Hybridzellen, bei welchen die genetische Rekombination in vivo tatsächlich
zustande kam, Kolonien bilden. Die Regeneration kann aber auch in einem organischen Stickstoff enthaltenden Nährmedium
durchgeführt werden. Dann kann die Zahl der Prototrophen in der Weise bestimmt werden, daß die in diesem Medium
gezüchteten Kolonien auf ein Minimalnährmedium übertragen werden.
Nach der obigen Verfahrensweise werden die prototrophen
Rekombinanten nach der Fusion von Protoplasten, die aus 1 oder mehreren auxotrophen Stämmen gebildet wurden, isoliert.
Die Umwandlung der antibioticumerzeugenden Stämme in auxotrophe Stämme verminderte aber beträchtlich ihre Erzeugungsfähigkeit.
Aus wirtschaftlichen Gründen ist es daher erwünscht, wenn mindestens einer der Fusionspartner
große Mengen des Antibioticums biosynthetisieren kann. Daher wird nach einer besonders bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens nur als einer der Partner ein Auxotroph, als anderer Partner dagegen ein Prototroph,
dessen Protoplasten vor der Fusion entweder durch chemische oder physikalische Behandlung lebensunfähig gemacht worden
sind, verwendet. Nach der Fusion werden von allen Auxotrophen oder abgetöteten Prototrophen, die zugegen sind, aber
weder regenerieren, noch wachsen können, allein die Hybridzellen regeneriert, da sie allein Kolonien bilden.
Am erfindungsgemäßen Verfahren wird vorteilhaft die Protoplastbildung und Protoplastfusion in einem 1 oder mehr
- 10 -
Calciumsalz(e) , vorzugsweise in Mengen von 0,1 bis 0,5 G-ew.-#,
1 oder mehr Magnesiumsalz(e), vorzugsweise in Mengen von
0,3 bis 0,8 Gew.-%, und Rohrzucker, vorzugsweise in Mengen
von 12 bis 14 Gew.-%, enthaltenden Nährmedium durchgeführt.
Zur Protoplasteninaktivierung kann jedes chemische Reagens, das zum Verlust der Regenerationsfähigkeit der Protoplasten
bei gleichzeitigem Bewahren ihrer genetischen Integrität führt, verwendet werden. So können vorteilhaft als
durch chemische Behandlung inaktivierte Stämme solche, welche mit 3-Methyl-6-isopropenyl-4-l-n-pentyl-2l ,6'-dihydroxy-
-1,2,3,6-tetrahydro-diphenyl-3'-Garbonsäure |Kannabidiolsäurej·
oder ihren Salzen, N-Äthylmaleinimid, 3-Chlor-4-[3'-
-(chlor)-2'-(nitro)-phenyl]-pyrrol -[Pyrrolnitrin], N-<4-
-[[4l-(diäthylamino)~phenyl]-phenylmethylenj--2,5-C7clohexadien-1-yliden>-N-<fäthyl>~äthanaminiumsulfat
£ Brillantgrün} oder 2-Mercaptoäthanol inaktiviert worden sind, eingesetzt
werden. Nach beendetem chemischem Inaktivieren können die Protoplasten gewaschen und als Fusionspartner eingesetzt
werden.
Vorteilhaft können als durch physikalische Behandlung inaktivierte Stämme solche, welche mit J'-Bestrahlung inaktiviert
worden sind, eingesetzt werden. So wird vorzugs-
60
weise eine Bestrahlung mit dem Co-Isotop mit einer Dosis von 30 bis 120 krad, insbesondere 80 krad, angewandt. Nach beendeter Bestrahlung können die Protoplasten zentrifugiert und als.Fusionspartner angesetzt werden.
weise eine Bestrahlung mit dem Co-Isotop mit einer Dosis von 30 bis 120 krad, insbesondere 80 krad, angewandt. Nach beendeter Bestrahlung können die Protoplasten zentrifugiert und als.Fusionspartner angesetzt werden.
Das Prüfen der Antibioticumerzeugungsfähigkeit der gewonnenen
prototrophen Isolate wird zweckmäßig in Reihenuntersuchungen durchgeführt. Nach der Fusion wird auch die
Erzeugungsfähigkeit von Doppelauxotrophen und auch von Prototrophen, die aus ihnen durch Segregation erhalten wurden,
bestimmt.
- 11 -
Die Er zeugungsfähigkeit der Stämme wird zweckmäßig wie
folgt geprüft. Mit ihnen werden, vorteilhaft organische Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, anorganische Salze und
Pflanzenöle enthaltende, Nährmedien geimpft und die Kulturen werden bebrütet. Nach 16 bis 24 Stunden werden diese
Impfkultüren benützt, um mit ihnen das Hauptgärmedium der
gleichen Zusammensetzung zu impfen. Die Gärung wird 140 bis
160 Stunden lang fortgesetzt. Proben werden erst in der 96-sten Stunde und dann in jeder 24-sten Stunde entnommen,
um den Antibioticumgehalt und das Komponentenverhältnis der erzeugten Antibiotica zu bestimmen.
Die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gewonnenen Mutanten mit hoher Antibioticumerzeugungsfähigkeit werden wie
bereits erwähnt in belüfteten Tauchkulturen in einem organische Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, anorganische Salze,
Spurenelemente und/oder öle und/oder Fette pflanzlichen und/oder tierischen Ursprunges enthaltenden Nährmedium gezüchtet.
Zweckmäßig wird diese Züchtung bei 32 bis 400C,
vorzugsweise 37°G, so lange durchgeführt, bis sich geeignete Mengen des Antibioticums bildeten.
Nach einer vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird als antibioticumerzeugender Streptomyces-Stamm
Streptomyces tenebrarius verwendet. So können Rekombinanten beispielsweise aus den in der Nationalen
Stammsammlung des ungarischen Landesinstitutes für Gesundheitswesen (Orszägos Közegeszsegügyilntezet) unter den Bezeichnungen
MNG 169 am 28. Dezember 1977 und MG 204 am 2. September 1981 hinterlegten Mikroorganismenstämmen
Streptomyces tenebrarius hergestellt werden. Der Stamm Streptomyces tenebrarius MG 169 kann Nebramycin-2, Nebramycin-4
und Nebramycin-5' und der Stamm Streptomyces tenebrarius
MNG 204 kann Nebramycin-51 neben Spuren von Nebramycin-4
biosynthetisieren. Aus diesen Stämmen können
- 12 -
mittels üblicher mutagener Behandlung mit N-Methyl-N'-
-nitro-N-nitroso-guanidin auxotrophe Mutanten gebildet werden und ihre genetische Stabilität kann durch mehrere Replikationen
und ihre Antibioticumerzeugungsfähigkeit in Reihenuntersuchungen geprüft werden. Die genetisch stabilen
Stämme werden selektiert und aus ihnen können Protoplasten gemäß den in den Beispielen beschriebenen Verfahrensweisen
gebildet werden. Die Protoplasten werden mit dein ausgewählten Pusionspartner kombiniert und nachfolgend
regeneriert- Sowohl die Prοtoρlastenbildung als auch die
Regeneration sind quantitativ, wenn die Züchtung, die ProtoplastenbildTung
und die Regeneration in Gegenwart von Rohrzucker und Salzen, welche zu Calcium- und Magnesiumionen
dissoziieren, durchgeführt werden. Die regenerierten Hybride werden isoliert und zweckmäßig an einem
Schrägagar gezüchtet. Die Häufigkeit der Prototrophenbildung aus auxotrophen Stämmen, die bei spontaner Mutation
nur 10 beträgt, ergibt sich
Verfahren zu 1 χ 10""' bis 5 x
Verfahren zu 1 χ 10""' bis 5 x
—S
nur 10" beträgt, ergibt sich mit dem erfindungsgemäßen
nur 10" beträgt, ergibt sich mit dem erfindungsgemäßen
Die Srzeugungsfähigkeit der isolierten prototrophen
Rekombinanten analysierend wurde festgestellt, daß die einzelnen Antibiotica, die Komponenten des vom Elternstamm erzeugten
Antibioticumkomplexes waren, auch von jedem Rekombinanten biosynthetisiert werden, aber in einem veränderten
Komponentenverhältnis und veränderter Erζeugungskonzentration.
Die Elternstämme erzeugen 2 (Stamm Streptomyces tenebrarius MtIG 204) beziehungsweise 3 (Stamm Streptomyces
tenebrarius MNG 169) Nebramycinkomponenten,· bei der Autofusion der Pro toplas ten Streptomyces tenebrarius MNG 204·
beziehungsweise MNG 169 und bei der Fusion der Protoplasten Streptomyces tenebrarius MNG 204 und MNG 169 entstehen dagegen
genetische Rekombinanten, welche im Vergleich zu den Elternstämmem entweder
- 13 -
a) überhaupt kein Antibioticum oder sehr niedrige oder sehr hohe Antibioticumkonzentrationen biosynthetisieren
oder
b) eine einzige Nebramycinkomponente, nämlich Nebramycin-2,
Nebramycin-4 oder Nebramycin-5'» biosynthetisieren oder
c) 2 Nebramycinkomponenten, nämlich Nebramycin-2 und
Nebramycin-4- oder Nebramycin-2 und Nebramycin-51 ,
biosynthetisieren oder
d) 3 Nebramycinkomponenten, nämlich Nebramycin-2, Nebramycin-4
und Nebramycin-5' , biosynthetisieren.
Von den gewonnenen Stämmen wurden in der Nationalen Stammsammlung des ungarischen Landesinstitutes für Gesundheitswesen
(Orszägos Közegeszsegügyi Intezet) der Nebramycin-2
erzeugende Stamm Streptomyces tenebrarius 35 TL
unter der Bezeichnung MNG 00243 am 25· November 1982, der Nebramycin-4 erzeugende Stamm Streptomyces tenebrarius
F104 unter der Bezeichnung MKG 00244 ebenfalls am 25. November
1982 und der Nebramycin-5' erzeugende Stamm Streptomyces
tenebrarius F77 unter der Bezeichnung MNG 00242 gleichfalls am 25. November 1982 hinterlegt.
Diese Stämme können Nebramycinkomponenten enthaltende Gärbrühen erzeugen. Die Gärung selbst wird vorzugsweise
nach dem Verfahren der ungarischen Patentschrift 176 103
durchgeführt, während die Antibiotica vorzugsweise nach
den Verfahren der ungarischen Patentschriften 174 315 und 176 103 isoliert werden.
Nach einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform des
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erfindungsgemäßen Verfahrens wird als antibioticumerzeugender
Streptomyces-Stamm Streptomyces kanamyceticus für die Bildung von Sekombinanten verwendet. Die Züchtung der
Mikroorganismen, die Protoplastenbildung, die Protoplastenfusion und die Regeneration und ferner die Reihenuntersuchung
der Produktivität der selektierten Stamme kann entweder gemäß der obigen Verfahrensweise oder gemäß den in
Beispielen 3 und 8 beschriebenen Verfahrensweisen durchgeführt werden.
Die so erhaltenen Stämme können Kanamycin [Nebramycin 5]
enthaltende Gärbrühen erzeugen.
Von den vielen Vorteilen des erfindungsgemäßen Verfahrens
sei darauf hingewiesen, daß die im Verfahren erfolgenden Rekombinationen und Diploidisationen die Biosynthese der
Stämme entweder durch Veränderung des Komponentenverhältnisses oder durch Erhöhung der Antibioticumerzeugungsfähigkeit
beeinflussen.
Die Erfindung wird an Hand der folgenden Beispiele näher erläutert.
Protoplastbildunqj Protoplastfusion und Regeneration
Schrägagare werden mit einer Sporensuspension
oder tiefgefrorenen Kultur von Streptomyces tenebrarius
MNG 169 und Streptomyces tenebrarius MNG 204 oder aus ihnen gebildeten auxotrophen Stammen beimpft.
Der Schrägagar hat folgende Zusammensetzung: Dextrin " 1,0 Gew.-%
Hefeextrakt 0,1 Gew.-%
Caseinhydrolysat /10 gew.-%-ig) *) 2,0 Gew.-%
Fleischextrakt 0,1 Gew.-%
Kobaltdiehloridhexahydrat 0,001 Gew.-%
Agar 2,5 Gew.-%
*) enzymatisch hydrolysiert β
Vor dem Sterilisieren wird der pH-'Wert des
Nährbodens mit einer wässrigen Natriumhydroxyd^
lösung auf 7,2 eingestellt, nachfolgend wird bei <L21°C 20 Minuten lang sterilisiert.
Die Schrägkulturen werden 4 Tage lang bei 37°C "bebrütet, dann werden die Sporen von der Oberflcche
- 16 -
des Agars mit sterilem destilliertem Wasser abgewaschen.
Mit der erhaltenen Sporensuspension wird ein steriles Impfnährmedium bezielmngsweise Inokulumnährmedium
folgender Zusammensetzung beimpft:
Glukose -1^0 Gew.-%
Hefeextrakt -1,0 Gew.-%
Der pH-Wert des Mediums wird auf 7,2 eingestellt.
Die Kulturen werden 48 Stunden lang bei 370C
bebrütet, dann wird mit 0,2 ml Portionen dieses Impfmateriales
ein steriles Nährmedium folgender Zusammensetzung geimpft;
Glukose 4,0 Gew.-%
Hefeextrakt I3O Gew.-%
Rohrzucker 20,5 Gew.-%
Calciumdichloriddihydrat 0,3 Gew.-fo
Magnesiumdichloridhexahydrat 0,6 Gew.-% Glykokoll 4, 5 oder 6 Gew.-%
Der pH-Wert der Medien wird auf 7,0-7,2 eingestellt.
Die Kulturen werden in"einer Schüttelmaschine
48 Stunden lang bei 37°c bebrütet, dann werden diejenigen Kulturen, in welchen die" wachstumshemmende Wirkung
des Glykokolles die stärkste, aber noch nicht vollständig
ist, selektiert. h:it diesen Kulturen werden obige Nahrmedien mit erhöhtem Glykokollgehalt beimpft. Falls
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ursprünglich die selektierte Kultur 4 Gew.-% Glykokoll
enthielt, so werden mit diesen Nährmedien geimpft, welche 5 bzw. 6 Gew.-% Glykokoll enthalten.
Dann wird da3 gebildete My'zel zentrifugiert (15 Minuten, 2300 g) und mit einer Lösung der"folgenden
Zusammensetzung gewaschen:
| Rohrzucker | 20 | ,5 | Gew.-% |
| Calciumdichloriddihydrat | 0 | ,3 | Gew.-% |
| Magnesiumdichloridhexahydrat | 0 | /6 | Gew.-% |
| Kaliumchlorid | 0 | -0075 | Gew.-% |
pH der Lösung: 7,2, Bezeichnung: M Nachfolgend wird wiederholt zentrifugiert.
Die Myzelmasse wird in der obigen Lösung erneut suspendiert und mit 0,5 gew.-%-igem Iysozym
(Serva, Feinbiochemica, Heidelberg) versetzt. Das Myzel
wird unter schwachem Schütteln bebrütet und die Protoplastenbildung wird alle 10 Minuten mikroskopisch
kontrolliert. Von der Stamir.art abhängend dauert die
quantitative Protoplastenbildung in myzelialen Streptomyces-Kulturen etwa 1-4 Stunden.
Die Kultur, die quantitativ zu Protoplasten umgewandelt war, wird zentrifugiert ('25 Minuten,
2300 g), mit Lösung M gewaschen und wiederholt zentrifugiert.
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, Der Bodensatz wird vorsichtig in 0,05 ml
Lösung M suspendiert, dann werden die Protoplasten regeneriert.
Zur Beseitigung der eventuell zurückgebliebenen Myzelstücke wird die Protoplastensuspension
durch eine 2,5 cm Schicht Y/atte gefiltert. Das Filtrat wird mit Lösung M verdünnt und auf
sterilen Regenerieragar der folgenden Zusammensetzung
geschichtet:
Glukose 1.0 Gew.-%
Hefeextrakt I1O Gew.-%
Rohrzucker 2.0^5 Gew.-%
Calciumdicliloriddihydrat 0-3 Gew.-%
Hagnesiumdichloridhexahydrat 0^6 Gew.-%
Agar 3.0 Gew.-% pH der Lösung: 7,0 - 7,2.
0,1 ml der Protoplastensuspension wird auf die Oberfläche von 25 ml Regenerieragar in einer Petri-—
Schale geschichtet, dann wird sie m;Lt 3 ml des Regenerieragars
bedeckt. Der Agar, welcher zur Bedeckung benutzt wird hat obige Zusammensetzung, doch wird
<L,2 Gew.-% Agar anstatt 3 Gew.-% benützt.
Die Kulturen werden in einer feuchten Kammer bei 35-370C bebrütet. Am dritten-visrten Tag können
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schon die regenerierten Kolonien frei beobachtet werden. In Anbetracht der Protoplastenzahl, die auf
die Regenerierplatte aufgetragen wurde, kann die Regeneration als quantitativ betrachtet werden.
Die aus den beiden auxotrophen Stämmen gewonnenen Protoplasten werden fusioniert. Falls von
den Hybriden nur die prototrophen Rekombinanten isoliert werden sollen, so werden sie auf einen Minimalnährboden
folgender Zusammensetzung aufgetragen:
Diammoniunisulfat 0,5 Gew.-%
Kaliumdihydrogenphosphat Ο,Ί Gew.-%
Magnesiumsulfatheptahydrat 0,G5 Gew.-%
Glukose 1,0 Gew.-%
Calciumchloriddihydrat 0.3 Gew.-%
Magnesiumchloridhexahydrat 0,6 Gew.-%
Rohrzucker 20,5 Gew.-%
Wickerham-Vitaminlösung 0,01 Gew.-%
Agar 3.0 Gew.-% pH des Mediums: 7.2 .
"Zusammensetzung der Jickerham—Vitaminlösung
| Polsäure | 0,2 | mg |
| Vitamin H [Biotin] | 0,2 | mg |
| Calciumpantothenat | 40,0 | mg |
| Inosit | .200,0 | mg |
Nicotinsäure [Niacin] 40,0 mg
- 20 -
p-Aminobenzoesäure 20,0 mg Pyridoxinhydrochlorid 40,0 mg
Vitamin-B.-hydrochlorid
[Aneurinhydrochlorid]
Riboflavin 20,0 mg
Destilliertes Wasser 100,0 ml
Prototrophe können auch isoliert werden, indem
die Kolonien, die auf komplettem Regeneriernährboden ausgewachsen waren, auf Minimalnährboden der obigen
oder anderer Zusammensetzung repliziert werden»
Die Protoplasten werden in der Weise fusioniert,
daß die Protoplasten, die aus zwei oder mehreren Stämmen gebildet wurden, in beliebigem Verhältnis, zweckmä
ßig 1:1, vermischt werden und 0,2 ml dieses Protopla stengemisches mit 2 ml Fusionslösung der folgenden Zusammensetzung
versetzt wird:
Polyäthylenglykol mit einem Molekulargewicht
von 1 000 bis 20 000 55»° Gew·"^
Calciumdichloriddihydrat 0,3 Gew.-%
Magnesiumdichloridhexahydrat 0,6 Gew.-%
pH der Lösung wird mit wäßriger Natriumhydroxydlösung auf 7»2 eingestellt.
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Das Vermischen mit der Fusionslösung induziert
die Aggregation der Protoplasten, ihre Membrane verschmelzen,
die Fusion kommt zustande. Die DNS von zwei oder mehreren Zellen,-die Träger der genetischen
Information sind, kommen näher zueinander und so kann die genetische Rekombination vor sich gehen.
In Tabelle 1 wird das erfindungsgemässe Verfahren
mit den Verfahren der belgischen Patentschriften
868 472 und 868 473 in Bezug der Protoplastbildung und Regenerationshäufigkeit verglichen.
Bildung und Regeneration von Protoplasten von Streptomyces
tenebrarius mit bekannten Verfahren und mit
dem erfindungsgemäßen Verfahren
| Ver fahren |
Protoplast bildung [90 Minuten] |
. Reger tic Kolo nie zahl |
tera- >n % |
Kolonien intakten Kolo nie zahl |
aus Zellen % |
| Bekanntes | 92,5 | 13 | 0,065 | 1. 500 | 7,5 |
| Erfindungs- gemäßea |
99,81 | 18 000 | 90,0 | 38 | 0,19 |
Aus der Tabelle 1 geht deutlich hervor, daß
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mit dem erfindungsgemässen Verfahren mittels Vorzüchtung
in der Gegenwart von Calciumchlorid, Magnesiumchlorid
und Rohrzucker die Wirksamkeit der Protoplastbildung, noch mehr aber die der Regenera- "
tion wesentlich erhöht werden können.
In den nachfolgenden Beispielen werden einige
genetische Rekombinationsversuche in vivo und ihre Ergebnisse erörtert.
Fusion von auxotrophen Stämmen und die Antibioticumbiosynthese
von Rekombinantenstämmen
a. Fusion der auxotrophe Stämme A222 his" und 404 ura~
Durch bekannte übliche mutagene Behandlung (beispielsweise
nach Davis, J. Am. Chem. Soc, 70 [1948],
4 267) werden aus dem neben Spuren von Nebramycin-4 Nebramycin-51 biosynthetisierenden Stamm Streptomyces
tenebrarius MNG 204 der histidinabhängige Stamm A222 his"" und aus dem Nebramycin-2, Nebramycin-4 und Nebramycin-!?1
produzierenden Stamm Streptomyces tenebrarius MNG 169 der uracilabhängige Stamm 404 ura~ hergestellt.
Aus den beiden Stämmen werden nach der Verfahrensweise des Beispieles 1 Protoplasten gebildet und diese
- 23 -
fusioniert und regeneriert. Ein Teil dar prototrophen Rekombinanten wird isoliert.
Rekombinationshäufigkeit: 5xlO""5 #
Dia Antibioticum-Produktionsfähigkeit dar isolierten
prototrophen Stamme wird gemäs3 der Verfahrensweise von Beispiel 8 bestimmt. In Tabelle 2 sind
die Ergebnisse dar Gärung von 147 isolierten
Rekombinanten zusammengestellt.
Antibioticum-Produktion von Prototrophen, die durch
die DNS-Rekombination in vivo von Auxotrophen A222 his"
und 404 ura"" gewonnen wurden
| Produktionsfähigkeit | Zahl der Stamme |
«V
/0 |
| Keine Antibioticuaproduktion | Ί6 | 10,9 |
| ^abramycin-5* | 24 | 16,3 |
| Nabramycin-4 | 11 | 7,5 |
| ^ebramyqin-4 und -5* | 57 | 38,8 |
| ^ebramycin-2 und -5' | 7 | 4,7 |
| Nebramycin-2, -4 und -5f | 32 | 21,8 |
Produktionsfähigkeit der Fusionspartner:
A222 his"": Nebramycln-2: O ,ug/ml
Nebramycin-4: 30 ug/ml Nebramycin-5': 675 ug/ml
404 ura": Nebramycin-2: 1120 ,ug/ml
Nebramycin-4: 75 jjg/ml Nebramycin-5': 145 ug/ml
Gleichzeitig übertrifft die Produktionsfähigkeit
von einem Teil der Rekombinanten die der Fusionspartner
ganz wesentlich. So biosynthetisiert zum Beispiel Streptomyces tenebrarius F 105
2140 ug/ml Nebramycin-2, 3SO yg/ml Nebramycin-4 und
1510 ug/ml Nebramycin-5', Streptomyces tenebrarius F 88 0 ug/ml Nebramycin-2, 140 ug/ml Nebramycin-4
und 1 440 ug/ml Nebramycin-51* Streptomyces tenebrarius
MtTG 00242 [Streptomyces tenebrarius F 77] 840 ug/ml Nebramycin-5' und Streptomyces tenebrarius
MNG 00244 [Streptomyces tenebrarius i1 104] neben Spuren
von Nebramycin-51 (weniger als 1 Gew.-%) 1 520 ug/ml Nebramycin-4.
Die Produktionsfähigkeit der Stämme, die nach
der Autofusion von aus Elternstämmen hergestellten
Protoplasten isoliert wurden, blieb unverändert.
- 25 -
Mit dem Stamm Streptomyces tenebrarius MNG 0024-4·
werden gemäß der Verfahrensweise des Beispieles 8 10
Gärbrühe hergestellt und die biologisch aktiven Verbindungen werden gemäß der ungarischen Patentschrift
174- 315 isoliert. Ausbeute: 13,8 g Nebramycin-5 (Kanamycin-B)
und 9 mg Nebramycin-6 (Tobramycin).
b. Fusion der auxotrophen Stämme 7-34- trp~ und 73 lys~
Aus dem tryptophanabhängigen Stamm Streptomyces tenebrarius 7-34- trp"~ und aus dem lysinabhängigen
Streptomyces tenebrarius 73 lys", die mit üblicher mutagener
Behandlung (beispielsweise nach Davis, J. Am. Chem. Soc, 70 [194-8], 4- 267) aus Streptomyces tenebrarius
MNG 169 gewonnen wurden, werden gemäß der Verfahrensweise des Beispieles 1 Protoplasten gebildet und
diese fusioniert und nachfolgend regeneriert. Ein Teil der Prototrophen wird isoliert und ihre Produktionsfähigkeit wird gemäß der Verfahrensweise des Beispieles
8 geprüft. Rekombinationshäufigkeit·. 1 χ 10 -. In der Tabelle 3 sind die Ergebnisse der Gärung von 34- isolierten
Rekombinanten zusammengestellt.
- 26 -
Antibioticum-Produktion von Prototrophen, die durch. DNS-
-Rekombination in vivo von Auxotrophen 7-34· trp~ und
73 lys~ gewonnen wurden
| Produktionsfähigkeit | Zahl der Stämme |
C/ |
| Keine Antibioticumproduktion | 2,9 | |
| Nebramycin-2 | 2 | 5,9 |
| Nebramycin-2 und -5' | 16 | 4-7,1 |
| Nebramycin-2, -4 und -5' | 15 | 44-,1 |
Die Fusionspartner selbst biosynthetisieren alle drei Nebramycin—Komponenten .
Nach der Fusion und Regeneration wurde beobachtet, dass es einige Stämme gibt, die im Minimalnährmedium
in der Gegenwart von Lysin oder Tryptophan nicht wachsen konnten, in der gleichzeitigen Gegenwart,
von Tryptophan und Lysin aber schnell wuchsen. Die ursprünglich auxotrophen Stämme wurden durch die
Rekombination zu Doppelauxotrophen (trp"lys"). Die Produktionsfähigkeit von 13 Doppelauxotrophen wurde
gemäß der Verfahrensweise des Beispieles.8 geprüft und die Ergebnisse sind in Tabelle 4- zusammengestellt. Naciider
_ 27 -
Segregation wurden aus den Doppelauxotrophen zwei Prototrophen (Streptomyces tenebrariua 35 W und 40 V/) isoliert,
ihre Produktionsfähigkeit wird ebenfalls angegeben.
Antibioticum-Produktion von Doppelauxotrophen trp~lys
und von Segreganten, die aus ihnen isoliert wurden
| Stamm | Biosynthetisierte Nebramycin- —Komponente |
% |
| Streptomycea | Nebramycin-2 | 23,1 |
| tenebrarius | Nebramycin-2 und -4 | 7,7 |
| trp~lys" | Nebramycin-2 und -5' | 30.7 |
| Nebramycin-2, -4 und -5* |
38,5 | |
| Streptomyces | Nebramycin-4 und | 100,0 |
| tenebrarius | -5f | |
| 35 W und 40 W |
Die Tabelle 4- zeigt eindeutig, daß die Produktionsfähigkeit
der Stämme, die nach genetischer Rekombination in vivo isoliert wurden, wesentlich geändert
ist. Es ist besonders bemerkenswert, daß die aus Doppelauxotrophen isolierten Prototrophen ihre
- 28 -
Fähigkeit, Nebramycin-^ (Apramycin) zu biosynthetisieren,
verloren hatten, gleichzeitig aber ihre sonstige Antibioticum-Produktionsfähigkeit
im Vergleich zu den Elternstämmen wesentlich höher wurde. So produzieren die Stämme
Streptomyces tenebrarius 7-34· trp~ und 73 lys~
1 300 bis 1 700 ug/ml Nebramycin-2, 200 ug/ml Nebramycin-4
und 1 04-0 ug/ml Nebramycin-51 » während die Rekombinanten
Streptomyces tenebrarius 35 W und 40 W 1 040 ug/ml Nebramycin-4
und 1 950 ^ig/ml Nebramycin-51 biosynthetisieren.
c. Fusion der auxotrophen Stämme J1OO6-3ade~ und
J211/2ura"
Streptomyces tenebrarius J-1006-3ade~ und J211/2ura~
wurden mit mutagener Behandlung (beispielsweise nach Davis, J. Am. Chem. Soc, 70 [1948], 4 267) aus Streptomyces
tenebrarius MG 204 gewonnen. Diese Stämme biosynthetisierten
entweder überhaupt kein Antibioticum oder nur Spuren von Nebramycin-51 (weniger als 5 lig/ml). Nach,
ihrer Fusion gemäß der Verfahrensweise des Beispieles 1 wurde die Produktionsfähigkeit der 150 prototrophen Rekombinanten
gemäß der im Beispiel 8 beschriebenen Verfahrensweise geprüft.
-4
Rekombinationshäufigkeit: 1 χ 10
- 29 -
60 % (90) der untersuchten Stämme biosynthetisierten
auch weiterhin überhapt kein Antibioticum, 40 % (θθ) produziertendagegen entweder Nebramycin-4
und Nebramycin-5' oder ausschliesslich nur Nebramycin-5* · Ί3 % der produktionsfähigen Stämme
(8) biosynthetisierten Nebramycin-5' in Mengen über 1500 jjg/ml.
Diese Ergebnisse zeigen eindeutig« dass die Antibioticura-Produktionsfähigkeit der Streptomyces-
-Stämme mit den erfindungsgemsssen Verfahren beträchtlich
erhöht werden kann.
Fusion der auxotrophen Stämme Strepjtonyces kanamyceticus
leu"" und arg"*
Die im Beispiel 1 beschriebene Verfahrensweise der Vor Züchtung, der Protoplastbildung, der Protoplastfusion
und der Regeneration der fusionierten Protoplasten wird mit dem Unterschied, daß die Züchtung der genetisch markierten
Stämme bei 280G solange fortgesetzt wird, bis in 3 Gew.-% Glykokoll enthaltendem Nährboden schwaches Wachsen
beobachtet werden kann, angewandt. Die auxotrophen
- 30 -
Stämme werden nach der mutagenen Behandlung des in der
AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION hinterlegten und vor dem 16. Mai 1983 freigegebenen Stammes Streptomyces kanamyceticus
ATCC 12 853 {ist im Katalog der AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION enthalten} (bezüglich der Herstellung von
Kanamycin durch diesen Stamm vergleiche Umezawa und Mitarb. J. Antibiotics, 1OA, 181 bis 188 [1957] und Jpn.
Kokai 8 695 [1961]) isoliert. Der Elternstamm produziert Kanamycin. Die leucinabhängige Mutante biosynthetisiert
überhaupt kein Antibioticum, die im Minimalnährmedium in Gegenwart von Arginin wachsende Mutante produziert dagegen
15 ug/ml Kanamycin.
Die Antibioticum-Produktionsfähigkeit von Streptomyces kanamyceticus wird gemäß der im Beispiel 8 beschriebenen
Verfahrensweise ebenfalls unter Verwendung von in der
AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION hinterlegtem und vor dem 16. Mai 1983 freigegebenem Stamm Bacillus subtilis ATCC
6633 als Testorganismus für die biologische Aktivitätsprüfung geprüft, jedoch mit dem Unterschied, daß die
Züchtung statt bei 370C bei 280G durchgeführt wird.
Nach der Fusion und Regeneration dar fusionierten
Protoplasten werden die Prototrophen isoliert und die Produktionsfähigkeit von 144 Stämmen
- 31 -
geprüft. 12 Stämme können zehnmal mehr (im Durchschnitt 155 jjg/ml Kanamycin) biosynthetisieren als
die argininabhängige auxotrophe Mutante.
-A-Rekombinationshsufigkeit:
3 his 8 χ 10
Herstellung von intakten, aber lebensunfähigen Protoplasten und ihre Anwendung als Fusionspartner
Aus Streptomyces tenebrarius MNG 169 und aus seinem Auxotrophen 4-04- ura"~ werden gemäß der Verfahrensweise des
Beispieles 1 Protoplasten gebildet. Zwecks Inaktivierung des prototrophen Streptomyces tenebrarius MG 169 wird
der aus ihm gebildeten Protoplastsuspension (10 Protoplasten/ml
Lösung M) 50 "bis 100 ng/ml Tr i ät hy 1 amins al ζ
von 3-^ethyl-6-isopropenyl-A-'-n-pentyl-2' ,6'-dihydroxy-
-1 ^^»e-tetrahydro-diphenyl-^1 -carbonsäure {Kannabidiolsäure^
in einer Lösung von Dimethylsulfoxyd, bei 300C zugesetzt.
Nach vierstündiger Behandlung werden die Protoplasten zentrifugiert (2 300 g, 25 Minuten), dann werden
sie zwecks Beseitigung des überschüssigen Inaktivierungsmittels
mit Lösung M gewaschen und wiederholt zentrifugiert. Die Fusion der chemisch inaktivierten, aus dem
Prototrophen Streptomyces tenebrarius MNG 169 gebildeten
- 32 -
Protoplasten und der aus dem Auxotrophen 404 ura" gebildeten
Protoplasten wird gemäß der Verfahrensweise des Beisüieles 1 durchgeführt. Die Fusionsergebnisse sind in
Tabelle 5 zusammengestellt.
| Stamm | Regenerierplatte (Koloniezahl/ml) |
0 | Minimal nähr me ~ dium (Kolo nie zahl/ml) |
Rekom- bina- tions- häufig- keit |
| Streptomyces tene- brarius MNG 169 Streptomyces tene- brarius 404 ura" Streptomyces tene- brarius MNG 169 x Streptomyces tene- brarius 404 ura"* |
Vor und nach Behandlung mit dem Triathylaminsalz von Kannabidiolsäure |
2,1 χ 104 0 30 |
2 χ 105 | |
| h 2 χ 10 1,5x10^ |
- 33 -
Herstellung von intakten, aber lebensunfähigen Protoplasten
und ihre Anwendung als Fusionspartner
Die im Beispiel 4 beschriebene Verfahrensweise wird durchgeführt, jedoch mit dem Unterschied, daß anstatt des
Triäthylaminsalzes von Kannabidiolsäure 80 bis 240 ug/ml
3-Chlor-4-[3'-(chlor)-2'-(nitro)-phenyl]-pyrrol £pyrrolnitrin}
oder 100 bis 300 ug/ml N-<4-{[4'-(diäthylamino)-
-phenyl]-phenylmethylen)-2,5-cyclohexadien-1-yliden>-N-
-^äthyl^-äthanaminiumsulfat ^BrillantgrünV als chemisches
Inaktivierungsmittel verwendet wird. In den Versuchen verlief die Inaktivierung der Protoplasten quantitativ. Die
erhaltenen lebensunfähigen Protoplasten werden als Fusionspartner in einer gemäß dem Beispiel 4- (oder einem der ihm
vorangehenden Beispiele) durchgeführten Fusion, beispielsweise mit aus dem Auxotrophen 404 ura" gebildeten Protoplasten
als anderem Fusionspartner, angewandt.
BeisOiel 6
Herstellung von intakten, aber lebensunfähigen Protoplasten
und ihre Anwendung als Fusionspartner
Protoplasten werden gemäß der Verfahrensweise des Beispieles
3 hergestellt, jedoch mit dem Unterschied, daß unmarkierter Streptomyces kanamyceticus ATGG 12 853 als Elternstamia
verwendet wird. Die gewonnenen Pro toplasten von Streptomyces kanamyceticus werden gemäß der im Beispiel 4
beschriebenen Verfahrensweise inaktiviert, jedoch mit dem Unterschied, daß anstatt Kannabidiolsäure 400 und
800 ^ug/ml N-Äthylmaleinimid [EM] als chemisches Inaktivierungsmittel
verwendet wird. Die Fusion der erhaltenen inaktivierten Protoplasten wird nach der Verfahrensweise des
Beispieles 4 (oder eines der ihm vorangehenden Beispiele) mit aus einem beliebigen markierten Stamm Streptomyces
kanamyceticus, wie Streptomyces kanamyceticus ATGC 12 853»
erhaltenen Protoplasten als anderem Fusionspartner durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 zusammengestellt:
- 35 -Tabelle 6
Stamm
u"nbehan~ delt
Regenerierplatte (Koloniezahl/ml) Mit 400 ug/ml
N-Ä thylmaleinimid
behandelt
Mit 800
N-Äthylmale inimid behandelt
fs/-
Streptomyces kanamyceticus ATCG 12 853
3,2 χ 10
χ 10
Die mit 800 iig/ml N-Äthylmaleinimid behandelten und dadurch
inaktivierten Protoplasten werden als Fusionspartner verwendet.
Herstellung von lebensunfähigen Protoplasten durch physikalische
Inaktivierung
Sine gemäß Beispiel 1 hergestellte Protoplastsuspen-
sion (10 Zellen/ml) von Streptomyces kanamyceticus
ATGG 12 853 wird in einem Plastikrohr der ^-Bestrahlung
/60
Co) unterworfen. Die mit einer Dosis von 80 krad inaktivierten
Zellen werden als Fusionspartner in einer nach der Verfahrensweise des Beispieles 4-(oder eines der ihm
vorangehenden Beispiele) durchgeführten Fusion mit aus
- 36 -
einem beliebigen markierten Stamm Streptomyces kanamyceticus, wie Streptomyces kanamyceticus ATCC 12 853» erhaltenen
Protoplasten als anderem Fusionspartner verwendet.
Prüfung der Antibioticum-Produktionsfähigkeit von Stämmen,
die Nebramycin-Komponenten biosynthetisieren, und Herstellung
von Antibioticum-Gärbruhen
Mit den Sporen oder der vegetativen Kultur des zu prüfenden Stammee werden Schrägagare, dia mit destilliertem
V/aaser bereitet v/urden# geimpft. Zusammensetzung
des Schragagars:
Dextrin 1,0 Gew.-%
Hefeaxtrakt 0,1 Gew.-%
Caseinhydrolysat (10 gew.-%-ig) *) 2,0 Gew.-%
Fleischextrakt 0,1 Gew.-%
Kobaltdichloridhexahydrat 0,001 Gew.-%
Agar 2,5 Gew.-%
*) enzymatisch hydrolysiert.
- 37 -
Der pH-Wert des Nährmediums wird vor dem Sterilisieren
mit einer wässrigen Natriumhydroxydlösung auf 7,2 eingestellt, dann wird 20 Minuten lang bei 1210C
sterilisiert .
Die Kulturen werden 4 Tage lang bei 37°C bebrütet, dann werden die Sporen von der Oberfläche
des Nährbodens mit sterilem destilliertem Wasser abgetrennt und mit dieser Sporensuspension werden zwei
mit Leitungswasser bereitete 100 ml Impfmaterialnährmedien, die in 500 ml Erlenmeyerkolben sterilisiert
wurden, geimpft. Zusammensetzung der ImpflnaterialnäinEedien:
Sojamehl 2,0 Gew.-%
Caseinhydrolysat (10 gew.-%-ig) *) 3,0 Gew.-%
Ammoniumnitrat 0,1 Gew.-%
Ammoniumchlorid 0,3 Gew.-%
Calciumcarbonat 0,3 Gew.-%
Magnesiumsulfatheptahydrat 0,5 Gew.-%
Gemisch von Palmöl und Leinöl
Tr-I , ,.,, , Λ Λ 3*0 Gew.-%
im Volumverhaltnis von 1:1 '
Glucose (abgesondert, als
50 gew.-%-ige Lösung sterilisiert) 2»° Gew*~%
*) enzymatisch hydrolysiert.
- 38 -
Der pH-Wert des Nährnediums wird mit einer
wässrigen Natriumhydroxydlösung auf 7,2 eingestellt,
dann wird bei l2l°C 20 Minuten lang im Autoklaven
sterilisiert.
Die beimpften Kulturen werden auf einem horizontalen
Schütteltisch (Durchmesser 2,4 cm, 280 min" ) bei 370C bebrütet.
Mit diesem reifen Impfmaterial werden entweder 100 ml des im 500 ml Erlenmeyerkolben sterilisierten Nährmediums
oder 5 1 desselben Nährmediums, welches jedoch 45 Minuten lang bei 1210O sterilisiert worden ist, in
einer 10 1 Laboratoriumsgärvorrichtung geimpft. Die Zusammensetzung dieses mit Leitungswasser bereiteten Hauptgärmediums
ist :
Sojamehl 3,0 Gew.-%
Gaseinhydrolysat (10 gew.-%-ig)*) 5,0 Gew.-%
Ammo niumn it r a t Ammoniumchlorid L-Glutaminsäure
Oalciumcarbonat Mag ne s iumsulfathept ahydrat
Kobaltdinitrathexahydrat
Gemisch von Palmöl und Leinöl
im Volumverhältnis von 1:1 ^»0 &öw.-%
Glucose (abgesondert, als
50 gew.-%-ige Lösung sterilisiert)
*) enzymatisch hydrolisiert.
| 0,1 | Gew. | -% |
| 0,5 | Gew. | -% |
| 0,8 | Gew. | -% |
| 0,5 | Gew. | -% |
| 0,5 | Gew. | -% |
| 0,001 | Gew. | -% |
Der pH-Wert des Nährmediums wird vor dem Sterilisieren
mit wässriger Ammoniumhydroxydlösung auf 7,2 eingestellt.
Die Gärung wird bei 370C durchgeführt.
Die Zellen in den Erlenmeyerkolben werden an der horizontalen Schüttelmaschine gezüchtet. Die Drehzahl
des GärvorEichi^n^rührers wird auf 360 min"" eingestellt
und 3 l/Minute sterile Luft wird durch das Nährmedium geführt.
- 40 -
Der Antibioticumgehalt der Kulturen wird nach bekannten
Verfahrensweisen biologisch oder durch Dünnschichtchromatographie mit Bioautographie bestimmt.
Als Prüforganismus der biologischen Bestimmung wird Staphylococcus epidermidis, für die spezifische Bestimmung
von Nebramycin-51 neben anderen Nebramycin-Komponenten
wird nebramycin-2- und nebramycin-4—resistentes
Rhizobium meliloti verwendet.
Bei der Bestimmung der Komponentenzusammensetzung
durch Dünnschichtchromatographie werden Antibioticnmroengen
von 0,1 bis 0,5 pg/ml auf Silicagel-Dünnschichtplatten
(Merck, Darmstadt) getropft und die Platten werden mit einem Gemisch von Äthylalkohol, Methyläthylketon und
25 gew.-%-igem Ammoniumhydroxyd im Volumverhältnis von
1:1:1 entwickelt. Nach vollständigem Trocknen des Gels wird auf die Plattenoberfläche in der AMERICAN TYPE
CULTURE COLLECTION hinterlegten und vor dem 16. Mai 1985
freigegebenen Stamm Bacillus subtilis ATCC 6633 {ist im Katalog der AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION enthalten}
enthaltendes Nährmedium geschichtet, dann wird die Platte 16 Stunden lang bei 37°C bebrütet. Nachfolgend wird
die Große der Hemmungszonen im Vergleich zum Standard bestimmt. Diese Verfahrensweise ist sowohl für qualitative
als auch für quantitative Bestimmungen geeignet.
Zusammenfassung
Claims (6)
1.) Verfahren zur Herstellung von Aminoglykosid-Antibiotica
enthaltenden Gärbrühen mittels genetischer Rekombination in vivo zu antibioticumerzeugenden
Stämmen mit modifiziertem genetischem Bestand durch Vorzüchten in einem Nährmedium, Bilden von Protoplasten
aus den Zellen von Streptomyces-Stämmen, Fusionieren der gebildeten Protoplasten und Regenerieren
der kombinierten Protoplasten, dadurch gekennzeichnet, daß man zum Vorzüchten ein Rohrzucker
sowie Calcium- und Magnesiumionen enthaltendes Nährmedium verwendet, als Protoplasten entweder aus 2
oder mehr genetisch markierten Stämmen oder aus 1 oder mehr genetisch markierten Stamm beziehungsweise
Stämmen und 1 oder mehreren durch chemische oder physikalische Behandlung inaktivierten prototrophen
oder unmarkierten Stamm beziehungsweise
Stämmen gebildete fusioniert sowie nach dem Fusionieren und Regenerieren der fusionierten Protoplasten
die Stämme mit modifiziertem genetischem Bestand (Prototrophen,
Doppelauxotrophen beziehungsweise Segreganten)
isoliert, in an sich bekannter Weise ihre Antibioticumerzeugungsfähigkeit
prüft und die Stämme mit geänderter Antibioticumerzeugungsfähigkeit selektiert
sowie mit diesen neuen Stämmen belüftete Gärungen in Tauchkulturen in einem organische Kohlenstoff- und
Stickstoffquellen, anorganische Salze, Spurenelemente
und/oder tierische oder pflanzliche Öle und/oder Fette enthaltenden Nährmedium durchführt.
2.) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß man die Protoplastbildung und Protoplastfusion in einem 1 oder mehr Galciumsalz(e), vorzugsweise
in Mengen von 0,1 bis 0,5 Gew.-%, 1 oder mehr Magnesiumsalz(e),
vorzugsweise in Mengen von 0,3 bis 0,3 Gew.-%, und .Rohrzucker, vorzugsweise in Mengen
von 12 bis 14 Gew.-%, enthaltenden Nährmedium durchführt.
3.) Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als durch chemische Behandlung
inaktivierte Stämme solche, welche mit 3-Methyl-6-
-isopropenyl^'-n-pentyl^1 ,6' -dihydroxy-1,2,3,6-
-tetrahydro-diphenyl-3'-carbonsäure JKannabidiolsäure]
oder ihren Salzen, N-Äthylmaleinimid, 3-Chlor-4-
-[3'-(chlor)-2'-(nitro)-phenyl]-pyrrol {Pyrrolnitrin},
Ν-<4-[[4'-(diäthylamino)-phenyl]-phenylmethylen}
-2,5-cyclohexadien-1-yliden) -N-(ä thy 1} -äthanaminiumsulfat
{ßrillantgrünj oder 2-Mercaptoäthanol
inaktiviert worden sind, einsetzt.
4.) Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als durch physikalische Behandlung inaktivierte
Stämme solche, welche mit ^T-Bestrahlung inaktiviert
worden sind, einsetzt.
5.) Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als antibioticumerzeugenden Streptomyces-
-Stamm Streptomyces tenebrarius verwendet.
6.) Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als antibioticumerzeugenden Streptomyces-Stamm
Streptomyces kanamyceticus verwendet.
Beschreibung
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|---|---|---|---|
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| D2 | Grant after examination | ||
| 8364 | No opposition during term of opposition | ||
| 8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |