CN113403299A - 一种选育高产抗菌脂肽的枯草芽孢杆菌的方法 - Google Patents

一种选育高产抗菌脂肽的枯草芽孢杆菌的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种选育高产抗菌脂肽的枯草芽孢杆菌的方法，包括步骤：(1)两亲株的获得；(2)两亲株原生质体制备；(3)两亲株原生质体灭活；(4)原生质体融合；(5)初筛、复筛及遗传稳定性测定。本发明利用原生质体融合的方法，成功筛选出一株提高抗菌肽产量的菌株fusB‑116。与原始菌株相比，经过改良的菌株fusB‑116产生抗菌肽的能力显著提高。与现有技术相比，本发明采用递进式原生质体融合技术，对出发菌株进行不断改良，其操作简单快速，效果显著，具有较好的应用推广前景。

Description

一种选育高产抗菌脂肽的枯草芽孢杆菌的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及菌株的培养和选育，具体是一种选育高产抗菌脂肽的枯草芽孢杆菌的方法。
背景技术
枯草芽孢杆菌产生的脂肽类抗菌活性物质具有强大的抗菌作用，同时它们又不会破坏动物体内的正常细胞，对人体组织来说绿色安全，而且具有“传统抗生素”无法比拟的优越性，它们是真正的广谱抗菌剂。尤其伊枯草菌素(Iturins)家族中的杆菌霉素D(Bacillomycin D)是目前唯一的一种从微生物中提取对黄曲霉具有良好抑制作用的天然活性物质。因而抗菌脂肽在食品、生物医药、农业等领域有重要的应用前景。目前国内发酵工业中微生物菌株分泌抗菌脂肽的产量普遍较低，满足不了批量化生产的要求。本实验室保藏的一株枯草芽孢杆菌，主要产抗菌肽类型为杆菌霉素D，但其产量比较低。因此筛选抗菌肽高产菌株来提高脂肽产量，对于今后工业化生产具有重要的应用价值。
培养和选育抗菌脂肽高产微生物菌株在工业化生产中占据非常重要的地位，需要人为利用一些技术手段对该野生型枯草芽孢杆菌株进行育种改造，进而提高菌株产抗菌脂肽的量以满足工业化生产需求。原生质体融合是20世纪60年代应用于动植物及微生物育种而产生的一门技术，是指细胞在破壁酶的作用下除去细胞壁形成的原生质体，利用特定物质诱导两个及以上亲本原生质体相互融合且发生基因重组，并在合适培养基的条件下重新长出细胞壁而获得融合子的过程。该方法可以提高遗传物质重组频率，应用范围广且便于开展工作。自原生质体融合技术诞生以来，已经广泛运用于微生物育种中并以此获得大量有应用价值的融合菌株。如王怡平等人利用两株不同菌种假单胞菌进行原生质体融合，获得的融合菌株(融合子)对硫化物等物质的耐受能力较双亲本菌株有显著提高。Jin等人以多株高产多杀菌素产生菌为原始菌株，通过原生质体融合选育出一株产多杀菌素的量较原始菌株提高了两倍。但是在提高枯草芽孢杆菌抗菌肽产量方面，还没有采用原生质体融合获得优良微生物的报道，因此，亟需提供一种选育高产抗菌脂肽的枯草芽孢杆菌的方法。
发明内容
本发明的目的是要现有技术中存在的不足，提供一种选育高产抗菌脂肽的枯草芽孢杆菌的方法，筛选出高产抗菌脂肽菌株。
为达到上述目的，本发明是按照以下技术方案实施的：
一种选育高产抗菌脂肽的枯草芽孢杆菌的方法，包括以下步骤：
S1、两亲株的获得：将购自中国普通微生物菌种保藏管理中心的枯草芽孢杆菌菌株B-01培养至对数后期，取枯草芽孢杆菌菌株B-01的菌液经等离子及化学复合诱变后，筛选获得抗弧菌能力较强的枯草芽孢杆菌mutB-23；另取枯草芽孢杆菌菌株B-01的菌液经紫外及化学复合诱变后，筛选获得抗霉菌能力较强的枯草芽孢杆菌mutB-36；以枯草芽孢杆菌mutB-23和枯草芽孢杆菌mutB-36作为出发菌株，分别将它们培养至对数后期，获得枯草芽孢杆菌mutB-23菌液和枯草芽孢杆菌mutB-36菌液；
S2、两亲株原生质体制备：分别向枯草芽孢杆菌mutB-23菌液和枯草芽孢杆菌mutB-36菌液中加入溶菌酶，于37℃酶解10-30min，获得枯草芽孢杆菌mutB-23原生质体溶液和枯草芽孢杆菌mutB-36原生质体溶液；枯草芽孢杆菌mutB-23菌液和枯草芽孢杆菌mutB-36菌液中溶菌酶添加量分别为0.05-0.4mg/mL；
S3、两亲株原生质体融合：分别将枯草芽孢杆菌mutB-23原生质体溶液和枯草芽孢杆菌mutB-36原生质体溶液进行灭活；然后取等量灭活的枯草芽孢杆菌mutB-23原生质体溶液和枯草芽孢杆菌mutB-36原生质体溶液混合5min，离心收集菌体；在收集的菌体中加入0.01-0.02mol/L的CaCl2溶液混合菌体，再加入pH值为7-9、浓度为30-50％的PEG6000于37℃融合10-20min，收集菌体并洗涤，涂布于再生培养基平板上培养24h，即得融合子；
S4、初筛、复筛及遗传稳定性测定：挑取适量融合子菌体接种于发酵培养基培养48h，离心得到发酵上清液；利用牛津杯法，以金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌为指示菌，初步筛选出抑菌圈直径较大的菌株fusB-101、fusB-116、fusB-132和fusB-156；将初筛效果较优菌株逐级活化后，接种至发酵液体培养基中发酵48h；离心得到发酵上清液；利用牛津杯法，以金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌为指示菌，复筛选出抑菌圈直径较大的菌株fusB-101、fusB-116、fusB-132和fusB-156；复筛后的每个菌株再分别传代培养，检查其抑菌活性大小，共传代九次，最后挑选出抑菌活性高、而且遗传性能稳定的高产融合菌株fusB-116。
作为本发明的进一步优选方案，所述步骤S1中培养至对数后期的时间为12-13h。
作为本发明的进一步优选方案，所述步骤S2中，枯草芽孢杆菌mutB-23菌液和枯草芽孢杆菌mutB-36菌液中溶菌酶添加量分别为0.2mg/mL，酶解时间为25min。
进一步地，所述步骤S3中灭活具体方法为：将枯草芽孢杆菌mutB-23原生质体溶液在100℃处理10-50min进行灭活；将枯草芽孢杆菌mutB-36原生质体溶液置于15w的紫外灯管下20cm处，紫外照射10-100min进行灭活。
作为本发明的进一步优选方案，所述枯草芽孢杆菌mutB-23原生质体溶液灭活的时间为40min，枯草芽孢杆菌mutB-36原生质体溶液灭活的时间为80min。
作为本发明的进一步优选方案，所述步骤S3中，在收集的菌体中加入0.01mol/L的CaCl2溶液混合菌体，再加入pH值为9、浓度为40％的PEG6000于37℃融合15min。
作为本发明的进一步优选方案，所述步骤S3中，每升再生培养基包括以下组分：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，葡萄糖10.0g，CaCl2 0.03mol，MgCl2·6H2O 0.02mol，丁二酸钠0.1mol，L-色氨酸0.2g，琼脂粉18.0g，余量为双蒸水；所述再生培养基的pH为7.0。
作为本发明的进一步优选方案，所述步骤S4中，每升液体发酵培养基包括以下组分：葡萄糖10.0g，牛肉膏15.0g，K2HPO4 5.0g，所述液体发酵培养基的pH为7.0。
与现有技术相比，本发明利用原生质体融合的方法，成功筛选出一株提高抗菌肽产量的菌株fusB-116。与原始菌株相比，经过改良的菌株fusB-116产生抗菌肽的能力显著提高,其发酵液的提取物产率相对原始菌株提高35.27％。抑菌活性检测发现，融合菌株fusB-116相对于原始菌株对金黄色葡萄球菌的抑制作用提高23.58％，对副溶血性弧菌的抑制作用提高24.31％。利用荧光定量PCR技术，检测杆菌霉素D的关键基因BCM在融合菌株fusB-116中的表达量与原始菌株的差异。结果表明，融合菌株fusB-116的BCM基因表达量为原始菌株的11.71倍。
综述，本发明采用递进式原生质体融合技术，对出发菌株进行不断改良，其操作简单快速，效果显著，具有较好的应用推广前景。
附图说明
图1为杆菌霉素D的产量比较图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定发明。
实施例1
S1、两亲株的获得：将购自中国普通微生物菌种保藏管理中心的枯草芽孢杆菌菌株B-01培养12h至对数后期，取枯草芽孢杆菌菌株B-01的菌液经等离子及化学复合诱变后，筛选获得抗弧菌能力较强的枯草芽孢杆菌mutB-23；另取枯草芽孢杆菌菌株B-01的菌液经紫外及化学复合诱变后，筛选获得抗霉菌能力较强的枯草芽孢杆菌mutB-36；以枯草芽孢杆菌mutB-23和枯草芽孢杆菌mutB-36作为出发菌株，分别将它们培养12h至对数后期，获得枯草芽孢杆菌mutB-23菌液和枯草芽孢杆菌mutB-36菌液；
S2、两亲株原生质体制备：分别向枯草芽孢杆菌mutB-23菌液和枯草芽孢杆菌mutB-36菌液中加入溶菌酶，于37℃酶解10min，获得枯草芽孢杆菌mutB-23原生质体溶液和枯草芽孢杆菌mutB-36原生质体溶液；枯草芽孢杆菌mutB-23菌液和枯草芽孢杆菌mutB-36菌液中溶菌酶添加量分别为0.05mg/mL；
S3、两亲株原生质体融合：将枯草芽孢杆菌mutB-23原生质体溶液在100℃处理10min进行灭活；将枯草芽孢杆菌mutB-36原生质体溶液置于15w的紫外灯管下20cm处，紫外照射10min进行灭活；然后取等量灭活的枯草芽孢杆菌mutB-23原生质体溶液和枯草芽孢杆菌mutB-36原生质体溶液混合5min，离心收集菌体；在收集的菌体中加入0.01mol/L的CaCl2溶液混合菌体，再加入pH值为7、浓度为30％的PEG6000于37℃融合10min，收集菌体并洗涤，涂布于再生培养基平板上培养24h，即得融合子，每升再生培养基包括以下组分：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，葡萄糖10.0g，CaCl2 0.03mol，MgCl2·6H2O 0.02mol，丁二酸钠0.1mol，L-色氨酸0.2g，琼脂粉18.0g，余量为双蒸水；所述再生培养基的pH为7.0；
S4、初筛、复筛及遗传稳定性测定：挑取适量融合子菌体接种于发酵培养基培养48h，离心得到发酵上清液；利用牛津杯法，以金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌为指示菌，初步筛选出抑菌圈直径较大的菌株fusB-101、fusB-116、fusB-132和fusB-156；将初筛效果较优菌株逐级活化后，接种至发酵液体培养基中发酵48h，本实施例中，每升液体发酵培养基包括以下组分：葡萄糖10.0g，牛肉膏15.0g，K2HPO4 5.0g，所述液体发酵培养基的pH为7.0；离心得到发酵上清液；利用牛津杯法，以金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌为指示菌，复筛选出抑菌圈直径较大的菌株fusB-101、fusB-116、fusB-132和fusB-156；复筛后的每个菌株再分别传代培养，检查其抑菌活性大小，共传代九次，最后挑选出抑菌活性高、而且遗传性能稳定的高产融合菌株fusB-116。
实施例2
S1、两亲株的获得：将购自中国普通微生物菌种保藏管理中心的枯草芽孢杆菌菌株B-01培养13h至对数后期，取枯草芽孢杆菌菌株B-01的菌液经等离子及化学复合诱变后，筛选获得抗弧菌能力较强的枯草芽孢杆菌mutB-23；另取枯草芽孢杆菌菌株B-01的菌液经紫外及化学复合诱变后，筛选获得抗霉菌能力较强的枯草芽孢杆菌mutB-36；以枯草芽孢杆菌mutB-23和枯草芽孢杆菌mutB-36作为出发菌株，分别将它们培养13h至对数后期，获得枯草芽孢杆菌mutB-23菌液和枯草芽孢杆菌mutB-36菌液；
S2、两亲株原生质体制备：分别向枯草芽孢杆菌mutB-23菌液和枯草芽孢杆菌mutB-36菌液中加入溶菌酶，于37℃酶解10-30min，获得枯草芽孢杆菌mutB-23原生质体溶液和枯草芽孢杆菌mutB-36原生质体溶液；枯草芽孢杆菌mutB-23菌液和枯草芽孢杆菌mutB-36菌液中溶菌酶添加量分别为0.4mg/mL；
S3、两亲株原生质体融合：将枯草芽孢杆菌mutB-23原生质体溶液在100℃处理50min进行灭活；将枯草芽孢杆菌mutB-36原生质体溶液置于15w的紫外灯管下20cm处，紫外照射100min进行灭活；然后取等量灭活的枯草芽孢杆菌mutB-23原生质体溶液和枯草芽孢杆菌mutB-36原生质体溶液混合5min，离心收集菌体；在收集的菌体中加入0.02mol/L的CaCl2溶液混合菌体，再加入pH值为9、浓度为50％的PEG6000于37℃融合20min，收集菌体并洗涤，涂布于再生培养基平板上培养24h，即得融合子，每升再生培养基包括以下组分：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，葡萄糖10.0g，CaCl2 0.03mol，MgCl2·6H2O 0.02mol，丁二酸钠0.1mol，L-色氨酸0.2g，琼脂粉18.0g，余量为双蒸水；所述再生培养基的pH为7.0；
S4、初筛、复筛及遗传稳定性测定：挑取适量融合子菌体接种于发酵培养基培养48h，离心得到发酵上清液；利用牛津杯法，以金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌为指示菌，初步筛选出抑菌圈直径较大的菌株fusB-101、fusB-116、fusB-132和fusB-156；将初筛效果较优菌株逐级活化后，接种至发酵液体培养基中发酵48h，本实施例中，每升液体发酵培养基包括以下组分：葡萄糖10.0g，牛肉膏15.0g，K2HPO4 5.0g，所述液体发酵培养基的pH为7.0；离心得到发酵上清液；利用牛津杯法，以金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌为指示菌，复筛选出抑菌圈直径较大的菌株fusB-101、fusB-116、fusB-132和fusB-156；复筛后的每个菌株再分别传代培养，检查其抑菌活性大小，共传代九次，最后挑选出抑菌活性高、而且遗传性能稳定的高产融合菌株fusB-116。
实施例3
S1、两亲株的获得：将购自中国普通微生物菌种保藏管理中心的枯草芽孢杆菌菌株B-01培养12h至对数后期，取枯草芽孢杆菌菌株B-01的菌液经等离子及化学复合诱变后，筛选获得抗弧菌能力较强的枯草芽孢杆菌mutB-23；另取枯草芽孢杆菌菌株B-01的菌液经紫外及化学复合诱变后，筛选获得抗霉菌能力较强的枯草芽孢杆菌mutB-36；以枯草芽孢杆菌mutB-23和枯草芽孢杆菌mutB-36作为出发菌株，分别将它们培养13h至对数后期，获得枯草芽孢杆菌mutB-23菌液和枯草芽孢杆菌mutB-36菌液；
S2、两亲株原生质体制备：分别向枯草芽孢杆菌mutB-23菌液和枯草芽孢杆菌mutB-36菌液中加入溶菌酶，于37℃酶解25min，获得枯草芽孢杆菌mutB-23原生质体溶液和枯草芽孢杆菌mutB-36原生质体溶液；枯草芽孢杆菌mutB-23菌液和枯草芽孢杆菌mutB-36菌液中溶菌酶添加量分别为0.2mg/mL；
S3、两亲株原生质体融合：将枯草芽孢杆菌mutB-23原生质体溶液在100℃处理40min进行灭活；将枯草芽孢杆菌mutB-36原生质体溶液置于15w的紫外灯管下20cm处，紫外照射80min进行灭活；然后取等量灭活的枯草芽孢杆菌mutB-23原生质体溶液和枯草芽孢杆菌mutB-36原生质体溶液混合5min，离心收集菌体；在收集的菌体中加入0.01mol/L的CaCl2溶液混合菌体，再加入pH值为9、浓度为40％的PEG6000于37℃融合15min，收集菌体并洗涤，涂布于再生培养基平板上培养24h，即得融合子，每升再生培养基包括以下组分：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，葡萄糖10.0g，CaCl2 0.03mol，MgCl2·6H2O 0.02mol，丁二酸钠0.1mol，L-色氨酸0.2g，琼脂粉18.0g，余量为双蒸水；所述再生培养基的pH为7.0；
S4、初筛、复筛及遗传稳定性测定：挑取适量融合子菌体接种于发酵培养基培养48h，离心得到发酵上清液；利用牛津杯法，以金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌为指示菌，初步筛选出抑菌圈直径较大的菌株fusB-101、fusB-116、fusB-132和fusB-156；将初筛效果较优菌株逐级活化后，接种至发酵液体培养基中发酵48h，本实施例中，每升液体发酵培养基包括以下组分：葡萄糖10.0g，牛肉膏15.0g，K2HPO4 5.0g，所述液体发酵培养基的pH为7.0；离心得到发酵上清液；利用牛津杯法，以金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌为指示菌，复筛选出抑菌圈直径较大的菌株fusB-101、fusB-116、fusB-132和fusB-156；复筛后的每个菌株再分别传代培养，检查其抑菌活性大小，共传代九次，最后挑选出抑菌活性高、而且遗传性能稳定的高产融合菌株fusB-116。
实施例4
菌株发酵液的抑菌活性比较：分别将实施例3中的原始菌株枯草芽孢杆菌菌株B-01、枯草芽孢杆菌mutB-23、枯草芽孢杆菌mutB-36以及高产融合菌株fusB-116同时进行2L摇瓶发酵。分别将4株菌株发酵得到的上清液对指示菌金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌做抑菌活性检测。活性物质抑菌结果比较如表1所示，高产融合菌株fusB-116相对于原始菌株对金黄色葡萄球菌的抑制作用提高23.58％，对副溶血性弧菌的抑制作用提高24.31％。
表1
Figure BDA0003172600410000091
实施例5
抗菌肽提取物产量比较：分别将实施例3中的原始菌株枯草芽孢杆菌菌株B-01、枯草芽孢杆菌mutB-23、枯草芽孢杆菌mutB-36以及高产融合菌株fusB-116同时进行2L摇瓶发酵，离心收集上清液，并用浓度为6mol/L的稀盐酸将其调节至pH为2(等电点)，将其放置于4℃环境中酸沉。待其充分沉淀后，离心收集沉淀物，并利用甲醇反复多次抽提后，过0.22μm有机滤膜收集滤液，获得的滤液于40℃条件下进行减压旋蒸，最后得到的干粉就是抗菌脂肽提取物。分别对这四株菌株发酵提取物进行产率计算。
抗菌肽提取物产量比较结果如表2所示，高产融合菌株fusB-116在提取物产量上高于融合亲本菌株枯草mutB-23和枯草mutB-36，在产率上相对原始菌株枯草芽孢杆菌菌株B-01提高35.27％。
表2
Figure BDA0003172600410000101
可见，本发明选育的枯草芽孢杆菌可明显提高抗菌肽产量。
实施例6
因为，枯草芽孢杆菌主要产抗菌肽类型为杆菌霉素D，进一步，为了验证本发明选育的枯草芽孢杆菌可明显提高抗菌肽产量，选取实施例3中的原始菌株枯草芽孢杆菌菌株B-01和高产融合菌株fusB-116，通过实时荧光定量PCR检测杆菌霉素D关键基因BCM表达量的差异。
RNA的提取：RNA的提取方法按照上海生工生物工程公司的RNA提取试剂盒法进行实验。
反转录PCR：cDNA的合成采用One-Step gDNARemoval and cDNA SynthesisSuperMix试剂盒。
荧光定量PCR：参照发表的枯草芽孢杆菌产抗菌肽基因的相关文献，利用Primerpremier 5引物设计软件，设计了杆菌霉素D的引物序列如表3。根据相关文献，选取16SrRNA作为内参基因，选取杆菌霉素D的关键基因BCM为目的基因进行反应，并采用2-△△CT相对定量法对实验结果进行分析。
实验结果如表4和图1所示，在高产融合菌株fusB-116中，编码杆菌霉素D的关键基因BCM的表达量比原始菌株枯草芽孢杆菌菌株B-01提高11.71倍，比融合亲本菌株枯草芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌mutB-36分别提高3.68和5.03倍。
表3
Figure BDA0003172600410000111
表4
Figure BDA0003172600410000112
综述，本发明选育的枯草芽孢杆菌具有很好的抑菌活性，且可明显提高抗菌肽产量。
本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种选育高产抗菌脂肽的枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、两亲株的获得：将购自中国普通微生物菌种保藏管理中心的枯草芽孢杆菌菌株B-01培养至对数后期，取枯草芽孢杆菌菌株B-01的菌液经等离子及化学复合诱变后，筛选获得抗弧菌能力较强的枯草芽孢杆菌mutB-23；另取枯草芽孢杆菌菌株B-01的菌液经紫外及化学复合诱变后，筛选获得抗霉菌能力较强的枯草芽孢杆菌mutB-36；以枯草芽孢杆菌mutB-23和枯草芽孢杆菌mutB-36作为出发菌株，分别将它们培养至对数后期，获得枯草芽孢杆菌mutB-23菌液和枯草芽孢杆菌mutB-36菌液；
S2、两亲株原生质体制备：分别向枯草芽孢杆菌mutB-23菌液和枯草芽孢杆菌mutB-36菌液中加入溶菌酶，于37℃酶解10-30min，获得枯草芽孢杆菌mutB-23原生质体溶液和枯草芽孢杆菌mutB-36原生质体溶液；枯草芽孢杆菌mutB-23菌液和枯草芽孢杆菌mutB-36菌液中溶菌酶添加量分别为0.05-0.4mg/mL；
S3、两亲株原生质体融合：分别将枯草芽孢杆菌mutB-23原生质体溶液和枯草芽孢杆菌mutB-36原生质体溶液进行灭活；然后取等量灭活的枯草芽孢杆菌mutB-23原生质体溶液和枯草芽孢杆菌mutB-36原生质体溶液混合5min，离心收集菌体；在收集的菌体中加入0.01-0.02mol/L的CaCl2溶液混合菌体，再加入pH值为7-9、浓度为30-50％的PEG6000于37℃融合10-20min，收集菌体并洗涤，涂布于再生培养基平板上培养24h，即得融合子；
S4、初筛、复筛及遗传稳定性测定：挑取适量融合子菌体接种于发酵培养基培养48h，离心得到发酵上清液；利用牛津杯法，以金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌为指示菌，初步筛选出抑菌圈直径较大的菌株fusB-101、fusB-116、fusB-132和fusB-156；将初筛效果较优菌株逐级活化后，接种至发酵液体培养基中发酵48h；离心得到发酵上清液；利用牛津杯法，以金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌为指示菌，复筛选出抑菌圈直径较大的菌株fusB-101、fusB-116、fusB-132和fusB-156；复筛后的每个菌株再分别传代培养，检查其抑菌活性大小，共传代九次，最后挑选出抑菌活性高、而且遗传性能稳定的高产融合菌株fusB-116。
2.根据权利要求1所述的选育高产抗菌脂肽的枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于，所述步骤S1中培养至对数后期的时间为12-13h。
3.根据权利要求1所述的选育高产抗菌脂肽的枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于，所述步骤S2中，枯草芽孢杆菌mutB-23菌液和枯草芽孢杆菌mutB-36菌液中溶菌酶添加量分别为0.2mg/mL，酶解时间为25min。
4.根据权利要求1所述的选育高产抗菌脂肽的枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于，所述步骤S3中灭活具体方法为：将枯草芽孢杆菌mutB-23原生质体溶液在100℃处理10-50min进行灭活；将枯草芽孢杆菌mutB-36原生质体溶液置于15w的紫外灯管下20cm处，紫外照射10-100min进行灭活。
5.根据权利要求4所述的选育高产抗菌脂肽的枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌mutB-23原生质体溶液灭活的时间为40min，枯草芽孢杆菌mutB-36原生质体溶液灭活的时间为80min。
6.根据权利要求1所述的选育高产抗菌脂肽的枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于，所述步骤S3中，在收集的菌体中加入0.01mol/L的CaCl2溶液混合菌体，再加入pH值为9、浓度为40％的PEG6000于37℃融合15min。
7.根据权利要求1所述的选育高产抗菌脂肽的枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于，所述步骤S3中，每升再生培养基包括以下组分：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，葡萄糖10.0g，CaCl2 0.03mol，MgCl2·6H2O 0.02mol，丁二酸钠0.1mol，L-色氨酸0.2g，琼脂粉18.0g，余量为双蒸水；所述再生培养基的pH为7.0。
8.根据权利要求1所述的选育高产抗菌脂肽的枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于，所述步骤S4中，每升液体发酵培养基包括以下组分：葡萄糖10.0g，牛肉膏15.0g，K2HPO4 5.0g，所述液体发酵培养基的pH为7.0。
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