CN114774498B - 一种用硅藻土固定芽孢杆菌发酵生产杆菌霉素d的方法 - Google Patents

一种用硅藻土固定芽孢杆菌发酵生产杆菌霉素d的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用硅藻土固定芽孢杆菌发酵生产杆菌霉素D的方法，属于生物技术领域。在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)fmbJ(CGMCC No.0943)的发酵过程中添加硅藻土将fmbJ固定化发酵，从而能显著提高枯草芽孢杆菌的次级代谢产物杆菌霉素D的产量，并且在不添加任何新鲜种子液的条件下，能够反复发酵，并显著提高杆菌霉素D产量。该方法不仅增加了杆菌霉素D的产量，还提高了原材料的利用率，降低生产成本，其发酵结束后的副产物(吸附枯草芽孢杆菌的硅藻土)还可用于制作微生物制剂，可以在粮食贮藏、果蔬保鲜以及动物饲料中得到应用。

Description

一种用硅藻土固定芽孢杆菌发酵生产杆菌霉素D的方法
一、技术领域
本发明涉及微生物发酵领域，具体涉及一种用硅藻土固定芽孢杆菌发酵生产杆菌霉素D的方法。
二、背景技术
随着社会经济的飞快发展，人们越来越关注绿色环保与健康。化学杀菌剂的大量使用导致化学残留问题，不仅会加剧环境污染，严重会危害人体健康。目前，全球都在迫切寻求一种新的化学杀菌剂替代品。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)fmbJ属于革兰氏阳性菌，芽孢杆菌属，可以分泌一系列如杆菌霉素D、丰霉素、表面活性素等的抗菌脂肽。采用其代谢产物抗菌脂肽作为化学杀菌剂的替代品，杆菌霉素D对多种霉菌具有较强的抑制作用，同时具备绿色环保、低耐药性等优点，可广泛应用于粮食贮藏(Growth inhibition ofFusarium graminearum and reduction of deoxynivalenol production in wheatgrain by bacillomycin D.Journal of Stored Products Research,2018,75,21-28)、果蔬保鲜(Effect of combined Bacillomycin D and chitosan on growth of Rhizopusstolonifer and Botrytis cinerea and cherry tomato preservation,Journal of theScience of Food and Agriculture,2020,101,229-239)、医疗(Bacillomycin D and itscombination with amphotericin B:promising antifungal compounds with powerfulantibiofilm activity and wound-healing potency,JournalofApplied Microbiology,2016,120,289-300)以及动物饲料(见授权专利ZL 201010576515.8一种枯草杆菌抗菌脂肽的生产方法及其在仔猪饲料中的应用)中，但是其缺点也很明显，产量低，成本高，无法满足工业化生产要求。
关于提高杆菌霉素D产量的研究主要集中于优化发酵培养基配方，筛选优异的菌种，基因工程编辑等手段。鲜有学者对其固定化反复发酵菌株提高杆菌霉素D产量方面进行研究。
硅藻土是一种重要的矿产资源，是硅藻生物死亡后遗骸沉淀堆积形成的生物沉积岩，也被广泛称为无定形硅石。硅藻土表面少量的微孔、介孔与大量的大孔组成其独特的多级孔道结构。它的储存量巨大，世界上已探明的储量为18-20亿吨，并广泛分布于全球。硅藻土拥有千差万别的形态，大多呈现为圆盘状、棒状、带状。其中圆盘状硅藻土由上下两个半壳套合在一起构成，其结构骨架呈现为蜂窝状，具有孔隙率高、体积密度低、比表面积大、吸附能力强、吸附性能好等特点，长度通常为1-100μm。因此，硅藻土可作为助滤、吸附、保温隔热和催化载体等材料广泛应用于石油化工、环境、食品、建筑等各个领域。但从来没有作为吸附载体固定枯草芽孢杆菌进行发酵。
三、发明内容
技术问题
本发明的目的是提供一种用硅藻土固定芽孢杆菌发酵生产杆菌霉素D的方法
技术方案
本发明的目的通过以下技术方案得以实现。
一种用硅藻土固定芽孢杆菌发酵生产杆菌霉素D的方法，其特征在于，是指在保藏号为CGMCC No.0943的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)fmbJ发酵过程中加入硅藻土进行固定化发酵，获得发酵上清液和沉淀物发酵残渣，用发酵上清液生产杆菌霉素D的方法。
所述的方法，其特征在于，将所述的含菌量为108CFU/mL的枯草芽孢杆菌fmbJ接种于Landy培养基，接种量为1-10％(体积比)，33℃、180rpm条件下进行发酵，发酵至0-36h时添加硅藻土继续发酵至72h，添加硅藻土的质量比为0-5wt％，将第一次发酵完成的菌液4℃、5000g离心15min，取上清液用于生产杆菌霉素D，沉淀物用于下一次继续发酵；
在第一次发酵沉淀物中继续添加与第一次发酵等量的新鲜的Landy培养基进行二次发酵；
第三次发酵操作同第二次发酵操作相同；
采用酸沉的方法提取三次发酵上清液中的杆菌霉素D，即为生产的杆菌霉素D。
所述的方法，其特征在于，优选含菌量为108CFU/mL的枯草芽孢杆菌fmbJ接种于Landy培养基，接种量为3-8％(体积比)，33℃、180rpm条件下进行发酵，发酵至6-24h时添加硅藻土继续发酵至72h，添加硅藻土的质量比为0-2wt％。
进一步优选含菌量为108CFU/mL的枯草芽孢杆菌fmbJ接种于Landy培养基，接种量为4-6％(体积比)，33℃、180rpm条件下进行发酵，发酵至6-24h时添加硅藻土继续发酵至72h，添加硅藻土的质量比为0.2-0.8wt％。
所述杆菌霉素D的应用，是指杆菌霉素D在粮食贮藏、果蔬保鲜、医疗或动物饲料方面的应用。
用所述方法生产的微生物制剂，其特征在于，将所述的沉淀物发酵残渣烘干得到微生物制剂，干燥的温度30-70℃。所述微生物制剂的应用，是指微生物制剂在粮食贮藏、果蔬保鲜以及动物饲料方面的应用。
有益效果
现有技术中关于提高杆菌霉素D产量的研究主要集中于优化发酵培养基配方，筛选优异的菌种，基因工程编辑等手段。鲜有学者对其固定化反复发酵菌株提高杆菌霉素D产量方面进行研究。
1、本发明采用硅藻土固定fmbJ进行杆菌霉素D的发酵，通过添加硅藻土提升杆菌霉素的产量，提高了原材料(硅藻土、种子液)的利用率，操作简便。
2、本发明所发明的硅藻土固定枯草芽孢杆菌fmbJ，可通过添加新鲜培养基而不添加种子液，实现重复发酵，反复发酵实验的结果表明，三次发酵生产杆菌霉素D产量分别为1101.31±30.81mg/L、1047.83±29.25mg/L和663.72±29.81mg/L，达到未固定fmbJ发酵产杆菌霉素D的1.33倍、1.55倍以及2.84倍(见图4)。节约了生产流程，降低了生产成本，其发酵残渣(硅藻土固定的枯草芽孢杆菌fmbJ)还可回收作为微生物制剂，可以在粮食贮藏、果蔬保鲜以及动物饲料中得到应用。并不会造成环境污染和资源浪费，节约了生产成本，保护了环境。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的硅藻土固定枯草芽孢杆菌fmbJ发酵杆菌霉素D的方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对发明保护范围的限定。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
四、附图说明
图1、技术方案流程图。
图2、不同单因素对硅藻土固定枯草芽孢杆菌fmbJ发酵杆菌霉素D的影响。其中CK为没有添加硅藻土固定枯草芽孢杆菌fmbJ发酵杆菌霉素D的对照组；A硅藻土添加量，B硅藻土添加时间，C枯草芽孢杆菌fmbJ的接种量，D振荡速度；小写字母(a、b、c、d)表示显著差异(p<0.05)。
图3、硅藻土固定化发酵不同因素之间的交互作用。
图4、不同发酵批次中杆菌霉素D的浓度。a：第一次发酵，b：第二次发酵，c：第三次发酵。
五、具体实施方式
硅藻土(杭州崇科新材料有限公司，Celite610)进行121℃灭菌处理后烘干备用。挑取枯草芽孢杆菌fmbJ(CGMCC No.0943，公知公用见授权专利ZL 201010576515.8一种枯草杆菌抗菌脂肽的生产方法及其在仔猪饲料中的应用)单菌落接种于营养肉汤培养基(NB，北京陆桥技术有限公司，规格250g)，37℃、180rpm条件培养15h，菌液为枯草芽孢杆菌fmbJ种子液，含菌量为108CFU/mL。
接种体积比为5％fmbJ种子液(含菌量为108CFU/mL)于Landy发酵培养基(详细配方见文献Growth inhibition of Fusarium graminearum and reduction ofdeoxynivalenol production in wheat grain by bacillomycin D.Journal ofStoredProducts Research,2018,75,21-28)(50mL，250mL三角瓶)，33℃、180rpm条件下进行发酵，发酵至12h时添加1wt％硅藻土继续发酵至72h。所有实验重复3次，结果以平均值±标准差表示。
1)挑选硅藻土添加量，硅藻土添加时间，菌种的接种量和转速进行单因素实验。结果表明以上四种单因素都对杆菌霉素D的产量具有显著的影响(图2)。
2)通过Plackett-Burman实验(Utilizing Plackett-Burman design andresponse surface analysis to optimize ultrasonic cleaning of pesticideresidues from rapes.Journal of the Science of Food and Agriculture.2021,102:2061-2069)挑选三个单因素进行响应面实验优化。Plackett-Burman实验结果方差分析见表1。根据显著性大小从四个单因素中挑选出硅藻土添加时间(p＝0.0486)、硅藻土添加量(p＜0.0001)和fmbJ初始接种量(p＝0.0044)进行响应面优化实验。
表1 Plackett-Burman设计中各因素对杆菌霉素D产量的方差分析
*表示显著差异(*<0.05,**<0.01)
3)筛选出具有显著影响的三个因素(硅藻土添加量，硅藻土添加时间，菌种的接种量)进行响应面实验。不同因素之间的交互作用如图3所示，硅藻土添加量和添加时间、硅藻土添加量和接种量以及硅藻土添加时间和接种量的等高线呈现椭圆形，说明两两因素之间存在相互作用。最优发酵条件为：接种6.38％的枯草芽孢杆菌fmbJ种子液(含菌量为108CFU/mL)于Landy发酵培养基(50mL，250mL三角瓶)中，33℃、180rpm条件下进行发酵，发酵至15.48h时添加0.62wt％硅藻土继续发酵至72h。
4)采用最优条件进行反复发酵实验，对照组发酵条件除不添加硅藻土其余条件相同。
将第一次发酵完成的菌液4℃、5000g离心15min，获得第一次发酵的上清液，沉淀用于添加50mL新鲜的Landy培养基进行二次发酵，获得第二次发酵的上清液；第三次发酵操作同第二次发酵操作相同。发酵完成后5000g离心15min，获得三次发酵的上清液。留下沉淀物中硅藻土固定的枯草芽孢杆菌fmbJ，可用于制作微生物制剂。
采用酸沉的方法提取三次发酵的上清液中的杆菌霉素D。将获得的三次发酵的上清液采用4M HCl调整上清液的pH为2，充分振荡，4℃条件下放置过夜(12h-24h)，8000g离心10min，获得沉淀。采用甲醇充分溶解含有杆菌霉素D的沉淀，进一步离心后去除不溶物，获得杆菌霉素D粗品，具体方法参照Gong等人的报道(Identification of bacillomycin Dfrom Bacillus subtilis fmbJ and its inhibition effectsagainstAspergillusflavus.Food Control,2014,36(1),8-14)。
反复发酵实验结果(图4)表明，硅藻土固定枯草芽孢杆菌fmbJ三次发酵的杆菌霉素D粗品，产量分别为1101.31±30.81mg/L、1047.83±29.25mg/L和663.72±29.81mg/L，达到对照组杆菌霉素D产量的1.33倍、1.55倍以及2.84倍。
现有技术公开了杆菌霉素D对多种霉菌具有较强的抑制作用，同时具备绿色环保、低耐药性等优点，可广泛应用于粮食贮藏(Growth inhibition of Fusarium graminearumand reduction of deoxynivalenol production in wheat grain by bacillomycinD.Journal of Stored Products Research,2018,75,21-28)、果蔬保鲜(Effect ofcombined Bacillomycin D and chitosan on growth of Rhizopus stolonifer andBotrytis cinerea and cherry tomato preservation,Journal of the Science ofFood and Agriculture,2020,101,229-239)、医疗(Bacillomycin D and itscombination with amphotericin B:promising antifungal compounds with powerfulantibiofilm activity and wound-healing potency,Journal of AppliedMicrobiology,2016,120,289-300)以及动物饲料(见授权专利ZL201010576515.8一种枯草杆菌抗菌脂肽的生产方法及其在仔猪饲料中的应用)中。因此，本发明生产的杆菌霉素D可以在粮食贮藏、果蔬保鲜、医疗以及动物饲料中得到应用。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)fmbJ属于革兰氏阳性菌，芽孢杆菌属，可以形成保护性的内生孢子，对人畜无害，同时它可以分泌抗菌活性物质而作为生防菌以及用于粮食贮藏、果蔬保鲜等(Growth inhibition of Fusarium graminearum and reductionof deoxynivalenol production in wheat grain by bacillomycin D.Journal ofStored Products Research,2018,75,21-28；Effect of combined Bacillomycin D andchitosan on growth of Rhizopus stolonifer and Botrytis cinerea andcherrytomato preservation,Journalofthe Science ofFoodandAgriculture,101,229-239)。
本发明采用的硅藻土为Celite610，在美国环境保护署(EPA)注册和有机材料评估研究所(OMRI)批准，已列入美国国家有机计划，是一种食品级的矿产品，主要应用于果蔬植物保护、中草药种植、粮食储藏、家禽畜牧养殖等农业各种领域杀虫。
本发明菌株枯草芽孢杆菌为安全的微生物，其抗菌产物可替代仔猪饲料中的抗生素，且具有更好的效果(见授权专利ZL 201010576515.8一种枯草杆菌抗菌脂肽的生产方法及其在仔猪饲料中的应用)。
因此，本发明采用硅藻土固定枯草芽孢杆菌可以构建多功能微生物制剂。所以用发酵残渣(硅藻土固定的枯草芽孢杆菌fmbJ)所制备的微生物制剂可以在粮食贮藏、果蔬保鲜以及动物饲料中得到应用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种用硅藻土固定芽孢杆菌发酵生产杆菌霉素D的方法，其特征在于，将含菌量为108 CFU/mL保藏号为CGMCC No. 0943的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）fmbJ接种于Landy培养基，接种量体积比为1%-10%，33℃、180 rpm条件下进行发酵，发酵至0-36 h时添加硅藻土继续发酵至72 h，添加硅藻土的质量比为0 -2 wt%，将发酵完成的菌液4℃、5000 g离心15 min，获得发酵上清液和沉淀物发酵残渣，取上清液用于生产杆菌霉素D，沉淀物用于下一次继续发酵；
在第一次发酵沉淀物中继续添加与第一次发酵等量的新鲜的Landy培养基进行二次发酵；
第三次发酵操作同第二次发酵操作相同；
采用酸沉的方法提取三次发酵上清液中的杆菌霉素D，即为生产的杆菌霉素D。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将含菌量为108 CFU/mL的枯草芽孢杆菌fmbJ接种于Landy培养基，接种量体积比为4%-6%，33℃、180 rpm条件下进行发酵，发酵至12-24 h时添加硅藻土继续发酵至72 h，添加硅藻土的质量比为0.2 wt%-0.8 wt%。
3.一种微生物制剂，其特征在于，将权利要求1所述的沉淀物发酵残渣烘干得到微生物制剂，干燥的温度为30-70℃。
4.权利要求3所述的微生物制剂在粮食贮藏、果蔬保鲜以及动物饲料方面的应用。
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