CN114717156A - 一种用硅藻土固定芽孢杆菌生产的生物制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用硅藻土固定芽孢杆菌生产的生物制剂，属于微生物制剂领域。采用硅藻土吸附培养液中的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)fmbJ(CGMCC No.0943)，能够短时间内获得大量活性细胞，过滤干燥后得到生物制剂，获得生物制剂的制备方法简便，不易变质，干燥且芽孢处于休眠状态，生物量巨大对比其余生物制剂，生物量达到5.09×1010CFU/g，贮藏性能稳定。
Description
一、技术领域
本发明涉及微生物制剂领域，具体涉及一种用硅藻土固定芽孢杆菌生产的生物制剂。
二、背景技术
目前关于粮食贮藏、果蔬保鲜方面主要还是采用化学抑菌剂，化学抑菌剂的大量使用导致化学残留问题，危害人体健康，加剧环境污染和大量的资源浪费。现在世界上都在迫切寻求一种新的化学抑菌剂替代品。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)fmbJ属于革兰氏阳性菌，芽孢杆菌属，可以形成保护性的内生孢子，对人畜无害，同时它可以分泌抗菌活性物质而作为生防菌以及用于粮食贮藏、果蔬保鲜等(Growth inhibition of Fusariumgraminearum and reduction of deoxynivalenol production in wheat grain bybacillomycin D.Journal of Stored Products Research,2018,75,21-28；Effect ofcombined Bacillomycin D and chitosan on growth of Rhizopus stolonifer andBotrytis cinerea and cherry tomato preservation,Journal of the Science ofFood and Agriculture,101,229-239)。将其作为生物制剂面临的问题是芽孢稳定性差，制备时间长，步骤繁琐、获取成本高，获得的芽孢数量少(LB培养基培养36h，获得芽孢数仅为108CFU/mL)等问题。
采用微生物固定的方法来解决上述出现的问题，首先需解决吸附材料的问题。目前国内外研究成果显示芽孢杆菌属的吸附方法主要采用石粉进行吸附，采用冷冻干燥和喷雾干燥的方法干燥分离得到的固形物。但是其工艺涉及多个高耗能单元，能源及设备投入较高，且吸附效果和微生物活性不好。
硅藻土是一种重要的矿产资源，是硅藻生物死亡后遗骸沉淀堆积形成的生物沉积岩，也被广泛称为无定形硅石。硅藻土表面少量的微孔、介孔与大量的大孔组成其独特的多级孔道结构。它的储存量巨大，世界上已探明的储量为18-20亿吨，并广泛分布于全球。硅藻土拥有千差万别的形态，大多呈现为圆盘状、棒状、带状。其中圆盘状硅藻土由上下两个半壳套合在一起构成，其结构骨架呈现为蜂窝状，具有孔隙率高、体积密度低、比表面积大、吸附能力强、吸附性能好等特点，长度通常为1-100μm。因此，硅藻土可作为助滤、吸附、保温隔热和催化载体等材料广泛应用于石油化工、环境、食品、建筑等各个领域。是作为微生物吸附的优良载体。
三、发明内容
技术问题
本发明的目的是寻找一种绿色、环保、性质稳定、效果优良的微生物源生物制剂。
技术方案
本发明的目的通过以下技术方案得以实现。
一种用硅藻土固定芽孢杆菌生产的生物制剂，其特征在于，是用硅藻土通过水浴振荡吸附包埋保藏号为CGMCC No.0943，菌种浓度为(5-6)×108CFU/mL的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)fmbJ培养液后，过滤烘干获得的生物制剂。将获得的生物制剂密封贮藏于阴凉干燥处；
所述枯草芽孢杆菌fmbJ培养液是通过以下方式制备获得的：将枯草芽孢杆菌fmbJ接种于液体LB培养基，37℃、180rpm下培养36h获得的菌液为枯草芽孢杆菌fmbJ培养液。
所述的水浴振荡吸附过程中吸附温度为20-50℃，振荡速率为0-180rpm，吸附时间10-120min，硅藻土的添加量为1-10wt％，干燥的温度30-70℃。
所述的水浴振荡吸附过程中优选为吸附温度为25-40℃，振荡速率为40-120rpm，吸附时间50-70min，硅藻土的添加量为1-8wt％，干燥的温度40-60℃。
所述的水浴振荡吸附过程中进一步优选吸附温度为26-35℃，振荡速率为60-90rpm，吸附时间55-65min，硅藻土的添加量为1-4wt％，干燥的温度45-55℃。
所述生物制剂的应用是指在植物防治、粮食贮藏或动物饲料中的应用。
本发明所制的生物制剂烘干后，便可包装储存，短期可置于常温，长期贮藏于-20℃条件下。
有益效果
目前国内外研究成果显示芽孢杆菌属的吸附方法主要采用石粉进行吸附，采用冷冻干燥和喷雾干燥的方法干燥分离得到的固形物。但是其工艺涉及多个高耗能单元，能源及设备投入较高，且吸附效果和微生物活性不好。
本发明采用的硅藻土为Celite610，在美国环境保护署(EPA)注册和有机材料评估研究所(OMRI)批准，已列入美国国家有机计划，是一种食品级的矿产品，主要应用于果蔬植物保护、中草药种植、粮食储藏、家禽畜牧养殖等农业各种领域杀虫。本发明菌株枯草芽孢杆菌为安全的微生物，其抗菌产物可替代仔猪饲料中的抗生素，且具有更好的效果(见授权专利ZL201010576515.8一种枯草杆菌抗菌脂肽的生产方法及其在仔猪饲料中的应用)。采用硅藻土固定枯草芽孢杆菌可以构建多功能微生物制剂。
1、本发明选用硅藻土吸附枯草芽孢杆菌fmbJ的生物制剂操作流程简单，操作简便，所需仪器简单，价格便宜节约能源。硅藻土的储量大，成本低，无毒，表面呈现蜂窝结构具有孔隙率高、比表面积大、吸附容量大、吸附性能好等优点，能够有效的吸附微生物，较好的保护微生物，提高抗逆性。本发明采用45℃烘干，极大的保护被吸附的微生物，获得巨大的生物量同时节约了成本和能源的消耗。
2、本发明制备的生物制剂生物量巨大(数量级高达1010CFU/g)，性质稳定，贮藏期长，经济环保，机械性能强等优点。生物制剂于-20℃的条件下贮藏180天枯草芽孢杆菌依旧可以维持80％的存活率(活菌数为4.0×1010CFU/g)。
3、所制备的生物制剂可以在粮食贮藏、果蔬保鲜以及动物饲料中得到应用。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的硅藻土吸附枯草芽孢杆菌的生物制剂及其制备方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对发明保护范围的限定。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
四、附图说明
图1、技术方案流程图。
图2、不同单因素对硅藻土吸附枯草芽孢杆菌fmbJ的影响。A硅藻土添加量，B吸附时间，C吸附温度，D振荡速率。误差条代表三个生物重复的标准偏差，条上的小写字母(a，b，c，d)表示显著差异(p<0.05)。
图3、不同因素间交互作用的3D模型。
图4、吸附枯草芽孢杆菌fmbJ的硅藻土(实验组)和硅藻土(对照组)的傅里叶变换红外光谱分析。
图5、硅藻土的粒径分布和参数图。(a)硅藻土(对照组)，(b)吸附枯草芽孢杆菌fmbJ的硅藻土(实验组)。
图6、扫描电子显微镜和能谱分析图。A硅藻土，B吸附枯草芽孢杆菌fmbJ的硅藻土。
图7、硅藻土吸附枯草芽孢杆菌fmbJ的抑菌试验。A：10μL吸附fmbJ的硅藻土溶液(0.1g溶于1mL无菌生理盐水，后续同上)，B：10μL吸附fmbJ的硅藻土溶液(0.05g溶于1mL生理盐水)，C：10μL硅藻土(0.1g溶于1mL生理盐水)，D：10μL丙酸钙溶液(300mg/L)，E：10μL生理盐水；a：黑曲霉，b：白曲霉，c：黄曲霉。
五、具体实施方式
枯草芽孢杆菌fmbJ(CGMCC No.0943，公知公用见授权专利ZL 201010576515.8一种枯草杆菌抗菌脂肽的生产方法及其在仔猪饲料中的应用)在37℃，180rpm的条件下LB培养基(配方：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L，采用蒸馏水定容，pH 7.0～7.2)培养36h后，菌种浓度为(5-6)×108CFU/mL，添加硅藻土进行固定化吸附实验。所有实验重复3次，结果以平均值±标准差表示。
1)硅藻土(杭州崇科新材料有限公司，Celite610)进行121℃灭菌处理后烘干备用。单因素实验结果如图2所示，结果表明硅藻土的添加量、吸附时间、吸附温度和振荡速率对硅藻土的吸附率具有显著影响。吸附率的计算公式如(1-1)所示。
2)通过Plackett-Burman实验(Utilizing Plackett-Burman design andresponse surface analysis to optimize ultrasonic cleaning of pesticideresidues from rapes.Journal of the Science of Food and Agriculture.2021,102:2061-2069)挑选三个单因素进行响应面实验优化。Plackett-Burman实验结果方差分析见表1。根据显著性大小从四个单因素中挑选出吸附温度(p＜0.0004)、吸附时间(p＜0.0381)和振荡速率(p＜0.481)进行响应面优化实验。
表1PB设计中各因素对fmbJ吸附率的方差分析
*表示显著差异(*<0.05,**<0.01)
3)通过Plackett-Burman实验挑选了吸附温度、吸附时间和振荡速率进行响应面实验。不同因素间相互作用如图3所示，等高线图呈椭圆形，说明吸附温度和吸附时间，吸附温度和振荡速率，吸附时间和振荡速率之间都存在相互作用。响应面法优化得出的最优吸附条件为：水浴温度29℃，振荡速率80rpm的条件下吸附58min。该条件下硅藻土对枯草芽孢杆菌的最佳吸附率为87.80％，其中枯草芽孢杆菌活菌数可达5.14×1010CFU/g。吸附完成后采用滤纸(规格9cm中速，孔径15-20μm，杭州沃华滤纸有限公司)过滤获得吸附枯草芽孢杆菌fmbJ的硅藻土，置于50℃烘箱中烘干水分后即为所制备的生物制剂，保存备用。
4)傅里叶变换红外光谱，激光粒度仪和扫描电子显微镜及能谱仪等表征实验证明枯草芽孢杆菌fmbJ是通过物理吸附作用被吸附于硅藻土的孔径内，较好地保护微生物，从而增加微生物抗逆性的。傅里叶变换红外光谱结果表明上述制备的生物制剂与硅藻土峰形一致，无羟基峰，说明样品干燥无水分，贮藏性质稳定(图4)。
5)粒径实验表明吸附过程会对硅藻土的完整性造成轻微的破坏，但不会完全破坏其结构，制备的生物制剂的整体结构稳定(图5)。
6)扫描电子显微镜及能谱仪表征显示枯草芽孢杆菌被吸附在硅藻土的孔洞中(图6)。
7)抑菌实验结果表明生物制剂对于粮食中常见的黑曲霉(A.niger，MK779059.1)，黄曲霉(A.oryzae，MTO93257.1)，白曲霉(A.glaucus，M206022)具有明显的抑制作用(图7)。而丙酸钙溶液只对于A.niger具有拮抗作用，对于A.oryzae和A.glaucus则无明显影响，对比化学杀菌剂来说，微生物杀菌剂拥有更强的抑菌广谱性。说明本发明所制备的生物制剂可以在粮食贮藏、果蔬保鲜中得到应用。
8)贮藏实验结果如表2，生物制剂于-20℃的条件下贮藏180天枯草芽孢杆菌依旧可以维持80％左右的存活率(活菌数为4.0×1010CFU/g)。
表2生物制剂的贮藏实验
注：在同一行中，不同的大写字母(A、B、C)所代表的意思为同一行之间存在显著性误差(p<5％)。小写字母(a、b、c、d、e)所代表的意思为同一列之间存在显著性误差(p<5％)。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)fmbJ属于革兰氏阳性菌，芽孢杆菌属，可以形成保护性的内生孢子，对人畜无害，同时它可以分泌抗菌活性物质而作为生防菌以及用于粮食贮藏、果蔬保鲜等(Growth inhibition of Fusarium graminearum and reductionof deoxynivalenol production in wheat grain by bacillomycin D.Journal ofStored Products Research,2018,75,21-28；Effect of combined Bacillomycin D andchitosan on growth of Rhizopus stolonifer and Botrytis cinerea and cherrytomato preservation,Journal of the Science of Food and Agriculture,101,229-239)。
本发明采用的硅藻土为Celite610，在美国环境保护署(EPA)注册和有机材料评估研究所(OMRI)批准，已列入美国国家有机计划，是一种食品级的矿产品，主要应用于果蔬植物保护、中草药种植、粮食储藏、家禽畜牧养殖等农业各种领域杀虫。
本发明菌株枯草芽孢杆菌为安全的微生物，其抗菌产物可替代仔猪饲料中的抗生素，且具有更好的效果(见授权专利ZL 201010576515.8一种枯草杆菌抗菌脂肽的生产方法及其在仔猪饲料中的应用)。
因此，本发明采用硅藻土固定枯草芽孢杆菌可以构建多功能微生物制剂。所制备的生物制剂可以在粮食贮藏、果蔬保鲜以及动物饲料中得到应用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种用硅藻土固定芽孢杆菌生产的生物制剂，其特征在于，是用硅藻土通过水浴振荡吸附包埋保藏号为CGMCC No.0943，菌种浓度为(5-6)×108CFU/mL的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)fmbJ培养液后，过滤烘干获得的生物制剂。
2.根据权利要求1所述的生物制剂，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌fmbJ培养液是通过以下方式制备获得的：将枯草芽孢杆菌fmbJ接种于液体LB培养基，37℃、180rpm下培养36h获得的菌液为枯草芽孢杆菌fmbJ培养液。
3.根据权利要求1或2所述的生物制剂，所述的水浴振荡吸附过程中吸附温度为20-50℃，振荡速率为0-180rpm，吸附时间10-120min，硅藻土的添加量为1-10wt％，干燥的温度30-70℃。
4.根据权利要求3所述的生物制剂，所述的水浴振荡吸附过程中优选吸附温度为25-40℃，振荡速率为40-120rpm，吸附时间50-70min，硅藻土的添加量为1-8wt％，干燥的温度40-60℃。
5.根据权利要求4所述的生物制剂，所述的水浴振荡吸附过程中进一步优先吸附温度为26-35℃，振荡速率为60-90rpm，吸附时间55-65min，硅藻土的添加量为1-4wt％，干燥的温度45-55℃。
6.权利要求1-5之一所述生物制剂的制备方法。
7.权利要求1-5之一所述生物制剂的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，是指在植物防治、粮食贮藏或动物饲料中的应用。
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